Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie adhezji komórek śródbłonka in vitro. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych fibronektyną na 24-światowej płytce klastrowej. Ludzkie komórki śródbłonka tętnic wieńcowych są następnie nakładane na szklane szkiełka nakrywkowe i pozostawiane do inkubacji, aż utworzy się zlewająca się monowarstwa komórek śródbłonka.

Po podaniu pożądanego leczenia komórkom śródbłonka, znakowane fluorescencyjnie monocyty dodane do szklanych szkiełek nakrywkowych i inkubowane z monowarstwą komórek śródbłonka. Ostatnim etapem jest usunięcie niezwiązanych monocytów z monowarstwy śródbłonka poprzez skrupulatną procedurę namaczania i mycia szkiełek nakrywkowych. Ostatecznie metoda ta pozwala na ilościowe określenie procentu populacji komórek śródbłonka, które są adhezyjne po określonym zabiegu.

Główną zaletą tej techniki jest to, że mierzy ona rzeczywistą liczbę lub procent adhezyjnych komórek śródbłonka, w przeciwieństwie do ogólnej lepkości monowarstwy śródbłonka, mierzonej wszystkimi obecnymi metodami. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy zmierzyć ADI komórek śródbłonka przy użyciu obecnie dostępnych metod i napotkaliśmy niedopuszczalnie duże różnice w wynikach ze względu na wyzwania techniczne związane z tymi metodami. Sterylizowane okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 milimetrów poprzez namoczenie ich w 70% etanolu przez co najmniej 10 minut z okazjonalnym mieszaniem, aby zapewnić całkowite narażenie wszystkich szkiełek nakrywkowych na działanie etanolu.

Następnie cała szklana pokrywa wsuwa się i etanol do sterylnego naczynia do hodowli komórek za pomocą pary sterylnych cienkich kleszczyków z pięcioma B. Podnieś i umieść każdą pojedynczą szklaną pokrywę w studzience z 24-dołkową płytką zbiorczą. Należy upewnić się, że szkiełka nakrywkowe nie dotykają rozmiaru studzienki i znajdują się mniej więcej w środku, studni, pozostaw odkrytą płytkę klastrową 24 world ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi do wyschnięcia w komorze przepływowej.

Zajmuje to około 10 minut. Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, nakładam 100 mikrolitrów roztworu powlekającego na każde szkiełko nakrywkowe, tak aby roztwór pokrył tylko szklankę, nie ciągnąc po zewnętrznej stronie studzienki. Umieścić przykrytą 24-dołkową płytkę zbiorczą w inkubatorze do hodowli komórkowych na co najmniej godzinę.

Hodowla, ludzkie komórki śródbłonka tętnic wieńcowych w pożywce o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla odessać z pożywki hodowlanej i przepłukać monowarstwę komórek śródbłonka 10 mililitrami roztworu soli równoważącej Hanka lub HBSS, a następnie odessać z HBSS przy dwóch mililitrach 0,5% w 0,2% roztworze EDTA i inkubowanej temperaturze pokojowej przez około pięć minut, kiedy komórki śródbłonka można usunąć za pomocą stuknięcia z boku kolba. Na pięć mililitrów inhibitora trypsyny sojowej tryskającego na powierzchnię kolby. Aby dalej usunąć komórki, przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i odwiruj probówkę przy 200 razy G przez pięć minut, odessaj supinat i ponownie zawieś osad śródbłonka w pięciu mililitrach pożywki.

Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie komórek do 50 000 komórek śródbłonka na mililitr pożywki. Dozować jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 24-dołkowej płytki zawierającej szkiełka pokrywowe z powlekanego szkła, inkubować komórki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza plus 5% dwutlenku węgla. Komórki są gotowe do pożądanego zabiegu.

Gdy w ciągu trzech dni utworzy się zlewająca się monowarstwa, przenieś komórki HL 60, które są hodowane w RPMI, uzupełnia się 10% płodową surowicą cielęcą do 15-mililitrowej probówki i odwirowuje komórki w temperaturze 200 razy G przez pięć minut. Następnie usuń supinat i ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach pożywki bez surowicy do znakowania fluorescencyjnego komórek HL 60. Policz i przenieś odpowiednią ilość komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Odwirować komórki w temperaturze 200 razy G przez pięć minut. Po usunięciu supinatu, ponownie zawieś osad komórkowy w trackerze komórkowym w naszym podłożu PMI bez surowicy. Przy stężeniu 1 miliona komórek na mililitr inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez godzinę po inkubacji, odwirować komórki przy 200 razy G przez pięć minut i wyrzucić supinat Reese'a.

Zawieś komórkę pal w pożywce do stężenia 2 milionów komórek na mililitr. Dodać jeden mililitr zawiesiny komórek oznaczonych jako HL 60 do każdego dołka 24-dołkowej płytki klastrowej zawierającej monowarstwę komórek śródbłonka i inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez wybrany ustalony okres czasu od jednej do trzech godzin po okresie inkubacji. Użyj pary cienkich pięciu kleszczyków B i podnieś szklany szkiełko nakrywkowe ze studzienki, rozrywając tylko zewnętrzną krawędź szkiełka nakrywkowego, zarówno szkiełko nakrywkowe, jak i przetrzyj krawędź okładki.

Połóż się na kawałku chusteczki na ławce przez trzy sekundy. Uważając, aby nie dotknąć pokrytej komórką powierzchni szkiełka nakrywkowego chusteczką tkankową, mocno przytrzymując szkiełko nakrywkowe parą kleszczyków. Zanurz szkiełko nakrywkowe do i z HBSS pięć razy po piątym zanurzeniu.

HBSS przetrzyj krawędź okładki. Połóż się na chusteczce przez trzy sekundy. Powtórz procedury wsadów i wkłuć, co daje w sumie trzy serie po pięć wsadów, a następnie uderzenie.

Następnie przenieś szkiełko nakrywkowe do studzienki zawierającej formułę Tencent, aby utrwalić komórki w temperaturze pokojowej. Kolorowy poślizg jest gotowy do wyliczenia w celu długotrwałego przechowywania lub do poddania barwieniu przeciwstawnemu pod kątem przeciwciał lub związanej ze starzeniem się aktywności sazy beta galakto, zgodnie z opisem w protokole tekstowym w celu zliczenia adhezyjnych komórek śródbłonka, zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych z barwnikiem przeciwstawnym DPI w celu identyfikacji pojedynczych komórek za pomocą mikroskopu odwróconego z obiektywem czterokrotnym lub 10x. Uzyskaj obrazy kilku pól i policz największą liczbę monocytów, które agregują się na nienapromieniowanych komórkach śródbłonka.

Ustaw dwukrotność tej liczby jako próg monocytów na komórce śródbłonka, aby w razie potrzeby zdefiniować ją jako klaster. Do definiowania klastra można użyć innego kryterium w zależności od charakteru eksperymentu. Policz liczbę skupisk i liczbę komórek śródbłonka w polu.

Podziel formę przez tę ostatnią, aby uzyskać procent adhezyjnych komórek śródbłonka. Ocenianie liczby pól, aby uzyskać średnią i odchylenie standardowe zliczeń. Monowarstwy śródbłonka po siedmiu dniach od szarego promieniowania przed inkubacją z monocytami były wiązane przez monocyty w skupiska wokół poszczególnych komórek śródbłonka.

Chociaż zjawisko to można łatwo zaobserwować w kontraście fazowym, mikroskopia fluorescencyjna ujawnia jeszcze wyraźniejszy obraz klastrów monocytów. Po wykonaniu opisanego testu ADI możliwe jest przystąpienie do barwienia komórek na obecność białek błonowych, cytoplazmatycznych lub jądrowych przy użyciu odpowiednich przeciwciał. W przypadku standardowych metod immunofluorescencyjnych należy zachować ostrożność na etapach mycia, ponieważ nadmierna siła może usunąć monocyty.

Ponadto można przeprowadzić testy oparte na enzymach, takie jak becyaza związana ze starzeniem. Powoduje to, że lizosomy komórek starczych zmieniają kolor na niebieski, co jest widoczne w komórce śródbłonka, która jest selektywnie związana przez liczne monocyty, które są identyfikowane ze względu na ich mały rozmiar i kulisty kształt. Ponieważ każde skupisko monocytów odpowiada pojedynczej komórce śródbłonka, wyliczenie klastrów ujawnia rzeczywistą liczbę adhezyjnych komórek śródbłonka w monowarstwie, a tym samym procent adhezyjnych komórek śródbłonka w populacji.

Jest to jedyna do tej pory metoda, która pozwala na ilościowe określenie adhezji komórek śródbłonka w razie potrzeby Monocyty przyłączone do monowarstw śródbłonka można usunąć za pomocą roztworu trypsyny EDTA, a fluorescencję zmierzyć za pomocą czytnika płytkowego, tak jak ma to miejsce we współczesnych metodach. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin i przy bardzo niewielkim nakładzie czasu. Ważne jest, aby pamiętać, że wszystkie etapy mycia i namaczania muszą być przeprowadzone w identyczny sposób i z taką samą liczbą powtórzeń między wszystkimi próbkami Zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak testy beta galakto związane z immunofluorescencją i starzeniem, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na pytania indywidualne, takie jak cechy komórek śródbłonka, które są adhezyjne w porównaniu z tymi, które nie są.