Wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie wysokich plonów glikozylowanych i enzymatycznie aktywnych granzymów foliowych w ludzkich embrionalnych komórkach T nerki 2 93. Osiąga się to poprzez najpierw rozprężanie limfocytów T HEC 2 93 w odpowiednich szalkach do hodowli tkankowej. Typowy rozmiar preparatu po ekspansji składa się z 20 do 25 naczyń hodowlanych.

Drugim krokiem jest przejściowa transfekcja ekspandowanych komórek plazmidem o ekspresji granzyma przy użyciu wydajnej metody fosforanu wapnia. Następnie zbiera się supernat komórkowy, a wydzielane wielkie enzymy są oczyszczane za pomocą unieruchomionej chromatografii powinowactwa do metali. Ostatnim krokiem jest aktywacja wielkich enzymów poprzez leczenie kinazą wejściową i dalsze oczyszczanie proteaz za pomocą chromatografii kationowymiennej.

Ostatecznie aktywność enzymatyczna jest testowana przy użyciu szybkiego i wiarygodnego testu metrycznego chole, ponieważ dostępność aktywnej proteazy w wystarczających ilościach jest czynnikiem ograniczającym w badaniach nad granzymem. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak charakterystyka nowych szlaków śmierci komórkowej w różnych organizmach lub identyfikacja nowych substratów proteazy w podejściach do ekspresji wielkich enzymów proteazy. Najpierw hoduj limfocyty T HEC 2 93 w 20 mililitrach pożywki hodowlanej, używając naczyń do hodowli tkankowych o wymiarach 150 na 25 milimetrów, podziel komórki przy płynności 80% Co luźno przylegają, ale można je mechanicznie odłączyć bez trypsyny, rygorystycznie pipetując płytkę w górę iw dół.

Komórki w noc poprzedzającą transfekcję, aby uzyskać płynność od 60 do 70% co w dniu transfekcji. Typowy rozmiar preparatu składa się z 20 do 25 naczyń kulturowych. Na godzinę przed transfekcją zmieniono standardową pożywkę hodowlaną na 20 mililitrów pożywki do transfekcji pod koniec godzinnego etapu inkubacji, zmieszano 400 mikrogramów DNA osocza z 10,95 mililitrami podwójnie destylowanej wody i 1,55 mililitra dwóch molowych chlorków wapnia w 50-mililitrowych probówkach na jedną do dwóch minut przed transfekcją.

W 12,5 mililitra dwóch x sterty buforowane soli fizjologicznej do 12,5 mililitra roztworu wapnia DNA zmieszanego przez odwrócenie probówek przed inkubacją przez 30 sekund. W temperaturze pokojowej dodaj tę mieszaninę, kroplami bezpośrednio do komórek w ilości pięciu mililitrów na naczynie, równomiernie rozsyp na całej powierzchni, zmieniając podłoże na lekko pomarańczowy kolor. Inkubować szalki hodowlane przez siedem do 11 godzin w inkubatorze do hodowli tkankowych.

Po inkubacji widoczny jest drobny osad. Usunąć podłoże transfekcyjne. Ostrożnie spłukać wstępnie ciepłym PBS i dodać 20 mililitrów pożywki hodowlanej wolnej od surowicy przed inkubacją przez 72 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych, przeanalizować transfekcję i wydajność ekspresji, uruchamiając próbkę supernatantu komórkowego na stronie SDS i barwiąc kumasi.

Brylantowy niebieski. Aby zwizualizować pasmo granzyme. Po inkubacji zdekantować supernatanty z kultur komórkowych do 250 mililitrowych probówek i oczyścić przez odwirowanie.

Wykonaj pierwsze wirowanie, które usunie podłoże z oderwanych komórek. Przenieś supernatant do świeżych probówek o pojemności 250 mililitrów i wiruj z prędkością 4 000 G przez 30 minut w czterech stopniach Celsjusza, aby usunąć wszelkie pozostałe resztki komórek. Następnie dodaj pięć mililitrów chlorku sodu, 6,25 mililitra zasady tris i jeden mililitr siarczanu niklu oraz 250 mililitrów oczyszczonego supernatantu.

Przefiltrować supernatant za pomocą 500-mililitrowego filtra próżniowego. Zrównoważyć kolumnę chromatograficzną do chromatografii powinowactwa jonów metali immobilizowanych niklem z jego buforem wiążącym. A za pomocą odpowiedniego systemu FPLC.

Następnie nanieść oczyszczony supernatant na zrównoważoną kolumnę przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po nałożeniu supernatantu przemyć kolumnę jego buforem wiążącym, aż do osiągnięcia linii podstawowej absorpcji promieniowania ultrafioletowego lub UV. Eluuj granzymy za pomocą liniowego 20-mililitrowego gradientu ILE przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę, zbierając dwie frakcje mililitrowe.

Przeanalizuj frakcje elucjańskie za pomocą strony SDS i barwienia kumasi. Wyciągnij wielki zym zawierający frakcje w oślepiającej tubie. Przechowywać małą próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza jako kontrolę kinazy pre entero.

Dodać kinazę entero w ilości 0,02 jednostki na 50 mililitrów początkowego supernatantu bezpośrednio do frakcji zbiorczej w probówce dializacyjnej i dializować przez noc w temperaturze pokojowej w buforze kinazy enterologicznej. Następnego dnia przeanalizuj kinazę traktowaną na poziomie grand w porównaniu z kontrolą kinazy pre enterer za pomocą strony SDS i barwienia na niebiesko kumasi. Po zakończeniu przetwarzania terminala końcowego.

Zmienić bufor dializacyjny na bufor S A i dializować przez kolejne cztery godziny w temperaturze pokojowej przed przefiltrowaniem ósemki DIALATE. Następnie zrównoważ kolumnę S z buforem S. A. Załaduj próbkę na kolumnę z natężeniem przepływu 0,5 mililitra na minutę w czterech stopniach Celsjusza po załadowaniu próbki.

Przemyć kolumnę buforem S A aż do osiągnięcia linii podstawowej absorpcji promieniowania UV. Eluować granzymy za pomocą 30-mililitrowego liniowego gradientu chlorku sodu, granzym A eluuje w około 650 milimolowym chlorku sodu, granzym B w około 700 milimolowym chlorku sodu, a granzym M w około 750 milimolowym chlorku sodu. Frakcje zawierające granzymy należy połączyć i skoncentrować do około 100 mikromoli w filtrach wirowych, podwielokrotnić skoncentrowane preparaty granzymu i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Następnie przeanalizuj frakcje elucjańskie za pomocą strony SDS i testów metrycznych chole, aby wykonać testy metryczne chole, rozprowadź małe próbki granzymu z frakcji ellucjańskich lub skoncentrowanych zapasów w 96. Cóż, płaskie płyty denne obejmują kontrolę pozytywną i kontrolę ujemną. Do każdego dodać 100 mikrolitrów buforu do testu.

Dobrze inkubuj płytkę przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec zmierz gęstość optyczną przy 405 nanometrach w czytniku mikropłytek. Protokół ten zapewni wysokie plony czystych granzymów, jak pokazano na tym reprezentatywnym żelu SDS barwionym kumasi, pokazującym granzym BE z kolumny S.

Rekombinowane granzymy wykazują podobną aktywność jak natywne preparaty proteazy, jak pokazano w tym teście metryki kolorów porównującym aktywność rekombinowanego i natywnego granzymu B. Co ważne, leczenie endodoncją H wskazuje, że granzymy wytwarzane w limfocytach T HEC 2 93 są w pełni glikozylowane. Rekombinowane wielkie enzymy są zdolne do rozszczepiania wielkocząsteczkowych substratów białkowych, jak wykazano w tym reprezentatywnym teście rozszczepienia granzymu przy użyciu bakteryjnego substratu białkowego i UOCD.

Tutaj pasmo reprezentujące rozszczepione N-O-U-C-D powoli zanika wraz ze wzrostem koncentracji granzymu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać w pełni glikozylowane i proaktywne enzymy grand z wysoką wydajnością w limfocytach T HK 2 93.