Name: Korelacyjna, konfokalna i trójwymiarowa mikroskopia elektronowa określonej komórki czuciowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę cocem3D łączącą mikroskopię konfokalną i elektronową do badania komórek czuciowych jelita. Technika ta pozwala wizualizować ultrastrukturę komórek enteroendokrynnych w ich naturalnym środowisku tkankowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nasze szczere podziękowania kierujemy do następujących osób: Drs. Sam Johnson i Benjamin Carlson z Duke Light Microscopy Core Facility za pomoc w tworzeniu oprogramowania do wizualizacji danych, oraz Pani. Valerie Lapham i Dr. John M. Mackenzie, Jr. z Centrum Mikroskopii Elektronowej na Uniwersytecie Stanowym Karoliny Północnej za ich porady dotyczące mikroskopii elektronowej. Dziękujemy dr Elaine B. Bohórquez za pomoc redakcyjną. Autorzy przyczynili się do tego w następujący sposób: DVB, SM i RAL zaprojektowali eksperymenty i przeanalizowali dane. DVB przeprowadziło eksperymenty, a FH wykonało ręczne renderowanie danych. SM jest dyrektorem firmy Renovo Neural, w której pozyskano dane SBEM. DVB napisało manuskrypt, a wszyscy autorzy zrecenzowali i zredagowali ostateczną wersję rękopisu. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01DK091946 i granty Veterans Affairs I01BX002230 dla RAL, a F32DK094704 dla DVB.

Wszystkie eksperymenty i opieka nad zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Duke'a.
Cocem3D powstał z kombinacji wcześniej opublikowanych protokołów10,11 i został tutaj zastosowany do badania specyficznej komórki enteroendokrynnej za pomocą myszy reporterowej PyyGFP12. Metodę tę można łatwo zastosować do innych komórek będących przedmiotem zainteresowania przy użyciu dostępnych na rynku transgenicznych myszy reporterowych. Metoda jest opisana w trzech sekcjach: Korelcyjna mikroskopia konfokalna, seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM) oraz renderowanie danych w 3D.
Mikroskopia konfokalna korelacyjna.
Celem tej sekcji jest pobranie segmentu tkanki z dystalnej części jelita grubego o wymiarach, które umożliwiają korelacyjne obrazowanie konfokalne i SBEM. Protokół jest następujący:
1. Pobieranie tkanki
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml roztworu heparyny o stężeniu 50 μg/ml w PBS.</li>
	<li>Przygotować bulion znieczulający ksylazyna/ketamina, mieszając 10 ml ketaminy (100 mg/ml) i 1 ml ksylazyny (20 mg/ml).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć ksylazynę/ketaminę 1:4 w 0,1 mln PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 100 ml roztworu utrwalającego zawierającego 4% paraformaldehydu i 0,1% aldehydu glutarowego w PBS.</li>
	<li>Znieczulenie myszy PyyGFP w wieku od 6 do 10 tygodni za pomocą śmiertelnej dawki środka znieczulającego ksylazyna/ketamina. Środek znieczulający należy wstrzykiwać dootrzewnowo w ilości 0,15 ml na 20 g masy myszy.</li>
	<li>Potwierdź prawidłowe znieczulenie myszy, szczypiąc ogon lub palce u nóg i nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Użyj pompy perystaltycznej o zmiennym przepływie, aby perfaktor utrwalający dosierdziowo10. Za pomocą nożyczek chirurgicznych (o długości 13 cm) rozetnij jamę brzuszną, aby odsłonić jelita, serce i płuca. Przytrzymaj serce za pomocą zakrzywionych kleszczyków o wąskim wzorze (12 cm długości) i włóż igłę motylkową (19 G) z pompy perystaltycznej do lewej komory. Natychmiast odetnij prawy przedsionek za pomocą sprężynowych nożyczek prostych (długość 4 mm). Perfuzję z szybkością 2 ml/min najpierw z roztworem heparyny przez 1 minutę, a następnie z lodowatym roztworem utrwalającym przez 15 minut, aż ogon myszy stanie się całkowicie sztywny. 
	Uwaga: Bardzo ważne jest, aby perfuzja była powolna, aby zapobiec pękaniu małych naczyń w błonie śluzowej jelit. Pękanie naczynek narusza ultrastrukturę tkanki. Jeśli perfuzja jest odpowiednia, wątroba powinna zblednąć w ciągu 3-5 minut.</li>
	<li>Za pomocą małych nożyczek otwórz jamę brzuszną i wytnij całą okrężnicę od połączenia z jelitem ślepym do dystalnej odbytnicy. Umieść tkankę w lodowatym PBS. Po zanurzeniu w PBS rozetnij małymi sprężynowymi nożyczkami okrężnicę wzdłuż krezki.</li>
</ol>
2. Wycinanie i naprawianie segmentów tkanek
<ol>
	<li>Za pomocą skalpela wytnij około 6 małych segmentów tkanki (2 mm2) z dystalnej części jelita grubego. Zrób to na arkuszu wosku dentystycznego i zanurz go w kilku kroplach PBS.</li>
	<li>Po utrwaleniu segmentów tkanki w roztworze utrwalającym przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Mikropreparowanie bloków tkanek
<ol>
	<li>Przygotować 5% niskotopliwej agarozy w PBS i przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C.</li>
	<li>Osadź segmenty tkanek w 5% niskotopliwej agarozie za pomocą małego plastikowego pojemnika, takiego jak standardowy rozmiar Tissue-Tek Cryomold.</li>
	<li>Zamontuj osadzone sekcje na mikrotomie z wibrującymi ostrzami i napełnij tackę buforową lodowatym PBS.</li>
	<li>Wycinanie pasków tkankowych o grubości 300 μm z amplitudą 0,8 i prędkością 0,04 mm/s. Uwaga: W tym momencie paski tkanki zostaną usunięte z agarozy.</li>
	<li>Ponownie zanurz paski tkankowe o wielkości 300 μm w agarozie i zamontuj je na mikrotomie prostopadle do ostrza wibratomu.</li>
	<li>Za pomocą wibratomu wytnij paski tkanki o grubości 50 μm. Uwaga: Końcowe bloki tkanek powinny mieć około 300 μm szerokości x 50 μm grubości. Wymiary te zostały zoptymalizowane na podstawie pilotażowych eksperymentów konfokalnych, które wykazały, że grubość komórki enteroendokrynnej wynosi od 15 do 20 μm, a długość neuropoda 30-70 nm. W związku z tym cała komórka może być zawarta w bloku tkanki o szerokości 300 μm i grubości 50 μm, jeśli orientacja komórki jest równoległa do powierzchni bloku tkankowego. Zmieniaj te wymiary w zależności od rodzaju tkanki i komórki, która Cię interesuje.</li>
	<li>Przechowywać bloki tkanek w PBS w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Obrazowanie konfokalne
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór barwienia jądrowego, rozcieńczając DAPI w PBS w stosunku 1:4,000.</li>
	<li>Inkubuj bloki tkanek w barwieniu jądrowym DAPI przez 5 minut. Uwaga: Barwienie DAPI ułatwia rozróżnianie poszczególnych komórek na podstawie ich jąder, co jest pomocne w korelacji obrazów konfokalnych i SBEM.</li>
	<li>Zamontuj bloki tkanek na naładowanym szkiełku podstawowym, dodaj kilka kropli PBS i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu konfokalnego zidentyfikuj bloki z nienaruszonymi kosmkami i komórkami PyyGFP będącymi przedmiotem zainteresowania i zobrazuj je, aby uzyskać przekroje optyczne z-stacks.
	<ol>
		<li>Użyj obiektywu Zeiss Plan Apochromat 20x/0,8, aby uzyskać stosy z o przekroju optycznym 1 μm.</li>
		<li>W przypadku stosu z użyj kanałów dla 405 nm (DAPI), aby określić związek z innymi komórkami, endogennego GFP 488 nm, aby zlokalizować komórkę będącą przedmiotem zainteresowania, oraz różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), aby określić lokalizację komórki względem światła.</li>
		<li>Użyj rozdzielczości obrazu 1 024 pikseli lub wyższej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Osadzanie bloków w agarozie
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml utrwalacza zawierającego 4% paraformaldehydu i 2,5% aldehydu glutarowego w PBS.</li>
	<li>Usunąć bloki tkanki ze szkiełka podstawowego, ostrożnie dodając PBS na krawędziach szkiełka nakrywkowego, aby zsunąć szkiełko nakrywkowe z szkiełka podstawowego bez uszkadzania szkiełka tkankowego. Następnie za pomocą pędzla artystycznego przenieś blok tkanki ze szkiełka do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 4% paraformaldehydu i 2,5% utrwalacza aldehydu glutarowego.</li>
	<li>Tkanka po utrwaleniu blokuje O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieś bloki tkanek do PBS. Następnie osadź bloki płasko w 5% niskotopliwej agarozie, umieszczając je między dwoma szklanymi szkiełkami. 
	Uwaga: Osadzenie klocków w cienkiej warstwie agarozy ułatwia manipulację tylną częścią ciała podczas barwienia.</li>
	<li>Pokrój agarozę w kwadrat i zrób nacięcie po górnej stronie. Uwaga: Ten krok jest konieczny, aby zachować orientację w kolejnych krokach.</li>
	<li>Przechowywać bloki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z PBS w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM)
W tej sekcji, blok tkankowy jest przygotowany i zobrazowany za pomocą SBEM w małym powiększeniu. Obraz geodezyjny powierzchni bloku jest następnie korelowany z danymi konfokalnymi w celu zidentyfikowania obszaru zawierającego komórkę będącą przedmiotem zainteresowania. Po zidentyfikowaniu regionu tkanka jest obrazowana w rozdzielczości 7 nm/piksel i w warstwach 70 nm. To wystarczyło, aby rozróżnić i odróżnić pęcherzyki wydzielnicze rdzenia o dużej gęstości od innych organelli. W komórkach enteroendokrynnych ten typ pęcherzyków ma średnicę od 100 do 150 nm13. Protokół jest następujący:
6. Barwienie skrawków tkanek
<ol>
	<li>Usunąć tkankę z PBS i spłukać trzykrotnie, po 5 minut każdy, w 0,1 M buforze kakodylowym.</li>
	<li>Bloki barwienia przez 1 godzinę w 0,1% kwasie garbnikowym rozpuszczonym w 0,1 M buforze kakodylowym w celu zwiększenia kontrastu błon komórkowych14.</li>
	<li>Przeprowadź późniejsze barwienie i odwodnienie tkanki zgodnie z opublikowanym protokołem11. Postępując zgodnie z protokołem Deerinck i wsp., przygotuj następujące roztwory: 1) 1% (w/v) tiokarbonhydrazydu (THC); 2) roztwór asparaginianu ołowiu; 3) 1% octan uranylu i 4) tetraoksyd osmu / żelazocyjanek potasu (żelazocyjanek OsO4/K). Wymieszaj 4% OsO4 i 2x K żelazocyjanek [0,3 g K żelazocyjanku i 0,86 g Kakodylanu Na w 10 ml H2O] w stosunku 1:1, aby uzyskać żelazocyjanek OsO4/K. Uwaga: Zanurzenie tkanki w agarozie ułatwia obchodzenie się z nią podczas barwienia. Ostrożnie usuń agarozę w celu późniejszej infiltracji żywicy.</li>
	<li>Próbki należy przepłukać trzykrotnie, po 5 minut każda, w 0,1 M buforze kakodylowym, a następnie wybarwić roztworem żelazocyjanku OsO4/K przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Spłucz w ultra czystej wodzie trzy razy po 5 minut i zaplamij TCH przez 30 minut w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Spłucz w ultra czystej wodzie trzy razy po 5 minut i zaplamij 2% OsO4 (bez żelazocyjanku K) przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Spłucz ponownie w ultra czystej wodzie trzy razy po 5 minut każdy.</li>
	<li>Plamić 1% octanem uranylu O/N w temperaturze 4 °C. Spłukać w ultra czystej wodzie trzy razy po 5 minut każdy.</li>
	<li>Barwieć asparaginianem ołowiu przez 30 minut w temperaturze 60 °C. Spłukać w ultra czystej wodzie trzy razy po 5 minut.</li>
	<li>Odwodnić tkanki przez płukanie w roztworach o rosnącym stężeniu etanolu. Spłucz 2 razy po 5 minut 50%, 75%, 85%, 95% i absolutnym 100% etanolem. Na koniec spłucz sekcje tlenkiem propylenu dwa razy po 10 minut każda.</li>
</ol>
7. Infiltracja i zatapianie skrawków tkanek w żywicy
<ol>
	<li>Infiltruj bloki żywicą za pomocą dostępnego na rynku zestawu. Zanurz tkanki w żywicy za pomocą zestawu do zatapiania epon. Przygotuj mieszankę żywic składającą się z 48% żywicy epoksydowej, 20% ml DDSA, 30% ml NMA i 2% DMP30. Mieszaj mieszaninę żywicy energicznie przez 5 minut, a następnie umieść mieszaninę w próżni na 30 minut, aby pęcherzyki mogły wydostać się na powierzchnię.</li>
	<li>Wymieszaj żywicę z tlenkiem propylenu w stosunku 1:1 i energicznie wstrząśnij. Usuń ostatnie płukanie odwodnieniowe z tkanek i dodaj żywicę zmieszaną z tlenkiem propylenu. Umieścić fiolkę z próbkami w rotatorze O/N i pozostawić fiolkę bez nakrętki. Następnego dnia dodaj świeżo przygotowaną żywicę epon i mieszaj przez 90 minut w rotatorze.</li>
	<li>Osadź bloki w żywicy tak płasko, jak to możliwe, umieszczając je między szklanymi szkiełkami, które zostały utwardzone płynnym środkiem antyadhezyjnym, aby zapobiec ich sklejaniu się ze sobą15.</li>
	<li>Po płaskim osadzeniu bloków utwardzić je przez 48 godzin w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Rozsuń suwaki, aby zwolnić bloki.</li>
</ol>
8. Montaż i przycinanie bloku tkankowego do obrazowania
<ol>
	<li>W zakresie preparacyjnym dopasuj orientację bloków tkanek zanurzonych w żywicy do orientacji mikrofotografii konfokalnych, aby ułatwić identyfikację regionów zawierających interesujące komórki przed przycięciem bloku.</li>
	<li>Ręcznie przytnij blok osadzony w żywicy do powierzchni bloku ~500 x 500 μm.</li>
	<li>Zamontuj blok płasko na kołku zawierającym przewodzącą żywicę epoksydową i schnij przez 30 minut. Następnie położyć blok płasko na powierzchni i wysuszyć O/N w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Pokryj blok płynem ze srebra koloidalnego. Utrzymuj skrawki tkanki płasko, aby zapewnić cięcie bloku pod kątem prostym, aby ułatwić korelację seryjnych mikrofotografii blokowych i konfokalnych.</li>
</ol>
9. SBEM
<ol>
	<li>Zobrazuj blok za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w system SBEM (np. 3View).</li>
	<li>Ustaw początkowy przekrój grubości w krokach co ~2 μm i tnij, aż powierzchnia tkanki wyłoni się z bloku.</li>
	<li>Uzyskaj obraz surver całej powierzchni bloku.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania Fidżi, wykonaj pomiary zarówno seryjnych mikrofotografii blokowych, jak i konfokalnych, aby wygenerować wspólny mianownik i uwzględnić wypaczenie próbki podczas utrwalania i barwienia16.</li>
	<li>Zlokalizuj obszar zainteresowania na powierzchni bloku, mnożąc mianownik przez współrzędne na obrazach konfokalnych. Użyj również innych cech strukturalnych, takich jak położenie mikrokosmków, komórek kubkowych lub blaszki właściwej, jako odniesienia.</li>
	<li>Obraz obszaru zainteresowania przy napięciu 2,25 kV i długości fali 7 nm/piksel (lub powiększeniu 15 147x) w trybie wysokiej próżni. Przyrosty warstwy powinny być ustawione na 70 nm lub mniej.</li>
	<li>Zbieraj dane SBEM w surowym 16-bitowym formacie .dm3.</li>
</ol>
10. Optymalizacja obrazów SBEM pod kątem segmentacji powierzchni
<ol>
	<li>Konwertuj obrazy SBEM z surowego formatu .dm3 na 8-bitowy .tiff.</li>
	<li>Filtruj obrazy .tiff za pomocą filtra rozmycia 0,8 Gaussa na Fidżi.</li>
	<li>Zmniejsz zestaw danych do 25% oryginalnego rozmiaru i zapisz go jako stos .tiff, aby zminimalizować ilość pamięci RAM niezbędnej do obsługi zestawu.</li>
	<li>Wyrównaj stos obrazów SBEM za pomocą wtyczki Fiji "liniowe wyrównanie stosu z SIFT" w trybie tłumaczenia i przycięte za pomocą wtyczki "crop 3D". Uwaga: Kadrowanie pomaga jeszcze bardziej zmniejszyć ilość pamięci RAM niezbędnej do segmentacji i renderowania woluminów.</li>
</ol>
Renderowanie danych w 3D
11. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Rekonstruuj stosy z za pomocą automatycznego trybu przewyższania narzędzia "powierzchnie". Rysunek 1D przedstawia rekonstrukcję każdego kanału przy użyciu opcji gładkiej, szczegółowości obszaru powierzchni na poziomie 0,126 μm i progowania jako intensywności bezwzględnej.</li>
</ol>
12. Szeregowy blok SEM
Uwaga: Ręczna segmentacja danych jest bardzo czasochłonną procedurą i w zależności od funkcji, które mają być renderowane, procedura może potrwać kilka tygodni. Segmentacja filmów i rysunków przedstawionych w Bohórquez et al. 2014 8 została wykonana ręcznie i zajęła około 500 godzin pracy. Zaleca się nadanie priorytetu podstawowym funkcjom wymagającym renderowania przed rozpoczęciem procesu segmentacji. Procedura jest następująca:
<ol>
	<li>Użyj narzędzia "powierzchnie" w trybie rysowania i opcji "kontur" w trybie rysowania 50 ms, aby ręcznie segmentować i objętościowo renderowaną komórkę zainteresowania.</li>
	<li>Kontury śledzenia są wykonywane na każdym wycinku komórki, aby zapewnić płynniejsze renderowanie, lub co 5 plasterków, aby zapewnić szybsze renderowanie.</li>
	<li>Eksportuj końcowe obrazy za pomocą narzędzia "migawka" w rozdzielczości 300 dpi lub większej.</li>
</ol>

<ol><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).</li>
<li>Smith, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+types%2C+neurosecretory+cells%2C+and+body+plan+of+the+early-diverging+metazoan+Trichoplax+adhaerens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens.</a> Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS biology. 2, e329(2004).</li>
<li>Engelstoft, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven+transmembrane+G+protein-coupled+receptor+repertoire+of+gastric+ghrelin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+metabolism%22%5BJournal%5D)">Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells.</a> Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).</li>
<li>Chandra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin-like+domain+containing+receptor+1+mediates+fat-stimulated+cholecystokinin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+stimulate+cholecystokinin+release+through+the+Ca2%2B-sensing+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).</li>
<li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).</li>
<li>Bohórquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enteroendocrine+cell-enteric+glia+connection+revealed+by+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy.</a> PloS one. 9, e89881(2014).</li>
<li>Bohórquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+circuit+formed+by+innervation+of+sensory+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells.</a> The Journal of clinical investigation. , (2015).</li>
<li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).</li>
<li>Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeerinck%2C+T+%22NCMIR+methods+for+3D+EM%3A+a+new+protocol+for+preparation+of+biological+specimens+for+serial+block+face+scanning+electron+microscopy%22">NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy</a>. , University of California. San Diego San Diego, CA. (2010).</li>
<li>Bohórquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+histology%22%5BJournal%5D)">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).</li>
<li>Nilsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+immunocytochemical+colocalization+of+peptide+YY+and+enteroglucagon+in+endocrine+cells+of+the+rabbit+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon.</a> Endocrinology. 129, 139-148 (1991).</li>
<li>Mizuhira, V., Futaesaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fixation+method+for+biological+membranes+using+tannic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">New fixation method for biological membranes using tannic acids.</a> Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).</li>
<li>Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+routine+flat+embedding+method+for+electron+microscopy+of+microorganisms+allowing+selection+and+precisely+orientated+sectioning+of+single+cells+by+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy.</a> Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Bohórquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Histol%22%5BJournal%5D)">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).</li>
<li>Jang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-expressed+gustducin+and+taste+receptors+regulate+secretion+of+glucagon-like+peptide-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).</li>
<li>Liou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G-protein-coupled+receptor+GPR40+directly+mediates+long-chain+fatty+acid-induced+secretion+of+cholecystokinin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin.</a> Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).</li>
<li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+sensing+in+L+cells%3A+a+primary+cell+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).</li>
<li>Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon-like+basal+processes+in+enteroendocrine+cells%3A+characteristics+and+potential+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets.</a> Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).</li>
<li>Batterham, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+hormone+PYY%283-36%29+physiologically+inhibits+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake.</a> Nature. 418, 650-654 (2002).</li>
<li>Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide+1+promotes+satiety+and+suppresses+energy+intake+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans.</a> The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).</li>
<li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper%3A+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+neural+circuits%22%5BJournal%5D)">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 68(2014).</li>
</ol>

Dr Satish Medicetty jest pracownikiem i otrzymuje 100% wynagrodzenia od Renovo Neural Inc.; Nie zmienia to jednak przestrzegania przez autora zasad JoVE dotyczących udostępniania danych i materiałów. W przypadku pozostałych autorów nie zgłasza się konfliktu interesów.

Chemosensacja przewodu pokarmowego staje się nową, ekscytującą dziedziną badań biomedycznych. Wynika to w dużej mierze z odkrycia funkcjonalnych receptorów smaku w komórkach enteroendokrynnych18. Późniejsze badania wykazały, że komórki enteroendokrynne wyrażają specyficzne receptory dla składników odżywczych, w tym węglowodanów, lipidów i aminokwasów5,6,19,20. Czynnikiem katalitycznym dla tych odkryć było opracowanie myszy reporterowych, u których komórki enteroendokrynne są znakowane fluorescencyjnie20. Opracowaliśmy jedną z tych myszy, mysz PyyGFP, do badania komórek enteroendokrynnych dystalnego jelita cienkiego i okrężnicy17,21. Komórki te są interesujące, ponieważ wydzielają PYY i glukagonopodobny peptyd 1, z których oba są induktorami sytości22,23. W tamtym czasie brakowało kompletnego ultrastrukturalnego opisu tych komórek, który naszym zdaniem był niezbędny do zrozumienia ich mechanizmów sygnalizacyjnych.
W tym miejscu opisaliśmy wizualnie metodę łączenia mikroskopii konfokalnej z SBEM. Metoda określana jest jako Cocem3D, co pozwoliło nam udokumentować pełną ultrastrukturę komórek enteroendokrynnych. Donieśliśmy, że komórki te mają neuropod, który zawiera trzy czwarte wszystkich pęcherzyków wydzielniczych8. Wewnątrz neuropoda znajdują się neurofilamenty i podobnie jak aksony neuronów, neuropody są pielęgnowane przez jelitowe komórki glejowe8. Co ważniejsze, to właśnie te neuropody fizycznie łączą się z neuronami unerwiającymi jelito i okrężnicę9.
Jedną z mocnych stron cocem3D jest jego prostota. Zredukowanie próbki tkanki do bloku, który można zobrazować za pomocą konfokalnego i SBEM, ułatwia identyfikację określonej komórki w tkance. Pęcherzyki wydzielnicze i inne organelle można łatwo zidentyfikować w rozdzielczości 7 nm/piksel. Ponieważ skrawki w SBEM są odrzucane, dalsze przetwarzanie tkanek w celu identyfikacji określonych białek nie jest w tym momencie opcją. Jednak rozwój metod takich jak ATUM24, w których zachowane są skrawki z bloku tkankowego, prawdopodobnie umożliwi identyfikację określonych białek w komórce. Określenie specyficznej lokalizacji receptorów chemosensorycznych na komórkach enteroendokrynnych jest niezbędną informacją dla opracowania terapii lekowych w leczeniu otyłości, ponieważ komórki enteroendokrynne są interfejsem sensorycznym między pokarmem w jelitach a uczuciem sytości w mózgu.

Życie wewnątrz komórki odbywa się w czasie i przestrzeni. Zmiany w czasie są często badane za pomocą mikroskopii poklatkowej w połączeniu z technikami obrazowania fluorescencyjnego, takimi jak mikroskopia superrozdzielcza. Przestrzeń, a w szczególności układ organelli wewnątrz komórki lub interakcje międzykomórkowe, można wyprowadzić jedynie poprzez pełny opis delikatnej struktury komórki. Kompleksowe opisanie delikatnej struktury komórki może również zapewnić jasność funkcji genomu w przypadkach, gdy genom jest dostępny, jak w przypadku nicienia C. elegans 1 lub płaskiego placozoa tricoplax adherens2. Mikroskopia elektronowa z seryjnym przekrojem jest obecnie powtarzalnym, efektywnym czasowo i tańszym zadaniem dzięki rozwojowi zautomatyzowanych technologii mikroskopii elektronowej 3D, takich jak seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa3 (SBEM).
Potrzeba informacji strukturalnych do wyjaśnienia funkcji jest bardzo widoczna w niektórych typach komórek, gdzie funkcja zależy od fizycznych interakcji między komórkami, takich jak neurony, komórki glejowe lub nabłonki czuciowe. Jesteśmy szczególnie zainteresowani wyjaśnieniem, w jaki sposób sygnały czuciowe ze składników odżywczych w świetle jelit są przekształcane w sygnał elektryczny, który ostatecznie moduluje zachowania pożądawcze. Obwód jest złożony, ale zaczyna się na ścianie jelita, gdzie składniki odżywcze wchodzą w kontakt z komórkami nabłonka czuciowego, zwanymi komórkami enteroendokrynnymi. W przeciwieństwie do innych komórek nabłonka czuciowego, takich jak komórki smaku, komórki enteroendokrynne są rozproszone w całym nabłonku jelitowym w stosunku od jednego do tysiąca4-7. W związku z tym były trudne do zidentyfikowania i zbadania, a przez długi czas były postrzegane jedynie jako źródło hormonów jelitowych. Ale wraz z rozwojem specyficznych dla komórek myszy reporterowych fluorescencyjnych pojawia się złożona funkcja sensoryczna tych komórek. Używając jednej z tych myszy reporterowych, myszy peptydowej YY-GFP (PyyGFP), odkryliśmy, że komórki enteroendokrynne mają wyraźny ogon cytoplazmatyczny, który nazwaliśmy neuropodem. Pojawienie się neuropodów sugerowało zachowaną funkcję w komunikacji międzykomórkowej. W związku z tym doszliśmy do wniosku, że dokumentując ultrastrukturę komórki enteroendokrynnej, można określić funkcję neuropodów.
Potrzeba zrozumienia struktury wyrostka w rozproszonej komórce, która jest trudna do zidentyfikowania, była głównym powodem opracowania metody łączącej mikroskopię konfokalną i SBEM. Komórka będąca przedmiotem zainteresowania została zidentyfikowana przy użyciu myszy reporterowych PyyGFP specyficznych dla komórek enteroendokrynnych. Metoda pozwoliła nam udokumentować całą ultrastrukturę komórki enteroendokrynnej i jej neuropoda. W obrębie neuropodów znaleźliśmy cechy strukturalne aksonów neuronalnych, a poza neuronogami znaleźliśmy fizyczny związek z glejem jelitowym8. Rzeczywiście, neuropody zawierają około 70% wszystkich pęcherzyków wydzielniczych, co sugeruje istotną rolę w funkcji wydzielniczej tych komórek. Opierając się na danych strukturalnych, niedawno odkryliśmy, że dzięki tym neuropodom komórki enteroendokrynne i neurony unerwiające jelita tworzą obwód neuronabłonkowy, podobny do tego, jaki mają komórki smakowe w języku8,9.
Odkrycie takich cech mechanizmów chemosensorycznych przewodu pokarmowego wynikało z danych strukturalnych zebranych za pomocą tej metody mikroskopii korelacyjnej. Uważamy, że ta metoda może być przydatna w innych obszarach biologii komórki, szczególnie tam, gdzie komórki są rozproszone w tkankach w bardzo niskim stosunku. Odnieśliśmy się do tej metody jako korelacyjnej konfokalnej i szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej w 3D (Cocem3D). Metoda składa się z następujących głównych etapów: preparacji tkanek, mikroskopii konfokalnej, obrazowania SBEM, korelacji SBEM i obrazu konfokalnego oraz segmentacji manualnej. W porównaniu z innymi metodami korelacji, koncepcja jest raczej prosta, ponieważ korelacja jest fizyczna, a nie chemiczna.

<table><tbody><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Technologie życia</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4%, świeżo wyprodukowana w PBS, końcowe pH 7,4</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Wosk dentystyczny</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72660</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Technologie życia</td><td>16520-100</td><td>5%, świeżo wyprodukowane w PBS</td></tr><tr><td>Standard Tissue-Tek Mikroskopia</td><td>elektronowa</td> Cryomold <td>62534-25</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp; plama jądrowa Technologie</td><td>życia</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dodatnio naładowane szkiełka podstawowe i nakrywkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pędzel artystyczny #1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor kakodylanowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>11650</td><td></td></tr><tr><td>Kwas garbnikowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw EMbed 812&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Płynny środek antyadhezyjny&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>70880</td><td></td></tr><tr><td>Ciekłe srebro koloidalne&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>CircuitWorks przewodząca żywica epoksydowa&nbsp; &nbsp;</td><td>ITW Chemtronics</td><td>CW2400</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływie</td><td>VWR</td><td>70730-064</td><td></td></tr><tr><td>VT1200S Mikrotom z wibracyjnymi ostrzami</td> Mikroskop konfokalny <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 780i</td><td>Carl Zeiss&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy Sigma VP&nbsp;</td><td>Carl Zeiss&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System 3view</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td><td></td><td>http://www.renovoneural.com</td><td>Renovo świadczy usługi 3D EM</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Fidżi</td><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td>otwartego dostępu</tr><tr><td>Stacja komputerowa z 16 GB pamięci RAM lub więcej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do wizualizacji danych Imaris 7.5&nbsp;</td><td>Płaszczyzna bitowa</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

korelacyjna, konfokalna i trójwymiarowa mikroskopia elektronowa określonej komórki czuciowej

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Określenie ultrastruktury komórki jest ważne dla zrozumienia jej funkcji. Może to być zniechęcające przedsięwzięcie w przypadku rzadkich typów komórek rozproszonych w tkankach zbudowanych z różnych typów komórek, takich jak komórki enteroendokrynne nabłonka jelitowego. Te czujniki żołądkowo-jelitowe żywności i bakterii były trudne do zbadania, ponieważ są rozproszone wśród innych komórek nabłonka w stosunku 1:1000. Ostatnio stworzono transgeniczne myszy reporterowe do identyfikacji komórek enteroendokrynnych za pomocą fluorescencji. Jednym z nich jest peptyd mysz YY-GFP. Korzystając z tej myszy, opracowaliśmy metodę korelacji konfokalnej i szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej z blokową powierzchnią. Nazwaliśmy metodę cocem3D i zastosowaliśmy ją do identyfikacji określonej komórki enteroendokrynnej w tkance i odsłonięcia ultrastruktury komórki w 3D. Rozdzielczość cocem3D jest wystarczająca do identyfikacji organelli tak małych jak pęcherzyki wydzielnicze i do rozróżnienia błon komórkowych w celu utylizacji objętościowej. Cocem3D można łatwo dostosować do badania ultrastruktury 3D innych określonych typów komórek w ich natywnej tkance.

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu została wykorzystana do badania ultrastruktury konkretnej komórki w obrębie warstwy nabłonka. Komórką, która nas interesuje w tym przypadku, jest trudna do zidentyfikowania komórka enteroendokrynna. Ich identyfikacja in situ stała się możliwa dopiero w ciągu ostatnich kilku lat dzięki opracowaniu myszy reporterowych z fluorescencją specyficzną dla danego typu komórek. W 2011 roku opracowaliśmy linię myszy, w której promotor hormonu PYY steruje ekspresją zielonego białka fluorescencyjnego17. U myszy PyyGFP komórki enteroendokrynne dystalnej części jelita cienkiego i jelita grubego są łatwo rozróżnialne w świetle UV. Model mysi ten stanowił podstawę do zidentyfikowania bloku tkanki zawierającego komórkę enteroendokrynną i jego przygotowania do SBEM. Metoda korelacji została tutaj określona jako cocem3D i została opracowana na podstawie wcześniej opublikowanych protokołów10,11.
Optymalizacja wymiarów bloku tkankowego jest kluczowa dla korelacji. W eksperymentach wstępnych ustalono, że w bloku tkankowym o wymiarach 300 µm długości x 50 µm grubości liczba obrazów SBEM zostaje zredukowana do minimum, przy jednoczesnym objęciu całego ciała analizowanej komórki. Rysunek 1A przedstawia ogólny widok sekcjonowania z użyciem mikrotomu z wibrującym ostrzem w celu uzyskania bloku tkankowego o odpowiednich wymiarach. Przed sortowaniem w celu wybrania bloków z nienaruszonymi analizowanymi komórkami uzyskuje się co najmniej 100 bloków. Wybrane bloki są obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, a stosy obrazów z (z-stacks) są optycznie rozmieszczone co 1 µm (Rysunek 1B i C). Rysunek 1D przedstawia widok z renderowaniem objętościowym komórki enteroendokrynnej w jelicie cienkim myszy. Jej wyraźny neuropod rozciąga się pod komórkami nabłonka na ok. 60 µm.
Komórkę docelową odnajduje się poprzez korelację stosów obrazów konfokalnych (z-stacks) z obrazem SBEM całej powierzchni bloku. Przedstawiono tutaj przykład bloku z dystalnej części okrężnicy myszy PyyGFP. Po uzyskaniu stosów obrazów konfokalnych (Rysunek 2A), blok zostaje zatopiony w cienkiej warstwie niskotopliwej agarozy (Rysunek 2B). Jest to niezbędne do dalszej manipulacji blokiem. Ważne jest, aby utrzymać orientację bloku tak płasko, jak to możliwe, aby dopasować przekroje optyczne do przekrojów SBEM. Na Rysunku 2C przedstawiono reprezentatywny obraz całej powierzchni bloku tkankowego. Części tego rysunku zostały wcześniej opublikowane w pracy Bohorquez et al., 20148. Następnie skorelowano go z obrazem konfokalnym, biorąc pod uwagę punkty orientacyjne i wymiary tkanki. Rysunek 2D pokazuje nałożenie obrazu konfokalnego i obrazu SBEM bloku, co ujawnia dokładną lokalizację naszej komórki docelowej.
Po zidentyfikowaniu komórki, obrazowanie SBEM jest wykonywane z rozdzielczością wystarczającą do zidentyfikowania pęcherzyków wydzielniczych i innych organelli komórkowych. Przedstawiony tutaj zestaw danych został obrazowany z rozdzielczością 7 nm na piksel, przy czym obrazy bloku były pobierane co 70 nm. Zestaw danych zawierał 643 obrazy obejmujące 45 µm głębokości tkanki. Kilka mikronów zostaje usuniętych podczas wstępnego obrazowania całej powierzchni bloku przy niskim powiększeniu. Surowy zestaw danych SBEM został pozyskany w formacie .dm3 i przekształcony do formatu .tiff w celu dalszej obróbki. Stos obrazów SBEM został przycięty za pomocą wtyczki oprogramowania Fiji „crop (3D)”, aby zawierał tylko interesujący region. Redukuje to ilość pamięci RAM potrzebnej do renderowania wolumetrycznego. Komórkę zidentyfikowano na podstawie jej położenia oraz pęcherzyków wydzielniczych, a następnie poddano segmentacji przy użyciu oprogramowania Imaris. Rysunek 3 przedstawia renderowanie 3D komórki enteroendokrynnej.
<img alt="Sekcjonowanie i analiza tkanek mysich; etapy obejmują krojenie oraz obrazowanie za pomocą korelacyjnej mikroskopii konfokalnej." src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1">
Rysunek 1: Korelacyjna mikroskopia konfokalna. (A) Schemat przygotowania fragmentu tkanki jelitowej w postaci bloku tkankowego o grubości 300 x 50 µm. (B) Reprezentatywny blok tkankowy o odpowiednich wymiarach. Należy zauważyć, że blok tkankowy o takich wymiarach z jelita cienkiego myszy obejmuje około 3 kosmków, a w przypadku jelita grubego około 8 krypt. (C) Kosmek w jelicie cienkim zawierający analizowaną komórkę. (D) Konfokalny stos obrazów z-stack, wyrenderowany w 3D przy użyciu oprogramowania Imaris, przedstawia komórkę enteroendokrynną z wyraźnym neuropodem biegnącym pod nabłonkiem jelitowym. Kolor niebieski = barwienie jąder DAPI. Paski skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa powierzchni bloku; schemat i obraz mikroskopowy tkanki do analizy." src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa powierzchni bloku (SBEM). (A) Obraz konfokalny wybranego bloku tkanki z okrężnicy zawierającego interesujące badacza komórki enteroendokrynne PyyGFP (zielone). (B) Po obrazowaniu bloku za pomocą mikroskopii konfokalnej zostaje on płasko zatopiony w agarozie o niskiej temperaturze topnienia przy użyciu szkiełek przedmiotowych. Zatopienie bloku tkankowego w agarozie ułatwia późniejszą manipulację, a wcięcie w lewym rogu pomaga zamontować blok w SBEM w odpowiedniej orientacji. (C) Obraz SBEM powierzchni bloku. (D) Korelacja danych konfokalnych z SBEM w celu zidentyfikowania interesującej komórki (biała strzałka). Obrazy c i d na tej rycinie zostały zmodyfikowane z pracy Bohorquez et al., 20148. Niebieski = barwienie jąder DAPI. Paski skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Renderowanie 3D neuropoda i mikrokosmków na obrazie z biologicznej mikroskopii elektronowej do badań nad strukturą komórkową." src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Renderowanie danych w 3D. (A) Renderowanie wolumetryczne komórki enteroendokrynnej z użyciem oprogramowania Imaris. Komórka zawiera neuropod wypełniony pęcherzykami wydzielniczymi. Pełny opis ultrastruktury komórki enteroendokrynnej znajduje się w pracy Bohórquez et al., 20148. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj wprowadzamy metodę, cocem3D, która pozwala na odkrycie ultrastruktury konkretnej komórki w jej natywnej tkance poprzez połączenie konfokalnej i seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna, konfokalna i trójwymiarowa mikroskopia elektronowa określonej komórki czuciowej

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest udokumentowanie pełnej ultrastruktury konkretnej komórki sensorycznej jelita, rozproszonej wśród innych komórek nabłonkowych w natywnym tkance jelitowej. Jest to realizowane poprzez pobranie w pierwszej kolejności segmentu tkanki jelitowej o wymiarach 300 na 50 micron. Następnie, przy użyciu mikroskopii konfokalnej, pozyskiwane są optyczne stosy Z (Z-stacks) tego segmentu.Następnie dane z mikroskopii konfokalnej służą jako wskazówka do opracowania i obrazowania tkanki przy użyciu seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z czołem bloku, czyli SBEM. Na koniec dane SBEM są poddawane segmentacji w celu odwzorowania w 3D ultrastruktury konkretnej komórki sensorycznej jelita. Ostatecznie zastosowano korelacyjną mikroskopię konfokalną i seryjne skanowanie czoła bloku.Mikroskopia elektronowa jest wykorzystywana do obrazowania konkretnych komórek w ich natywnych tkankach oraz do ujawniania ich ultrastruktury w 3D. Metoda ta pozwala na znalezienie odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki, takie jak specyficzne oddziaływania międzykomórkowe, których nie można zwizualizować za pomocą mikroskopii świetlnej. Stosując tę metodę, opisaliśmy wcześniej ukrytą fizykochemiczną relację między sensorycznymi komórkami enteroendokrynnymi a enteroggl.Po wyizolowaniu okrężnicy myszy zgodnie z protokołem tekstowym, umieść ją w schłodzonym PBS i będąc w zanurzeniu, rozetnij tkankę wzdłuż krezki; przenieś tkankę do kilku kropel PBS na arkusz wosku dentystycznego i za pomocą skalpela wytnij około sześciu małych fragmentów tkanki z dystalnej części okrężnicy. Po przygotowaniu 5% niskotopiącej agarozy w PBS, użyj jej do zatopienia fragmentów tkanki w małym plastikowym pojemniku, takim jak standardowa forma do kriotomii Tissue Tech; zamocuj zatopione sekcje w mikrotomie z wibrującym ostrzem i wypełnij tackę z buforem lodowatym PBS. Następnie wytnij paski tkanki o grubości 300 micron przy amplitudzie 0,8 i prędkości 0,04 milimetrów na sekundę.Ułożyć paski tkanki o grubości 300 µm w rzędach i zamocować je na mikrotomie prostopadle do noża. Następnie paski tkanki należy pociąć na sekcje o grubości 50 µm, odnosząc się do protokołu tekstowego w celu uzyskania szczegółowych informacji, a następnie przechowywać bloki w PBS w temperaturze 4 °C. Po wykonaniu obrazowania bloków tkankowych za pomocą mikroskopii konfokalnej zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeprowadzić infiltrację i zatopienie sekcji tkankowych w żywicy.Wyjąć tkankę z PBS i wypłukać ją trzykrotnie buforem co coate 0,1 M przez pięć minut w każdym cyklu. Po przygotowaniu żywicy i zabarwieniu tkanek do mikroskopii elektronowej, zgodnie z protokołem tekstowym, umieścić bloki tkankowe pomiędzy szkiełkami przedmiotowymi utwardzonymi płynnym środkiem uwalniającym po uprzednim zatopieniu bloków tkankowych; utwardzać bloki na płasko przez kolejne 48 h w temperaturze 60°C. Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, rozdzielić szkiełka, aby uwolnić bloki, i dopasować orientację bloków tkankowych zatopionych w żywicy do orientacji na mikrografach konfokalnych.Aby ułatwić identyfikację obszarów zawierających interesujące komórki, zamocuj blok płasko na pinie zawierającym przewodzącą żywicę epoksydową i susz przez 30 minut. Następnie połóż blok płasko na powierzchni i susz przez noc w temperaturze 60 °C następnego dnia. Pokryj blok płynnym srebrem koloidalnym.Należy utrzymać przekroje tkankowe w pozycji płaskiej, aby zapewnić cięcie bloku pod odpowiednim kątem, co ułatwi korelację seryjnych obrazów powierzchni bloku z mikrografiami konfokalnymi. Po przeprowadzeniu skaningowej mikroskopii elektronowej zgodnie z protokołem tekstowym, przekonwertować obrazy SPEM z surowego formatu DM three na ośmiobitowe obrazy TIFF, stosując filtr rozmycia Gaussa o wartości 0,8 w programie Fiji. Przefiltrować obrazy TIFF.Zmniejsz zestaw danych do 25% oryginalnego rozmiaru i zapisz go jako stos TIFF, aby zminimalizować ilość pamięci RAM niezbędną do przetworzenia zestawu danych za pomocą wtyczki Fiji linear stack alignment with sift w trybie translation. Wyrównaj stos obrazów SPEM i użyj wtyczki crop 3D, aby je przyciąć. W celu wizualizacji danych użyj narzędzia surfaces w trybie draw oraz opcji contour w trybie draw z parametrem 50 milisekund, aby ręcznie wysegmentować i przeprowadzić rendering wolumetryczny wybranej komórki.Obrysuj kontury na każdym przekroju komórki, aby uzyskać gładsze renderowanie, lub co pięć przekrojów, aby przyspieszyć proces renderowania. Użyj narzędzia do migawek, aby wyeksportować końcowe obrazy w rozdzielczości 300 DPI lub wyższej, korzystając z myszy P-Y-Y-G-F-P. Wszystkie komórki enteroendokrynne dystalnej części jelita cienkiego są identyfikowane i przetwarzane w celu wykonania SBEM, jak pokazano tutaj.Wybrany fragment tkanki obrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu uzyskania obrazów typu Zack, które są optycznie rozmieszczone w odstępach jednego mikrona. Optymalizacja wymiarów bloków tkankowych jest kluczowa dla korelacji topograficznej między danymi z mikroskopii konfokalnej a danymi SBEM. Ten widok z renderowaniem wolumetrycznym komórki enteroendokrynnej w jelicie cienkim myszy pokazuje wyraźny neuropod rozciągający się pod komórkami nabłonka na odległość około 60 mikronów.Poprzez korelację konfokalnych stosów obrazów Z z obrazem SBEM całej powierzchni bloku, zidentyfikowano tutaj interesującą komórkę w bloku pobranym z dystalnego odcinka okrężnicy myszy A-P-Y-Y-G-F-P. Ważne jest, aby zachować orientację bloku tak płasko, jak to możliwe, aby dopasować plastry optyczne do obrazów SBEM. Po zidentyfikowaniu komórki przeprowadzono obrazowanie SBEM z rozdzielczością wystarczająco wysoką, aby zidentyfikować ziarnistości wydzielnicze oraz inne organelle komórkowe.Ten film zawiera rendering 3D komórki enteroendokrynnej. Zbiór danych składa się z 643 obrazów obejmujących 45 mikronów głębokości tkanki. Komórka zawiera neuropod wypełniony ziarnistościami wydzielniczymi oraz mikrokosmki.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu dokumentowania kompletnej ultrastruktury konkretnej komórki sensorycznej jelita, rozproszonej wśród innych komórek nabłonkowych w natywnym tkance jelitowej, wykorzystując fluorescencję jako wskazówkę do identyfikacji interesującej komórki lub komórek oraz przygotowania tkanki do seryjnej blokowej skaningowej mikroskopii elektronowej.

correlative-confocal-3d-electron-microscopy-specific-sensory

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Technikę CLEM dostosowano do analizy morfologii ultrastrukturalnej błon, organelli i struktur wewnątrzkomórkowych pod wpływem cząsteczek wstrzykniętych metodą mikroiniekcji. Metoda ta łączy zaawansowane techniki mikromanipulacji/mikroiniekcji, konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikroskopii elektronowej, co pozwala na uzyskanie rozdzielczości od milimetrów do wielu nanometrów. Technika ta znajduje zastosowanie w szerokim spektrum badań.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) jako narzędzie do wizualizacji cząsteczek wprowadzonych metodą mikroiniekcji oraz ich eukariotycznych celów wewnątrzkomórkowych

Weź stały odcinek tkanki korowej mózgu myszy z aksonami neuronalnymi i dendrytami. Dendryty posiadają wypukłości, znane jako kolce dendrytyczne, które tworzą synapsy z aksonami. Inkubuj tkankę z żelazocyjankiem osmu, który wiąże się z lipidami, a następnie ponownie zastosuj osm, który zwiększa kontrast strukturalny do obrazowania. Barwnik ze związkiem metalu ciężkiego, który wiąże się z makrocząsteczkami i zwiększa kontrast. Odwodnić za pomocą zwiększających się stężeń alkoholu do zatapiania...

Skaningowa mikroskopia elektronowa ze skupioną wiązką jonów do rekonstrukcji 3D neuronów połączonych synaptycznie

Źródło: Bagheri, M., et al. Protokół trójwymiarowej konfokalnej analizy morfometrycznej astrocytów. J. Vis. Exp. (2015).Ten film pokazuje obrazowanie fluorescencyjnie znakowanych astrocytów w części mózgu myszy przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Wycinek mózgu umieszcza się pod odpowiednią soczewką obiektywu i dobiera odpowiednie fluorofory i filtry. Po automatycznej optymalizacji ekspozycji, parametry skanowania są definiowane w celu zapewnienia obrazów 2D o wysokiej rozdzielczości. Parametry...

Trójwymiarowe obrazowanie astrocytów znakowanych immunologicznie za pomocą mikroskopii konfokalnej

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

Ten protokół opisuje niezbędne kroki do uzyskania wyników lokalizacji białek subkomórkowych na siatkówce danio pręgowanego poprzez korelację obrazów z superrozdzielczej mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

Przeciwciała, które wiążą się z docelowymi receptorami na powierzchni komórki, mogą powodować zmiany konformacji i grupowania. Te dynamiczne zmiany mają implikacje dla charakterystyki rozwoju leków w komórkach docelowych. Protokół ten wykorzystuje mikroskopię konfokalną i spektroskopię korelacji obrazów za pomocą ImageJ/FIJI w celu ilościowego określenia zakresu grupowania receptorów na powierzchni komórki.

Mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Poznaj metodę cocem3D łączącą mikroskopię konfokalną i elektronową do badania komórek czuciowych jelita. Technika ta pozwala wizualizować ultrastrukturę komórek enteroendokrynnych w ich naturalnym środowisku tkankowym.

Korelacyjna, konfokalna i trójwymiarowa mikroskopia elektronowa określonej komórki czuciowej

Przeglądaj więcej filmów