Name: Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Naucz się techniki implantacji mikrogranulek w zarodki Danio rerio, aby badać biologię rozwoju bez zakłócania normalnego rozwoju. Ta metoda umożliwia ocenę wpływu cząsteczek na organogenezę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez DP2OD008470 grantu NIH.

Procedury pracy z embrionami danio pręgowanego opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Notre Dame.
1. Przygotowanie roztworu Ringera
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 3,6 mM CaCl2 i 5 mM Hepes z ultraczystymH2Opoprzez ciągłe mieszanie, aby uniknąć wytrącania się soli.</li>
	<li>Po dodaniu soli, gdy roztwór nadal miesza, dodać 100 jednostek/penicylinę na ml i 100 μg streptomycyny na ml.</li>
	<li>Po dodaniu wszystkich antybiotyków i soli należy przeprowadzić sterylizację filtracyjną roztworu i przechowywać w sterylnym pojemniku. 
	Uwaga: N-fenylotiomocznik (1-fenylo-2-tiomocznik) lub PTU można dodać do roztworu Ringera w celu zablokowania tworzenia się pigmentu w zarodkach z zagnieżdżonymi kulkami bez negatywnych konsekwencji dla zdrowia zarodka. Do przygotowania roztworu Ringera/blokującego pigmentację należy użyć roztworu o stężeniu 0,003% PTU. Ze względu na niskie stężenie PTU, które ma być dodawane, zaleca się przygotowanie większej objętości roztworu Ringera, co najmniej 1 l, aby uniknąć dodawania niewielkich ilości proszku PTU. Dodaj PTU w kroku 1.2, podczas gdy roztwór miesza.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu trikainy
<ol>
	<li>Dodać 2 g soli metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu (Trikainy) na l roztworu plus 0,1 M Tris, z 1 M podstawowego roztworu zbalansowanego do pH 9,5 i otrzymanego z ultraczystym H2O. 
	Uwaga: Trikaina zostanie użyta do eutanazji zarodków danio pręgowanego w pożądanym punkcie czasowym w celu zbadania fenotypów implantacji koralików.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworu E3
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 0,25 M NaCl, 10 mM KCl, 12,5 mM CaCl2 i 16,6 mM MgSO4 do 1 l ultraczystej wody, aby uzyskać 1 l E3.</li>
	<li>Dodaj 200 μl błękitu metylenowego do roztworu E3, aby zahamować rozwój grzybów.</li>
</ol>
4. Ciągnięcie igieł do przenoszenia mikrokulek
<ol>
	<li>Użyć polerowanego ogniowo szkła borokrzemianowego z żarnikiem o średnicy zewnętrznej: 1,0 mm, średnicy wewnętrznej: 0,5 mm, o długości 10 cm.</li>
	<li>Umieść szkło borokrzemowe w ściągaczu do mikropipet, aby przygotować cienkie igły. 
	Uwaga: Następujące cztery wymiary mogą być użyte jako punkt wyjścia do wyciągania igieł: Ciepło = 540, Ciągnięcie = 245, Prędkość = 200 i Czas = 125.</li>
	<li>Po wyciągnięciu odpowiedniej liczby igieł przechowywać na przykrytych plastikowych szalkach Petriego, umieszczonych na paskach plasteliny lub taśmie klejącej, aby zapobiec złamaniu końcówki igły, do czasu użycia.</li>
	<li>Aby przyciąć końcówkę igły do żądanego rozmiaru otworu, użyj pary drobnych kleszczy, aby naciąć koniec igły. 
	Uwaga: Rozmiar otworu igły będzie się różnić w zależności od używanego rozmiaru mikrokulek, a także preferencji użytkownika dotyczących obsługi. Dobrym punktem wyjścia jest wykonanie otworów o rozmiarach od 100 do 200 μm, jeśli zostaną wykorzystane mikrogranulki w zakresie od 50 do 100 μm.</li>
	<li>Przed użyciem włóż przyciętą igłę do uchwytu rurki kapilarnej, aby uformować gotowy instrument do przenoszenia mikrokulek.</li>
</ol>
5. Przygotowanie narzędzia do wąsów/rzęs
<ol>
	<li>Zdobądź wąsy, rzęsy lub inny mały, ale mocny kawałek naturalnego lub syntetycznego włókna włosowego. Ciąć w pobliżu podstawy filamentu pod kątem 45°. Przyklej wąs do końcówki mikropipety P-1000 za pomocą trwałego, przezroczystego kleju samoprzylepnego.</li>
</ol>
6. Przygotowanie tacki do implantacji mikrokulek
<ol>
	<li>Zmieszać 2 g agarozy ze 100 ml roztworu E3, aby uzyskać 2 % żel agarozowy E3.</li>
	<li>Podgrzewać 2 % roztwór agarozy przez 1 minutę i 30 sekund w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml, obracając kolbę co 30 sekund, aby uniknąć bulgotania żelu.</li>
	<li>Weź pokrywkę szalki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm i umieść ją w większym naczyniu o wymiarach 150 mm x 15 mm wnętrzem skierowanym do góry.</li>
	<li>Wlej gorący żel agarozowy do szalki Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm, upewniając się, że palcem wskazującym zakotwiczyłeś pokrywkę mniejszego naczynia. 
	Uwaga: Pozostaw cienką warstwę agarozy pod pokrywką mniejszego naczynia, aby usunąć kondensację, która utworzy się podczas nalewania żelu; Sprawi to, że koraliki będą lepiej widoczne pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Gdy agaroza ostygnie, ale zanim zastygnie, dobrze umieść formę na żelu. Pozwoli to na łatwiejsze umieszczanie zarodków.</li>
	<li>Uwaga: Aby uniknąć pęcherzyków w studzienkach, powoli umieszczaj formę pod kątem, aż będzie unosić się na wierzchu żelu.</li>
	<li>Za pomocą mikroszpatułki ostrożnie usuń dobrze pleśń, gdy żel zastygnie. Dodać roztwór E3 i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
7. Pobieranie zarodków
<ol>
	<li>Przygotuj komory godowe, oddzielone przegrodami, napełniając je wodą systemową, a następnie umieszczając dorosłe pary samców i samic danio pręgowanego w komorach O/N.</li>
	<li>Zbierz zapłodnione jaja za pomocą drobnego sitka z siatki drucianej (stadia embrionalne będą się nieznacznie różnić).</li>
	<li>Umieść zapłodnione jaja na czystej szalce Petriego o średnicy 10 cm, obracając sitko do góry nogami i spłukując je drobnym strumieniem E3, aż w sitku nie pozostaną żadne jaja, a w naczyniu znajduje się około 25 ml roztworu E3.</li>
	<li>Po zebraniu podziel jaja na kilka misek (około 50-60 jaj na półkę), aby uniknąć przepełnienia, które może prowadzić do asynchroniczności rozwojowej w obrębie lęgu i utrudnić zbieranie pożądanych punktów czasowych.</li>
	<li>Inkubować zarodki w roztworze E3 w temperaturze 28,5 °C, aby umożliwić ocenę rozwoju zgodnie ze standardową serią oceny stopnia zaawansowania danio pręgowanego 40, 
	Uwaga: Zarodki należy przenieść do E3/PTU po 24 godzinach od zapłodnienia (hpf), aby zapobiec rozwojowi pigmentu, jeśli manipulacje w starszych stadiach wymagają przejrzystości optycznej.</li>
</ol>
8. Implantacja koralików
<ol>
	<li>Inkubować mikrogranulki w pożądanym stężeniu cząsteczki badanej lub w odpowiednim roztworze nośnika przez wymagany czas w odpowiedniej objętości. 
	Uwaga: Badacz może użyć sterylnych szalek Petriego o średnicy od 3 do 6 cm lub płytek wielodołkowych, które umożliwiają wizualizację mikrogranulek w roztworze. Czas może się różnić w zależności od rodzaju i ilości cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, a badacz powinien zapoznać się z zaleceniami producenta lub opublikowanymi zaleceniami dotyczącymi czasu inkubacji i innych aspektów, takich jak wrażliwość na światło i temperaturę.</li>
	<li>Gdy zarodki osiągną pożądany punkt czasowy rozwoju, usuń zarodki z ich kosmówki za pomocą cienkich kleszczy.</li>
	<li>Inkubuj zarodki w przefiltrowanym roztworze Ringera z antybiotykami przez 10 minut, aby przyzwyczaić je do roztworu.</li>
	<li>Podczas aklimatyzacji zarodków przenieś mikrogranulki do płytki mikrogranulek umieszczonej w tacce implantacyjnej i płucz je w roztworze Ringera przez 10 minut 
	Uwaga: Wszczep koraliki w ciągu 50 minut po osiągnięciu tego punktu. Zmniejszy to prawdopodobieństwo, że zostanie wszczepiony koralik o mniejszym stężeniu interesującej nas cząsteczki.</li>
	<li>Ułóż zarodki w dołkach tacki do implantacji mikrogranulek, uważając, aby ustawić je tak, aby obszar zainteresowania, w którym zostanie wszczepiony mikrogranulek, był dostępny.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie na zarodku za pomocą igły wolframowej.</li>
	<li>Przenieś mikrogranulkę na zarodek za pomocą pipety do transferu mikrokapilarnego: naciskając gruszkę pipety, delikatnie wciągnij mikrokulkę do kolumny kapilarnej, a następnie zwolnij nacisk, aby przenieść mikrokulkę w żądane miejsce.</li>
	<li>Użyj narzędzia do wąsów/rzęs, aby umieścić mikrogranulkę wewnątrz zarodka. Uwaga: Pamiętaj, aby umieścić mikrogranulkę w tkance z dala od miejsca nacięcia, aby mikrogranulka nie została wydalona z zarodka podczas gojenia.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ciągu ostatniego stulecia zrozumienie wzorców planu ciała i organogenezy poczyniło ogromne postępy. Techniki manipulacji tkankami miały kluczowe znaczenie dla odkrycia kluczowych informacji na temat tych ważnych procesów. Modyfikacja genetyczna jest jedną z najczęściej stosowanych metod ustalania funkcji genów, a metody analizy mozaikowej, takie jak przeszczep komórek, dostarczają użytecznych podejść do zrozumienia autonomii funkcji genów. Implantacja mikrogranulek stanowi kolejne miejsce do zbadania, w jaki sposób poszczególne cząsteczki zmieniają dynamikę rozwoju, ponieważ metoda ta umożliwia badaczowi zmianę lokalnego środowiska tkankowego poprzez wprowadzenie cząsteczek sygnałowych lub inhibitorów. Na rynku dostępnych jest wiele różnych mikrogranulek, które mają różne rozmiary i istnieją inne właściwości fizyczne (np. ładunek), dzięki czemu można je zastosować w warunkach eksperymentalnych. W ten sposób, wszczepiając mikrogranulki, które są nasączone w białku lub substancji chemicznej będącej przedmiotem zainteresowania w organizmie, naukowcy mogą badać miejscowe efekty podczas rozwoju i znaleźć powiązania między genem lub cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania a określonym fenotypem biologicznym.
W badaniach, takich jak to przeprowadzone przez Wada i współpracowników, wykorzystano implantację mikrogranulek w celu oceny wpływu zwiększonej sygnalizacji Hedgehog na wzorzec szkieletowy w przednim neurokranium (ANC) u danio pręgowanego 23. Wcześniejsze badania wykazały, że Shh jest wymagane do tworzenia ANC 14. Korzystając z mikrogranulek pokrytych Shh, naukowcy odkryli, że sygnał ten sprzyja tworzeniu się chrząstki w ANC. Proces implantacji mikrokulek wykorzystano do wykazania wyraźnego związku między sygnalizacją Hedgehog a tworzeniem się chrząstki w ANC. Inny kluczowy przykład tej techniki manipulacji tkankami u danio pręgowanego obserwuje się w badaniach, w których naukowcy badali kontrolę transkrypcji czynników domeny Erythroblastoma Twenty-Six (ETS), cząsteczki związanej z ETS (Erm) i aktywatora wzmacniacza polioma 3 (Pea3) poprzez sygnalizację Fgf podczas wczesnego rozwoju mózgu danio pręgowanego 19. Dzięki eksperymentom z implantacją mikrogranulek udało im się wykazać, że Fgf8 i Fgf3 mogą ektopowo aktywować ekspresję erm i grochu3. Przykłady te ilustrują użyteczność mikrogranulek w celu zapewnienia wglądu w mechanizmy rozwojowe, które współpracują podczas tworzenia tkanek, które można dobrze scharakteryzować za pomocą metod oceny ekspresji genów 41. W związku z tym przeszczep mikrogranulek może być realną metodą badania innych tkanek, takich jak mezoderma pośrednia (IM), która daje początek nerce. W szczególności pomogłoby to w badaniach nad rozwojem nerek, aby zbadać, w jaki sposób różne cząsteczki wpływają na segmentację nefronów 42 i tuburologenezę 43,44, procesy, które obecnie są tylko powierzchownie rozumiane. Co więcej, implantacja mikrogranulek zaczęła być stosowana do badania procesów regeneracji u ryb danio pręgowanego i może być dostosowana do stosowania z dowolną liczbą modeli regeneracji narządów, takich jak ablacja laserowa tkanek embrionalnych, takich jak nefron 45 lub w połączeniu z metodami, które zostały opracowane w celu przeprowadzenia badań z odpowiednimi dorosłymi strukturami 46-49. Wreszcie, implantacja mikrogranulek może być stosowana w modelach chorób ludzkich, takich jak rak 50,51 lub zwyrodnienie tkanek 52,53.
W niniejszym protokole demonstrujemy metodę implantacji mikrogranulek w zarodkach danio pręgowanego, która została również podobnie opisana przez innych badaczy, ale nie została pokazana za pomocą protokołów wideo 1. Przy minimalnej praktyce byliśmy w stanie wszczepić mikrogranulki w przybliżeniu 8-10 zarodków / godzinę, co wiąże się z wykonalnością tej procedury, gdy badacz zdobędzie pewne doświadczenie. Przedstawione tutaj wyniki pokazują, że koraliki o różnych rozmiarach mogą być wszczepiane we wczesnych stadiach i że przy zachowaniu ostrożności ta technika manipulacji tkankami może być stosowana przy minimalnym fizycznym zakłóceniu zarodka. Jednym z ulepszeń, na które należy zwrócić uwagę, jest użycie narzędzia do wąsów/rzęs do umieszczania mikrogranulki w zarodku. Ten stosunkowo niedrogi i prosty sprzęt ma mniej więcej taką samą średnicę jak mikrogranulka, jest łatwy do uzyskania i pomaga przyspieszyć proces implantacji. Wąs/rzęsę można przyciąć do pożądanej długości, aby uzyskać mocne, ale delikatne narzędzie do obsługi koralików, w zależności od zręczności i preferencji badacza. Wreszcie, chociaż opisaliśmy tutaj, jak fizycznie manipulować mikrogranulkami i zarodkami danio pręgowanego w celu przeprowadzenia implantacji, protokół ten nie określa konkretnych procedur postępowania z różnymi lekami lub peptydami. Ogólnie rzecz biorąc, mikrogranulki poddane działaniu substancji chemicznej powinny być wszczepiane zwierzęciu z dużą ostrożnością, aby uniknąć niepożądanych skutków w innych obszarach organizmu, a naukowcy powinni być dobrze poinformowani o możliwych obawach dotyczących bezpieczeństwa związanych z takimi chemikaliami przed rozpoczęciem badań.
Podsumowując, zademonstrowaliśmy stosunkowo prostą i wydajną metodę implantacji mikrogranulek o szerokim zakresie zastosowań przy użyciu materiałów, które są łatwo dostępne w laboratorium. Mamy nadzieję, że podręcznik ten pomoże naukowcom zajmującym się delikatną naturą manipulacji tkankami danio pręgowanego.

Badacze biologii rozwojowej wykorzystują szeroki wachlarz metod komórkowych, molekularnych i genetycznych, aby odkryć mechanizmy kontrolujące formowanie organizmu. Wśród tych podejść manipulacja tkankami jest kluczowym narzędziem w rozszyfrowywaniu złożonych pytań dotyczących losu komórek, ruchu komórek i organizacji tkanek. Jednym ze sposobów zmiany lokalnego środowiska tkankowego jest chirurgiczne zastosowanie mikrogranulek, które są używane do dostarczania ogniskowego źródła białek lub innych cząsteczek sygnałowych 1. Ten rodzaj eksperymentalnej manipulacji został szeroko zastosowany w klasycznych modelach embriologicznych kręgowców, takich jak żaba i pisklę 2.
Danio pręgowany stał się ważnym modelowym organizmem kręgowców do badań organogenezy, a także zapewnia wiele unikalnych korzyści w modelowaniu chorób 3-5, ponieważ dzielą z ludźmi wysoką ochronę genetyczną 6. W szczególności przezroczystość optyczna i rozwój zewnętrzny zarodka danio pręgowanego oferują niezrównany punkt widzenia do obserwacji ontogenezy tkanek 3-5. Wdrożenie zakrojonych na szeroką skalę badań genetycznych pozwoliło na stworzenie potężnego repozytorium zmutowanych szczepów danio pręgowanego do dalszych badań 7,8 oraz identyfikacji alternatywnych technik przesiewowych, które można skutecznie przeprowadzić na mniejszą skalę w pojedynczych laboratoriach 9,10. Dalsze prace eksperymentalne na danio pręgowanym zostały ułatwione dzięki postępom w metodologiach transgenicznych i odwrotnych podejściach genetycznych 11,12, a także genetyce chemicznej 13-15.
Techniki manipulacji tkankami, takie jak implementacja mikrogranulek, nie były tak szeroko stosowane u danio pręgowanego, ale mimo to dostarczają użytecznego narzędzia do dalszego zrozumienia sygnalizacji komórkowej podczas rozwoju. Wszczepienie mikrogranulek zostało wykorzystane do zbadania procesów tworzenia się narządów w siatkówce danio pręgowanego 16,17, sercu 18, mózgu 19-22, grzebieniu nerwowym 23 i płetwie 24,25. W tych i innych badaniach kulki zostały zastosowane podczas rozwoju, aby zrozumieć dyfuzję cząsteczek sygnałowych 26, jak gradienty wpływają na migrację komórek 27 i wzorzec osiowy 28. Ostatnio mikrogranulki zostały wykorzystane do oceny mechanizmów regeneracji u dorosłych ryb danio pręgowanego 29. Na przykład w badaniach rozwojowych prace nad mikrokulkami danio pręgowanego dostarczyły informacji na temat mechanizmów tworzenia kończyn dzięki badaniom płetwy piersiowej 25. Pączek płetwy piersiowej danio pręgowanego jest homologiczny do zawiązka kończyn przednich u myszy 30 i piskląt 31. Pączek kończyny kręgowca ma dwa podstawowe węzły sygnalizacyjne: strefę aktywności polaryzacyjnej (ZPA), która ustanawia oś od przodu do tyłu poprzez ekspresję celów genu Sonic hedgehog (Shh) i dalszych celów genu Hox, oraz wierzchołkowy grzbiet ektodermalny (AER) obecny na końcu zawiązka kończyny, który działa w celu ustalenia bliższej do dystalnej tożsamości kończyny poprzez ekspresję czynników wzrostu fibroblastów (Fgfs). Wszczepiając mikrogranulki nasączone Fgf mutantom genetycznym Shh danio pręgowanego, badacze zidentyfikowali Fgf jako niezbędny do progresji cyklu komórkowego i wzrostu kończyny kręgowca 25. Oprócz kaskad sygnalizacyjnych Fgf i Shh, które ustalają tożsamość pozycyjną, pionierskie badania z wykorzystaniem pąka kończyny pisklęcia zidentyfikowały kwas retinowy (RA) jako cząsteczkę, która może naśladować działanie regionu polaryzującego w celu ustalenia tożsamości przedniej do tylnej 32. Eksperymenty te polegały na umieszczeniu małych pasków papieru Whatman nasączonego RA w kończynie pisklęcia, aby ocenić wzór palców 32. Co więcej, naukowcy przeprowadzili inne eleganckie badania, w których wykorzystano mikrogranulki, przeszczep komórek i egzogenne zabiegi RZS u danio pręgowanego, aby ustalić, że RZS działa w celu zapewnienia dalekosiężnych wskazówek pozycyjnych w tyłomózgowiu danio pręgowanego i mezodermie 28. Jednak obecnie pozostaje wiele pytań dotyczących roli czynników sygnalizacyjnych, takich jak Fgf i RA, w wielu aspektach rozwoju kręgowców. Efekty sygnalizacyjne RZS, działając jako morfogen, wpływają na wiele narządów 33, takich jak rozwijające się serce 34 i komórki progenitorowe nerek, gdzie RZS określa losy typu bliższych komórek nerki 35-39. Pogłębienie wiedzy na ten temat może przynieść znaczne korzyści z badań eksperymentalnych wykorzystujących techniki manipulacji tkankami i implantacji mikrogranulek.
Chociaż przeprowadzono mniej badań z mikrogranulkami u danio pręgowanego, w porównaniu do modeli takich jak pisklę, te, które zostały przeprowadzone, były bardzo pouczające. Jedną z przyczyn niedostatku badań opartych na implantacji mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego jest prawdopodobnie przekonanie, że istnieją trudne wyzwania techniczne, oparte na wielkości zarodka, które stanowią przeszkodę w skutecznym przeprowadzaniu takich manipulacji. Jednak implantacji mikrogranulek w zarodkach danio pręgowanego można nauczyć się w praktyce i wspomóc poprzez wizualną obserwację techniki, a tym samym można ją wykorzystać jako środek do zbadania mechanizmów rozwoju. Tutaj demonstrujemy precyzyjne zastosowanie mikrogranulek do zarodka danio pręgowanego, które można wykorzystać do przeprowadzenia szerokiej gamy testów dotyczących tworzenia tkanek i morfogenezy komórek.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td> Amerykański <td>AB01915</td><td></td><td>Bioanalityczny</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td> Amerykański <td>AB01652</td><td></td><td>Bioanalityczny</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td> Amerykański <td>AB00366</td><td></td><td>bioanalityczny</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoesan etylu (trikaina)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Kolba Erlenmeyera</td><td>Fischer Scientific</td><td>FB-500-250</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Jednorazowe szalki Petriego, sterylne</td><td></td><td>Corning 430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Chemware Mikroszpatułka</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-50B</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 Końcówki do mikropipet</td><td>Fischer Scientific</td><td>2707402</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator niskotemperaturowy</td><td>Fischer Naukowy</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Dwusulfotlenek Amerykański</td><td>AB00435</td><td></td><td>bioanalityczny</td></tr><tr><td>Mikrogranulki (45-106 &mikro; m)</td> <td>Biorad</td><td>140-1454 AG1-X8</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki (45 &mikro; m)</td> <td>Polysciences</td><td>7314</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta do mikro preparacji</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Igła wolframowa</td><td>Roboz Instrumenty chirurgiczne Co.</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt rurki kapilarnej</td><td>Globe Scientific Inc.&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 51674</td><td></td></tr></tbody></table>

implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Danio pręgowany stał się cennym systemem modeli genetycznych do badań nad biologią rozwoju i chorobami. Danio pręgowany ma wysoki stopień ochrony genomu, a także podobieństwa w procesach komórkowych, molekularnych i fizjologicznych z innymi kręgowcami, w tym ludźmi. We wczesnej ontogenezie zarodki danio pręgowanego są optycznie przezroczyste, co pozwala naukowcom na wizualizację dynamiki organogenezy za pomocą prostego stereomikroskopu. Implantacja mikrogranulek to metoda, która umożliwia manipulację tkankami poprzez zmianę czynników w środowisku lokalnym. Dzięki temu naukowcy mogą badać wpływ dowolnej liczby interesujących nas cząsteczek sygnałowych, takich jak wydzielane peptydy, w określonych punktach przestrzennych i czasowych w rozwijającym się zarodku. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół manipulowania koralikami i wszczepiania koralików podczas wczesnego rozwoju danio pręgowanego.

W badaniach wykorzystuje się kilka rodzajów narzędzi manipulacyjnych do operowania mikrokulkami (Rysunek 1). Ponadto, do unieruchomienia zarodka danio pręgowanego można użyć prostej formy z agarozy z małymi wgłębieniami, co jest kluczowe dla sprawnego i efektywnego przeprowadzenia tych eksperymentów (Rysunek 1). Implantację mikrokulki można przeprowadzić w interesującym badacza położeniu przestrzennym i etapie czasowym, co pozwala na zawężenie konkretnego okna aktywności badanej cząsteczki.
W tym przypadku pojedyncze mikrokulki zostały wszczepione do embrionów zebrafish w stadium pączka ogonowego lub w późniejszych punktach czasowych podczas etapów somitogenezy (Rysunek 3). W tej demonstracji protokołu wykorzystano mikrokulki o dwóch różnych rozmiarach, wypłukane samym roztworem Ringera (Rysunek 3A, 3B i 3C). Wszczepienie mikrokulek w przypadku braku jakichkolwiek sprzężonych małych cząsteczek pokazuje, że implantacja kulek może zostać przeprowadzona bez wywołania drastycznych efektów morfologicznych podczas prawidłowego rozwoju embrionu zebrafish (Rysunek 4).
Badacz może napotkać trudności z manewrowaniem mikrokuleczką w otworze wykonanym igłą wolframową na powierzchni zarodka. Aby ułatwić manipulację mikrokuleczką po jej umieszczeniu na zarodku za pomocą mikroigły, można zastosować narzędzie w postaci włośka lub rzęsy. Można je wykonać z naturalnie linionych wibrysów kota lub psa, choć można wykorzystać również inne naturalne lub syntetyczne włókna rzęs (Rysunek 1). Delikatne pchnięcie mikrokuleczki igłą wolframową lub narzędziem z włośka powinno spowodować jej zanurzenie w roztworze Ringera w formie. Po zanurzeniu mikrokuleczki w formie, w razie potrzeby można ją przesuwać na większe odległości za pomocą igły wolframowej, a po umieszczeniu nad zarodkiem użyć igły lub narzędzia z włośka, aby wprowadzić mikrokuleczkę do wnętrza zarodka. Sukces implantacji mikrokuleczki można natychmiast ocenić podczas obserwacji pod stereomikroskopem; kuleczka powinna pozostać stabilnie osadzona w tkance. Aby ocenić położenie kuleczki w czasie, każdą próbkę zarodka można obrazować za pomocą fotografii z przebiegiem czasowym in vivo lub sprawdzać w regularnych odstępach czasu (jak przedstawiono na Rysunku 4), aby upewnić się, że lokalizacja kuleczki nie zmieniła się w trakcie trwania eksperymentu na skutek endogennej morfogenezy tkankowej. Monitorowanie położenia kuleczki w czasie jest kluczowe dla rzetelnej interpretacji wyników, np. przy ocenie wpływu małej cząsteczki na tkankę docelową lub proces rozwojowy.
Zastosowanie powyższych kroków zapewni optymalne warunki do osadzania mikrokulek w zarodku ryby danio w pożądanym czasie i miejscu. Z naszego doświadczenia wynika, że początkujący użytkownicy tego protokołu implantacji mikrokulek zazwyczaj nabywają umiejętności niezbędnych do przeprowadzania spójnej chirurgicznej implantacji mikrokulek do zarodka ryby danio po około jednym tygodniu praktyki.
<img alt="Narzędzia do implantacji kulek: płytka do mikrokulek, precyzyjna pęseta, igła wolframowa, mikropipeta, narzędzie do przesuwania (whisker tool)." src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Narzędzia używane do przeprowadzenia implantacji mikrokulek. (A) Taca do implantacji kulek (po lewej, średnica 15 cm) z formami do zarodków (po lewej) oraz taca inkubacyjna do mikrokulek (po prawej, średnica 6 cm). Ta taca robocza umożliwia badaczowi umieszczenie zarodków w pożądanej orientacji do implantacji mikrokulek oraz zapewnia bliskość przygotowanych mikrokulek w obrębie stanowiska mikroskopowego. Mikrokulki powinny być inkubowane w małej cząsteczce(kach) i/lub nośniku, a następnie płukane w oddzielnej płytce do mikrokulek (po prawej) przed umieszczeniem ich w tacy do implantacji kulek znajdującej się pod mikroskopem. (B) Dwie pary precyzyjnych pęset zostaną użyte do usunięcia chorionu otaczającego każdy zarodek danio przebrzuchłego oraz do odłamania końcówki igły mikrokapilarnej. (C) Igła wolframowa zostanie wykorzystana do wykonania bardzo cienkiego nakłucia w zarodku danio przebrzuchłego, w którym zostanie umieszczona mikrokulka. (D) Mikrokapilarna pipeta transferowa posłuży do pobrania i umieszczenia mikrokulki na wierzchu zarodka danio przebrzuchłego w pobliżu miejsca nakłucia. (E) Narzędzie do przesuwania (whisker/lash tool) pozwoli na delikatne wprowadzenie mikrokulki w miejsce nacięcia w zarodku, wykonanego wcześniej igłą wolframową. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat przetwarzania zarodka zebrafish; zawiera formę do zarodków, tackę z mikrokulkami oraz narzędzie z igły wolframowej." src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat procedury implantacji mikrokulek. (A) Tacka do implantacji mikrokulek, w której mikrokulki są namaczane w odpowiednim roztworze płuczącym, zostaje ustawiona pod stacją stereomikroskopu, a zarodki są ułożone tkanyką skierowaną do góry. (B) Za pomocą igły wolframowej można wykonać niewielkie nacięcie w zarodku, stosując lekki, lecz zdecydowany ruch. (C) Za pomocą mikrokapilarnej pipety transferowej pożądaną mikrokulkę można pobrać z komory inkubacyjnej mikrokulek w tacce (znajdującej się po prawej stronie) i przenieść do przedziału po lewej stronie, w którym znajduje się obszar roboczy zarodka. Mikrokulkę należy umieścić w pobliżu miejsca nacięcia, a następnie delikatnie wprowadzić do nacięcia wykonanego igłą wolframową, używając narzędzia typu whisker/lash. Po wprowadzeniu mikrokulki do miejsca nacięcia, należy ją wsunąć w tkankę (od strony przeciwnej do nacięcia), aby stabilnie ją umieścić i zapobiec jej późniejszemu wypadnięciu z zarodka w miarę rozwoju. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozwój zarodka danio pręgowanego, efekt implantacji kuleczki, obraz mikroskopowy, od etapu pączka ogonowego do 7 somytów." src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Mikrokuleczki mogą być implantowane do zarodków na różnych etapach rozwoju. (A) Do zarodków danio pręgowanego na etapie pączka ogonowego w okolicy tułowia implantowano mikrokuleczkę (średnica ok. 50 µm). W badaniu przeprowadzonym 24 h po implantacji kuleczki (hpbi) zarodki rozwijały się prawidłowo, a mikrokuleczka wykazywała minimalne przemieszczenie w czasie rozwoju. (B) Zarodki danio pręgowanego, którym na etapie 3 somytów (ss) implantowano mikrokuleczki (o średnicy ok. 50 µm) do pęcherzyka żółtkowego, wykazywały prawidłowy rozwój przy stosunkowo niewielkim przemieszczeniu kuleczek w czasie. (C) Większe mikrokuleczki (średnica ok. 70 µm) implantowane do zarodka na etapie 7 ss również wykazywały prawidłowy dalszy rozwój oraz minimalne lub żadne przemieszczenie z miejsca implantacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie implantacji kulek w zarodku, obrazy mikroskopowe, widoki boczne i grzbietowe, punkty czasowe rozwoju." src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Ogólny rozwój zarodka danio-pręgławki nie jest zaburzony przez obecność mikrokulki do 72 hpbi. W zarodki danio-pręgławki w stadium 7 somitu (ss) wszczepiono mikrokulki namoczone w roztworze Ringera (o średnicy około 50 µm). Każdą mikrokulkę wprowadzono chirurgicznie do tułowia, pomiędzy somity 3 i 4. Obecność kulki nie wiązała się z widocznymi wadami rozwojowymi w 24 hr po implantacji kulki (hpbi), 48 hpbi lub 72 hpbi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badań genetycznych i rozwojowych. Implantacja kulek jest cenną techniką manipulacji tkankami, którą można wykorzystać do badania mechanizmów rozwojowych poprzez wprowadzanie zmian w lokalnych środowiskach komórkowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić implantację mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego.

Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykorzystanie implantacji mikrokuleczek do wprowadzenia zmian w lokalnym środowisku tkankowym w określonych punktach przestrzennych i czasowych podczas embriogenezy danio pręgowanego. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie tacy do implantacji kuleczek, aby ułatwić precyzyjną manipulację i implantację mikrokuleczek. W drugim kroku jaja danio pręgowanego są inkubowane do pożądanego stadium rozwoju.Następnie mikrokulki przygotowuje się w odpowiednich roztworach eksperymentalnych i ostrożnie przenosi w pożądane miejsce wewnątrz zarodka. W ostatecznym rozrachunku implantację mikrokulek można przeprowadzić bez zakłócania prawidłowego rozwoju danio pręgowanego, co pozwala na ocenę wpływu interesujących badacza cząsteczek na embriogenezę ryb z gatunku zebrafish. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak: w jaki sposób różne cząsteczki wpływają na proces organogenezy?Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ opanowanie techniki obchodzenia się z mikrokulkami wymaga praktyki. Aby przygotować tackę do implantacji mikrokulek, należy najpierw podgrzewać świeżo przygotowany 2% roztwór aro przez 90 sekund. Proces ten należy przeprowadzić w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml, delikatnie obracając kolbą co 30 sekund, aby zapobiec wykipieniu żelu.Następnie umieść pokrywkę szalki Petriego o wymiarach 60 by 15 mm w szalce o wymiarach 150 by 15 mm, tak aby wewnętrzna strona pokrywki była skierowana do góry. Następnie, stabilizując pokrywkę mniejszej szalki Petriego palcem wskazującym, wlej gorący żel agarowy do większej szalki.Pozwól na utworzenie się cienkiej warstwy agros pod mniejszą pokrywką, aby zapobiec kondensacji pary wodnej i ułatwić obserwację kulek pod mikroskopem podczas stygnięcia agros. Zanim żel zastygnie, powoli wprowadź formę do dołka w górną część żelu, aby ułatwić umieszczenie embrionów. Po zestaleniu żelu ostrożnie usuń formę do dołka za pomocą mikrospatułki.Następnie należy dodać do naczynia roztwór E3 i przechowywać je w temperaturze 4 °C. Aby zebrać embriony danio pręgowanego, należy napełnić komorę do tarła wodą systemową. Następnie w środku komory należy umieścić przegrodę i umieścić dorosłe osobniki samce i samice danio pręgowanego po odpowiednich stronach komory.Następnego ranka należy użyć drobnego sita z drucianej siatki, aby zebrać zapłodcone jaja. Odwrócić sito do góry dnem w czystej płytce Petriego o średnicy 10 cm i płukać siatkę cienkim strumieniem roztworu E3, aż w sicie nie zostaną żadne jaja, a w płytce znajdzie się około 25 ml roztworu E3. Następnie należy podzielić jaja pomiędzy kilka płytek, umieszczając od 50 do 60 jaj na płytkę, aby uniknąć zbyt dużego zagęszczenia, i inkubować jaja w roztworze E3 w temperaturze 28,5 °C; przed implantacją mikrokulek inkubować je w odpowiedniej objętości testowanej cząsteczki lub nośnika kontrolnego przez odpowiedni czas.Następnie, gdy embriony osiągną pożądany punkt czasowy rozwoju, użyć pęsety precyzyjnej, aby usunąć ich kons, a następnie inkubować danio pręgowane w filtrowanym roztworze Ringera z dodatkiem antybiotyków przez 10 minut, podczas gdy embriony aklimatyzują się. Przenieść mikrokulki do wcześniej przygotowanej płytki do mikrokulek, umieszczonej w tacy do implantacji, a następnie płukać kulki i roztwór Ringera przez 10 minut.W ciągu 50 minut od wypłukania kulek ułóż zarodki jeden po drugim w dołku tacy do implantacji w taki sposób, aby obszar implantacji mikrokulek był dostępny. Za pomocą igły wolframowej wykonaj niewielkie nacięcie w zarodku, następnie naciśnij gruszkę mikrokapilarnej pipety transferowej, aby delikatnie wciągnąć mikrokuleczkę do kolumny kapilarnej, a następnie zwolnij nacisk, aby przenieść mikrokuleczkę do tacy implantacyjnej, co ułatwi manipulowanie nią. Delikatnie pchnij kuleczkę, aby zanurzyła się w roztworze Ringera wewnątrz formy.Następnie, używając mikropipety, przenieś mikrokulkę na embrion i wprowadź ją do nacięcia. Na koniec, za pomocą narzędzia do manipulacji (tzw. whiskera), odsuń mikrokulkę od miejsca nacięcia, aby nie została ona wypchnięta podczas gojenia. Powodzenie implantacji mikrokulki można wówczas natychmiast ocenić pod mikroskopem stereoskopowym, ponieważ kulka powinna pozostać stabilnie umieszczona w tkance.W tym eksperymencie pojedyncze mikrokulki o dwóch różnych rozmiarach, płukane wyłącznie roztworem Ringera, zostały wszczepione do embrionów zebrafish na etapie pączka ogonowego lub w późniejszych punktach czasowych podczas miogenezy, aby upewnić się, że położenie kulki nie zmieniło się w trakcie trwania eksperymentu na skutek endogennej morfogenezy tkanek. Próbki embrionów można wizualizować za pomocą fotografii z przebiegiem czasowym lub sprawdzać w regularnych odstępach czasu, zgodnie z obrazami prezentującymi implantację mikrokulek. W przypadku braku koniugatów możliwe jest zastosowanie małych cząsteczek bez wywoływania drastycznych efektów morfologicznych podczas prawidłowego rozwoju embrionu ryby SPR.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak Whole Mount In Situ Hybridization, aby zbadać wpływ mikrokulek na ekspresję genów. Ogólnie rzecz biorąc, zrozumienie pozycji kuleczki w czasie jest kluczowe dla interpretacji wyników, na przykład przy ocenie wpływu małej cząsteczki na tkankę docelową lub proces rozwojowy.

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Ten film opisuje technikę mikroiniekcji zarodka w celu dostarczenia związków do woreczka z żółtkiem danio pręgowanego.

Mikroiniekcja zarodka: technika dostarczania związku do żółtka danio pręgowanego

Źródło: Zhang, X. i wsp., Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia model zarodka danio pręgowanego do badania infekcji związanych z wszczepionymi biomateriałami. Wstrzykiwanie Staphylococcus aureus mikrosferom polistyrenowym zwiększa przeżywalność bakterii, potwierdzając rolę wszczepionych materiałów w promowaniu infekcji.

Analiza in vivo zakażeń bakteryjnych związanych z implantami przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Źródło: Shi, J. i in., Przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje procedurę przygotowania hodowli Agrobacterium tumefaciens poprzez indukowanie ekspresji genów za pomocą acetosyringonu, a następnie usunięcie antybiotyku poprzez płukanie i ponowną zawiesinę, aby wygenerować zawieszenie gotowe do transformacji do dostarczania genów do tkanek roślinnych.

Mikrowstrzykiwanie bakterii do żyły ogonowo zarodków danio pręgowanego

Niniejsze badanie opisuje model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej infekcji związanej z biomateriałem w czasie na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Model ten jest obiecującym systemem uzupełniającym modele zwierzęce ssaków, takie jak modele mysie, do badania zakażeń związanych z biomateriałem in vivo.

Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem

Manipulacje embriologiczne, takie jak eksterminacja i przeszczepianie komórek, są ważnymi narzędziami do badania wczesnego rozwoju. Protokół ten opisuje proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania do wykonywania tych manipulacji w zarodkach danio pręgowanego.

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Ten protokół demonstruje mikroiniekcję lipopolisacharydu do obszaru komorowego mózgu w modelu larwalnym danio pręgowanego w celu zbadania wynikowej reakcji neurozapalnej i neurotoksyczności.

Mikroiniekcje lipopolisacharydu do komór mózgowych larwom danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Naucz się techniki implantacji mikrogranulek w zarodki Danio rerio, aby badać biologię rozwoju bez zakłócania normalnego rozwoju. Ta metoda umożliwia ocenę wpływu cząsteczek na organogenezę.

Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów