Name: Wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj ekonomiczną metodę ekspresji ludzkich granzymów w komórkach HEK293T. System ten zapewnia wysokie wydajności czystych, w pełni zglikozylowanych i aktywnych enzymatycznie proteaz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Fundacji Novartis na rzecz Badań Medyczno-Biologicznych oraz z Puli Badawczej Uniwersytetu we Fryburgu (do MW). Dziękujemy Li Zhao, Zhan Xu i Solange Kharoubi Hess za wsparcie techniczne, a także Radu Aricescu i Yvonne Jones (Uniwersytet Oksfordzki, Wielka Brytania) za dostarczenie plazmidu pHLsec oraz Thomasowi Schürpfowi (Harvard Medical School) za pomocne dyskusje.

1. Produkcja ekspresji plazmid pHLsec-Gzm
<ol>
	<li>Przygotować całkowite RNA z ludzkich komórek NK (komórki pierwotne przygotowane jak w26lub linia komórkowa NK NK-92 wykazująca ekspresję wszystkich pięciu ludzkich Gzms) przy użyciu odpowiedniej metody izolacji RNA i dokonać odwrotnej transkrypcji przy użyciu zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA, zgodnie z zaleceniami producenta. Amplifikacja cDNA Gzm za pomocą PCR i klonowanie do pHLsec, jak opisano w23 (dar Radu Aricescu i Yvonne Jones, Uniwersytet Oksfordzki, Wielka Brytania) przy użyciu miejsc AgeI i KpnI (Figura 1). 
	UWAGA: Stosować następujące podkłady wskazane w Tabeli 1.</li>
	<li>Potwierdź prawidłowe wstawki przez sekwencjonowanie. Rozszerz ekspresję plazmidów w komórkach DH5α i oczyść za pomocą zestawu do izolacji plazmidu bez endotoksyn i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Oczyszczone plazmidy zawiesić ponownie w wolnej od endotoksyn, sterylnej wodzie o stężeniu 2 mg/ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Ekspresja Gzms w HEK293T komórkach
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników
	<ol>
		<li>Przygotuj standardową pożywkę hodowlaną. Do Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) zawierającego wysoki poziom glukozy (25 mM), GlutaMax (4 mM), pirogronian sodu (1 mM) dodaj 10% standardowej surowicy płodu cielęcego (FCS), penicylinę (100 jednostek/ml), streptomycynę (100 μg/ml).</li>
		<li>Przygotuj podłoże do transfekcji. Do pożywki bez penicyliny-streptomycyny dodać 25 μg/ml chlorochiny (dodać świeżo w dniu transfekcji z 1000 razy więcej w PBS, przechowywanej w temperaturze -20 °C).</li>
		<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną bez surowicy: Do pożywki bez surowicy dla komórek HEK293 dodaj glutaminę (4 mM), penicylinę (100 jednostek/ml), streptomycynę (100 μg/ml) i 2,5 mg/l amfoterycyny B.</li>
		<li>Przygotować roztwory opisane w Tabeli 2 i przefiltrować filtrem 0,45 μm przed użyciem:</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozszerzanie HEK293T komórek
	<ol>
		<li>Hodować HEK293T komórek w 20 ml pożywki hodowlanej, używając szalek do hodowli tkankowych o wymiarach 150 x 25 mm.</li>
		<li>Podziel komórki przy 80% zbiegu (stosunek podziału 1:4, zwykle co 3dni). Komórki luźno przylegają, można je mechanicznie odłączyć bez trypsynizacji poprzez rygorystyczne pipetowanie w górę iw dół.</li>
		<li>Płytki komórkowe w noc poprzedzającą transfekcję, aby uzyskać 60-70% zbieżności w dniu transfekcji (gęstość wysiewu ~2 x 105komórek/ml). Typowy rozmiar preparatu składa się z 20 do 25 naczyń kulturowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja wapniowo-fosforanowa
	<ol>
		<li>Na 1 godzinę przed transfekcją należy zmienić standardową pożywkę hodowlaną na 20 ml pożywki do transfekcji. Pod koniec tego 1-godzinnego etapu inkubacji zmieszać 400 μg plazmidowego DNA z 10,95 ml ddH20 i 1,55 ml 2M CaCl2 w probówkach o pojemności 50 ml (1 probówka/5 szalek).</li>
		<li>1 do 2 minut przed transfekcją dodać 12,5 ml 2x HBS do 12,5 ml roztworu DNA-Wapń, wymieszać przez odwrócenie probówek i inkubować przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać mieszaninę przygotowaną w ppkt 2.3.2 bezpośrednio do komórek (5 ml na naczynie), kroplami do pożywki. Posyp równomiernie na całej powierzchni, zmieniając podłoże na lekko pomarańczowy kolor.</li>
		<li>Inkubować szalki hodowlane przez 7 do 11 godzin w inkubatorze do hodowli tkankowych (37°C, 5% CO2 w wilgotnym powietrzu). Po inkubacji widoczny jest drobny osad. Usunąć pożywkę do transfekcji, ostrożnie przepłukać wstępnie podgrzanym PBS i dodać 20 ml pożywki hodowlanej bez surowicy, przygotowanej w 2.1.3. Inkubować przez 72 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych.</li>
		<li>Przeanalizuj wydajność transfekcji i ekspresji, uruchamiając próbkę (~20 μl) supernatantu komórkowego na SDS-PAGE i barwiąc za pomocą Coomassie Brilliant Blue w celu wizualizacji pasma granzyme.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie Gzms z supernatantu kulturowego za pomocą Nickel-IMAC
	<ol>
		<li>Po inkubacji zdekantować supernatanty z kultur komórkowych do probówek o pojemności 250 ml i oczyścić przez odwirowanie. Przeprowadzić pierwsze wirowanie (400 x g, 10 min, 4 °C), które usunie podłoże z oderwanych komórek. Przenieść supernatant do świeżych probówek o pojemności 250 ml i wirować w temperaturze 4 000 x g, 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich pozostałych resztek komórek.</li>
		<li>Dodać 5 ml 5 M NaCl, 6,25 ml 2 M Tris-Base (pH 8) i 1 ml 0,25 MNiSO4na 250 ml oczyszczonego supernatantu. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra próżniowego o pojemności 500 ml (0,45 mm).</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę niklowo-IMAC z buforem wiążącym His A (10 objętości kolumn, CV) za pomocą odpowiedniego systemu FPLC.</li>
		<li>Nanieść oczyszczony supernatant na wyrównaną kolumnę przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po nałożeniu supernatantu przemyć kolumnę buforem wiążącym His, aż do osiągnięcia linii bazowej absorbancji UV (zwykle 10 CV).</li>
		<li>Elute Gzms z liniowym gradientem 20 ml (0 do 250 mM imidazolu) z natężeniem przepływu 0,5 ml/min przy jednoczesnym zbieraniu frakcji 2 ml. Analizować frakcje elucyjne za pomocą barwienia SDS-PAGE i Coomassie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie enterokinazą (EK) i końcowe oczyszczanie metodą chromatografii kationowymiennej
	<ol>
		<li>Pula Gzm zawierająca frakcje w probówce dializującej z ≤10 MWCO. Przechowywać małą próbkę w temperaturze -20 °C jako kontrolę wstępną.</li>
		<li>Dodać EK w stężeniu 0,02 jednostki/50 ml początkowego supernatantu bezpośrednio do frakcji zbiorczej w probówce dializacyjnej i dializować O/N (co najmniej 16 godzin) w temperaturze pokojowej w buforze EK (4 l, zmienić bufor jeden raz).</li>
		<li>Następnego dnia przeanalizuj Gzms traktowany EK w porównaniu z kontrolą pre-EK za pomocą SDS-PAGE i barwienia Coomassie.</li>
		<li>Po zakończeniu przetwarzania N-końcowego zmień bufor dializacyjny na bufor S A (4 l) i dializuj przez kolejne 4 godziny w temperaturze RT. Dializat filtrować (0,45 μm).</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę S z buforem S A. Umieścić próbkę w kolumnie o natężeniu przepływu 0,5 ml/min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po załadowaniu próbki przemyć kolumnę buforem S A aż do osiągnięcia linii podstawowej absorbancji UV (około 10 CV). Eluować Gzms za pomocą gradientu liniowego o wielkości 30 ml (150 do 1,000 mM NaCl). GzmA eluuje przy ~650 mM NaCl, GzmB przy ~700 mM NaCl i GzmM przy ~750 mM NaCl.</li>
		<li>Analizuj frakcje elucyjne za pomocą SDS-PAGE i testów kolorymetrycznych (patrz poniżej). Frakcje basenowe zawierające Gzms i koncentrat (około 30-krotny, do stężenia około 100 μM) w filtrach wirowych (15 ml, 10 MWCO). Podwielokrotnić zagęszczony preparat Gzm i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Testowanie aktywności Gzm
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników
	<ol>
		<li>Przygotować bufor do testu kolorymetrycznego: 50 mM Tris-Base, pH 7.
		<ol>
			<li>Do pomiaru GzmA dodać ester tiobenzylowy N-a-CBZ-L-lizyny (S-Bzl) (BLT) do buforu testowego do końcowego stężenia 0,2 mM i 5,5′-ditio-bis(kwas 2-nitrobenzoesowy) (DTNB) do stężenia 0,22 mM. W przypadku GzmB należy dołączyć 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) i 0,22 mM DTNB. W przypadku GzmM należy uwzględnić 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (pNA) (AAPL). Peptydy syntetyczne dodaje się z odpowiednich roztworów podstawowych (w DMSO, przechowywanych w temperaturze -20 °C) do buforu świeżo przed badaniem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować bufor do oznaczania rozszczepienia: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-Base, pH 7,5</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testy kolorymetryczne
	<ol>
		<li>Rozmieścić małe próbki Gzm (<5 μl) z frakcji elucyjnych lub skoncentrowanych podkładów w 96-dołkowych płytkach płaskodennych. Obejmują kontrolę dodatnią (badane preparaty Gzm lub surowe lizaty komórek NK) i kontrolę ujemną (tylko bufor).</li>
		<li>Dodać 100 μl buforu testowego do każdego dołka (za pomocą pipety wielokanałowej). Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Zmierzyć OD przy 405 nm w czytniku mikropłytek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test rozszczepienia
	<ol>
		<li>W przypadku testów rozszczepienia z wykorzystaniem oczyszczonych substratów, należy wspólnie inkubować substrat białkowy (natywny lub rekombinowany, 100 - 400 nM; kilka przykładów skutecznych substratów Gzm przedstawiono w sekcji wyników oraz w uwadze na końcu tej sekcji) z seryjnymi rozcieńczeniami Gzm (zaczynając od 400 nM) w buforze do oznaczania przez różne czasy. Analiza za pomocą SDS-PAGE i Coomassie lub barwienie srebrem; lub przez western blotting przy użyciu specyficznych przeciwciał.</li>
		<li>W przypadku testów rozszczepienia z użyciem lizatów komórkowych zawiesić 106 komórek HeLa (lub dowolną dostępną linię komórek nowotworowych) w 1 ml buforu do oznaczania i poddać lizie przez zamrożenie w kąpieli etanolowej/suchego lodu i trzykrotne rozmrożenie w temperaturze 37 °C. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie (15 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Współinkubować oczyszczony lizat z Gzms w różnych stężeniach i czasach jak powyżej. Rozszczepienie wykrywa się za pomocą immunoblottingu przy użyciu odpowiednich przeciwciał. 
		UWAGA: Kilka przykładów substratów działających w dobrej wierze, dla których dostępne są komercyjne przeciwciała: Bid (agonista śmierci domeny oddziałującej z BH3) i kaspaza 3 rozszczepiona przez GzmB27,28; wiele heterogenicznych rybonukleoprotein jądrowych (hnRNPA1, A2 i U) rozszczepionych przez GzmA29; fosfoproteina wirusa cytomegalii 71 przez GzmM30.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chowdhury, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+by+a+thousand+cuts%3A+granzyme+pathways+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death.</a> Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).</li>
<li>Thiery, J., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin%3A+a+key+pore-forming+protein+for+immune+control+of+viruses+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer.</a> Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).</li>
<li>Krensky, A. M., Clayberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+clinical+relevance+of+granulysin%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Biology and clinical relevance of granulysin.</a> Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).</li>
<li>Bovenschen, N., Kummer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+granzymes+find+a+home%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Orphan granzymes find a home.</a> Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).</li>
<li>Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+A+activates+another+way+to+die%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Granzyme A activates another way to die.</a> Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).</li>
<li>Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quarter+century+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">A quarter century of granzymes.</a> Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).</li>
<li>Hiebert, P. R., Granville, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+in+injury%2C+inflammation%2C+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Granzyme B in injury, inflammation, and repair.</a> Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).</li>
<li>Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+and+non-cytotoxic+roles+of+the+CTL%2FNK+protease+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme.</a> B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).</li>
<li>Walch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cells+kill+intracellular+bacteria+through+granulysin-mediated+delivery+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes.</a> Cell. 157, 1309-1323 (2014).</li>
<li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells+act+as+an+extravascular+cytotoxic+barrier+for+joint-invading+Lyme+Borrelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).</li>
<li>Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimalarial+activity+of+granzyme+B+and+its+targeted+delivery+by+a+granzyme+B-scFv+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2014).</li>
<li>Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cytotoxic+T+cell+and+NK+granules+and+purification+of+their+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).</li>
<li>Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+use+of+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and use of granzyme B.</a> Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).</li>
<li>Masson, D., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+serine+esterases+in+lytic+granules+of+cytolytic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes.</a> Cell. 49, 679-685 (1987).</li>
<li>Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+refolding%2C+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B.</a> Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B+from+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris.</a> Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+enzymatically+active+recombinant+granzyme+B+in+a+baculovirus+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system.</a> Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).</li>
<li>Stahnke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-H22%28scFv%29%2C+a+human+immunotoxin+targeting+CD64+in+acute+myeloid+leukemia+of+monocytic+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes.</a> Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).</li>
<li>Gehrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+expression+and+purification+system+for+the+production+of+enzymatic+and+biologically+active+human+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme.</a> B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).</li>
<li>Metkar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cell+granule-mediated+apoptosis%3A+perforin+delivers+granzyme+B-serglycin+complexes+into+target+cells+without+plasma+membrane+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation.</a> Immunity. 16, 417-428 (2002).</li>
<li>Motyka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mannose+6-phosphate%2Finsulin-like+growth+factor+II+receptor+is+a+death+receptor+for+granzyme+B+during+cytotoxic+T+cell-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis.</a> Cell. 103, 491-500 (2000).</li>
<li>Pinkoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+and+trafficking+of+granzyme+B+in+target+cells+during+granzyme+B-perforin-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis.</a> Blood. 92, 1044-1054 (1998).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Fukuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+assays+of+nine+heterogeneous+promoters+in+neural+and+other+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).</li>
<li>Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptidyl+peptidase+I%3A+importance+of+progranzyme+activation+sequences%2C+other+dipeptide+sequences%2C+and+the+N-terminal+amino+group+of+synthetic+substrates+for+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity.</a> Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+purification%2C+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Barry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+short-circuits+the+need+for+caspase+8+activity+during+granule-mediated+cytotoxic+T-lymphocyte+killing+by+directly+cleaving+Bid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid.</a> Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).</li>
<li>Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+apoptotic+protease+CPP32+by+cytotoxic+T-cell-derived+granzyme+B.+%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. </a> Nature. 377, 446-448 (1995).</li>
<li>Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+RNA+processing+during+immune-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).</li>
<li>Domselaar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncytotoxic+inhibition+of+cytomegalovirus+replication+through+NK+cell+protease+granzyme+M-mediated+cleavage+of+viral+phosphoprotein+71%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71.</a> J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+activates+clathrin-+and+dynamin-dependent+endocytosis%2C+which+is+required+for+plasma+membrane+repair+and+delivery+of+granzyme+B+for+granzyme-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis.</a> Blood. 115, 1582-1593 (2010).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+pores+in+the+endosomal+membrane+trigger+the+release+of+endocytosed+granzyme+B+into+the+cytosol+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells.</a> Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).</li>
<li>Thomas, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+protease+binding+to+nucleic+acids+promotes+nuclear+localization+and+cleavage+of+nucleic+acid+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins.</a> J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).</li>
<li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-induced+mitochondrial+ROS+are+required+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis.</a> Cell death and differentiation. , (2014).</li>
<li>Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+recombinant+granzyme+A+zymogen+and+its+activation+by+the+cysteine+proteinase+cathepsin+C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).</li>
<li>Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+that+specifically+measures+Granzyme+B+proteolytic+activity%3A+hydrolysis+of+Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).</li>
<li>Huang, M. T., Gorman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervening+sequences+increase+efficiency+of+RNA+3%27+processing+and+accumulation+of+cytoplasmic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA.</a> Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).</li>
<li>Luthman, H., Magnusson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+polyoma+DNA+transfection+of+chloroquine+treated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).</li>
<li>Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+one-stage+method+for+assay+of+enterokinase+activity+by+release+of+radiolabelled+activation+peptides+from+alpha-N-%5B3H%5Dacetyl-trypsinogen+and+the+effect+of+calcium+ions+on+the+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity.</a> Biochem J. 197, 239-244 (1981).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Klasyczną i szeroko badaną rolą GzmA i GzmB jest indukcja apoptozy w komórkach ssaków po ich cytozolowym dostarczeniu przez białko tworzące pory PFN1. Ostatnio spektrum cytotoksyczne Gzms zostało znacznie poszerzone z komórek ssaków na bakterie9,10, a także na niektóre pasożyty11. Co więcej, nieklasyczne, zewnątrzkomórkowe funkcje GzmA i GzmB, a także biologiczne znaczenie różnych sierocych Gzmów są nadal niejasne. W związku z tym solidny, efektywny czasowo i kosztowo system odciągania i ...

Gzms to rodzina wysoce homologicznych proteaz serynowych zlokalizowanych w wyspecjalizowanych lizosomach komórek CTL i NK1. Cytotoksyczne ziarnistości tych komórek zabójczych zawierają również białka naruszające błonę PFN i GNLY, które są uwalniane jednocześnie z Gzms po rozpoznaniu komórki docelowej przeznaczonej do eliminacji2,3. U ludzi występuje pięć Gzms (GzmA, B, H, K i M), a u myszy 10 Gzms (GzmA – G, K, M i N). GzmA i GzmB są najliczniejsze i najszerzej badane u ludzi i myszy1. Jednak nowsze badania zaczęły badać szlaki śmierci komórkowej, a także dodatkowe efekty biologiczne, w których pośredniczą inne, tak zwane sieroce Gzms w zdrowiu i chorobie4.
Najbardziej znaną funkcją Gzms, w szczególności GzmA i GzmB, jest indukcja zaprogramowanej śmierci komórki w komórkach ssaków, gdy jest dostarczana do komórek docelowych przez PFN5,6. Jednak nowsze badania wykazały również zewnątrzkomórkowe działanie Gzms z głębokim wpływem na regulację immunologiczną i stan zapalny, niezależnie od dostarczania cytozolu przez PFN7,8. Spektrum komórek, które są skutecznie zabijane po wniknięciu cytozolu do Gzms, zostało również niedawno poszerzone z komórek ssaków na bakterie9,10, a nawet niektóre pasożyty11. Ostatnie odkrycia otworzyły przed badaczami z Gzm zupełnie nowe pole do popisu. W związku z tym opłacalny, wysokowydajny system ekspresji ssaków znacznie ułatwi przeprowadzenie tych przyszłych badań.
Rodzime Gzms ludzkie, mysie i szczurze zostały pomyślnie oczyszczone z frakcji granulek komórek CTL i NK linii12-14. Jednak w naszych rękach wydajność takich technik oczyszczania mieści się w zakresie mniejszym niż 0,1 mg/L hodowli komórkowej (niepublikowana obserwacja i12). Ponadto rozdzielczość chromatograficzna pojedynczego Gzm bez zanieczyszczenia innymi Gzmami i/lub białkami, które są również obecne w granulkach, jest wyzwaniem (dane niepublikowane i12,14). Rekombinowane Gzms wytwarzano w bakteriach15, drożdżach16, komórkach owadów17, a nawet w komórkach ssaków, takich jak HEK 29318,19. Tylko systemy ekspresji ssaków mają potencjał do wytwarzania rekombinowanych enzymów z modyfikacjami potranslacyjnymi identycznymi z natywnym białkiem cytotoksycznym. Modyfikacje potranslacyjne są związane ze specyficznym wychwytem przez endocytozę i wewnątrzkomórkową lokalizacją proteazy w komórkach docelowych20-22. Dlatego, używając pHLsec23 (życzliwy dar Radu Aricescu i Yvonne Jones, Uniwersytet Oksfordzki, Wielka Brytania) jako szkieletu plazmidu do ekspresji Gzm, stworzyliśmy prosty, efektywny czasowo i kosztowo system do wysokowydajnej produkcji białek w komórkach HEK293T. pHLsec łączy wzmacniacz CMV z promotorem β-aktyny kurczaka; Razem pierwiastki te wykazały najsilniejszą aktywność promotora w różnych liniach komórkowych24. Ponadto plazmid zawiera króliczy intron Β-globiny, zoptymalizowane sygnały Kozak i wydzielania, znacznik Lys-6xHhis i sygnał poli-A. Inserty można wygodnie klonować między sygnałem wydzielania a znacznikiem Lys-6xHhis (ryc. 1), zapewniając optymalną ekspresję i wydajność wydzielania białek pozbawionych odpowiednich domen N-końcowych. W celu ekspresji Gzms zastąpiliśmy endogenną sekwencję sygnału wydzielania sygnałem wydzielania dostarczanym przez wektor, po którym następuje miejsce enterokinazy (EK) (DDDDK), tak aby leczenie EK aktywowało wydzielane Gzms (aktywne Gzms zaczynają się od N-końcowej sekwencji aminokwasowej IIGG25). Dodatkowo, na korzyść tej metody, komórki HEK293T szybko rosną w tanim podłożu, takim jak Modified Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, i dobrze nadają się do opłacalnej metody transfekcji wapniowo-fosforanowej.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Zestaw do izolacji całkowitego RNA</td></tr><tr><td>SuperScript II Odwrotna transkryptaza</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phusion o wysokiej wierności</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 293 Pożywka bez surowicy dla komórek HEK 293</td><td>Sigma</td><td>14571C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronian</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do dializy SnakeSkin, 10K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Enterokinaza z jelita bydlęcego</td><td>Rekombinowana Sigma</td><td>E4906</td>, <td>&ge; 20&nbsp; jednostek/mg białka</td></tr><tr><td>HisTrap Excel 5 ml kolumna</td><td>GE Healthcare</td><td>17-3712-06&nbsp;</td><td>Nikiel IMAC</td></tr><tr><td>Kolumna HiTrap SP HP 5 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1152-01&nbsp;</td><td>Kolumna S</td></tr><tr><td>N-&alfa;-Cbz-L-lizyna tiobenzylester (BLT)</td><td>Sigma</td><td>C3647</td><td>GzmA substrat</td></tr><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)</td><td>MP Biomedicals</td><td>2193608 _10mg</td><td>GzmB Substrat</td></tr><tr><td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)</td><td>Bachem</td><td></td><td>GzmM substrate</td></tr><tr><td>5,5&prime;-dithio-bis(kwas 2-nitrobenzoesowy) (DTNB)</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td>Odczynnik Ellmana</td></tr></tbody></table>

wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

Gdy cytotoksyczne limfocyty T (CTL) lub komórki NK rozpoznają komórki nowotworowe lub komórki zakażone wewnątrzkomórkowymi patogenami, uwalniają swoją cytotoksyczną zawartość granulek, aby wyeliminować komórki docelowe i wewnątrzkomórkowy patogen. Śmierć komórek gospodarza i patogenów wewnątrzkomórkowych jest wywoływana przez granulowane proteazy serynowe, granzymy (Gzms), dostarczane do cytozolu komórki gospodarza przez białko tworzące pory perforynę (PFN) oraz do patogenów bakteryjnych przez błonę prokariotyczną zaburzającą granulyzynę białkową (GNLY). Aby zbadać molekularne mechanizmy śmierci komórki docelowej, w której pośredniczy Gzms w eksperymentalnych warunkach in vitro, konieczne są systemy ekspresji i oczyszczania białek, które wytwarzają duże ilości aktywnych enzymów. Systemy ekspresji białek wydzielanych przez ssaki implikują potencjał do wytwarzania prawidłowo pofałdowanych, w pełni funkcjonalnych białek, które podlegają modyfikacji potranslacyjnej, takiej jak glikozylacja. W związku z tym zastosowaliśmy opłacalną metodę wytrącania wapnia do przejściowej transfekcji komórek HEK293T z ludzkimi Gzms sklonowanymi do ekspresji plazmidu pHLsec. Oczyszczanie Gzm z supernatantu hodowli uzyskano za pomocą unieruchomionej chromatografii powinowactwa do niklu przy użyciu C-końcowego znacznika polihistydyny dostarczonego przez wektor. Wprowadzenie miejsca enterokinazy na N-końcu białka pozwoliło na wytworzenie aktywnej proteazy, która została ostatecznie oczyszczona przez chromatografię kationowymienną. System został przetestowany pod kątem wytwarzania wysokich poziomów cytotoksycznych ludzkich Gzm A, B i M i powinien być w stanie wytwarzać praktycznie każdy enzym w ludzkim ciele z wysoką wydajnością.

W następnej sekcji przedstawimy pełną dokumentację przygotowania GzmA, aby wyjaśnić tę metodę. Z powodzeniem oczyszczyliśmy również GzmB i GzmM, uzyskując podobne wyniki pod kątem wydajności oczyszczania i aktywności. Jednakże z tych późniejszych preparacji przedstawimy jedynie kilka wybranych danych. Preparaty GzmB z komórek 293T, otrzymane zgodnie z niniejszym protokołem, zostały wykorzystane w kilku opublikowanych badaniach, co potwierdza ich aktywność w różnych systemach testów biologicznych9,29,31-34....

Opisujemy tutaj opłacalny system ekspresji granzymu wykorzystujący komórki HEK293T, który daje wysokie plony czystej, w pełni glikozylowanej i enzymatycznie aktywnej proteazy.

Wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie wysokiej wydajności glikozylowanych i enzymatycznie aktywnych granzymów w ludzkich komórkach embrionalnych nerek 2 93 T. Osiąga się to poprzez wstępną ekspansję komórek HEC 2 93 T w odpowiednich naczyniach hodowlanych. Standardowa wielkość preparacji po ekspansji obejmuje od 20 do 25 naczyń hodowlanych.Drugim krokiem jest przejściowa transfekcja namnożonych komórek plazmidem ekspresyjnym granzymu z wykorzystaniem wydajnej metody fosforanu wapnia. Następnie zbiera się supernaty komórkowe, a wydzielone granzymy są oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa do jonów metali (IMAC). Ostatnie etapy obejmują aktywację granzymów poprzez traktowanie enterokinazą oraz dalsze oczyszczanie proteaz za pomocą chromatografii wymiany kationowej.Ostatecznie aktywność enzymatyczną bada się za pomocą szybkiego i niezawodnego testu kolorymetrycznego, ponieważ dostępność aktywnej proteazy w wystarczających ilościach jest czynnikiem ograniczającym w badaniach nad granzymami. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak charakterystyka nowych szlaków śmierci komórkowej w różnych organizmach lub identyfikacja nowych substratów proteazy w podejściach obejmujących cały proteom w celu ekspresji granzymów. Najpierw hoduje się komórki HEK 293 T w 20 ml pożywki hodowlanej, używając naczyń do hodowli tkanek o wymiarach 150 x 25 mm; komórki pasażuje się przy 80% konfluencji. Komórki przylegają słabo, ale można je oddzielić mechanicznie bez użycia trypsyny, energicznie pipetując zawartość naczynia w górę i w dół.Komórki wysiewamy dzień przed transfekcją, aby w dniu transfekcji osiągnęły 60 do 70% konfluencji. Standardowa partia przygotowań obejmuje od 20 do 25 naczyń hodowlanych. Na godzinę przed transfekcją wymieniono standardową pożywkę hodowlaną na 20 mililitrów pożywki do transfekcji. Pod koniec jednogodzinnego etapu inkubacji, na jedną do dwóch minut przed transfekcją, zmieszano 400 mikrogramów plazmidowego DNA z 10,95 mililitrami wodyy dwukrotnie destylowanej i 1,55 mililitrami dwumolarnego chlorku wapnia w probówkach o pojemności 50 mililitrów.Dodaj 12,5 mililitrów dwukrotnego roztworu soli buforyzowanej z hepesem do 12,5 mililitrów roztworu DNA z wapniem, mieszając poprzez odwracanie probówek, a następnie inkubuj przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Dodaj tę mieszaninę kroplami bezpośrednio do komórek w ilości 5 mililitrów na płytkę, rozprowadzając ją równomiernie na całej powierzchni, aż medium przybierze lekko pomarańczowy kolor. Inkubuj płytki hodowlane przez 7 do 11 godzin w inkubatorze do hodowli tkanek.Po inkubacji widoczny jest drobny osad. Usunąć medium do transfekcji. Ostrożnie wypłukać podgrzanym wcześniej PBS i dodać 20 mililitrów bezzserwatkowej pożywki hodowlanej przed inkubacją przez 72 godziny w inkubatorze do hodowli tkanek, a następnie przeanalizować wydajność transfekcji i ekspresji, przeprowadzając elektroforezę SDS-PAGE próbki supernatantu komórkowego i barwiąc ją kumaszem.Błękit brylantowy. W celu wizualizacji prążka granzymu. Po inkubacji przelać nadnadlewa z kultur komórkowych do probówek o pojemności 250 ml i oczyścić poprzez wirowanie.Przeprowadź pierwsze wirowanie, aby usunąć pożywkę z oddzielonych komórek. Przenieś nadsącz do nowych probówek o pojemności 250 ml i wiruj przy 4 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć pozostałe szczątki komórkowe. Następnie dodaj pięć mililitrów chlorku sodu, 6,25 mililitra Tris-base oraz jeden mililitr siarczanu niklu do 250 mililitrów oczyszczonego nadsączu.Przefiltruj nadsącz, używając jednostki filtracji próżniowej o pojemności 500 mililitrów. Równoważ kolumnę do chromatografii powinowactwa do jonów metali unieruchomionych na niklu za pomocą buforu wiążącego białka z histagiem, wykorzystując odpowiedni system FPLC.Następnie naświetlony nadpływ nanieś na wyrównaną kolumnę z szybkością przepływu 0,5 ml/min w temperaturze 4 °C. Po naniosieniu nadpływu przemyj kolumnę buforem wiążącym His, aż do osiągnięcia linii bazowej absorbancji UV. Granzymy eluuj za pomocą liniowego gradientu ILE o objętości 20 ml przy szybkości przepływu 0,5 ml/min, zbierając frakcje o objętości 2 ml.Przeanalizuj frakcje elucyjne za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i barwienia kumasy. Przenieś frakcje zawierające granzym do probówki typu dazing. Przechowuj niewielką próbkę w temperaturze -20 °C jako kontrolę przed dodaniem enterokinazy.Dodaj enterokinazę w ilości 0,02 jednostek na 50 mililitrów początkowego supernatantu bezpośrednio do połączonej frakcji w probówce do dializy i dializuj przez noc w temperaturze pokojowej w buforze do enterokinazy. Następnego dnia przeanalizuj próbkę traktowaną kinazą w porównaniu z kontrolą przed dodaniem enterokinazy za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i barwienia błękitem Coomassie. Po zakończeniu przetwarzania terminalnego.Zmienić bufor do dializy na bufor S A i dializować przez kolejne cztery godziny w temperaturze pokojowej przed przefiltrowaniem dializatu. Następnie zrównoważyć kolumnę S buforem S A. Nałożyć próbkę na kolumnę przy szybkości przepływu 0,5 ml/min w temperaturze 4 °C po załadowaniu próbki.Przemywaj kolumnę buforem S A, aż do osiągnięcia linii bazowej absorbancji UV. Eluuj granzymy, stosując liniowy gradient chlorku sodu o objętości 30 ml; granzym A eluuje przy około 650 millimolar NaCl, granzym B przy około 700 millimolar NaCl, a granzym M przy około 750 millimolar NaCl. Zbierz frakcje zawierające granzymy i zagęszcz je do stężenia około 100 micromolar za pomocą filtrów wirowych, a następnie podziel zagęszczone preparaty granzym na alykwoaty i przechowuj w temperaturze -80 °C.Następnie należy przeanalizować frakcje elucyjne za pomocą elektroforezy SDS-PAGE oraz testów kolorymetrycznych. Aby przeprowadzić testy kolorymetryczne, należy rozdzielić niewielkie próbki granzymu z frakcji elucyjnych lub skoncentrowanych zapasów do 96-dołkowych płytek z płaskim dnem, uwzględniając kontrolę pozytywną i kontrolę negatywną. Do każdego dołka należy dodać 100 µL buforu testowego.Następnie inkubuj płytkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Na koniec zmierz gęstość optyczną przy 405 nm w czytniku mikropłytek. Protokół ten pozwoli na uzyskanie wysokiej wydajności czystych granzymów, co wykazano na reprezentatywnym żelu SDS-PAGE barwionym metodą Coomassie, przedstawiającym granzym BE w kolumnie S.Rekombinowane granzymy wykazują aktywność podobną do natywnych preparatów proteaz, co pokazano w tym kolorymetrycznym teście porównującym aktywność rekombinowanej i natywnej granzymy B. Co istotne, traktowanie endo H wskazuje, że granzymy produkowane w komórkach HEC 2 93 T są w pełni glikozylowane. Rekombinowane granzymy są zdolne do rozszczepiania makromolekularnych substratów białkowych, co zademonstrowano w tym reprezentatywnym teście rozszczepiania przez granzymę a z użyciem bakteryjnego substratu białkowego UOCD.Tutaj prążek reprezentujący rozszczepione N-O-U-C-D powoli znika wraz ze wzrostem stężenia granzymu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak uzyskać w pełni glikozylowane i proaktywne granzymy o wysokiej wydajności w komórkach HK 2 93 T.

a-high-yield-cost-efficient-expression-system-human-granzymes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Opisujemy prosty, ilościowy test kolorymetryczny, który konkretnie mierzy aktywność proteolityczną ludzkiego, mysiego lub szczurzego Granzyme B (GzmB). Protokół ten można łatwo dostosować do określania aktywności proteazy innych granulowanych proteaz serynowych poprzez hydrolizę innych syntetycznych substratów peptydowych z odpowiednią sekwencją rozpoznawania.

Test kolorymetryczny, który specyficznie mierzy aktywność proteolityczną Granzyme B: hydroliza Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Ekspresja białek malarycznych w systemach komórkowych pozostaje wyzwaniem. Pokazujemy dwuetapowe i jednoetapowe systemy ekspresji komórkowej IVT (translacja in vitro) do ekspresji rekombinowanych białek rhoptrii malarii z komórek HeLa. Do oczyszczania białek rhoptrii używamy systemu oczyszczania opartego na powinowactwie do żywicy Ni.

Oparte na HeLa systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek Plasmodium Rhoptry

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Zapewniamy skalowalne protokoły obejmujące projektowanie konstrukcji, transfekcję przejściową oraz ekspresję i oczyszczanie pełnowymiarowych wariantów ludzkiego białka huntingtyny w komórkach HEK293.

Wydajna i skalowalna produkcja pełnowymiarowych wariantów ludzkiej huntingtyny w komórkach ssaków przy użyciu systemu ekspresji przejściowej

Oczyszczanie, dializa i aktywacja znacznika his-tag są stosowane w celu zwiększenia wydajności rozpuszczalnej, aktywnej metaloproteinazy-3 domeny katalitycznej ekspresji białka u bakterii. Frakcje białkowe są analizowane za pomocą żeli SDS-PAGE.

Bakteryjna ekspresja i oczyszczanie metaloproteinazy ludzkiej macierzy-3 za pomocą chromatografii powinowactwa

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Poznaj ekonomiczną metodę ekspresji ludzkich granzymów w komórkach HEK293T. System ten zapewnia wysokie wydajności czystych, w pełni zglikozylowanych i aktywnych enzymatycznie proteaz.

Wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów