Name: Łatwe i wydajne otrzymywanie trójskładnikowych glikopolimerów fluorescencyjnych za pomocą polimeryzacji kontrolowanej przez RAFT (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Poznaj metodę syntezy fluorescencyjnych glikopolimerów z użyciem polimeryzacji RAFT. Protokół obejmuje przygotowanie glikomonomeru, kontrolowaną polimeryzację i modyfikację fluorescencyjną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Laboratoria Chemiczne Stacji Doświadczalnej Uniwersytetu Missouri oraz przez Stowarzyszenie Mukowiscydozy w Missouri.

1. Synteza 2-laktobionamidoetylometakryloamidu glikomonomeru
<ol>
	<li>Rozpuścić 2 g kwasu laktobionowego w 3,0 ml bezwodnego metanolu i powoli dodawać absolutny etanol w kroplach, aż roztwór stanie się mętny, a następnie usunąć rozpuszczalniki przez odparowanie rotacyjne.</li>
	<li>Rozpuścić pozostałość z kroku 1.1 w 3,0 ml bezwodnego metanolu i ponownie powoli dodawać absolutny etanol aż do zmętnienia, a następnie odparować rozpuszczalniki przez odparowanie rotacyjne. Powtórz ten krok 3 razy, aby uzyskać laktobiono-1,5-lakton (1,94 g, 98% wydajności). Produkt ten ma wystarczającą czystość, aby można go było stosować w następujących reakcjach.</li>
	<li>Dodać 1,0 g laktobionolaktonu w 3,0 ml metanolu do N-(2-aminoetylo)metakryloamidu (AEMA, 0,58 g) i hydrochinonu eteru monometylowego (MEHQ, 1,0 mg), inhibitora samopolimeryzacji, w 2,0 ml metanolu, a następnie 1,0 ml trietyloaminy. Mieszaj w RT przez 48 godzin.</li>
	<li>Dodać 20 ml dejonizowanegoH2O(dH2O) do kolby reakcyjnej, następnie usunąć metanol i wolną trietyloaminę przez odparowanie do sucha przez odparowanie rotacyjne.</li>
	<li>W celu usunięcia pozostałości kwasu laktobionowego dodać 20 ml dH2O, a następnie przepuścić roztwór wodny przez kolumnę anionowymienną (forma OH, 10 mm x 20 mm) do zlewki odbiorczej zawierającej 1,0 mg MEHQ.</li>
	<li>Usunąć trietyloaminę, wytworzoną w kroku 1.5, poprzez odparowanie do sucha w procesie odparowania rotacyjnego.</li>
	<li>Dodać 20 mldH2O i usunąć nieprzereagowaną AEMA, powoli dodając 1 mg porcji żywicy kationowymiennej (forma H+), aż do momentu, gdy nie będą wykrywalne żadne materiały reagujące z ninhydryną. Monitorować usuwanie, pobierając 1 μl podwielokrotności roztworu po dodaniu każdej żywicy, nakładając go na cienkowarstwową płytkę chromatograficzną, a następnie spryskując płytkę 2% ninhydryną w roztworze etanolu. Jeżeli nie zaobserwuje się rozwoju ciemnoniebieskiego koloru po podgrzaniu płytki do 90 °C przez 1 minutę, oznacza to, że osiągnięto punkt końcowy.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór przez lejek ze spiekanego szkła, przenieść filtrat do probówki, zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C, a następnie poddać liofilizowaniu.</li>
	<li>Usunąć MEHQ z próbki, rozpuszczając liofilizowany materiał w minimalnej ilości metanolu (~0,5 ml), a następnie dodać zimny bezwodny aceton (-20 °C, 15 ml) w celu wytrącenia produktu. Zebrać osad przez filtrację za pomocą lejka ze spiekanego szkła, a następnie wysuszyć osad w eksykatorze pod próżnią, aby otrzymać 2-laktobionamidoetylometakryloamid (LAEMA) w postaci białawego proszku (0,94 g, wydajność 68%). Produkt ten ma wystarczającą czystość, aby można go było stosować w następujących reakcjach.</li>
</ol>
2. Synteza monomeru 2-glukonamidoetylometakryloamidu
Uwaga: Przygotowanie 2-glukonamidoetylometakryloamidu (GAEMA), który nie posiada cukru wiszącego, zostało zaadaptowane z opublikowanej metody15.
<ol>
	<li>Dodać 2,0 g AEMA rozpuszczonego w 10 ml metanolu do roztworu D-glukonolaktonu (1,6 g) w 30 ml metanolu i mieszając, powoli dodawać 1,6 ml trietyloaminy.</li>
	<li>Mieszać reakcję w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.</li>
	<li>Przefiltrować wytrącony produkt za pomocą lejka ze spiekanego szkła i przepłukać osad trzykrotnie po 10 ml izopropanolu, a następnie przemyć 10 ml suchego acetonu. Wysuszyć wytrącony produkt w eksykatorze w próżni.</li>
</ol>
3. Synteza glikopolimeru RAFT
<ol>
	<li>Aby usunąć inhibitor MEHQ obecny w dostępnym na rynku N-(2-hydroksyetylo)akrylamidzie (HEAA), należy dodać 1 ml HEAA do probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml, a następnie dodać 0,5 g nanocząstek tlenku glinu. Odwirować probówkę o masie 300 x g przez 30 sekund i użyć górnej warstwy HEAA w następnej reakcji.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 32,8 mg LAEMA (70,0 μmol), 1,7 mg AEMA (10,5 μmol) i 27,5 μl HEAA (270 μmol), wszystkie rozpuszczone w 0,4 mldH2O, do dobrze oczyszczonej probówki Schlenka o pojemności 1 ml, o stosunku molowym monomeru 20:3:77.</li>
	<li>W reakcji równoległej, w celu wytworzenia polimerów kontrolnych, które nie zawierają cukru wiszącego, zamiast stosować LAEMA w kroku 3.2, należy zastąpić 21,4 mg GAEMA (70,0 μmol) w reakcji.</li>
	<li>Do odpowiedniej probówki Schlenka (tj. 3.2 lub 3.3) dodać kolejno 50 μl DMF zawierającego 0,53 mg (kwasu 4-cyjanopentanowego)-4-ditiobenzoesanu (1,9 μmol, czynnik RAFT) i 50 μl DMF zawierającego 250 μg 4,4′-azobis-(kwasu 4-cyjanowalerynowego) (0,9 μmol, inicjator). Delikatnie wymieszaj, stukając palcem.</li>
	<li>Zamrozić zawartość zawartą w probówce Schlenka za pomocą kąpieli suchy lód-etanol (75 g suchego lodu w 100 ml etanolu), zastosować podciśnienie z dokładnością do 10-50 mTorr, następnie zamknąć zawór Schlenka i pozwolić, aby roztwór powoli rozmroził się do RT. Powtórz ten cykl zamrażania-ewakuacji-rozmrażania jeszcze dwa razy. Upewnij się, że wszystkie odczynniki zostały rozpuszczone po ostatnim rozmrożeniu.</li>
	<li>Umieść rurkę Schlenk w zamykanej plastikowej torbie, spuść powietrze z worka, a następnie zamknij ją. Przenieść worek zawierający probówkę Schlenka do łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 70 °C i inkubować przez 24 godziny.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść roztwór z probówki Schlenka do przygotowanego worka do dializy (MWCO = 3 500) i dializować w stosunku dodH 2O (10 x 2 L) przez 24 godziny, zmieniającdH2O co godzinę przez pierwsze 8 godzin. Po dializie przenieść próbkę z rurki dializacyjnej do probówki, zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C, a następnie poddać ją liofilizacji.</li>
</ol>
Uwaga: Otrzymano wynikowe statystyczne kopolimery polimetakrylamidu/akrylamidu (PMA) zawierające wisiorek 4-O-β-D-galaktopiranozylo-D-glukonamid (laktobionamid) (z Kroku 3.2) lub D-glukonamid (z Kroku 3.3). Dla wygody dyskusji, te dwa glikopolimery są skracane odpowiednio jako PMA-LAEMA i PMA-GAEMA.
4. Modyfikacja glikopolimerów za pomocą fluoroforów
<ol>
	<li>Rozpuścić 5,0 mg glikopolimeru PMA-LAEMA lub PMA-GAEMA zawierającego ~0,9 μmola pierwszorzędowych aminowych grup funkcyjnych w 0,9 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, 0,1 M fosforan sodu, 0,15 M NaCl, pH 7,5).</li>
	<li>Powoli dodawać 0,6 mg estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny w 100 μl DMF do roztworów, szybko mieszając. Delikatnie mieszaj reakcje przez 16 godzin w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Chroniąc ją przed światłem, załadować próbkę do przygotowanego rurki do dializy (MWCO = 3 500) i dializować w stosunku dodH 2O (2 L) przez 16 godzin, zmieniając roztwór dializacyjny co godzinę przez pierwsze 8 godzin. Po dializie przenieść próbkę z rurki dializacyjnej do probówki, zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C, a następnie poddać ją liofilizacji.</li>
</ol>
Uwaga: Po liofilizacji otrzymuje się fluorescencyjne glikopolimery PMA-LAEMA-Fluoresceina i PMA-GAEMA-Fluoresceina, odpowiednio.
5. Charakterystyka glikopolimerów
<ol>
	<li>Oznaczyć średnią liczbową masę cząsteczkową (Mn), średnią wagowo masę cząsteczkową (Mw) i dyspersję (Mw/Mn) glikopolimerów w komercyjnym systemie HPLC wyposażonym w oprogramowanie do chromatografii żelowej (GPC), kolumnę GPC odpowiednią do masy cząsteczkowej będącej przedmiotem zainteresowania oraz detektor indeksu refrakcji, używając 0,1 M Tris/0,1 M buforu chlorku sodu (pH 7) jako eluentu o natężeniu przepływu 0,6 ml/min14. Jako wzorce masy cząsteczkowej należy stosować wzorce glikolu polietylenowego (MW: 200-1 200 000 g/mol).</li>
	<li>Określić ilościowo rzeczywiste stężenia pierwszorzędowych aminowych grup funkcyjnych w glikopolimerach16. Przeanalizować całkowitą zawartość węglowodanów w zsyntetyzowanych glikopolimerach zgodnie z opublikowaną metodą17.</li>
	<li>Wykonać badania składu strukturalnego i czystości glikomonomerów LAEMA, GAEMA i glikopolimerów PMA-LAEMA, PMA-GAEMA wD2Ometodą spektroskopii NMR14.</li>
</ol>
6. Testy wiązania syntetycznych glikopolimerów z kulkami agarozowymi pokrytymi lektyną
<ol>
	<li>Dodać 1,5 ml PBS do 50 μl zawiesiny kulek agarozowych pokrytych lektyną Erythrina crista-galli (ECL), odwirować przy 300 x g przez 1 minutę, a następnie ostrożnie usunąć i usunąć sklarowany osad. Powtórz ten krok dwukrotnie, a następnie ponownie zawieś kulki w 0,5 ml PBS.</li>
	<li>Dodać 3 μg PMA-LAEMA-Fluoresceiny lub PMA-GAEMA-Fluoresceiny (kontrola ujemna) w 6 μl PBS do zawiesiny kulek i inkubować mieszaniny, w ciemności, w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj mieszaniny trzykrotnie 1,5 ml PBS i ponownie zawieś kulki w 0,2 ml PBS. Załadować podwielokrotność (4 μl) do studzienki na szkiełku mikroskopu immunofluorescencyjnego (pokrytym teflonem), przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu filtra FITC (długość fali wzbudzenia: 467-498 nm, długość fali emisji: 513-566 nm) i obiektywu 10X, aby zbadać wiązanie fluorescencyjnych glikopolimerów z kulkami14.</li>
</ol>

<ol><li>Scharfman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+binds+to+neoglycoconjugates+bearing+mucin+carbohydrate+determinants+and+predominantly+to+sialyl-Lewis+x+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates.</a> Glycobiology. 9 (8), 757-764 (1999).</li>
<li>Song, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeting+of+alveolar+macrophages+via+RAFT-based+glycopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers.</a> Biomaterials. 33 (28), 6889-6897 (2012).</li>
<li>Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolfenden%2C+ML+%22Carbohydrate+Recognition%3A+Biological+Problems%2C+Methods%2C+and+Applications%22">Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications</a>. Wang, B., Boons, G. .-J. , John Wiley, & Sons, Inc., Chapter. 349-370 (2011).</li>
<li>Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radical+addition-fragmentation+chemistry+in+polymer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis.</a> Polymer. 49 (5), 1079-1131 (2007).</li>
<li>Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+synthesis+of+well-defined+glycopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polym.+Sci.%2C+Part+A%3A+Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers.</a> J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45 (11), 2059-2072 (2007).</li>
<li>Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+various+glycopolymer+architectures+via+RAFT+polymerization%3A+From+block+copolymers+to+stars%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars.</a> Biomacromolecules. 7 (1), 232-238 (2006).</li>
<li>Bulmus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAFT+polymerization+mediated+bioconjugation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies.</a> Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).</li>
<li>Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+glycopolymers+and+their+multivalent+recognitions+with+lectins%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins.</a> Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).</li>
<li>Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+glycopolymers+by+controlled+radical+polymerization+techniques+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications.</a> Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).</li>
<li>Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+glyco-functionalized+quantum+dots%3A+Synthesis%2C+characterization%2C+and+cytotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies.</a> Bioconjugate Chem. 20 (5), 994-1001 (2009).</li>
<li>Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-defined+galactose-containing+multi-functional+copolymers+and+glyconanoparticles+for+biomolecular+recognition+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes.</a> Macromolecules. 42 (17), 6393-6405 (2009).</li>
<li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+N-2-hydroxypropyl+methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl+methacrylamide+block+copolymers+as+hepatocyte-targeting+gene+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers.</a> Bioconjugate Chem. 22 (8), 1503-1512 (2011).</li>
<li>Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+RAFT+polymerization+of+N-acryloylmorpholine%2C+synthesis+of+an+ABA+triblock+glycopolymer+and+study+of+its+self-association+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior.</a> Macromol. Chem. Phys. 213 (17), 1768-1782 (2012).</li>
<li>Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAFT-based+tri-component+fluorescent+glycopolymers%3A+synthesis%2C+characterization+and+application+in+lectin-mediated+bacterial+binding+study%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study.</a> Glycoconj. J. 31 (2), 133-143 (2014).</li>
<li>Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+well-defined+glycopolymers+synthesized+via+the+reversible+addition+fragmentation+chain+transfer+process+in+aqueous+media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polymer+Sci.+Part+A%3A+Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media.</a> J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47 (2), 614-627 (2009).</li>
<li>Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+primary+amine+groups+available+for+subsequent+biofunctionalization+of+polymer+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces.</a> Bioconjugate Chem. 22 (8), 1690-1699 (2011).</li>
<li>Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFox%2C+A+%22Analysis+of+Carbohydrates+by+GLC+and+MS%22">Analysis of Carbohydrates by GLC and MS</a>. , CRC Press. 87-170 (1989).</li>
<li>Thomas, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+molecular+weight+control+of+the+polymerization+of+acrylamide+via+RAFT%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT.</a> Macromolecules. 37 (24), 8941-8950 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym raporcie przedstawiono łatwy i skuteczny protokół dla trójskładnikowych fluorescencyjnych glikopolimerów na bazie tratwy, z węglowodanami w wisiorku i bez niego, oraz ich zastosowanie w teście wiązania lektyny. Protokół rozpoczyna się od przygotowania glikomonomerów LAEMA i GAEMA. Poprzez jednoetapową kopolimeryzację sterowaną tratwą uzyskuje się glikopolimery o powtarzalnej wydajności, przewidywalnym składzie monomerów i niskiej dyspersji. Po późniejszej modyfikacji glikopolimerów estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny, wiązanie otrzymanego odpowiedniego glikopolimeru znakowanego fluorescencyjnie można łatwo przetestować pod kątem jego specyficzności wiązania lektyny.
W początkowych etapach preparatywnych glikomonomerów, które mają być wykorzystane w kolejnych syntezach glikopolimerów, wykorzystano łatwo dostępny kwas laktobionowy i glukonolakton. Teoretycznie wszelkie interesujące nas węglowodany, od cukrów prostych po złożone oligosacharydy, mogą zostać przekształcone w glikomonomery poprzez sprzężenie docelowego cukru z pierwszorzędową grupą hydroksylową na C6 glukozy. Po utlenieniu reszty glukozy redukującej, a następnie jej odwodnieniu do laktonu, produkt może być następnie łatwo poddany reakcji z aminą pierwszorzędową na AEMA, tworząc odpowiedni glikomonomer. Dalsze przykłady tej trasy można znaleźć w niedawnym raporcie14. Należy zauważyć, że przed rozpoczęciem jakiegokolwiek etapu polimeryzacji, MEHQ, silny inhibitor polimeryzacji, musi zostać usunięty ze wszystkich preparatów monomerów i glikomonomerów tuż przed użyciem. Można to łatwo osiągnąć poprzez użycie minimalnej ilości metanolu do rozpuszczenia glikomonomeru, który posiada MEHQ, a następnie natychmiastowe potraktowanie go acetonem w temperaturze -20 °C w celu wytrącenia produktu wolnego od inhibitorów z wysoką wydajnością.
Niezbędne w każdym schemacie polimeryzacji rodnikowej jest podkreślenie dbałości o szczegóły i czystość monomerów. Jak to jest typowe dla systemu polimeryzacji RAFT, składa się on ze źródła rodnika, odczynnika RAFT, monomeru i rozpuszczalnika. W tej wizualizacji opisano jednoetapowy system polimeryzacji RAFT, który koncentruje się na wytwarzaniu statystycznych kopolimerów generowanych z mieszaniny reakcyjnej zawierającej trzy różne monomery w roztworze wodnym. Przedstawiono dwie oddzielne reakcje, w których pośredniczy RAFT, w jednej wykorzystuje się glikomonomer, który posiada wiszący, nieredukujący koniec węglowodanowy (tj. β-D-galaktozę), a drugi zawiera poliol bez związanej reszty węglowodanowej. Wspólne dla obu reakcji za pośrednictwem RAFT były monomery posiadające pojedynczą grupę hydroksylową, która służy jako cząsteczka dystansowa, oraz inne posiadające wolną aminę do późniejszej modyfikacji za pomocą amino-reaktywnego fluoroforu.
Ponieważ obecność tlenu w mieszaninie reakcyjnej i środowisku jest szkodliwa dla polimeryzacji za pośrednictwem RAFT, jego usunięcie do śladowych ilości można łatwo osiągnąć poprzez kilka cykli zamrażania-ewakuacji-rozmrażania, utrzymując naczynie reakcyjne rurki Schlenka w wysokiej próżni.
Należy zauważyć, że stosunek molowy różnych monomerów w reakcji można dostosować w razie potrzeby. Ponadto, zmieniając ilość użytego środka RAFT, można kontrolować długość powstałych polimerów18. Jednak stosunek molowy środka RAFT do inicjatora powinien być zawsze większy niż dwa, aby zapewnić niską dyspersję produktu. W tych warunkach ewolucja kopolimeryzacji jest stabilna, a powtarzalność reakcji jest bardzo wysoka. Biorąc to pod uwagę, jest mało prawdopodobne, aby uzyskać całkowicie równomierny rozkład wszystkich uczestniczących monomerów w statystycznym kopolimerze, ze względu na ich różne prędkości polimeryzacji. Scharakteryzowanie rozkładu różnych monomerów w polimerze jest nadal bardzo trudne.
Przedstawiona tutaj metoda po modyfikacji jest zarówno prostsza, jak i bardziej podatna na zastosowanie szerszego wyboru znaczników fluorescencyjnych w porównaniu z innymi protokołami stosowanymi do znakowania glikopolimerów2,11. Obejmuje to wiele rozpuszczalnych w wodzie fluoroforów reagujących z aminami, kropek kwantowych, biotyn i innych. Specyfika wiązania zsyntetyzowanych, znakowanych glikopolimerów jest łatwa do zweryfikowania przy użyciu lektyn o znanym powinowactwie wiązania. PMA-GAEMA nie zawierający cukru w układzie macierzystym stanowi odpowiednią kontrolę negatywną. Glikopolimery o różnych znacznikach fluorescencyjnych otrzymane tą drogą zostały z powodzeniem wykorzystane w badaniach wiązania bakteryjnego za pośrednictwem lektyny14. Jak pokazano, to łatwe i wydajne przygotowanie statystycznych glikopolimerów fluorescencyjnych powinno zapewnić ogromny potencjał dla szerokiej gamy badań glikobiologicznych.

W ciągu ostatnich dwóch dekad, badania nad syntetycznymi glikopolimerami były powolne, ale ciągłe rozwijane, wykazując znaczny potencjał w badaniu mechanizmów zakaźnych, w tym badania koncentrujące się na procesach rozpoznawania lektyn1-3. Ponieważ syntetyczne glikopolimery zawierające wielowartościowe ugrupowania cukrowe wykazują znacznie wyższą skuteczność wiązania lektyn w porównaniu z węglowodanami jednowartościowymi, są one bardzo poszukiwane w dziedzinie glikobiologii3. Szczególnie interesujące w badaniach klinicznych jest zastosowanie glikopolimerów fluorescencyjnych do scharakteryzowania wiązania bakteryjnego za pośrednictwem lektyny z węglowodanami dostępnymi na powierzchni ludzkich komórek oddechowych i glikoproteinami śluzówki. We wczesnych badaniach in vitro wykorzystano dostępne na rynku glikopolimery na bazie poliakrylamidu w testach wiązania bakteryjnego. Kilka z tych sond wykazało obiecujące wyniki, ale wzbudziło obawy dotyczące możliwości uzyskania i różnic między partiami zarówno w masie cząsteczkowej polimeru, jak i zawartości glikoepitopu. Opracowano ekonomiczny protokół laboratoryjny, który zapewniłby zadowalającą kontrolę struktury, wielkości i czystości syntetycznych glikopolimerów przeznaczonych do lektyn bakteryjnych.
W poszukiwaniu odpowiedniego podejścia do syntezy glikopolimerów, przetestowano stosunkowo nową technikę polimeryzacji przy użyciu typu kontrolowanej polimeryzacji rodnikowej, która wykorzystywała odwracalne środki do przenoszenia łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT)4. Takie odczynniki RAFT są ostatnio stosowane w kilku preparatach glikopolimerowych5-7. W porównaniu z innymi protokołami przygotowania glikopolimerów, polimeryzacja za pośrednictwem raft wykazuje kilka zalet, w tym tolerancję na różne struktury monomerów i warunki reakcji, potencjalną kompatybilność z roztworami wodnymi oraz niską dyspersję pożądanych produktów polimerowych8,9. Na uwagę zasługują protokoły otrzymywania trójskładnikowych glikopolimerów na bazie tratwy, pozwalające na kontrolę składu różnych monomerów, z których każdy może pełnić odrębne funkcje10-13. Jednak większość wcześniejszych przedsięwzięć badawczych albo nie zawierała anomerycznych węglowodanów wiszących10, albo wykorzystywała polimeryzacje stopniowane, w wyniku których powstały kopolimery trójblokowe, które składają się z kowalencyjnie połączonych homopolimerów, które często służą innym celom niż polimery statystyczne, które są kopolimerami, w których sekwencja reszt monomerów jest zgodna z regułą statystyczną9-13.
Niedawno, stosując tiokarbonylotiotio-raft (kwas 4-cyjanopentanowy)-4-ditiobenzoesan w środowisku wodnym, zgłoszono przygotowanie grupy liniowych trójskładnikowych statystycznych glikopolimerów na bazie RAFT zawierających określone cukry wiszące i ich zastosowanie w testach wiązania bakteryjnego za pośrednictwem lektyny14. Ogólnym celem tej metody, przedstawionym w sposób wizualny, jest otrzymanie trójskładnikowych statystycznych glikopolimerów fluorescencyjnych poprzez kopolimeryzację sterowaną RAFT. Ze względu na łatwość jednoetapowego protokołu polimeryzacji, precyzyjną kontrolę nad długością i składem polimeru oraz wysoką odtwarzalność reakcji, protokół ten można łatwo zastosować do innych syntez glikopolimerów opartych na tratwie o pożądanych strukturach.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>odczynnik</td></tr><tr><td>Kwas laktobionowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukonolakton&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2164</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-hydroksyetylo)akryloamid (HEAA)Sól</td> sodowa <td>Sigma-Aldrich</td><td>697931</td><td></td></tr><tr><td>Orange II Eter monometylowy</td><td>hydrochinonu Sigma-Aldrich</td><td>O8126</td><td></td></tr> (<tr><td>MEHQ)</td><td>Inhibitor polimeryzacji</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>54050</td></tr><tr><td>N-(2-aminoetylo)metakryloamidu chlorowodorek (AEMA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24833-5</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-616</td><td></td></tr><tr><td>Żywica anionowymienna IRN-78 w postaci wodorotlenku, 80 mesh</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10343-U</td><td></td></tr><tr><td>Żywica kationowymienna 50Wx8, 200 mesh</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>217514</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek glinu, ~150 oczek&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1522</td><td>Typ WN-6, Neutralny, Klasa aktywności Super I</td></tr><tr><td>Ninhydrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4876</td><td>W teście użyto roztworu etanolu 0,2% ninhydryny Kwas</td></tr><tr><td>4-cyjano-4-(fenylokarbomatioltio)pentanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>722995</td><td>Środek RAFT</td></tr><tr><td>4,4&prime;-Azobis(kwas 4-cyjanolerynowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11588</td><td>Inicjator polimeryzacji</td></tr><tr><td>Ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Koralik agarozowy pokryty lektyną Erythrina Cristagalli</td><td>Vector Laboratories</td><td>AL-1143&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solvent</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>Produkowane przez system oczyszczania wody Barnstead, 18 megOhm-cm</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461-4</td><td>klasa ACS lub lepsza</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>ACS lub lepszy</td></tr> Absolutny <tr><td>etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td>ACS klasa lub lepsza</td></tr><tr><td>Dimetyloformamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705</td><td>Klasa ACS lub lepsza</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>ACS klasa lub lepsza</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>membrana do dializy (MWCO: 3,500)</td><td>Spectrum Labs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy standard analityczny glikolu polietylenowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ø2393</td><td></td></tr><tr><td>Probówka Schlenka, 1 ml</td> Szkło <td></td><td></td><td>twarogowe</td></tr><tr><td>Dostosowane TSK-GEL G4000 PWxl&nbsp;</td><td>Tosoh Bioscience&nbsp;</td><td>8022</td><td>Używany do analizy GPC glikopolimerów</td></tr><tr><td>Empower 3 z pakietem GPC/SEC</td> System HPLC <td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Alliance&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td>Wyposażony w detektor indeksu refrakcji (Waters 2414) i detektor fluorescencji (Waters 2475)</td></tr> <tr><td>Spektrometr NMR Avance III 800 MHz</td> Mikroskop fluorescencyjny <td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX43</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Używany z filtrem FITC w teście wiązania glikopolimeru</td></tr><tr><td>Rotavap / Parownik Rotoevapor</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fritted lejek dyskowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-109</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopu immunofluorescencyjnego</td><td>Polysciences</td><td>18357-1</td><td></td></tr><tr><td>Revco Ultima Plus -80&nbsp; &#176; C Zamrażarka</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy worek próżniowy i pompka ręczna</td><td>Pompa próżniowa Ziploc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, napęd bezpośredni, wakuometr Maxima C Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sargent-Welch</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Łatwe i wydajne otrzymywanie trójskładnikowych glikopolimerów fluorescencyjnych za pomocą polimeryzacji kontrolowanej przez raft

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

Syntetyczne glikopolimery są instrumentalnymi i wszechstronnymi narzędziami używanymi w różnych dziedzinach badań biochemicznych i biomedycznych. Przedstawiono przykład łatwej i wydajnej syntezy dobrze kontrolowanych fluorescencyjnych statystycznych glikopolimerów przy użyciu odwracalnej polimeryzacji opartej na przenoszeniu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT). Syntezę rozpoczyna się od otrzymania glikomonomeru 2-laktobionamidoetylometakryloamidu zawierającego β-galaktozę, otrzymanego w reakcji laktobionolaktonu i N-(2-aminoetylo)metakryloamidu (AEMA). 2-glukonamidoetylometakryloamid (GAEMA) jest stosowany jako analog strukturalny pozbawiony końcowego β-galaktozydu. Poniższa reakcja kopolimeryzacji, w której pośredniczy RAFT, obejmuje trzy różne monomery: N-(2-hydroksyetylo)akryloamid jako przekładkę, AEMA jako cel do dalszego znakowania fluorescencyjnego oraz glikomonomery. Tolerancyjny na układy wodne, środkiem RAFT stosowanym w reakcji jest (kwas 4-cyjanopentanowy)-4-ditiobenzoesan. Wśród produktów zaobserwowano niskie dyspersje (≤1,32), przewidywalne składy kopolimerów oraz wysoką powtarzalność polimeryzacji. Polimery fluorescencyjne otrzymuje się przez modyfikację glikopolimerów estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny ukierunkowanym na pierwszorzędowe aminowe grupy funkcyjne na AEMA. Specyficzność wiązania lektyn otrzymanych glikopolimerów jest weryfikowana poprzez testowanie z odpowiednimi kulkami agarozowymi pokrytymi specyficznymi lektynami rozpoznającymi glikoepitopy. Ze względu na łatwość syntezy, ścisłą kontrolę składu produktu i dobrą powtarzalność reakcji, protokół ten można przełożyć na przygotowanie innych glikopolimerów na bazie RAFT o określonych strukturach i składach, zgodnie z potrzebami.

Synteza glikomonomeru
W niniejszej pracy kwas laktobionowy posłużył jako przykład do otrzymania glikomonomerów. Stosując metody opisane w pierwotnym raporcie dotyczącym syntezy LAEMA11, zaobserwowano zmienne wydajności preparatyki przy niezadowalającej czystości. Zmodyfikowana metoda oczyszczania z wykorzystaniem jonitów kationowych i anionowych do usunięcia nieprzereagowanego substratu pozwoliła uzyskać stabilną wydajność produktu oraz wysoką czystość, co potwierdzono za pomocą spektroskopii NMR 1H i 13C (Rysunek 1).
Synteza glikopolimerów metodą RAFT i post-modyfikacja glikopolimerów fluoroforami
W przeciwieństwie do glikopolimerów blokowych przygotowanych poprzez stopniową polimeryzację RAFT, ten jednowykrokowy protokół kopolimeryzacji zapewnia jednorodny rozkład glikomonomeru w całym szkielecie polimeru. Przedstawione tutaj glikopolimery zawierają 20 mol% glikomonomeru, 77 mol% HEAA jako łącznika oraz 3 mol% AEMA jako punkt docelowy dla późniejszych modyfikacji (patrz Rysunek 2). Spektroskopia 1H- i 13C-NMR potwierdziła struktury PMA-LAEMA i PMA-GAEMA (Rysunki 3 i 4). Jak pokazano na Rysunku 5, po zestawieniu z profilami elucji GPC glikopolimeru zsyntetyzowanego bez RAFT, zarówno PMA-LAEMA, jak i PMA-GAEMA wykazują niskie dyspersyjności, co dowodzi skuteczności metody RAFT. Zgodnie z oczekiwaniami, PMA-GAEMA posiada mniejszą wartość Mn niż PMA-LAEMA ze względu na brak bocznego cukru w PMA-GAEMA. Analiza zawartości węglowodanów i grup funkcyjnych amin pierwszorzędowych w glikopolimerach RAFT wykazała, że stosunek monomerów w otrzymanych glikopolimerach jest zgodny ze stosunkiem stechiometrycznym monomerów wyjściowych zastosowanych w reakcji polimeryzacji prowadzonej za pomocą RAFT (Tabela 1). Oznacza to ścisłą kontrolę składu monomerowego w zsyntetyzowanych glikopolimerach, zgodnie z założeniami.
Reakcja grup funkcyjnych amin pierwszorzędowych z aktywowanymi fluoroforami jest powszechnie stosowaną techniką znakowania białek. Technikę tę zastosowano tutaj do znakowania oczyszczonych glikopolimerów karboksyfluoresceiną. W wyniku modyfikacji otrzymano polimery fluorescencyjne (Rysunek 6). Analiza GPC nie wykazała degradacji polimerów znakowanych fluoresceiną w trakcie reakcji (dane nie zostały przedstawione).
Testy wiązania syntetycznych glikopolimerów z kuleczkami agarozowymi powlekanymi lektynami
W celu oceny specyficzności wiązania lektynowego syntetyzowanych glikopolimerów wykorzystano kulki agarozowe powlekane lektynami o znanej specyficzności wiązania węglowodanów. Lektyna z Erythrina crista-galli (ECL), zastosowana w eksperymentach, wykazuje specyficzność wiązania wobec β-D-galaktozydu. Rycina 7A wyraźnie pokazuje, że PMA-LAEMA-Fluoresceina, zawierająca β-D-galaktozyd jako węglowodan boczny, wykazała silne wiązanie z lektyną ECL. Z kolei na Rycynie 7B przedstawiono brak wiązania z ECL w przypadku glikopolimeru PMA-GAEMA-Fluoresceina, który nie posiada cukru bocznego. Wynik ten egzemplifikuje efektywność wiązania i powinowactwo syntetyzowanego fluorescencyjnego glikopolimeru.
<img alt="Widmo NMR, 1H i 13C, ustalenie struktury, przesunięcia chemiczne, schemat analizy cząsteczkowej." src="/files/ftp_upload/52922/52922fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przypisane 1H- (a) oraz 13C-NMR (b) widma (D2O) dla LAEMA. (Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Wang et al.14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig1large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat procesu syntezy chemicznej z reakcją polimeryzacji i strukturą fluoresceiny." src="/files/ftp_upload/52922/52922fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schematyczna ilustracja syntezy fluorescencyjnego glikopolimeru PMA-LAEMA zawierającego β-galaktozyd jako cukier boczny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat spektroskopii NMR dla analizy struktury cząsteczkowej, przedstawiający przesunięcia chemiczne w ppm." src="/files/ftp_upload/52922/52922fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przypisane 1H- (A) i 13C-NMR (B) widma (D2O) dla glikopolimeru PMA-LAEMA. (Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Wang et al.14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki spektroskopii NMR; analiza struktury chemicznej; widma NMR protonów i węgla; identyfikacja cząsteczkowa." src="/files/ftp_upload/52922/52922fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Przypisane widma 1H-NMR (A) oraz 13C-NMR (B) (D2O) dla PMA-GAEMA. (Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Wang et al.14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres chromatograficzny przedstawiający czas retencji polimeru wraz z analizą rozkładu masy cząsteczkowej." src="/files/ftp_upload/52922/52922fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Przebiegi chromatografii przenikania żelu dla PMA-GAEMA oraz PMA-LAEMA otrzymanych metodą RAFT, a także ich odpowiedników przygotowanych bez użycia czynnika RAFT.W przeciwieństwie do PMA-LAEMA przygotowanego bez czynnika RAFT (kolor niebieski), PMA-LAEMA otrzymany metodą RAFT (kolor zielony) wykazuje znacznie niższą dyspersyjność (Mw/Mn). PMA-GAEMA (kolor czerwony) oraz PMA-LAEMA otrzymane metodą RAFT mają podobne profile GPC, jednak w pierwszym przypadku Mn jest mniejsza ze względu na brak cukrów bocznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Fluorescencja związków chemicznych w probówkach; eksperyment spektroskopowy z emisją widzialną." src="/files/ftp_upload/52922/52922fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. PMA-LAEMA przed i po modyfikacji fluorophorem. (A) W porównaniu z białym, nieznakowanym glikopolimerem (lewa probówka), PMA-LAEMA znakowany fluoresceiną wykazuje intensywny żółty kolor (prawa probówka). (B) W świetle UV nieznakowany PMA-LAEMA (lewa probówka, 1 mg/ml w PBS) jest ciemny i nie wykazuje fluorescencji, podczas gdy PMA-LAEMA znakowany fluoresceiną (prawa probówka, 1 mg/ml w PBS) wykazuje silną zieloną fluorescencję. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikrografia fluorescencyjna zielona kulistych komórek; eksperyment analizy morfologii komórek." src="/files/ftp_upload/52922/52922fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Erythrina crista-galli kuleczki agarozowe powlekane lektyną (ECL) wiążą glikopolimery zawierające β-D-galaktozyd, a nie te, które nie posiadają wiszącego cukru. (A) PMA-LAEMA-Fluoresceina (3 µg) wykazała silne wiązanie z ECL, podczas gdy w (B) PMA-GAEMA-Fluoresceina, która nie posiada wiszącej reszty β-D-galaktozydu, nie wykazała wiązania z kuleczkami powlekanymi lektyną. Pasek skali = 100 µm.
Tabela 1. Wartości docelowea parametrów syntetycznych oraz rzeczywisty skład glikopolimerów. a) Wartości docelowe, wartości pożądane dla produktów; b) DP, stopień polimeryzacji; c) NA, niedostępne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody style="vertical-align:middle;text-align:center">
		<tr>
			<td style="width:120px"></td>
			<td style="width:40px">DPb </td>
			<td style="width:70px">Dispersyjność</td>
			<td style="width:120px">Rzeczywista zawartość glikomonomerów 
			mol %</td>
			<td>Rzeczywista zawartość aminy pierwotnej 
			mol %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wartości docelowe</td>
			<td>100</td>
			<td>&lt; 1.3</td>
			<td>20</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA-LAEMA</td>
			<td>99</td>
			<td>1.26</td>
			<td>19</td>
			<td>3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA-GAEMA</td>
			<td>89</td>
			<td>1.32</td>
			<td>NAc</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Wykazano wydajną, trzyetapową syntezę fluorescencyjnych glikopolimerów na bazie RAFT, składającą się z przygotowania glikomonomeru, kopolimeryzacji i późniejszej modyfikacji. Protokół ten może być wykorzystany do przygotowania statystycznych glikopolimerów na bazie tratwy o pożądanych strukturach.

Łatwe i wydajne otrzymywanie trójskładnikowych glikopolimerów fluorescencyjnych za pomocą polimeryzacji kontrolowanej przez RAFT

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ściśle kontrolowana synteza fluorescencyjnych statystycznych liniowych glikopolimerów z wykorzystaniem polimeryzacji z odwracalnym przeniesieniem łańcucha (RAFT). Jest to realizowane poprzez wstępną syntezę glikomonomeru 2-laktobioetylo-metakryloamidu (L-A-E-M-A). W drugim kroku wykorzystuje się polimeryzację RAFT L-A-E-M-A, N-(2-aminoetylo)-metakryloamidu (AEMA) oraz N-(2-hydroksyetylo)-akryloamidu (HEAA) w celu syntezy odpowiadającego im glikopolimeru o niskiej dyspersyjności.Następnie polimer glikowy jest modyfikowany w jednej z jego amin pierwszorzędowych poprzez reakcję z esterem karboksyfluoresceiny, aby otrzymać fluoresceinylowany polimer glikowy. Ostatnim krokiem jest związanie fluoresceinylowanego polimeru glikowego z kulkami agarozy powleczonymi lektyną o znanej specyficzności wiązania węglowodanów. Ostatecznie do analizy wiązania polimerów glikowych z kulkami agarozy wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną, co potwierdza, że polimer glikowy posiada interesujący nas węglowodan i jest znakowany znacznikiem fluorescencyjnym.Zaletą polimeryzacji RAF w porównaniu z istniejącymi metodami wykorzystującymi konwencjonalną polimeryzację rodnikową jest to, że proces ten jest techniką polimeryzacji kontrolowanej, która minimalizuje liczbę łańcuchów pochodzących od inicjatora. Przynosi to polimery o określonej masie cząsteczkowej i bardzo wąskim rozkładzie polidyspersyjności. Polimeryzacje te można zastosować do zdefiniowanej mieszaniny monomerów w celu przygotowania specyficznych fluorescencyjnych glikopolimerów.Glikopolimery te posiadają określone zdolności wiązania, które można zweryfikować przy użyciu kulek powlekanych lektynami. Wydajna synteza fluorescencyjnych glikopolimerów powinna mieć w przyszłości ogromną wartość dla badań z zakresu glikobiologii. Aby rozpocząć, należy rozpuścić 2 g kwasu laktobionowego w 3 mL bezwodnego metanolu.Następnie powoli dodawaj absolutny etanol kroplami do roztworu, aż stanie się on lekko mętny. Użyj rotacyjnego odparowacza, aby usunąć wszystkie rozpuszczalniki. Powtórz ten proces trzy razy, aby uzyskać 1,94 grama lakto bioo one five laktonu z wydajnością 98%.Do roztworu A EMA i MEHQ w 2 ml metanolu dodać roztwór 1 g laktobiolaktonu w 3 ml metanolu. Następnie dodać 1 ml trietyloaminy i mieszać mieszaninę w temperaturze pokojowej. Po 48 godzinach dodać do mieszaniny 20 ml wody dejonizowanej i przenieść ją do rotacyjnego odparowacza.Odparowywać do całkowitego wyschnięcia. Pozostałość rozpuścić w 20 mililitrach wody dejonizowanej i nanieść roztwór na górną część kolumny wymiany anionowej o wymiarach 10 na 20 milimetrów. Pod wylotem umieścić zlewkę zawierającą jeden miligram MEHQ i przeprowadzić elucję z kolumny do zlewki.Po odparowaniu roztworu w rotacyjnym ewaporatorze, rozpuścić pozostałość w 20 mililitrach wody dejonizowanej i dodać miligramowe porcje żywicy jonowymiennej. Procedurę powtarzać, aż test na obecność wody okaże się negatywny; testy te przeprowadza się poprzez pobranie 1 µL roztworu i naniesienie go na płytkę do cienkowarstwowej chromatografii. Płytkę spryskać 2% roztworem anidrygenu w etanolu i ogrzewać w temperaturze 90 °C przez jedną minutę na płycie grzejnej.Punkt końcowy zostaje osiągnięty, gdy nie powstaje niebieski kolor. Następnie przefiltruj roztwór przez szklany lejek spiekany do probówki. Zamroź roztwór w temperaturze -80 °C, a następnie przenieś go do liofilizatora w celu przeprowadzenia liofilizacji.Rozpuść pozostałość w minimalnej ilości metanolu, a następnie wytrąć produkt, dodając bezwodny aceton w temperaturze -20 °C. Zbierz wytrącone L-A-E-M-A poprzez filtrację za pomocą szklanego lejka spiekanego. Przenieś lejek wraz z osadem do eksykatora próżniowego w celu wysuszenia; najpierw dodaj około 0,5 g nanocząsteczek tlenku glinu o ziarnistości 150 mesh do 1 mL HEAA klasy handlowej w probówce o pojemności 2 mL.Wirować probówkę przy przyspieszeniu 300 ×g przez 30 sekund, a następnie ostrożnie pobrać górną warstwę jako HEAA wolny od inhibitora. Rozpuścić 32,8 mg L-A-E-M-A, 1,7 mg a EMA, 27,5 µL HEAA wolnego od inhibitora oraz 0,4 mL wody dejonizowanej i przenieść roztwór do dokładnie oczyszczonej probówki typu flank o pojemności 1 mL. Następnie dodać do probówki 50 µL odczynnika RAFT oraz 50 µL odczynnika inicjującego i wymieszać, delikatnie opukując ściankę probówki przy zamkniętym zaworze. Podłączyć probówkę do linii próżniowej i zamrozić zawartość w kąpieli z suchego lodu i etanolu.Następnie za pomocą pompy obniżcie ciśnienie w probówce do wartości zbliżonej do 50 millitorr i zamknijcie zawór. Usuńcie łaźnię z suchego lodu i pozwólcie zawartości odmarznąć. Powtórzcie cykl zamrażania, próżniowania i rozmrażania jeszcze dwa razy, zachowując ostrożność.Sprawdzić probówkę, aby upewnić się, że zawartość jest całkowicie rozpuszczona, i w razie potrzeby delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex. Przed osadzeniem wyjąć zamkniętą probówkę z linii próżniowej i umieścić ją w przezroczystej plastikowej torbie próżniowej. Odessać powietrze z torby za pomocą plastikowej pompki ręcznej.Następnie umieść worek w zakrytej łaźni wodnej w temperaturze 70 °C na 24 godziny. Potem wyjmij probówkę z worka i przelej jej zawartość do worka dializacyjnego o granicy odcięcia masy cząsteczkowej 3 500 Daltons. Umieść worek dializacyjny w zlewce i prowadź dializę przeciwko dwóm litrom wody dejonizowanej przez 24 godziny.Przenieś zawartość worka do dializy do probówki i umieść ją w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Po zamrożeniu przenieś próbkę do liofilizatora i poddaj liofilizacji. Aby otrzymać puszysty, biały glikopolimer PMA LA EMA, przygotuj najpierw roztwór 5 mg PMA LA EMA w 0,9 ml PBS.Następnie do szybko mieszanego roztworu powoli dodaj 0,6 mg karboksyfluoresceiny z eterem w 100 µL dimetyloformamidu, zamknij mikropprobówkę folią i mieszaj powoli przez 16 h w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś roztwór do worka dializacyjnego o progu odcięcia masy cząsteczkowej 3 500 Da. Umieść worek w zlewce i dializuj przeciwko 2 l wody dejonizowanej przez 16 h, chroniąc go przed światłem. Przenieś zawartość worka dializacyjnego do probówki.Po zamrożeniu roztworu w temperaturze -80 °C należy poddać go liofilizacji. Aby otrzymać puszysty, żółty, znakowany fluorescencyjnie glikopolimer P-M-A-L-A-E-M-A, należy wyznaczyć średnią liczbową masę cząsteczkową, średnią wagową masę cząsteczkową oraz dyspersyjność glikopolimerów za pomocą systemu HPLC. W pierwszej kolejności do probówki wirówkowej zawierającej 50 µL zawiesiny kulek agarozy pokrytych galektyną erykrystyczną należy dodać 1,5 ml PBS.Następnie wirować probówkę z prędkością 300 ×g przez jedną minutę. Potem odlać nadsącz i powtórzyć przemywanie jeszcze dwukrotnie, a na koniec dodać 0,5 mL PBS. Do probówki zawierającej koraliki pokryte lektyną dodać roztwór 3 µg PMA LA EMA znakowanego fluoresceinactive w 6 µL PBS.Jako kontrolę negatywną należy wykorzystać P-M-A-G-A-E-M-A znakowany fluoresceiną. Następnie probówki należy owinąć folią aluminiową i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Probówkę wirujemy przez jedną minutę, a następnie odrzucamy nadsącz.Następnie ponownie zawiesić kuleczki w 1,5 milliliters świeżego PBS i powtórzyć płukanie trzykrotnie. Na koniec ponownie zawiesić kuleczki w 0,2 milliliters PBS. Przenieść cztery µL zawiesiny kuleczek do dołka szkiełka do mikroskopii immunofluorescencyjnej i przykryć szkiełkiem podstawowym w celu rejestracji.Obrazy preparatu wykonane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 10x, filtr FITC oraz kamerę. Glikopolimery przeanalizowano metodą chromatografii żelowej. Polimery syntetyzowane bez użycia RAFT charakteryzują się znacznie wyższą dyspersyjnością niż te otrzymane z wykorzystaniem RAFT.Po oznakowaniu fluoresceiną wygląd fizyczny glikopolimeru zmienia się z białego na intensywny żółty kolor widoczny w świetle UV. Roztwór nieoznakowanego polimeru pozostaje ciemny, podczas gdy polimer oznakowany fluoresceiną świeci na jaskrawozielono, co potwierdza obecność znacznika; specyficzne wiązanie z koralikami powlekanymi lektyną zachodzi tylko w przypadku polimerów posiadających wiszące reszty cukrowe – koraliki świecą na zielono po związaniu, natomiast pozostają ciemne po potraktowaniu polimerami pozbawionymi wiszących reszt cukrowych. Ta technika polimeryzacji oparta na raft pozwala na dużą elastyczność w doborze typów syntetyzowanych glikopolimerów.Kolejne znakowanie glikopolimerów można również przeprowadzić przy użyciu szerokiej gamy reagentów fluorescencyjnych, zdolnych do reagowania z aminami pierwszorzędowymi w środowisku wodnym. Badacze w dziedzinie glikobiologii mogą wykorzystać tę technikę do łatwego otrzymywania bardzo wszechstronnych i zdefiniowanych glikopolimerów. Glikopolimery te mogą służyć jako narzędzia do badania specyficzności wiązania węglowodanów, takich jak te obserwowane w drogach oddechowych pacjentów z mukowiscydozą lub tych zaangażowanych w wiele typów nowotworów u ludzi.

facile-efficient-preparation-tri-component-fluorescent-glycopolymers

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Tutaj opisujemy unikalną strategię tworzenia biokompatybilnych, warstwowych matryc z ciągłymi interfejsami między różnymi warstwami dla inżynierii tkankowej. Takie rusztowanie może zapewnić idealne, konfigurowalne środowisko do modulowania zachowania komórek za pomocą różnych sygnałów biologicznych, chemicznych lub...

Polimeryzacja wielowarstwowa z gradientem gęstości (DGMP): nowatorska technika tworzenia wielokompartyjnych, konfigurowalnych rusztowań dla inżynierii tkankowej

Nasze laboratorium opracowało usieciowane DNA hydrożele poliakrylamidowe, dynamiczny system hydrożelowy, aby lepiej zrozumieć wpływ modulacji sztywności tkanek na funkcjonowanie komórek. Tutaj podajemy schematy, opisy i protokoły przygotowania tych hydrożeli.

Otrzymywanie usieciowanych DNA hydrożeli poliakrylamidowych

Przedstawiamy protokół szybkiego tworzenia gigantycznych pęcherzyków polimerowych (pGV). Krótko mówiąc, roztwory polimerów są odwadniane na wysuszonych foliach agarozowych przyklejonych do szkiełek nakrywkowych. Rehydratacja folii polimerowych powoduje szybkie tworzenie się pGV. Metoda ta znacznie przyspiesza przygotowanie syntetycznych pęcherzyków olbrzymich do bezpośredniego zastosowania w badaniach biomimetycznych.

Tworzenie gigantycznych rozmiarów polimeromów za pomocą ponownego uwodnienia wspomaganego żelem

Ten artykuł opisuje proces wytwarzania polimerowych, samoorganizujących się nanocząstek za pomocą polimeryzacji dyspersyjnej za pośrednictwem światła widzialnego. Wykorzystanie niskoenergetycznego światła widzialnego do kontrolowania polimeryzacji pozwala na powtarzalne tworzenie samoorganizujących się miceli przypominających robaki przy wysokiej zawartości części stałych.

Łatwa synteza robakopodobnych miceli za pomocą polimeryzacji dyspersyjnej za pośrednictwem światła widzialnego przy użyciu katalizatora fotoredoks

Polimeryzacja wytrącająca bez mieszania zapewnia szybkie, powtarzalne podejście do prototypowania syntezy wrażliwych na bodźce mikrożeli poli(N-izopropyloakrylamidowych) o wąskim rozkładzie rozmiarów. W tej syntezie protokołu demonstruje się charakterystykę rozpraszania światła i śledzenie fluorescencji pojedynczych cząstek tych mikrożeli w mikroskopii szerokokątnej.

Kontrolowana synteza i śledzenie fluorescencji wysoce jednorodnych mikrożeli poli(N-izopropyloakrylamidowych)

Przedstawiamy protokół syntezy hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako urządzeń do dostarczania komórek i leków. Procedura polega na katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej (CuAAC) pomiędzy modyfikowanym alkinami kwasem poliakrylowym (PAA) a pochodną azydku RGD. Hydrożele powstają w procesie polikondensacji wspomaganej mikrofalami i badane są ich właściwości fizykochemiczne.

Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

Opisane są protokoły wytwarzania degradowalnych termoresponsywnych hydrożeli opartych na sieciowaniu hydrazonów polimerowych oligomerów na skalę masową, mikroskalową i nanoskalę, przy czym ta ostatnia służy do przygotowania zarówno nanocząstek żelowych, jak i nanowłókien.

Wytwarzanie degradowalnych termoczułych hydrożeli w różnych skalach długości za pomocą wytłaczania reaktywnego, mikrofluidyki, samoorganizacji i elektroprzędzenia

Przedstawiono protokół syntezy i charakterystyki ruchu dyfuzyjnego cyklicznych polimerów na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Synteza polimerów cyklicznych i charakterystyka ich ruchu dyfuzyjnego w stanie stopionym na poziomie pojedynczej cząsteczki

Tutaj prezentujemy protokół do przygotowania i wizualizacji struktur drugorzędnych (np. włókien, architektur toroidalnych i nanosfer) pochodzących z polikarmidów spiralnych. Wykazano, że morfologia charakteryzująca się zarówno mikroskopią sił atomowych (AFM), jak i skaningową mikroskopią elektronową (SEM) zależy od struktury molekularnej, stężenia i wybranego rozpuszczalnika.

Samoorganizujące się morfologie otrzymane z helikalnych kopolimerów polikarbodimidu i ich pochodnych triazolowych

Mikrożelowe pręty z komplementarnymi grupami reaktywnymi są produkowane za pomocą mikrofluidyki z możliwością łączenia się w roztworze wodnym. Anizometryczne mikrożele zacinają się i łączą w stabilne konstrukcje z większymi porami w porównaniu z systemami sferycznymi. Mikrożele modyfikowane za pomocą GRGDS-PC tworzą makroporowate konstrukcje 3D, które można wykorzystać do hodowli komórkowych.

Połączone makroporowate rusztowania 3D z prętów mikrożelowych

Poznaj metodę syntezy fluorescencyjnych glikopolimerów z użyciem polimeryzacji RAFT. Protokół obejmuje przygotowanie glikomonomeru, kontrolowaną polimeryzację i modyfikację fluorescencyjną.

Łatwe i wydajne otrzymywanie trójskładnikowych glikopolimerów fluorescencyjnych za pomocą polimeryzacji kontrolowanej przez RAFT (Wideo) | JoVE Journal

Łatwe i wydajne otrzymywanie trójskładnikowych glikopolimerów fluorescencyjnych za pomocą polimeryzacji kontrolowanej przez RAFT

Przeglądaj więcej filmów