Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Ogólnym celem tej procedury jest uproszczenie odczytu wyników analiz digital droplet assays z wykorzystaniem konwencjonalnego urządzenia do realtime PCR w celu pomiaru fluorescencji całkowitej analizy. Osiąga się to poprzez przygotowanie reakcji amplifikacji próbek badawczych oraz dwóch standardów, a następnie utworzenie kropelek, aby podzielić każdą z nich na tysiące reaktorów o rozmiarze nanolitra. Drugim krokiem jest inkubacja kropelek w celu amplifikacji kwasów nukleinowych wewnątrz każdej kropelki.

Następnie mierzy się całkowitą fluorescencję każdej próbki lub wzorca za pomocą standardowego QPC lub termocyklera. Ostatnim krokiem jest określenie frakcji kropel fluorescencyjnych w badanych próbkach z wykorzystaniem krzywej wzorcowej wyznaczonej na podstawie próbek standardowych. W celu weryfikacji skuteczności tej metody można zastosować mikroskopię fluorescencyjną, aby niezależnie ocenić wydajność ilościową analizy całkowitej fluorescencji.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak liczenie kropel, jest brak konieczności stosowania specjalistycznej aparatury. Przed rozpoczęciem procedury naprawy tego testu niezbędne są wszystkie odczynniki opisane w tekście protokołu oraz dwa standardy. Pierwszy to kontrola bez matrycy, taka jak woda wolna od nukleaz, a drugi to wysoka koncentracja matrycy, na przykład lambda DNA. Zdenaturuj 3,3 µL każdego standardu z 3,3 µL buforu do denaturacji w probówce A-Q-P-C-R.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Każdą próbkę zneutralizować, dodając 3,3 µL buforu neutralizującego. W analogiczny sposób denaturować 3,3 µL matrycy docelowej, dodając 3,3 µL buforu denaturującego i inkubując w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.

Zneutralizuj reakcję, dodając 3,3 µL buforu neutralizującego. Przygotuj 11 µL mieszaniny głównej (master mix) na próbkę, aby zminimalizować liczbę wyników fałszywie dodatnich. Przed formowaniem kropel naświetl mieszaninę główną światłem UV.

W pierwszej kolejności przygotować 10 µL mieszaniny premix dla każdej próbki w przezroczystej probówce o pojemności 0,5 ml lub 1,5 ml, utrzymując ją na lodzie. Mieszanina premix składa się z randomizowanych oligonukleotydów, buforu do reakcji polimerazy B-S-A-D-N-A, dn, NTP oraz wody wolnej od nukleaz. Umieścić probówkę w wodzie na lodzie, a następnie poddać działaniu światła UV.

Do mieszaniny wstępnej dodać barwnik wiążący A-D-S-D-N-A oraz dietę referencyjną. Na samym końcu dodać polimerazę DNA PHI 29, aby upewnić się, że polimeraza nie zostanie poddana działaniu wartości pH znacznie wyższych lub niższych niż 7,5. Dokładnie wymieszać, połączyć 10 µL zdenaturowanej matrycy lub standardu oraz 10 µL mieszaniny głównej i ponownie dobrze wymieszać.

Ponieważ kropelki mogą być bardzo wrażliwe na elektryczność statyczną i naprężenia ścinające, osoba przeprowadzająca eksperyment powinna zdjąć ubrania, które mogą generować ładunki elektrostatyczne, i uziemić się przed formowaniem kropelek. Urządzenie mikrofluidyczne użyte w tej demonstracji zostało wyprodukowane wewnątrz jednostki i posiada wlot dla fazy olejowej oraz dwa wloty dla fazy wodnej z złączem ogniskującym przepływ do generowania kropelek. Należy użyć dwóch pomp strzykawkowych do kontroli szybkości przepływu 55 µL oleju z surfaktantem oraz 20 µL mieszaniny reakcyjnej przez chip mikrofluidyczny.

Aby wygenerować krople o objętości 20 001 nanolitrów, jednym z najtrudniejszych etapów jest zbieranie kropel bez zakłócania emulsji. Ważne jest, aby pipetować powoli i najlepiej z użyciem szerokiego grotu.

Wszystkie kropelki z każdej próbki należy zebrać do probówek PCR. Za pomocą końcówki o szerokim otworze, pipetując bardzo powoli, należy odmierzyć 30 µL oleju do nowych probówek PCR z optycznymi nakrętkami. Następnie należy przenieść 20 µL kropelek na powierzchnię oleju.

Zapewnienie stałych objętości gwarantuje jak najwyższą dokładność analizy. Należy szczelnie zamknąć nakrętki probówek, ponieważ nieszczelne zamknięcie doprowadzi do odparowania oleju; probówki z emulsją należy trzymać za górną część, jak najdalej od samej emulsji. Do amplifikacji izotermicznej można wykorzystać termocykler PCR, termocykler A-Q-P-C-R lub płytkę grzejną.

W tej demonstracji zastosowano termocykler A-Q-P-C-R. Próbki inkubowano przez siedem godzin w temperaturze 30 °C, a następnie inaktywowano przez jedną minutę w temperaturze 75 °C. Bezpośrednio po reakcji i aktywacji.

Zmierz poziomy fluorescencji dla wszystkich próbek za pomocą termocyklera QPCR. Dla każdej próbki podziel intensywność fluorescencji barwnika wiążącego dsDNA przez intensywność fluorescencji barwnika referencyjnego.

Odjąć fluorescencję tła lub znormalizowaną fluorescencję kontroli bez matrycy od wszystkich próbek. Stworzyć liniową krzywą wzorcową, wykorzystując pomiary korygującej fluorescencji ze wzorców. Wzorzec kontroli bez matrycy reprezentuje fluorescencję dla próbki z 0% fluorescencyjnych kropli oraz dla wysokiego stężenia matrycy.

Pomiar fluorescencji to oczekiwana fluorescencja dla próbki z 100% fluorescencyjnymi kropelkami, wyznaczona przy użyciu odpowiedniej krzywej wzorcowej. Przewiduje ona pośrednie proporcje kropelek pozytywnych i negatywnych na podstawie ich fluorescencji całkowitej. Metoda ta wykorzystuje konwencjonalne urządzenie do real-time PCR do pomiaru fluorescencji całkowitej w cyfrowych testach opartych na kropelkach.

Krople fluorescencyjne i niefluorescencyjne zmieszano wstępnie w różnych proporcjach, a następnie porównano fluorescencję całkowitą z frakcją kropel pozytywnych. Zgodnie z oczekiwaniami, fluorescencja całkowita oraz liczba kropel pozytywnych skalują się liniowo w zależności od wejściowej frakcji kropel fluorescencyjnych. Przewidywane proporcje na podstawie wzorców porównano z oczekiwanymi wejściowymi frakcjami fluorescencyjnymi.

Linia wskazuje wartość oczekiwaną przy założeniu zależności liniowej. Wyniki wykazują wysoką precyzję w kwantyfikacji stosunku kropel w zakresie dwóch rzędów wielkości zakresu dynamicznego. Aby przetestować tę metodę w rzeczywistym ilościowym badaniu amplifikacji całego genomu, wykorzystano poziomy fluorescencji oraz frakcje kropel pozytywnych w technice cyfrowych kropel.

Przeprowadzono test MDA z zastosowaniem rosnących stężeń matrycowego DNA Lambda. Linia wskazuje oczekiwaną frakcję fluorescencyjną, wykorzystując rozkład Poissona do modelowania danych z eksperymentu. Przedstawiono reprezentatywne obrazy fluorescencyjne kropel; zarówno całkowita fluorescencja, jak i frakcja kropel pozytywnych z cyfrowych próbek MDA skalują się zgodnie z oczekiwaniami w zależności od średniej liczby matryc na kroplę, co wskazuje, że odczyt całkowity może wiernie oddać wynik testu cyfrowego.

Metoda ta może przynieść korzyści innym analizom cyfrowym, takim jak cyfrowy PCR, poprzez przyspieszenie, zrównoleglenie i uproszczenie odczytu wyników analizy.