Korelacyjna, konfokalna i trójwymiarowa mikroskopia elektronowa określonej komórki czuciowej

Ogólnym celem tej procedury jest udokumentowanie pełnej ultrastruktury specyficznej komórki czuciowej jelita rozproszonej wśród innych komórek nabłonkowych w natywnej tkance jelitowej. Osiąga się to poprzez uprzednie uzyskanie segmentu tkanki o wymiarach 300 na 50 mikronów z jelita. Następnie uzyskuje się optyczne stosy Z segmentu za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Następnie dane konfokalne służą jako przewodnik do przetwarzania i obrazowania tkanki za pomocą mikroskopii elektronowej ze skaningiem szeregowym lub SBEM. Na koniec dane SBEM są segmentowane w celu odwzorowania ultrastruktury określonej komórki czujnika jelitowego w 3D. Ostatecznie korelacyjne mikroskopie konfokalne i skanowanie twarzy w bloku szeregowym.

Mikroskopia elektronowa służy do pokazania konkretnej komórki w jej natywnej tkance i ujawnienia jej ultrastruktury w 3D. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, takie jak specyficzne interakcje między komórkami, których nie można było zobrazować w inny sposób na poziomie mikroskopii świetlnej. Korzystając z tej metody, wcześniej informowaliśmy o ukrytym związku fizykochemicznym między sensorycznym wejściem do komórek endokrynowych a wejściem do ggl.

Po wyizolowaniu okrężnicy myszy, zgodnie z protokołem tekstowym, umieść ją w przyjemnym zimnym PBS i będąc zanurzonym, rozetnij tkankę wzdłuż mesentary, przenieś tkankę do kilku kropli PBS na arkuszu wosku dentystycznego i za pomocą skalpela przekłuj około sześciu małych segmentów tkanki z dystalnej okrężnicy. Po przygotowaniu 5% niskotopliwego aros w PBS, użyj go do osadzenia segmentów tkanek w małym plastikowym pojemniku, takim jak standardowa forma kriogeniczna tissue tech, zamontuj osadzone sekcje na mikrotomie z wibrującym ostrzem i użyj lodowatego PBS do napełnienia tacki buforowej. Następnie wytnij paski tkanki o grubości 300 mikronów przy amplitudzie 0,8 i prędkości 0,04 milimetra na sekundę.

Rozpiąć paski tkanki o grubości 300 mikronów w aros i zamontuj je na mikrotonie prostopadle do ostrza. Następnie wytnij paski tkanek o grubości 50 mikronów, odnosząc się do protokołu tekstowego w celu uzyskania szczegółowych informacji przed przechowywaniem bloków w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zobrazowaniu tkanki blokuje się za pomocą mikroskopii konfokalnej zgodnie z protokołem tekstowym w celu infiltracji i zatopienia skrawków tkanki w żywicy.

Usuń tkankę z PBS i użyj 0,1 molowego buforu co coate, aby przepłukać ją trzy razy przez pięć minut każdy. Po przygotowaniu żywicy i wybarwieniu tkanek do mikroskopii elektronowej, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj jej do umieszczenia bloków tkanek między szkiełkami utwardzonymi płynnym środkiem antyadhezyjnym po osadzeniu bloków tkankowych, utwardź je na płasko przez dodatkowe 48 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie rozsuń szkiełka, aby uwolnić bloki pod lunetą sekcyjną, dopasuj orientację bloków tkanek zatopionych w żywicy do orientacji mikrofotografii konfokalnych.

Aby ułatwić identyfikację obszarów zawierających interesujące komórki, zamontuj blok płasko na szpilce zawierającej przewodzącą żywicę epoksydową i wysusz przez 30 minut. Następnie połóż blok płasko na powierzchni i wysusz przez noc w temperaturze 60 stopni Celsjusza następnego dnia. Pokryj blok płynem ze srebra koloidalnego.

Utrzymuj skrawki tkanki płasko, aby zapewnić krojenie bloku pod odpowiednim kątem, aby ułatwić korelację powierzchni bloku szeregowego i mikrofotografii konfokalnych. Po przeprowadzeniu skaningowej mikroskopii elektronowej zgodnie z protokołem tekstowym, przekonwertuj obrazy SPEM z surowego formatu DM Three na ośmiobitowe obrazy TIFF przy użyciu filtra rozmycia 0,8 Gaussa na Fidżi. Filtruj obrazy TIFF.

Zmniejsz zestaw danych do 25% oryginalnego rozmiaru i zapisz go jako stos TIFF, aby zminimalizować ilość pamięci RAM niezbędnej do obsługi zestawu danych za pomocą liniowego wyrównania stosu wtyczki Fiji z przesiewaniem w trybie tłumaczenia. Wyrównaj stos obrazów SPEM i użyj wtyczki crop 3D, aby je przyciąć. Aby renderować dane, użyj narzędzia Powierzchnie w trybie rysowania i opcji konturu w trybie rysowania 50 milisekund, aby ręcznie segmentować i renderować objętość interesującej komórki.

Kontury śledzenia są wykonywane na każdym wycinku komórki, aby zapewnić płynniejsze renderowanie, lub co pięć warstw, aby zapewnić szybsze renderowanie. Użyj narzędzia migawki, aby wyeksportować końcowe obrazy w rozdzielczości 300 DPI lub większej za pomocą myszy P-Y-Y-G-F-P. Wszystkie komórki enteroendokrynne dystalnej części jelita cienkiego są identyfikowane i przetwarzane pod kątem SBEM, jak pokazano tutaj.

Wybrany segment tkanki zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu uzyskania obrazów Zacka, które są optycznie oddalone od siebie o jeden mikron. Optymalizacja wymiarów bloków tkankowych ma kluczowe znaczenie dla korelacji topograficznej między danymi konfokalnymi a danymi SBEM. Ten tom, renderowany widok komórki enteroendokrynnej w jelicie krętym myszy, pokazuje wyraźny neuro pod komórkami nabłonka o długości około 60 mikronów.

Poprzez skorelowanie konfokalnych stosów Z z obrazem SBEM całej powierzchni bloku, komórka będąca przedmiotem zainteresowania jest tutaj identyfikowana w bloku z dystalnej okrężnicy myszy A-P-Y-Y-G-F-P. Ważne jest, aby orientacja bloku była jak najbardziej płaska, aby pasowała do warstw optycznych na obrazach SBEM. Po zidentyfikowaniu komórki obrazowanie SBEM wykonuje się w rozdzielczości wystarczająco wysokiej, aby zidentyfikować błony wydzielnicze i inne organelle komórkowe.

Ten film zawiera renderowanie w 3D komórki enteroendokrynnej. Zestaw danych zawiera 643 obrazy, które obejmują 45 mikronów głębokości tkanki. Komórka zawiera neuro pod wypełniony wydzielniczymi les, a także mikrokosmkami.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak udokumentować pełną ultrastrukturę określonego jelita Komórka czuciowa jest rozproszona wśród innych komórek nabłonkowych w natywnej tkance jelitowej przy użyciu fluorescencji jako przewodnika do identyfikacji komórki lub komórek będących przedmiotem zainteresowania i przetworzenia tkanki do skaningowej mikroskopii elektronowej z szeregową fazą blokową.