Immunohistochemiczna wizualizacja aktywności neuronów hipokampa po uczeniu przestrzennym w mysim modelu zaburzeń neurorozwojowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie zmian w fosforylacji hipokampa irk po uczeniu się przestrzennym u dwóch myszy Grailed z nokautem jako modelu zaburzeń neurorozwojowych. Osiąga się to poprzez pierwsze przetestowanie zarówno dzikiego typu, jak i w Graalu dwóch myszy nokautujących w labiryncie wodnym Morrisa. W drugim kroku mózgi myszy są usuwane, a plastry myszy typu dzikiego i nokautowego są przygotowywane przez cięcie viome.

Następnie wycinki mózgu myszy typu dzikiego i z nokautem są przetwarzane do immunohistochemii i wykorzystywane do wykrywania zmian fosforylacji w hipokampie. Wyniki pokazują różnice w fosforylacji RC hipokampa między typem dzikim a myszami z nokautem Graala w oparciu o wizualizację barwienia immunohistochemicznego za pomocą mikroskopii świetlnej. Metoda ta pozwala zidentyfikować określone podzbiory neuronów hipokampa, które są aktywowane po specjalnym zadaniu uczenia się zależnym od hipokampa, takim jak labirynt wodny Maurice.

Po raz pierwszy dodaliśmy pomysł na tę metodę, gdy zdecydowaliśmy się zbadać kaskadę molekularną, która podkreśla deficyt molekularny u myszy z nokautem drugiego stopnia, mysim modelu zaburzeń ze spektrum autyzmu. Na początek trenuj myszy z różnych środowisk w zadaniu uczenia przestrzennego, takim jak Morris Water Mae. Postępuj zgodnie ze schematem treningowym opisanym w dołączonym protokole tekstowym pod koniec okresu treningowego, poddaj myszy eutanazji, a następnie napraw i usuń ich mózgi.

Gdy będziesz gotowy do kontynuowania zabiegu, użyj skalpela, aby usunąć móżdżek. Następnie przyklej resztę mózgu pionowo do płytki uchwytu vibrato. Pokrój mózg na szeregowe sekcje o grubości od 20 do 40 mikronów w całym grzbietowym hipokampie.

Przenieś każdą cząstkę do jednego dołka 24-dołkowej płytki wypełnionej jednym mililitrem 0,1 molowego PBS, przenieś od trzech do pięciu grzbietowych odcinków hipokampa dla każdej myszy do dołków 24-dołkowej płytki zawierającej 500 mikrolitrów 0,1 molowej PBS dla każdej. Dobrze umyć skrawki zawarte w każdej studzience 500 mikrolitrami 0,1 molowego PBS, wszystkie płukania i inkubacje wykonywać w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem, chyba że zaznaczono inaczej. Pod wyciągiem inkubować skrawki w 40% metanolu, 1% nadtlenku wodoru w 0,1 molowym PBS przez 20 minut w celu wygaszenia endogennej aktywności peroksydazy.

Po trzech kolejnych płukaniach w 0,1 molowym PBS przeczesuj sekcje, inkubując je w 500 mikrolitrach 0,2% Triton X 100 przez pięć minut, podczas gdy sekcje są inkubowane, przygotuj wystarczającą ilość bufora blokującego na cały eksperyment. Następnie usuń przepuszczalny roztwór i dodaj do każdego 100 mikrolitrów buforu blokującego. Dobrze inkubuj sekcje przez godzinę.

Następnie usuń bufor blokujący i przykryj skrawki fosforylowaną zewnątrzkomórkową regulowaną kinazą. Przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczono od jednego do 500 w buforze blokującym. Skrawki inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem następnego dnia po trzykrotnym umyciu skrawków w 0,1 molowym PBS przez pięć minut.

Każdy z nich inkubuje sekcje z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z biotyną, rozcieńczonym w stosunku 1 do 250 w buforze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej podczas inkubacji. Przygotuj odczynnik A BC co najmniej 30 minut przed użyciem, aby dać wystarczająco dużo czasu na uformowanie się kompleksu Aden i biotyny. Po trzykrotnym przemyciu skrawków 0,1-molowym PBS, dodać odczynnik A, b, C i pozostawić do inkubacji z próbką przez 45 minut.

Podczas następnej serii trzech płukań w PBS należy przygotować roztwór roboczy DAB w dygestorium zgodnie ze specyfikacją producenta, podawszy roztwór roboczy DAB na płytce. Następnie przenieś skrawki do studzienek zawierających roztwór roboczy DAB i powoli obracaj płytkę, aby umożliwić maksymalne wystawienie skrawków na działanie roztworu. Monitoruj reakcję DAB pod mikroskopem, aż do momentu powstania odpowiedniego sygnału.

Po około dwóch do pięciu minutach zatrzymaj reakcję przy pożądanej intensywności koloru, myjąc tkankę w 0,1 molowym PBS. Po trzech kolejnych praniach w PBS zamontuj sekcje na szkiełkach pokrytych żelatyną i susz je w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy do czterech godzin. Po wyschnięciu na powietrzu przenieś ślizgi w dygestoriach i odwodnij sekcje, sekwencyjnie umieszczając je w zintegrowanych roztworach etanolu na dwie minuty każda, a następnie wyczyść szkiełka w 100% ksylenie przez pięć minut.

Przykryj, wsuń szkiełka za pomocą medium montażowego i pozostaw je na noc w dygestoriach do wyschnięcia, przenieś szkiełka do mikroskopu jasnego pola, wyposażonego w kamerę i soczewkę obiektywową 20x. Uzyskaj wiele obrazów w jasnym polu z każdej sekcji w powiększeniu 200 razy, pokrywających obraz grzbietowego hipokampa. Trzy do pięciu sekcji od każdego zwierzęcia.

Pokazano tutaj sekcje z grzbietowych regionów campi hipopotama myszy typu dzikiego i myszy Grailed z dwoma nokautami wybarwionymi na potrzeby fosforylacji. Zewnątrzkomórkowy regulował wiarygodny odczyt molekularny zależnej od uczenia się aktywacji neuronów. Obie te myszy przeszły klasyczny schemat uczenia się przestrzennego zależny od hipokampa, labirynt wodny Morrisa przed złożeniem ich w ofierze.

W ostatnim dniu testów dwie myszy Grailed z nokautem wykazywały znaczny deficyt uczenia się przestrzennego w porównaniu z myszami typu dzikiego. Aby przeanalizować wycinki mózgu myszy, policzono całkowitą liczbę dodatnich komórek w różnych regionach hipokampa. W warstwie trzech parametrów CA myszy typu dzikiego miały znacznie więcej fosforylowanych komórek RK dodatnich na obszar niż u myszy z nokautem.

Odwrotne wyniki uzyskano w warstwie komórek hili i ziarnistości lub GCL. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać formułę fos na wycinkach mózgu z hipokampa zarówno genetycznych, jak i farmakologicznych mysich modeli zaburzeń neurorozwojowych charakteryzujących się deficytami poznawczymi. Technika ta może być również wykorzystana do badania zmian w formułowaniu siły irk w innych obszarach mózgu, a także do wykonywania zadań poznawczo-behawioralnych innych niż labirynt Maurice Water.

Nie zapominaj, że praca z benzyną DIA może być skrajnym dezerterem i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochronnych.