Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykorzystanie implantacji mikrokuleczek do wprowadzenia zmian w lokalnym środowisku tkankowym w określonych punktach przestrzennych i czasowych podczas embriogenezy danio pręgowanego. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie tacy do implantacji kuleczek, aby ułatwić precyzyjną manipulację i implantację mikrokuleczek. W drugim kroku jaja danio pręgowanego są inkubowane do pożądanego stadium rozwoju.

Następnie mikrokulki przygotowuje się w odpowiednich roztworach eksperymentalnych i ostrożnie przenosi w pożądane miejsce wewnątrz zarodka. W ostatecznym rozrachunku implantację mikrokulek można przeprowadzić bez zakłócania prawidłowego rozwoju danio pręgowanego, co pozwala na ocenę wpływu interesujących badacza cząsteczek na embriogenezę ryb z gatunku zebrafish. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak: w jaki sposób różne cząsteczki wpływają na proces organogenezy?

Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ opanowanie techniki obchodzenia się z mikrokulkami wymaga praktyki. Aby przygotować tackę do implantacji mikrokulek, należy najpierw podgrzewać świeżo przygotowany 2% roztwór aro przez 90 sekund. Proces ten należy przeprowadzić w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml, delikatnie obracając kolbą co 30 sekund, aby zapobiec wykipieniu żelu.

Następnie umieść pokrywkę szalki Petriego o wymiarach 60 by 15 mm w szalce o wymiarach 150 by 15 mm, tak aby wewnętrzna strona pokrywki była skierowana do góry. Następnie, stabilizując pokrywkę mniejszej szalki Petriego palcem wskazującym, wlej gorący żel agarowy do większej szalki.

Pozwól na utworzenie się cienkiej warstwy agros pod mniejszą pokrywką, aby zapobiec kondensacji pary wodnej i ułatwić obserwację kulek pod mikroskopem podczas stygnięcia agros. Zanim żel zastygnie, powoli wprowadź formę do dołka w górną część żelu, aby ułatwić umieszczenie embrionów. Po zestaleniu żelu ostrożnie usuń formę do dołka za pomocą mikrospatułki.

Następnie należy dodać do naczynia roztwór E3 i przechowywać je w temperaturze 4 °C. Aby zebrać embriony danio pręgowanego, należy napełnić komorę do tarła wodą systemową. Następnie w środku komory należy umieścić przegrodę i umieścić dorosłe osobniki samce i samice danio pręgowanego po odpowiednich stronach komory.

Następnego ranka należy użyć drobnego sita z drucianej siatki, aby zebrać zapłodcone jaja. Odwrócić sito do góry dnem w czystej płytce Petriego o średnicy 10 cm i płukać siatkę cienkim strumieniem roztworu E3, aż w sicie nie zostaną żadne jaja, a w płytce znajdzie się około 25 ml roztworu E3. Następnie należy podzielić jaja pomiędzy kilka płytek, umieszczając od 50 do 60 jaj na płytkę, aby uniknąć zbyt dużego zagęszczenia, i inkubować jaja w roztworze E3 w temperaturze 28,5 °C; przed implantacją mikrokulek inkubować je w odpowiedniej objętości testowanej cząsteczki lub nośnika kontrolnego przez odpowiedni czas.

Następnie, gdy embriony osiągną pożądany punkt czasowy rozwoju, użyć pęsety precyzyjnej, aby usunąć ich kons, a następnie inkubować danio pręgowane w filtrowanym roztworze Ringera z dodatkiem antybiotyków przez 10 minut, podczas gdy embriony aklimatyzują się. Przenieść mikrokulki do wcześniej przygotowanej płytki do mikrokulek, umieszczonej w tacy do implantacji, a następnie płukać kulki i roztwór Ringera przez 10 minut.

W ciągu 50 minut od wypłukania kulek ułóż zarodki jeden po drugim w dołku tacy do implantacji w taki sposób, aby obszar implantacji mikrokulek był dostępny. Za pomocą igły wolframowej wykonaj niewielkie nacięcie w zarodku, następnie naciśnij gruszkę mikrokapilarnej pipety transferowej, aby delikatnie wciągnąć mikrokuleczkę do kolumny kapilarnej, a następnie zwolnij nacisk, aby przenieść mikrokuleczkę do tacy implantacyjnej, co ułatwi manipulowanie nią. Delikatnie pchnij kuleczkę, aby zanurzyła się w roztworze Ringera wewnątrz formy.

Następnie, używając mikropipety, przenieś mikrokulkę na embrion i wprowadź ją do nacięcia. Na koniec, za pomocą narzędzia do manipulacji (tzw. whiskera), odsuń mikrokulkę od miejsca nacięcia, aby nie została ona wypchnięta podczas gojenia. Powodzenie implantacji mikrokulki można wówczas natychmiast ocenić pod mikroskopem stereoskopowym, ponieważ kulka powinna pozostać stabilnie umieszczona w tkance.

W tym eksperymencie pojedyncze mikrokulki o dwóch różnych rozmiarach, płukane wyłącznie roztworem Ringera, zostały wszczepione do embrionów zebrafish na etapie pączka ogonowego lub w późniejszych punktach czasowych podczas miogenezy, aby upewnić się, że położenie kulki nie zmieniło się w trakcie trwania eksperymentu na skutek endogennej morfogenezy tkanek. Próbki embrionów można wizualizować za pomocą fotografii z przebiegiem czasowym lub sprawdzać w regularnych odstępach czasu, zgodnie z obrazami prezentującymi implantację mikrokulek. W przypadku braku koniugatów możliwe jest zastosowanie małych cząsteczek bez wywoływania drastycznych efektów morfologicznych podczas prawidłowego rozwoju embrionu ryby SPR.

Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak Whole Mount In Situ Hybridization, aby zbadać wpływ mikrokulek na ekspresję genów. Ogólnie rzecz biorąc, zrozumienie pozycji kuleczki w czasie jest kluczowe dla interpretacji wyników, na przykład przy ocenie wpływu małej cząsteczki na tkankę docelową lub proces rozwojowy.