Łatwe i wydajne otrzymywanie trójskładnikowych glikopolimerów fluorescencyjnych za pomocą polimeryzacji kontrolowanej przez RAFT

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ściśle kontrolowana synteza fluorescencyjnych statystycznych liniowych glikopolimerów z wykorzystaniem polimeryzacji z odwracalnym przeniesieniem łańcucha (RAFT). Jest to realizowane poprzez wstępną syntezę glikomonomeru 2-laktobioetylo-metakryloamidu (L-A-E-M-A). W drugim kroku wykorzystuje się polimeryzację RAFT L-A-E-M-A, N-(2-aminoetylo)-metakryloamidu (AEMA) oraz N-(2-hydroksyetylo)-akryloamidu (HEAA) w celu syntezy odpowiadającego im glikopolimeru o niskiej dyspersyjności.

Następnie polimer glikowy jest modyfikowany w jednej z jego amin pierwszorzędowych poprzez reakcję z esterem karboksyfluoresceiny, aby otrzymać fluoresceinylowany polimer glikowy. Ostatnim krokiem jest związanie fluoresceinylowanego polimeru glikowego z kulkami agarozy powleczonymi lektyną o znanej specyficzności wiązania węglowodanów. Ostatecznie do analizy wiązania polimerów glikowych z kulkami agarozy wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną, co potwierdza, że polimer glikowy posiada interesujący nas węglowodan i jest znakowany znacznikiem fluorescencyjnym.

Zaletą polimeryzacji RAF w porównaniu z istniejącymi metodami wykorzystującymi konwencjonalną polimeryzację rodnikową jest to, że proces ten jest techniką polimeryzacji kontrolowanej, która minimalizuje liczbę łańcuchów pochodzących od inicjatora. Przynosi to polimery o określonej masie cząsteczkowej i bardzo wąskim rozkładzie polidyspersyjności. Polimeryzacje te można zastosować do zdefiniowanej mieszaniny monomerów w celu przygotowania specyficznych fluorescencyjnych glikopolimerów.

Glikopolimery te posiadają określone zdolności wiązania, które można zweryfikować przy użyciu kulek powlekanych lektynami. Wydajna synteza fluorescencyjnych glikopolimerów powinna mieć w przyszłości ogromną wartość dla badań z zakresu glikobiologii. Aby rozpocząć, należy rozpuścić 2 g kwasu laktobionowego w 3 mL bezwodnego metanolu.

Następnie powoli dodawaj absolutny etanol kroplami do roztworu, aż stanie się on lekko mętny. Użyj rotacyjnego odparowacza, aby usunąć wszystkie rozpuszczalniki. Powtórz ten proces trzy razy, aby uzyskać 1,94 grama lakto bioo one five laktonu z wydajnością 98%.

Do roztworu A EMA i MEHQ w 2 ml metanolu dodać roztwór 1 g laktobiolaktonu w 3 ml metanolu. Następnie dodać 1 ml trietyloaminy i mieszać mieszaninę w temperaturze pokojowej. Po 48 godzinach dodać do mieszaniny 20 ml wody dejonizowanej i przenieść ją do rotacyjnego odparowacza.

Odparowywać do całkowitego wyschnięcia. Pozostałość rozpuścić w 20 mililitrach wody dejonizowanej i nanieść roztwór na górną część kolumny wymiany anionowej o wymiarach 10 na 20 milimetrów. Pod wylotem umieścić zlewkę zawierającą jeden miligram MEHQ i przeprowadzić elucję z kolumny do zlewki.

Po odparowaniu roztworu w rotacyjnym ewaporatorze, rozpuścić pozostałość w 20 mililitrach wody dejonizowanej i dodać miligramowe porcje żywicy jonowymiennej. Procedurę powtarzać, aż test na obecność wody okaże się negatywny; testy te przeprowadza się poprzez pobranie 1 µL roztworu i naniesienie go na płytkę do cienkowarstwowej chromatografii. Płytkę spryskać 2% roztworem anidrygenu w etanolu i ogrzewać w temperaturze 90 °C przez jedną minutę na płycie grzejnej.

Punkt końcowy zostaje osiągnięty, gdy nie powstaje niebieski kolor. Następnie przefiltruj roztwór przez szklany lejek spiekany do probówki. Zamroź roztwór w temperaturze -80 °C, a następnie przenieś go do liofilizatora w celu przeprowadzenia liofilizacji.

Rozpuść pozostałość w minimalnej ilości metanolu, a następnie wytrąć produkt, dodając bezwodny aceton w temperaturze -20 °C. Zbierz wytrącone L-A-E-M-A poprzez filtrację za pomocą szklanego lejka spiekanego. Przenieś lejek wraz z osadem do eksykatora próżniowego w celu wysuszenia; najpierw dodaj około 0,5 g nanocząsteczek tlenku glinu o ziarnistości 150 mesh do 1 mL HEAA klasy handlowej w probówce o pojemności 2 mL.

Wirować probówkę przy przyspieszeniu 300 ×g przez 30 sekund, a następnie ostrożnie pobrać górną warstwę jako HEAA wolny od inhibitora. Rozpuścić 32,8 mg L-A-E-M-A, 1,7 mg a EMA, 27,5 µL HEAA wolnego od inhibitora oraz 0,4 mL wody dejonizowanej i przenieść roztwór do dokładnie oczyszczonej probówki typu flank o pojemności 1 mL. Następnie dodać do probówki 50 µL odczynnika RAFT oraz 50 µL odczynnika inicjującego i wymieszać, delikatnie opukując ściankę probówki przy zamkniętym zaworze. Podłączyć probówkę do linii próżniowej i zamrozić zawartość w kąpieli z suchego lodu i etanolu.

Następnie za pomocą pompy obniżcie ciśnienie w probówce do wartości zbliżonej do 50 millitorr i zamknijcie zawór. Usuńcie łaźnię z suchego lodu i pozwólcie zawartości odmarznąć. Powtórzcie cykl zamrażania, próżniowania i rozmrażania jeszcze dwa razy, zachowując ostrożność.

Sprawdzić probówkę, aby upewnić się, że zawartość jest całkowicie rozpuszczona, i w razie potrzeby delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex. Przed osadzeniem wyjąć zamkniętą probówkę z linii próżniowej i umieścić ją w przezroczystej plastikowej torbie próżniowej. Odessać powietrze z torby za pomocą plastikowej pompki ręcznej.

Następnie umieść worek w zakrytej łaźni wodnej w temperaturze 70 °C na 24 godziny. Potem wyjmij probówkę z worka i przelej jej zawartość do worka dializacyjnego o granicy odcięcia masy cząsteczkowej 3 500 Daltons. Umieść worek dializacyjny w zlewce i prowadź dializę przeciwko dwóm litrom wody dejonizowanej przez 24 godziny.

Przenieś zawartość worka do dializy do probówki i umieść ją w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Po zamrożeniu przenieś próbkę do liofilizatora i poddaj liofilizacji. Aby otrzymać puszysty, biały glikopolimer PMA LA EMA, przygotuj najpierw roztwór 5 mg PMA LA EMA w 0,9 ml PBS.

Następnie do szybko mieszanego roztworu powoli dodaj 0,6 mg karboksyfluoresceiny z eterem w 100 µL dimetyloformamidu, zamknij mikropprobówkę folią i mieszaj powoli przez 16 h w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś roztwór do worka dializacyjnego o progu odcięcia masy cząsteczkowej 3 500 Da. Umieść worek w zlewce i dializuj przeciwko 2 l wody dejonizowanej przez 16 h, chroniąc go przed światłem. Przenieś zawartość worka dializacyjnego do probówki.

Po zamrożeniu roztworu w temperaturze -80 °C należy poddać go liofilizacji. Aby otrzymać puszysty, żółty, znakowany fluorescencyjnie glikopolimer P-M-A-L-A-E-M-A, należy wyznaczyć średnią liczbową masę cząsteczkową, średnią wagową masę cząsteczkową oraz dyspersyjność glikopolimerów za pomocą systemu HPLC. W pierwszej kolejności do probówki wirówkowej zawierającej 50 µL zawiesiny kulek agarozy pokrytych galektyną erykrystyczną należy dodać 1,5 ml PBS.

Następnie wirować probówkę z prędkością 300 ×g przez jedną minutę. Potem odlać nadsącz i powtórzyć przemywanie jeszcze dwukrotnie, a na koniec dodać 0,5 mL PBS. Do probówki zawierającej koraliki pokryte lektyną dodać roztwór 3 µg PMA LA EMA znakowanego fluoresceinactive w 6 µL PBS.

Jako kontrolę negatywną należy wykorzystać P-M-A-G-A-E-M-A znakowany fluoresceiną. Następnie probówki należy owinąć folią aluminiową i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Probówkę wirujemy przez jedną minutę, a następnie odrzucamy nadsącz.

Następnie ponownie zawiesić kuleczki w 1,5 milliliters świeżego PBS i powtórzyć płukanie trzykrotnie. Na koniec ponownie zawiesić kuleczki w 0,2 milliliters PBS. Przenieść cztery µL zawiesiny kuleczek do dołka szkiełka do mikroskopii immunofluorescencyjnej i przykryć szkiełkiem podstawowym w celu rejestracji.

Obrazy preparatu wykonane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 10x, filtr FITC oraz kamerę. Glikopolimery przeanalizowano metodą chromatografii żelowej. Polimery syntetyzowane bez użycia RAFT charakteryzują się znacznie wyższą dyspersyjnością niż te otrzymane z wykorzystaniem RAFT.

Po oznakowaniu fluoresceiną wygląd fizyczny glikopolimeru zmienia się z białego na intensywny żółty kolor widoczny w świetle UV. Roztwór nieoznakowanego polimeru pozostaje ciemny, podczas gdy polimer oznakowany fluoresceiną świeci na jaskrawozielono, co potwierdza obecność znacznika; specyficzne wiązanie z koralikami powlekanymi lektyną zachodzi tylko w przypadku polimerów posiadających wiszące reszty cukrowe – koraliki świecą na zielono po związaniu, natomiast pozostają ciemne po potraktowaniu polimerami pozbawionymi wiszących reszt cukrowych. Ta technika polimeryzacji oparta na raft pozwala na dużą elastyczność w doborze typów syntetyzowanych glikopolimerów.

Kolejne znakowanie glikopolimerów można również przeprowadzić przy użyciu szerokiej gamy reagentów fluorescencyjnych, zdolnych do reagowania z aminami pierwszorzędowymi w środowisku wodnym. Badacze w dziedzinie glikobiologii mogą wykorzystać tę technikę do łatwego otrzymywania bardzo wszechstronnych i zdefiniowanych glikopolimerów. Glikopolimery te mogą służyć jako narzędzia do badania specyficzności wiązania węglowodanów, takich jak te obserwowane w drogach oddechowych pacjentów z mukowiscydozą lub tych zaangażowanych w wiele typów nowotworów u ludzi.