Łatwe i wydajne otrzymywanie trójskładnikowych glikopolimerów fluorescencyjnych za pomocą polimeryzacji kontrolowanej przez RAFT

Ogólnym celem tej procedury jest dobrze kontrolowana synteza fluorescencyjnych statystycznych liniowych polimerów glikopolimerowych przy użyciu odwracalnego fragmentowania addycji, przenoszenia łańcucha lub polimeryzacji tratwy. Osiąga się to poprzez pierwszą syntezę monomeru gliko, dwóch lakto-bio etylometamfetamidu, akrylamidu lub L-A-E-M-A. Drugim krokiem jest zastosowanie polimeryzacji tratwy L-A-E-M-A-N dwóch aminoetylometakryloamidu lub A EMA i N dwóch hydroksyetyloakryloamidu lub GAA w celu syntezy odpowiedniego polimeru glikologicznego o niskiej dyspersji.

Następnie polimer glikopolimeru jest modyfikowany na jednej z jego pierwszorzędowych amin w reakcji ze środkowym estrem karboksyfluoresceiny xito w celu wytworzenia fluoresceinowego polimeru glikologicznego. Ostatnim krokiem jest związanie natywnego polimeru glikopolimeru fluoresceiny z pokrytymi lektyną kulkami różowymi o znanej specyficzności wiązania węglowodanów. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna służy do analizy wiązania polimerów glikologicznych z powstałymi kulkami, potwierdzając, że polimer glikologiczny posiada interesujący go węglowodan i jest oznaczony znacznikiem fluorescencyjnym.

Przewagą polimeryzacji RAF nad istniejącymi metodami, które wykorzystują konwencjonalne polimeryzacje wolnorodnikowe, jest to, że proces gniewu jest techniką polimeryzacji kontrolnej, która minimalizuje liczbę łańcuchów pochodzących od inicjatora. W ten sposób powstają polimery o z góry określonej masie cząsteczkowej i bardzo wąskim stojaku na polidyspersję. Polimerizacje można stosować do określonej mieszaniny monomerów w celu wytworzenia określonych fluorescencyjnych polimerów glikopolimerowych.

Te polimery glikopolimerowe mają określone zdolności wiązania, które można zweryfikować za pomocą kulek pokrytych lektyną. Efektywne otrzymywanie fluorescencyjnych polimerów glikopolimerowych powinno w przyszłości okazać się bardzo cenne dla badań z zakresu biologii glikologicznej. Na początek rozpuść dwa gramy kwasu laktobionowego w trzech mililitrach bezwodnego metanolu.

Następnie powoli dodawaj kroplami absolutny etanol do roztworu, aż stanie się mętny. Użyj wyparki obrotowej, aby usunąć wszystkie rozpuszczalniki. Powtórz ten proces trzy razy, aby wyprodukować 1,94 grama laktonu lacto bioo one five lakton w 98% wydajności.

Dodać roztwór jednego grama lakto-biolaktonu w trzech mililitrach metanolu do roztworu A, EMA i MEHQ w dwóch mililitrach metanolu. Następnie dodaj jeden mililitr trietyloaminy i wymieszaj mieszaninę w temperaturze pokojowej. Po 48 godzinach dodaj do mieszaniny 20 mililitrów wody dejonizowanej i przenieś ją do wyparki obrotowej.

Odparować do całkowitego wyschnięcia. Rozpuść pozostałość w 20 mililitrach wody dejonizowanej i nałóż roztwór na wierzch kolumny anionowymiennej o wymiarach 10 na 20 milimetrów. Umieścić zlewkę zawierającą jeden miligram MEHQ pod wylotem i wymyć kolumnę do zlewki.

Po pobraniu roztworu w wyparce obrotowej rozpuść pozostałość w 20 mililitrach wody dejonizowanej i dodaj jedną miligramową porcję żywicy jonowymiennej. Dopóki test hydrantowy nie będzie negatywny, przeprowadza się go w próbach hydrantowych, usuwając jeden mikrolitr roztworu i nakładając go na płytkę chromatografii cienkowarstwowej. Spryskaj płytkę 2% roztworem anhy w etanolu i podgrzewaj w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez minutę na gorącej płycie.

Punkt końcowy został osiągnięty, gdy nie tworzy się żaden niebieski kolor. Następnie przefiltruj roztwór przez lejek ze spiekanego szkła do probówki. Zamrozić roztwór w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza, a następnie przenieść go do liofilizatora w celu wysuszenia.

Rozpuścić pozostałość w minimalnej ilości metanolu i wytrącić produkt, dodając minus 20 stopni Celsjusza i bezwodny aceton. Zebrać wytrącony L-A-E-M-A przez filtrację przez lejek ze spiekanego szkła. Przenieś lejek i wytrącić do próżniowego osuszacza w celu wysuszenia najpierw w 0,5 grama około 150 nanocząstek tlenku glinu o oczkach na jeden mililitr komercyjnego HEAA w dwumililitrowej probówce.

Odwirować probówkę o ciśnieniu 300 razy G przez 30 sekund i użyć górnej warstwy jako wolnego od inhibitorów HEAA, ostrożnie rozpuścić 32,8 miligrama L-A-E-M-A, 1,7 miligrama EMA i 27,5 mikrolitra wolnego od inhibitorów HEAA i 0,4 mililitra wody dejonizowanej i przenieść roztwór do dobrze oczyszczonej jednomililitrowej probówki bocznej. Następnie dodaj 50 mikrolitrów odczynnika tratwy i 50 mikrolitrów odczynnika inicjatora do probówki i wymieszaj, delikatnie stukając w bok probówki przy zamkniętym zaworze. Podłącz rurkę do przewodu próżniowego i zamroź zawartość za pomocą kąpieli etanolowej z suchym lodem.

Następnie zmniejsz ciśnienie w rurze, aby osiągnąć 50 militorów za pomocą pompy i zamknij zawór. Usunąć suchą łaźnię lodową i pozostawić zawartość do rozmrożenia. Powtórz cykl zamrażania, odkurzania i rozmrażania dwa razy ostrożniej.

Sprawdź probówkę, aby upewnić się, że zawartość jest całkowicie rozpuszczona i w razie potrzeby delikatnie przemieszaj. Przed posadzeniem wyjmij zamkniętą rurkę z przewodu próżniowego i umieść ją w przezroczystym plastikowym worku próżniowym. Opróżnij powietrze z worka za pomocą plastikowej pompki ręcznej.

Następnie umieść worek w przykrytej łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza na 24 godziny. Następnie wyjmij probówkę z worka i przenieś jej zawartość do worka do dializy z odciętą masą cząsteczkową 3 500 daltonów. Umieść worek do dializy w zlewce i dializuj w dwóch litrach wody dejonizowanej przez 24 godziny.

Przenieś zawartość worka dializacyjnego do probówki i umieść ją w zamrażarce w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po zamrożeniu przenieś do liofilizatora i liofilizuj. Aby uzyskać puszysty biały polimer glikotechniczny PMA LA EMA, najpierw przygotuj roztwór pięciu miligramów PMA LA EMA w 0,9 mililitra PBS.

Następnie powoli dodać 0,6 miligrama karboksyfluoresceiny cyny, środek eteru w 100, mikrolitrach dimetyloformamidu do szybko wymieszanego roztworu, mikroprobówki i folii i powoli mieszać przez 16 godzin w temperaturze pokojowej, przenieść roztwór do worka dializacyjnego z odciętą masą cząsteczkową 3 500 daltonów. Umieść worek w zlewce i dializ w dwóch litrach wody dejonizowanej przez 16 godzin, chroniąc go przed światłem. Przenieść zawartość worka dializacyjnego do probówki.

Po zamrożeniu roztworu w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza wyliofilizować na sucho. Aby uzyskać puszystą żółtą fluoryzację znakowaną P-M-A-L-A-E-M-A, polimer glikotechniczny, należy określić średnią liczbową masę cząsteczkową, wagę, średnią masę cząsteczkową i dyspersję polimerów glikologicznych za pomocą systemu HPLC. Najpierw od 1,5 mililitra PBS do 50 mikrolitrowej zawiesiny koralików aro pokrytych lektyną ery Krista galley w probówce wirówkowej.

Następnie odwirować probówkę o stężeniu 300 razy G przez jedną minutę. Następnie wyrzuć supernatant i powtórz pranie jeszcze dwa razy, zanim ostatecznie dodasz 0,5 mililitra PBS. Dodać roztwór trzech mikrogramów fluoresceiny znakowanej PMA LA EMA w sześciu mikrolitrach PBS do probówki zawierającej kulki pokryte lektyną.

Fluoresceinę oznaczoną P-M-A-G-A-E-M-A jako kontrolę ujemną. Następnie zawiń probówki w folię i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez godzinę. Odwirować probówkę przez jedną minutę i wyrzucić supernatant.

Następnie ponownie us, zawieś koraliki w 1,5 mililitra świeżego PBS i powtórz pranie trzy razy. Na koniec ponownie zawiesić kulki w 0,2 mililitra PBS Przenieś cztery mikrolitry zawieszonych kulek do studzienki mikroskopu immunofluorescencyjnego. Przesuń i przykryj szklanym rekordem na szkiełku nakrywkowym.

Obrazy szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w 10-krotny obiektyw z filtrem FITC i kamerą. Polimery glikopolimerowe analizowano metodą chromatografii żelowej. Polimery syntetyzowane bez użycia tratwy mają znacznie wyższą dyspersję niż te wytwarzane przy użyciu tratwy.

Po znakowaniu fluoresceiną fizyczny wygląd polimeru glikopolimeru zmienia się z białego na mocno żółty kolor widoczny w świetle UV. Roztwór nieznakowanego polimeru pozostaje ciemny, podczas gdy polimer znakowany fluoresceiną świeci Jasnozielony kolor potwierdzający obecność etykiety specyficzne wiązanie z kulkami pokrytymi lektyną występuje tylko w przypadku polimerów zawierających pozostałości cukru w wisiorku Koraliki świecą na zielono po związaniu, podczas gdy pozostają ciemne po potraktowaniu polimerami pozbawionymi reszt cukru w wisiorku. Ta technika polimeryzacji oparta na tratwie pozwala na dużą elastyczność w zakresie rodzaju polimerów gliko, które można zsyntetyzować.

Późniejsze znakowanie polimerów glikologicznych można również osiągnąć za pomocą szerokiej gamy odczynników fluorescencyjnych, zdolnych do reagowania ze środkami pierwotnymi w środowisku wodnym. Naukowcy zajmujący się biologią glikoterapii mogą wykorzystać tę technikę do łatwego uzyskania wysoce wszechstronnych i zdefiniowanych polimerów glikologicznych. Te glikopolimery mogą być wykorzystywane jako narzędzia do badania specyfiki wiązania węglowodanów, takich jak te obserwowane w torach oddechowych pacjentów z mukowiscydozą lub te zaangażowane w wiele rodzajów nowotworów u ludzi.