Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Ogólnym celem tej procedury jest uproszczenie odczytu cyfrowych testów kropelkowych przy użyciu konwencjonalnego instrumentu PCR w czasie rzeczywistym do pomiaru fluorescencji masowej testu. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw reakcji amplifikacji interesujących nas próbek, dwóch wzorców i uformowanie kropel, które dzielą się na tysiące reaktorów o rozmiarach nanolitrów. Drugim krokiem jest inkubacja kropelek w celu amplifikacji kwasów nukleinowych w każdej kropli.

Następnie fluorescencja objętościowa każdej próbki lub wzorca jest mierzona za pomocą standardowego QPC lub termocyklera. Ostatnim krokiem jest przewidzenie frakcji kropelek fluorescencyjnych w próbkach będących przedmiotem zainteresowania przy użyciu krzywej wzorcowej wygenerowanej z próbek wzorcowych. Aby zweryfikować skuteczność tej metody, mikroskopia fluorescencyjna może być wykorzystana do niezależnej oceny wydajności ilościowej testu fluorescencji masowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak liczenie kropel, jest to, że nie wymaga specjalistycznego oprzyrządowania Przed rozpoczęciem naprawy testu. Wymagane są wszystkie niezbędne odczynniki zgodnie z opisem w tekście protokołu, wymagane są dwa wzorce. Jeden, bez kontroli matrycy, taki jak woda wolna od nukleaz i jeden wysoki poziom stężenia matrycy, taki jak lambda, DNA, denaturacja 3,3 mikrolitra każdego wzorca z 3,3 mikrolitra buforu denaturacyjnego w probówce A-Q-P-C-R.

Inkubuj go w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Ugasić każdy z 3,3 mikrolitra buforu neutralizacyjnego. Podobnie, denaturuj 3,3 mikrolitra interesującej nas matrycy za pomocą 3,3 mikrolitra buforu denaturacyjnego inkubowanego w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.

Ugasić 3,3 mikrolitra buforu neutralizacyjnego. Przygotuj 11 mikrolitrów mieszaniny wzorcowej na próbkę, aby uzyskać mniej wyników lub wyniki fałszywie dodatnie. Wystawić mieszankę wzorcową na działanie światła UV przed utworzeniem kropel.

Najpierw przygotuj 10 mikrolitrów mieszanki premiksów na próbkę w przezroczystej tubie o pojemności 0,5 mililitra lub 1,5 mililitra na lodzie. Mieszanina premiksów składa się z randomizowanego oligo, buforu reakcyjnego polimerazy B-S-A-D-N-A, DN, NTP i wody wolnej od nukleaz. Umieść probówkę w wodzie na lodzie i wystaw na działanie światła UV po ekspozycji na promieniowanie UV.

A-D-S-D-N-A wiążący barwnik i dieta referencyjna z mieszanką premiksu. Dodaj polimerazę DNA PHI 29 na końcu, aby upewnić się, że polimeraza nie napotka poziomu pH znacznie wyższego lub niższego niż 7,5. Dobrze wymieszaj, wymieszaj 10 mikrolitrów denaturowanego szablonu lub wzorca i 10 mikrolitrów mieszanki wzorcowej, dobrze wymieszaj.

Ponieważ kropelki mogą być bardzo wrażliwe na elektryczność statyczną i zwykły stres, eksperymentator powinien zdjąć ubrania, które mogą powodować elektryczność statyczną i uziemić się w miejscu przed utworzeniem kropel. Urządzenie mikroprzepływowe użyte do tej demonstracji zostało wyprodukowane we własnym zakresie i ma wlot oleju oraz dwa wloty wody z łącznikiem skupiającym przepływ do generowania kropel. Użyj dwóch pomp strzykawkowych, aby kontrolować natężenie przepływu 55 mikrolitrów oleju ze środkiem powierzchniowo czynnym i 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej przez chip mikroprzepływowy.

Aby wygenerować 20 001 nanolitrowych kropel, Jednym z najtrudniejszych kroków jest zebranie kropelek bez naruszania emulsji. Ważne jest, aby pipetować powoli i najlepiej. Użyj szerokiej końcówki do deski.

Zebrać wszystkie kropelki do probówek PCR dla każdej próbki. Porcjować 30 mikrolitrów oleju do świeżych probówek PCR z nasadkami optycznymi za pomocą końcówki o szerokim otworze i pipetować bardzo powoli. Przenieś 20 mikrolitrów kropelek na wierzch oleju.

Stałe objętości zapewniają, że test jest tak dokładny, jak to tylko możliwe. Zamknij szczelnie nakrętki tuby, ponieważ luźne nakrętki pozwolą olejowi odparować rurki emulsji z uchwytu od góry tubki jak najdalej od emulsji. Do amplifikacji izotermicznej można użyć termocyklera PCR, TERMOCYKLERA A-Q-P-C-R lub płyty grzejnej.

W tej demonstracji używany jest termocykler A-Q-P-C-R. Inkubować próbki przez siedem godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza i inaktywować przez jedną minutę w temperaturze 75 stopni Celsjusza. Natychmiast po reakcji i aktywacji.

Zmierz poziomy fluorescencji dla wszystkich próbek za pomocą termocyklera QPCR. Dla każdej próbki. Podzielić intensywność fluorescencji barwnika wiążącego D DS DNA przez intensywność fluorescencji barwnika wzorcowego.

Odejmij fluorescencję tła lub znormalizowaną fluorescencję kontroli bez matrycy od wszystkich próbek. Utwórz liniową krzywą wzorcową, korzystając z korekcyjnych pomiarów fluorescencji z wzorców. Wzorzec kontroli bez matrycy reprezentuje fluorescencję próbki z 0% kropelkami fluorescencyjnymi i wysokim stężeniem matrycy.

Pomiar fluorescencji to oczekiwana fluorescencja próbki ze 100% fluorescencyjnymi kropelkami przy użyciu odpowiedniej krzywej wzorcowej. Przewiduj pośrednie proporcje kropel dodatnich i ujemnych na podstawie ich fluorescencji objętościowej. Metoda ta wykorzystuje konwencjonalny instrument do PCR w czasie rzeczywistym do pomiaru fluorescencji masowej w testach cyfrowych opartych na kropelkach.

Kropelki fluorescencyjne i niefluorescencyjne zostały wstępnie zmieszane w różnych proporcjach i porównano fluorescencję objętościową z frakcją kropel dodatnich. Zgodnie z oczekiwaniami, fluorescencja masowa i dodatnia liczba kropel skaluje się liniowo z frakcją wejściową kropel fluorescencyjnych. Przewidywane proporcje oparte na wzorcach porównano z oczekiwanymi fluorescencyjnymi frakcjami wejściowymi.

Linia wskazuje wartość oczekiwaną przy danej zależności liniowej. Wyniki wskazują na dobrą wydajność w kwantyfikacji stosunku kropel w dwóch logarytmach zakresu dynamiki. Aby przetestować tę metodę w rzeczywistym ilościowym teście amplifikacji całego genomu, poziomy fluorescencji i frakcje dodatnich kropel kropli cyfrowej.

Zmierzono test MDA ze wzrostem stężenia matrycowego DNA Lambda. Linia wskazuje oczekiwaną frakcję fluorescencyjną przy użyciu rozkładu poissanta do modelowania danych z eksperymentu. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne kropel są pokazane zarówno fluorescencyjną, jak i dodatnią frakcję kropel z cyfrowej skali próbek MDA, zgodnie z oczekiwaniami ze średnią matrycą na kroplę, co wskazuje, że odczyt masowy może wiernie uchwycić wynik cyfrowego testu.

Ta metoda może przynieść korzyści innym testom cyfrowym, takim jak cyfrowy PCR, przyspieszając równoległość i upraszczając odczyt testu.