Name: Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji adhezji komórek śródbłonka in vitro z wykorzystaniem ludzkich komórek tętnicy wieńcowej. Technika ta pozwala dokładnie mierzyć liczbę komórek adhezyjnych po zabiegach, zmniejszając zmienność wyników w badaniach biologii naczyń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy bardzo wdzięczni Simonowi Boufflerowi za jego pełne wsparcie oraz Public Health England za wsparcie infrastruktury. Prace te były wspierane przez Public Health England poprzez grant National Institute for Health Research (NIHR). Niniejszy raport jest pracą zleconą przez NIHR. Poglądy wyrażone w tej publikacji są poglądami autorów, a niekoniecznie poglądami NHS, NIHR lub Departamentu Zdrowia. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

1. Przygotowanie szklanych szkiełek nakrywkowych
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm należy wysterylizować, mocząc je w 70% etanolu przez co najmniej 10 minut, od czasu do czasu mieszając, aby zapewnić całkowite narażenie wszystkich szkiełek nakrywkowych na działanie etanolu. Wlej szklane szkiełka nakrywkowe i etanol do sterylnego naczynia do hodowli komórkowych (o średnicy 6 cm lub 10 cm).</li>
	<li>Za pomocą pary sterylnych cienkich kleszczyków 5B podnieś i umieść każde pojedyncze szklane szkiełko nakrywkowe w dołku z 24-dołkową płytką zbiorczą. Należy upewnić się, że szkiełka nakrywkowe nie dotykają boków studzienki i znajdują się mniej więcej pośrodku studzienki.</li>
	<li>Pozostawić odkrytą 24-dołkową płytkę zbiorczą ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi do wyschnięcia w komorze przepływowej. Trwa to około 10 minut</li>
	<li>W tym okresie należy przygotować mieszankę otoczkową, rozcieńczając 10 mg/ml ludzkiej fibronektyny w roztworze soli Hanka (HBSS) do 0,1 mg/ml.</li>
	<li>Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, odpipetować 100 μl roztworu powlekającego na każde szklane szkiełko nakrywkowe, tak aby roztwór pokrywał tylko szkło, nie gromadząc się na zewnątrz studzienki. Umieścić przykrytą 24-dołkową płytkę zbiorczą w inkubatorze do hodowli komórkowych na co najmniej godzinę.</li>
	<li>Tuż przed użyciem usuń roztwór powlekający. Ten sam roztwór powlekający można przenieść do sterylnej probówki i użyć do trzech razy bez widocznej utraty skuteczności.</li>
</ol>
2. Przygotowanie monowarstwy komórek śródbłonka
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich komórek śródbłonka tętnicy wieńcowej (EC) w pożywce w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać monowarstwę EC 10 ml HBSS</li>
	<li>Odessać HBSS i dodać 2 ml 0,5% roztworu trypsyny, 0,2% EDTA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez około 5 minut.</li>
	<li>Gdy EC można usunąć za pomocą kranu z boku kolby, dodać 5 ml inhibitora trypsyny sojowej i za pomocą pipety spryskać powierzchnię kolby, aby dalej usunąć komórki.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować probówkę o stężeniu 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać sklarat nad osadem i ponownie zawiesić osad EC w 5 ml pożywki. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie komórek do 50 000 EC na ml pożywki EC.</li>
	<li>Dozować 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka z 24-dołkowej płytki zawierającej szkiełka nakrywkowe ze szkła powlekanego. Inkubować komórki O/N w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C plus 5% dwutlenku węgla.</li>
	<li>Komórki są gotowe do użycia w eksperymentach, gdy w ciągu 3 dni utworzy się zlewająca się monowarstwa.</li>
</ol>
3. Przygotowanie monocytów
<ol>
	<li>Przenieś komórki HL-60, które są hodowane w RPMI, uzupełnione 10% płodową surowicą cielęcą, jako hodowlę zawiesinowa, do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce o pojemności 5 ml i dostosować stężenie komórek z pożywką do 2 milionów komórek/ml. Jeśli pożądane jest znakowanie fluorescencyjne HL-60, ponownie zawiesić komórki w RPMI bez surowicy i postępować zgodnie z opisem w sekcji 4.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml zawiesiny komórek HL-60 do każdego dołka 24-dołkowej płytki zbiorczej zawierającej monowarstwę EC i inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla przez wybrany ustalony okres czasu między 1 a 3 godziną. Obserwuje się niewielką różnicę między punktem czasowym 1 godzina a 3 godzina, gdzie osiągane jest nasycenie wiązania.</li>
	<li>Przygotuj się do mycia/zbierania komórek: Napełnij probówkę o pojemności 120 ml 100 ml HBSS. Dozować 1 ml formaliny do każdego dołka świeżej 24-dołkowej płytki.</li>
	<li>Po okresie inkubacji użyj pary ostrych kleszczyków i podnieś szklane szkiełko nakrywkowe ze studzienki i przytrzymaj szkiełko nakrywkowe pionowo i przetrzyj krawędź szkiełka nakrywkowego na kawałku chusteczki na stole przez 3 sekundy, uważając, aby nie dotknąć tkanką pokrytej komórkami powierzchni szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Mocno przytrzymując szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczyków, zanurz szkiełko nakrywkowe w HBSS i wyjmuj je z HBSS pięć razy.</li>
	<li>Po piątym zanurzeniu w HBSS natrzyj krawędź szkiełka nakrywkowego na chusteczce przez 3 sekundy.</li>
	<li>Powtórz procedury zanurzania i wkłuwania opisane w ppkt 3.6 i 3.7, wykonując w sumie trzy serie po 5 wsadów, po których następuje uderzenie.</li>
	<li>Przenieś szkiełko nakrywkowe do studzienki zawierającej 10% formaliny, aby utrwalić komórki w temperaturze pokojowej. Szkiełko nakrywkowe jest gotowe do sporządzenia spisu, do długotrwałego przechowywania lub do poddania innym procedurom opisanym poniżej.</li>
</ol>
4. Etykietowanie komórek HL-60 za pomocą Cell Tracker (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Policz i przenieś odpowiednią ilość komórek HL-60 (np. 10 milionów) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki HL-60 przy 200 x g przez 5 min. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w Cell Tracker w pożywce RPMI bez surowicy w stężeniu 1 miliona komórek/ml. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odwirować komórki o masie 200 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do stężenia 2 milionów komórek/ml.</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml HL-60 znakowanego Cell Tracker do każdej studzienki zawierającej komórki śródbłonka wyhodowane na szklanym szkiełku nakrywkowym. Kontynuuj w punkcie 3.3.</li>
</ol>
5. Wyliczanie adhezyjnych komórek śródbłonka
<ol>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych z przeciwbarwieniem DAPI, aby zidentyfikować poszczególne komórki.</li>
	<li>Używając mikroskopu odwróconego z obiektywem 4X lub 10X, uzyskaj obrazy kilku pól (np. 5 pól) i policz największą liczbę monocytów, które agregują się na nienapromieniowanych komórkach śródbłonka (zwykle powinno to być 3-5).</li>
	<li>Ustaw dwukrotność tej liczby jako próg monocytów na komórce śródbłonka, który ma być zdefiniowany jako klaster. W razie potrzeby do zdefiniowania klastra można użyć innego kryterium w zależności od charakteru eksperymentu.</li>
	<li>Policz liczbę skupisk i liczbę komórek śródbłonka w polu. Podziel te pierwsze przez drugie, aby uzyskać procent adhezyjnych komórek śródbłonka. Ocenianie liczby pól, aby uzyskać średnią i odchylenie standardowe zliczeń.</li>
</ol>
6. Barwienie przeciwdziałające przeciwciałom
<ol>
	<li>Po oznaczeniu adhezji i utrwaleniu komórek na szkiełku nakrywkowym w 10% formalinie przez 15 minut w temperaturze pokojowej, należy poddać szkiełka nakrywkowe immunofluorescencji przy użyciu standardowej procedury10 i przeciwciał z wyboru.</li>
	<li>Dodawaj i usuwaj różne roztwory bardzo delikatnie, aby uniknąć przemieszczania monocytów, które są przyczepione do komórek śródbłonka.</li>
</ol>
7. Barwienie przeciwdziałające aktywności beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem się
<ol>
	<li>Po wykonaniu testu adhezyjnego i utrwaleniu komórek na szkiełku nakrywkowym w formalinie przez 15 minut, wybarwić pod kątem aktywności beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem, zgodnie z opisem w instrukcji dołączonej do zestawu do barwienia. Dodawaj i usuwaj różne roztwory bardzo delikatnie, aby uniknąć przemieszczania monocytów, które są przyczepione do komórek śródbłonka.</li>
</ol>

<ol><li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation%3A+an+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li>
<li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li>
<li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells%3A+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li>
<li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li>
<li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li>
<li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin%2C+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li>
<li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li>
<li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li>
<li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany powyżej test adhezji monocytów został z powodzeniem wykorzystany w eksperymentach mających na celu zbadanie biologicznych skutków promieniowania jonizującego na monowarstwy śródbłonka10. Chociaż nie jest to jedyna dostępna metoda oceny adhezji monowarstwy śródbłonka, jest to jedyna metoda, która pozwala na ilościowe określenie proporcji lub procentu komórek śródbłonka w monowarstwie, która jest adhezyjna. Jest to ważne rozróżnienie, ponieważ globalną ilościową zmianę adhezji monocytów, mierzoną innymi metodami, można przypisać albo ogólnemu wzrostowi adhezji wszystkich komórek monowarstwy śródbłonka, albo wzrostowi adhezji subpopulacji komórek śródbłonka w monowarstwie, jak pokazano w powyższym przykładzie. O tym, jak ważne jest posiadanie tych informacji, świadczy fakt, że możliwość ilościowego określenia odsetka komórek śródbłonka, które wykazywały zwiększoną adhezję po napromieniowaniu, doprowadziła do nieuniknionego wniosku, że efekt ten nie jest spowodowany mutacją genetyczną konkretnego genu, ponieważ odsetek komórek, które były adhezyjne, był znacznie wyższy (ponad 1000 razy większy) niż ten, którego można by się spodziewać po losowej mutacji genu przez promieniowanie rentgenowskie dawka.
Czynnikiem, który pozwala na dobrą powtarzalność wyników, jest reżim prania. Ponieważ procedura mycia polega na zanurzeniu szkiełka nakrywkowego w buforze do płukania, a następnie wklepaniu w tkankę, unika się zmienności turbulencji buforu, która nieuchronnie wynika ze starej metody pipetowania buforu do płukania do studzienki. W rzeczywistości to właśnie obserwacja nadmiernej zmienności między powtórzeniami uzyskanymi za pomocą metody pipetowania zmusiła nas do opracowania procedury mycia, która usunęła element zmienności z etapu mycia.
Trzeba przyznać, że ograniczenia tego testu polegają na konieczności ręcznego zliczania klastrów monocytów, co nie pozwala na dostosowanie go do analiz wysokoprzepustowych. Po drugie, decyzja o tym, ile monocytów składa się na klaster, musi być ustalana częściowo arbitralnie, a poziom może być zbyt wysoki i skutkować wykluczeniem niektórych prawdziwych klastrów. Brak siły ścinającej w tej metodzie może być również postrzegany jako ograniczenie w eksperymentach, w których indukowana jest znacznie zwiększona adhezja komórek śródbłonka (np. +TNFα). Jednak w innych sytuacjach brak siły tnącej jest zaletą, ponieważ pozwala na wykrycie mniej przesadnego zwiększenia przyczepności. Niewielki wzrost adhezji monocytów może być szczególnie ważny i istotny. In vivo nie można oczekiwać, że monocyty (w typowym czasie eksperymentalnym) będą przyczepiać się w dużych ilościach do komórek śródbłonka z niewielkim wzrostem adhezji, głównie z powodu siły ścinającej. Z czasem jednak niektóre monocyty prawdopodobnie by to zrobiły, a to z większym prawdopodobieństwem reprezentuje środowisko przewlekłego stanu zapalnego. W związku z tym brak siły ścinającej może być zaletą, ponieważ daje możliwość ujawnienia niewielkiego wzrostu adhezji komórek śródbłonka w eksperymentalnych ramach czasowych, które są zwykle krótkie i prawdopodobnie zbyt ulotne, aby można było zaobserwować umiarkowany wzrost adhezji pod wpływem naprężeń ścinających.
Możliwość poddania komórek po tym teście innym analizom, takim jak test starzenia i barwienie immunofluorescencyjne, zwiększa użyteczność tej metody, ponieważ umożliwia powiązanie adhezji określonych komórek śródbłonka z określonymi białkami komórkowymi lub stanami komórkowymi, jak wykazano powyżej, cecha, która nie jest dostępna w starszych testach adhezyjnych.
Metodę tę zastosowano w przypadku ludzkich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych unieśmiertelnionych za pomocą est2, a podobne wyniki uzyskano również w przypadku pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka wieńcowego10, co pokazuje, że nie jest ona specyficzna tylko dla określonej linii komórkowej. Ponadto przyjęcie tej metody oznaczania adhezji komórek śródbłonka nie wyklucza poddania tych samych komórek standardowemu testowi adhezji, który mierzy fluorescencję znakowanych immunocytów. Podsumowując, raport ten pokazuje, że metoda ta jest wszechstronna, kompleksowa i dostarcza znacznie więcej informacji niż standardowy test adhezji.

Infiltracja komórek odpornościowych, takich jak monocyty, przez warstwę komórek śródbłonka, które wyściełają naczynia krwionośne, jest ważnym krokiem w procesie zapalenia. 1. Pozwala to na naprowadzanie komórek odpornościowych (immunocytów) do miejsca urazu. W innych przypadkach i lokalizacjach, takich jak tętnica wieńcowa i tętnica szyjna, naciekanie monocytów przez warstwę śródbłonka może prowadzić do niepożądanego długotrwałego przebywania tych komórek w ścianie tętnicy, potencjalnie prowadząc do tworzenia się blaszek miażdżycowych2. We wszystkich przypadkach naciekania immunocytów pierwszym krokiem jest aktywacja komórek śródbłonka w zlokalizowanym obszarze naczynia krwionośnego. Komórki śródbłonka są aktywowane przez cytokiny prozapalne, takie jak TNF-α i IL-6, w celu zwiększenia ekspresji białek powierzchniowych komórek, takich jak VCAM, ICAM i E-selektyna, które ułatwiają rekrutację i przyłączanie immunocytów do powierzchni komórki śródbłonka3-6.
Początkowo pomiar adhezji komórek śródbłonka był przeprowadzany poprzez liczenie monocytów, które przylegały do monowarstwy 7 śródbłonka. Ograniczenia tej metody pod względem precyzji doprowadziły do zastosowania znakowanych radioaktywnie limfocytów lub monocytów, a następnie do oznaczania ilościowego materiału promieniotwórczego, który odpowiada adhezji limfocytów lub monocytów 4. Metoda ta została ostatecznie zastąpiona metodą opartą na fluorescencji, w której interesujące immunocyty znakowano barwnikiem fluorescencyjnym i poddawano tej samej procedurze, co powyżej, z tą różnicą, że mierzy się fluorescencję zamiast radioaktywności 8. Obecnie ta metoda stała się najwygodniejsza i jest sprzedawana w formie zestawu przez kilku komercyjnych dostawców. Chociaż test ten może mierzyć względne poziomy adhezji między próbkami kontrolnymi i eksperymentalnymi, nie ujawnia, czy zmiana fluorescencji jest spowodowana jednolitą zmianą adhezji w całej populacji komórek śródbłonka, czy też zmiana jest spowodowana różnicą adhezji w subpopulacji komórek. Oczywiste jest również, że rygorystyczność mycia wywiera głęboki wpływ na wynik, a co ważniejsze, równomierność spłukiwania niezwiązanych monocytów między różnymi monowarstwami komórek śródbłonka będzie miała duży wpływ na bliskość wyników z powtórzeń i odtwarzalność wyników między próbkami. Niedawno wykorzystano kilka systemów, które pompują monocyty w pożywce przez monowarstwę komórek śródbłonka, aby rozwiązać ten problem 9. Ponadto te systemy przepływu podsumowują również wpływ siły ścinającej na komórki śródbłonka. Chociaż zalety takich systemów są oczywiste i bardzo atrakcyjne, ważne jest również, aby zdać sobie sprawę, że podczas gdy adhezja komórek śródbłonka może być znacznie zwiększona, jak ma to miejsce w przypadku ostrego zapalenia, przez czynniki takie jak TNFα, niektóre inne aktywatory, takie jak promieniowanie jonizujące10 wywołują zmiany, które nie są łatwo wykrywalne w in vitro eksperymentalnych ram czasowych przez te bardzo rygorystyczne systemy. Chociaż takie drobne zmiany w adhezji komórek śródbłonka są łatwe do przeoczenia lub odrzucenia in vitro, niekoniecznie są one łagodne in vivo, gdzie takie małe zmiany w ciągu życia, które są charakterystyczne dla przewlekłego stanu zapalnego, mogą mieć bardzo znaczące skutki. W związku z tym potrzebna jest solidna, a jednocześnie czuła i specyficzna metoda wykrywania i pomiaru adhezji komórek śródbłonka.
Tutaj przedstawiamy metodę bezpośredniego pomiaru adhezji komórek śródbłonka. Metoda ta nie opiera się na pomiarze fluorescencji jako pośrednim zastępczym wskaźniku adhezji komórek śródbłonka. Ujawnia, czy zmiany adhezji są spowodowane jednolitą zmianą we wszystkich komórkach, czy też ograniczają się do subpopulacji. Ponadto umożliwia jednoczesne barwienie komórek śródbłonka markerami, takimi jak beta-galaktozydaza związana ze starzeniem się, marker żywotności komórek, Calcien AM i przeciwciała przeciwko białkom powierzchniowym i wewnątrzkomórkowym, umożliwiając asocjację poszczególnych adhezyjnych komórek śródbłonka z określonymi stanami komórkowymi lub ekspresją określonych białek.

<table><tbody><tr><td>Hepes Buforowany roztwór soli fizjologicznej (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane o średnicy 12 mm</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka klastrowa</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Mezo-Endo Cell</td><td>Media Zastosowania w komórkach</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Soja Inhibitor trypsyny</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td> Life <td>Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania beta glasctozydazy&nbsp; &nbsp;</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Jednym z głównych procesów zapalnych jest infiltracja komórek odpornościowych ze światła naczynia krwionośnego do otaczającej tkanki. Dzieje się tak, gdy komórki śródbłonka, które wyściełają naczynia krwionośne, stają się adhezyjne do krążących komórek odpornościowych, takich jak monocyty. Pomiar tej adhezji in vitro był do tej pory wykonywany poprzez ilościowe określenie całkowitej liczby monocytów, które przylegają do warstwy śródbłonka, albo jako bezpośrednie zliczenie, albo poprzez pośredni pomiar fluorescencji przylegających monocytów. Chociaż takie pomiary wskazują na średnią adhezjalność populacji komórek śródbłonka, są one zaburzone przez szereg czynników, takich jak liczba komórek, i nie ujawniają proporcji komórek śródbłonka, które są faktycznie adhezyjne. W tym artykule opisano i zademonstrowano metodę, która pozwala na wyliczenie komórek adhezyjnych w badanej populacji monowarstwy śródbłonka. Komórki śródbłonka są hodowane na szklanych szkiełkach nakrywkowych, a po pożądanym leczeniu są poddawane monocytom (które mogą być znakowane fluorescencyjnie). Po inkubacji, procedurze płukania, obejmującej wiele rund zanurzania i drenażu, komórki są utrwalane. Adhezyjne komórki śródbłonka, które są otoczone monocytami, są łatwo identyfikowane i zliczane, co daje wskaźnik adhezji, który ujawnia rzeczywistą proporcję komórek śródbłonka w populacji, które są adhezyjne.

Ta metoda pozwala na wykrycie pojedynczych adhezyjnych komórek śródbłonka w obrębie populacji. Na przykład, podczas gdy monowarstwa nienaświetlanych komórek śródbłonka zachowała kilka sporadycznych monocytów HL-60 po inkubacji i przemyciu, monowarstwa śródbłonka 7 dni po naświetlaniu dawką 10Gy przed inkubacją z monocytami była związana przez monocyty tworzące skupiska wokół pojedynczych komórek śródbłonka (Rysunek 1). Chociaż zjawisko to jest łatwo dostrzegalne w mikroskopii kontrastowej, mikroskopia fluorescencyjna pozwala na uzyskanie jeszcze wyraźniejszego obrazu skupisk monocytów.
Po przeprowadzeniu opisanego testu adhezji można przystąpić do barwienia białek błonowych, cytoplazmatycznych lub jądrowych (Rysunek 2>) przy użyciu odpowiednich przeciwciał ze standardowymi metodami immunofluorescencji. Ponadto można przeprowadzić testy enzymatyczne, takie jak test na beta-galaktozydazę związaną ze starzeniem (Rysunek 3>).
Ponieważ każdy skupisko monocytów odpowiada pojedynczej komórce śródbłonka, wyliczenie tych skupisk pozwoli określić rzeczywistą liczbę adhezyjnych komórek śródbłonka w obrębie monowarstwy (Rysunek 4), a tym samym procent adhezyjnych komórek śródbłonka w populacji (Tabela 1, Rysunek 6). Jest to jedyna znana dotychczas metoda umożliwiająca taką kwantyfikację adhezyjności komórek śródbłonka. Należy zauważyć, że komórki śródbłonka wykorzystane w niniejszych eksperymentach wykazują hamowanie kontaktowe i nie zwiększają swojej liczby po osiągnięciu konfluencji. Eliminuje to potencjalną komplikację związaną ze wzrostem liczby komórek śródbłonka w późniejszych punktach czasowych. W razie potrzeby monocyty przyłączone do monowarstw śródbłonka można odczepić za pomocą roztworu 0,5% trypsyny i 0,2% EDTA (zamiast utrwalania w punkcie 3.9), a następnie zmierzyć ich fluorescencję za pomocą czytnika płytek, podobnie jak ma to miejsce w współczesnych metodach (Rysunek 5).
<img alt="Reakcja hodowli komórkowych na promieniowanie; analiza porównawcza; obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego." src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Adhezja monocytów do monowarstwy komórek śródbłonka. Na nienapromieniowanych komórkach śródbłonka monocyty przylegały jako pojedyncze komórki w sposób sporadyczny i losowy (panele lewe) oraz w skupiskach na poszczególnych komórkach śródbłonka w monowarstwie 7 dni po napromieniowaniu dawką 10 Gy (panele prawe). Dolne panele przedstawiają obrazy fluorescencyjne odpowiadające panelom górnym, co potwierdza, że małe i jasne sferyczne komórki widoczne w kontraście fazowym są rzeczywiście monocytami, które uprzednio oznakowano barwnikiem Cell-Tracker Green. Niektóre skupiska monocytów wskazano białymi strzałkami. Obrazy wykonano przy użyciu obiektywu 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna pokazująca śledzenie komórek oraz markery CD44 i mikrotubul; schemat analizy komórek." src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Barwienie komórek śródbłonka na obecność białek po teście adhezji. Po przeprowadzeniu opisanego testu adhezji, komórki na szkiełkach podstawowych poddano immunofluorescencji w celu wykrycia (A) białka błonowego (CD44), b) białka cytoplazmatycznego (Tubulina) lub c) białka jądrowego (γ-H2AX). Lewe panele (A) i (B) (obrazowane obiektywem 20X) przedstawiają monocyty uprzednio znakowane barwnikiem Cell Tracker Green, a analogiczne obrazy na prawych panelach ukazują CD44 i mikrotubule (czerwone) oraz jądra barwione DAPI (niebieskie). Białe strzałki w (C) wskazują jądra napromieniowanych komórek śródbłonka, które zostały zabarwione przeciwciałami przeciwko γ-H2AX. Jądra monocytów, zabarwione przez DAPI na jaśniejszy niebieski kolor, są łatwo odróżnialne od owalnych jąder komórek śródbłonka. Obrazy wykonano przy użyciu obiektywu 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obserwacja hodowli komórkowej; obraz mikroskopowy; badanie wzrostu i morfologii komórek." src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Barwienie komórek śródbłonka na beta-galaktozydazę związaną z senescencją. Po teście adhezji komórki na szkiełkach podstawowych poddano barwieniu na beta-galaktozydazę związaną z senescencją, co powoduje zabarwienie lizosomów komórek senescentnych na niebiesko, co jest widoczne w komórce śródbłonka selektywnie związanej z licznymi monocytami, które są łatwo identyfikowalne ze względu na mały rozmiar i sferyczny kształt. Obraz uzyskany przy użyciu obiektywu 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Kultury komórkowe pod mikroskopem; badanie morfologii i proliferacji komórek in vitro." src="/files/ftp_upload/52924/52924fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Wyliczanie skupisk monocytów na poszczególnych komórkach śródbłonka. Po przeprowadzeniu testu adhezji wykonano zdjęcia komórek z kilku różnych pozycji, a następnie zidentyfikowano i zakreślono (na zielono) skupiska monocytów. Skupisko zdefiniowano jako aglomerację 10 lub więcej monocytów na jednej komórce śródbłonka. Policzono liczbę skupisk monocytów oraz liczbę komórek śródbłonka 12 dni po napromieniowaniu (oznaczone czerwonymi kropkami) na zdjęciu, a następnie obliczono procent przywierających komórek śródbłonka, jak przedstawiono w Tabeli 1. Zdjęcie wykonano przy użyciu obiektywu 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres adhezji monocytów po napromienianiu, jednostki fluorescencji, 0 Gy vs 10 Gy w ciągu 14 dni." src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Ilościowe oznaczenie fluorescencji adherentnych monocytów. Po przeprowadzeniu testu adhezji komórki na szkiełkach przedmiotowych poddano trypsynizacji, a następnie zmierzono fluorescencję monocytów uprzednio znakowanych barwnikiem CellTracker Green za pomocą płytkowego czytnika fluorescencji, co służyło jako pośredni wskaźnik adhezyjności warstwy endotelialnej. Wyniki takich pomiarów w określonych dniach po napromienianiu zostały zestawione i naniesione na powyższy wykres.
<img alt="Wykres słupkowy procentowej liczby komórek przylegających na trzech krążkach, z naniesionymi słupkami błędów obrazującymi zmienność." src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Przedstawienie wyników testu adhezji z Tabeli 1. Przylegające komórki śródbłonka w pięciu różnych miejscach na trzech szklanych zakryciach oceniono zgodnie z opisem na Rysunku 4; wyniki zestawiono w powyższej tabeli, wykazując, że 12 dni po irradiation 10 Gy, od 8 do 10 procent napromieniowanych komórek śródbłonka stało się przylegającymi.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Procentowa zawartość kleju 
			komórki śródbłonka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Płyta 1</td>
			<td>Płyta 2</td>
			<td>Płyta 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pole 1</td>
			<td>8.65</td>
			<td>8.29</td>
			<td>8.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pole 2</td>
			<td>10.44</td>
			<td>7.27</td>
			<td>7.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pole 3</td>
			<td>9.63</td>
			<td>9.05</td>
			<td>8.33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pole 4</td>
			<td>11.11</td>
			<td>7.09</td>
			<td>8.41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pole 5</td>
			<td>10.55</td>
			<td>9.4</td>
			<td>11.61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia</td>
			<td>10.07</td>
			<td>8.22</td>
			<td>8.75</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Wyniki testu adhezji. Adhezyjne komórki śródbłonka w pięciu różnych miejscach na trzech szkiełkach podstawkowych oceniono zgodnie z opisem w Rysunku 4, a wyniki zestawiono w powyższej tabeli, wykazując, że 12 dni po napromieniowaniu dawką 10 Gy od 8 do 10 procent napromieniowanych komórek śródbłonka stało się adhezyjnych.

Opisujemy metodę in vitro, która pozwala na ilościowe określenie rzeczywistej liczby komórek adhezyjnych w monowarstwie komórek śródbłonka.

Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie przylegania komórek śródbłonka in vitro. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie szkiełek podstawowych pokrytych fibronektyną w 24-dołkowej płytce hodowlanej. Następnie na szklane szkiełka nanosi się ludzkie komórki śródbłonka tętnic wieńcowych i inkubuje je do momentu utworzenia konfluentnej monowarstwy komórek śródbłonka.Po podaniu wybranego preparatu do komórek śródbłonka, do szkiełek podstawowych dodano monocyty znakowane fluorescencyjnie i inkubowano je z monowarstwą komórek śródbłonka. Ostatnim krokiem jest usunięcie niezwiązanych monocytów z monowarstwy śródbłonka poprzez dokładne zanurzanie i płukanie szkiełek. Ostatecznie metoda ta pozwala na ilościowe określenie odsetka populacji komórek śródbłonka wykazujących adhezję po konkretnejy obróbce.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na pomiar rzeczywistej liczby lub procentowego udziału przylegających komórek śródbłonka, w przeciwieństwie do ogólnej lepkości monowarstwy śródbłonka mierzonej wszystkimi obecnie stosowanymi metodami. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy próbowaliśmy zmierzyć ADI komórek śródbłonka przy użyciu dostępnych metod i napotkaliśmy nieakceptowalnie dużą zmienność wyników ze względu na wyzwania techniczne nieodłącznie związane z tymi technikami. Sterylizowano okrągłe szkiełka nakrywki o średnicy 12 mm, mocząc je w 70% etanolu przez co najmniej 10 minut, z okresowym wstrząsaniem w celu zapewnienia pełnego kontaktu wszystkich szkiełek z etanolem.Następnie za pomocą sterylnej pęsety precyzyjnej przenieś wszystkie szkiełka nakrywkowe i etanol do sterylnej szalki hodowlanej. Chwyć każde szkiełko nakrywkowe pojedynczo i umieść je w dołku płytki 24-dołkowej. Należy zadbać o to, aby szkiełka nakrywkowe nie dotykały ścianek dołka i znajdowały się mniej więcej w jego środku. Pozostaw nieprzykrytą płytkę 24-dołkową ze szkiełkami nakrywkowymi do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Zajmuje to około 10 minut. Po wyschnięciu szkiełek podstawkowych nanioszę 100 µL roztworu powlekającego na każde szkiełko w taki sposób, aby roztwór pokrywał tylko szkło, nie rozlewając się na brzegi dołka. Płytkę 24-dołkową z naniesionym roztworem i szkiełkami umieszczam w inkubatorze do hodowli komórkowych na co najmniej godzinę.Kulturować ludzkie komórki śródbłonka tętnicy wieńcowej w pożywce w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide. Odessać pożywkę i wypłukać monowarstwę komórek śródbłonka 10 mL roztworu soli zrównoważonej Hank'a (HBSS), a następnie odessać HBSS. Dodać 2 mL roztworu 0,5% tripsiny w 0,2% EDTA i inkubować w temperaturze pokojowej przez około pięć minut, aż komórki śródbłonka będą mogły zostać oderwane poprzez stuknięcie w bok kolby. Dodać 5 mL inhibitora trypsyny sojowej, rozpylając go na powierzchnię kolby. Aby całkowicie odseparować komórki, przenieść je do probówki o pojemności 15 mL i wirować probówkę przy 200 ×g przez pięć minut, odessać supernat i resuspender osad komórek śródbłonka w 5 mL pożywki.Policz komórki za pomocą cytometru hematologicznego i dostosuj ich stężenie do 50 000 komórek śródbłonka na mililitr pożywki. Rozlej jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 24-dołkowej zawierającej powlekane szkiełka podstawowe i inkubuj komórki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Komórki są gotowe do pożądanego traktowania.Po utworzeniu się zgodnej warstwy jednowarstwowej w ciągu trzech dni, przenieść komórki HL 60 hodowane w pożywce RPMI uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej do probówki o pojemności 15 ml i odwirować komórki z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Następnie usunąć nadlewek i resuspender komórki w pięciu mililitrach pożywki bez surowicy w celu znakowania fluorescencyjnego komórek HL 60. Odliczyć i przenieść odpowiednią liczbę komórek do probówki wirówki o pojemności 15 ml.Odwirować komórki przy 200 ×g przez pięć minut. Po usunięciu nadsączu, zawiesić osad komórkowy w barwniku CellTracker w pożywce PMI bez surowicy. Przy stężeniu 1 milion komórek na ml inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez jedną godzinę; po inkubacji odwirować komórki przy 200 ×g przez pięć minut i odrzucić nadsącz.Zresuspenduj pellet komórkowy w medium do uzyskania stężenia 2 milionów komórek na mililitr. Do każdej studni 24-dołkowej płytki klastrowej zawierającej monowarstwę komórek śródbłonka dodaj jeden mililitr zawiesiny komórek HL 60 oznakowanych znacznikiem CellTracker i inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla przez wybrany, stały okres czasu od jednej do trzech godzin. Po zakończeniu inkubacji za pomocą precyzyjnej pęsety 5B wyjmij szklaną lamellkę ze studni, chwytając jedynie za jej zewnętrzną krawędź, a następnie osusz krawędź lamellki.Połóż szkiełko nakrywkowe na kawałku chusteczki higienicznej na blacie na trzy sekundy. Trzymając szkiełko nakrywkowe mocno pęsetą, uważaj, aby chusteczka nie dotknęła powierzchni pokrytej komórkami. Zanurz szkiełko nakrywkowe w HBSS i wyjmij je pięć razy; po piątym zanurzeniu.Osusz krawędź przykrywka za pomocą HBSS. Przesuń po niej chusteczkę przez trzy sekundy. Powtórz procedurę zanurzania i osuszania łącznie trzy razy, wykonując za każdym razem pięć zanurzeń, po których następuje osuszenie.Następnie przenieś szkiełko nakrywkowe do dołka zawierającego formułę Tencent w celu utrwalenia komórek w temperaturze pokojowej. Szkiełko nakrywkowe jest gotowe do zliczenia, długoterminowego przechowywania lub poddania barwieniu kontrastowemu przeciwciałami lub określaniu aktywności beta-galaktozydazy związanej z procesem starzenia, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zliczyć przylegające komórki śródbłonka, zamocuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach przedmiotowych z barwnikiem kontrastowym DPI, aby zidentyfikować poszczególne komórki przy użyciu mikroskopu odwróconego z obiektywem 4x lub 10x. Wykonaj zdjęcia kilku pól widzenia i policz najwyższą liczbę monocytów agregujących na nienapromieniowanych komórkach śródbłonka.Jeśli wymagane jest zdefiniowanie klastra, przyjmij dwukrotność tej liczby jako próg liczby monocytów na komórce śródbłonka. W zależności od charakteru eksperymentu można zastosować inne kryterium definiowania klastra. Policz liczbę klastrów oraz liczbę komórek śródbłonka w polu widzenia.Podziel wartość mianownika przez tę ostatnią, aby otrzymać procent przylegających komórek śródbłonka. Przeanalizuj liczne pola widzenia, aby uzyskać średnią oraz odchylenie standardowe liczby komórek. Monocyty wiązały się z monowarstwami śródbłonka siedem dni po naświetlaniu gamma, przed inkubacją z monocytami, tworząc skupiska wokół poszczególnych komórek śródbłonka.Choć zjawisko to jest łatwo dostrzegalne w mikroskopii fazowo-kontrastowej, mikroskopia fluorescencyjna pozwala na uzyskanie jeszcze wyraźniejszego obrazu skupisk monocytów. Po przeprowadzeniu opisanego testu ADI można przystąpić do barwienia białek błonowych, cytoplazmatycznych lub jądrowych przy użyciu odpowiednich przeciwciał. Stosując standardowe metody immunofluorescencji, należy zachować ostrożność podczas etapów płukania, ponieważ zbyt silny strumień może spowodować oderwanie monocytów.Ponadto można przeprowadzić testy enzymatyczne, takie jak test na obecność beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem (senescence-associated beta-galactosidase). Powoduje to zabarwienie lizosomów komórek starzejących się na niebiesko, co jest widoczne w komórce śródbłonka, do której selektywnie przyłączyło się liczne monocyty, zidentyfikowane po ich małym rozmiarze i kulistym kształcie. Ponieważ każdy skup monocytów odpowiada pojedynczej komórce śródbłonka, przeliczenie tych skup pozwala ustalić rzeczywistą liczbę adhezyjnych komórek śródbłonka w warstwie jednowarstwowej, a tym samym procent adhezyjnych komórek śródbłonka w całej populacji.Jest to jedyna do tej pory metoda pozwalająca na ilościowe określenie przyległości komórek śródbłonka, jeśli jest to pożądane. Monocyty przytwierdzone do monowarstw śródbłonka można odłączyć za pomocą roztworu trypsyny z EDTA, a następnie zmierzyć fluorescencję przy użyciu czytnika płytek, podobnie jak w przypadku współczesnych metod. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w cztery godziny przy bardzo krótkim czasie pracy manualnej. Należy pamiętać, że wszystkie etapy płukania i zanurzania muszą być przeprowadzone w identyczny sposób i z taką samą liczbą powtórzeń dla wszystkich próbek zgodnie z poniższą procedurą.W celu udzielenia odpowiedzi na pytania badawcze, takie jak jakie są cechy komórek śródbłonka adhezyjnych w porównaniu do komórek nieadhezyjnych, można przeprowadzić inne metody, takie jak immunofluorescencja oraz testy aktywności beta-galaktozysydazy związanej ze starzeniem.

quantitation-of-endothelial-cell-adhesiveness-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje prosty test adhezji bakteryjnej, polegający na zliczaniu jednostek tworzących kolonie bakterii, które przylgnęły do hodowli komórkowych. Test ten jest wiarygodny, niezależny od badanej adhezyny, a jego liczne modyfikacje są stosowane w większości laboratoriów zajmujących się patogenezą bakteryjną.

In Vitro Analiza Adhezji Bakteryjnej do Komórek Nabłonkowych Ssaków

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

W tym filmie demonstrujemy test wykorzystujący mikroskopię fluorescencyjną do wykrywania adhezji komórek rakowych do pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET). W studzienkach testowych obserwuje się znaczny wzrost liczby znakowanych fluorescencyjnie komórek rakowych przylegających do NET, podczas gdy studzienki potraktowane DNazą wykazują zmniejszoną adhezję komórek rakowych do NET.

Test adhezji in vitro w celu wykrycia przylegania komórek rakowych do zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Rekrutacja leukocytów do wątroby odbywa się w wyspecjalizowanych kanałach sinusoid wątrobowych, które są wyściełane unikalnymi komórkami śródbłonka sinusoidalnego wątroby.  Mikroskopia z kontrastem fazowym rekrutacji leukocytów przez ludzki śródbłonek sinusoidalny wątroby w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego może ułatwić wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw tego procesu.

Test adhezji przepływowej do badania rekrutacji leukocytów do ludzkiego śródbłonka sinusoidalnego wątroby w warunkach naprężeń ścinających

Opisano metodę ilościowego oznaczania adhezji neutrofili. Ta metoda tworzy dynamiczne środowisko przepływu podobne do tego, które występuje w naczyniu krwionośnym. Pozwala to na badanie adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych (ligand) lub substratu komórek śródbłonka (HUVEC) w kontekście podobnym do środowiska in vivo z czystym stresem.

Test adhezji w komorze przepływu ludzkich neutrofili

Tutaj prezentujemy protokół do ciągłego ilościowego oznaczania procesów adhezji i deadhezji komórek z wysoką rozdzielczością czasową w sposób nieinwazyjny poprzez impedancję substratu komórkowego i analizy obrazowania żywych komórek. Podejścia te ujawniają dynamikę procesów adhezji/deadhezji komórek wyzwalanych przez modyfikację matrycy i ich czasowy związek ze zdarzeniami sygnalizacyjnymi zależnymi od adhezji.

Wykorzystanie impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w adhezji komórkowej i deadhezji wywołanych modyfikacją matrycy

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Śródbłonek naczyniowy ściśle kontroluje rekrutację leukocytów. Niewystarczające wynaczynienie leukocytów przyczynia się do chorób zapalnych u ludzi. Dlatego poszukiwanie nowych elementów regulacyjnych aktywacji śródbłonka jest niezbędne do projektowania ulepszonych terapii zaburzeń zapalnych. W tym miejscu opisujemy kompleksową metodologię charakteryzującą nowe regulatory śródbłonka, które mogą modyfikować transport leukocytów podczas stanu zapalnego.

Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Tutaj opisujemy protokół, rozszerzoną metodę hodowli komórek śródbłonka (EECM), która umożliwia różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu (BMEC). Komórki te wykazują ekspresję cząsteczki adhezyjnej komórek śródbłonka, a zatem są modelem bariery krew-mózg odpowiednim do badania interakcji komórek odpornościowych in vitro.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym

Poznaj metodę kwantyfikacji adhezji komórek śródbłonka in vitro z wykorzystaniem ludzkich komórek tętnicy wieńcowej. Technika ta pozwala dokładnie mierzyć liczbę komórek adhezyjnych po zabiegach, zmniejszając zmienność wyników w badaniach biologii naczyń.

Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

Przeglądaj więcej filmów