Name: Proste i wspomagane komputerowo testy węchowe dla myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj proste testy węchowe dla myszy z analizą komputerową w ImageJ. Metoda ocenia dyskryminację zapachów, preferencje i unikanie u różnych genotypów w znajomej arenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest finansowana przez Szwajcarską Fundację Narodową (31_138429) i Fundację Synapsis w celu wspierania badań nad chorobą Alzheimera.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt są zgodne z Dyrektywą UE 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych i są zatwierdzone przez lokalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (Kanton Fryburg, Szwajcaria).
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Zwierzęta doświadczalne
	<ol>
		<li>Przeprowadzaj eksperymenty na dorosłych samcach myszy typu dzikiego i transgenicznego (tło C57BL/6) w wieku 3-5 miesięcy. Trzy grupy myszy odpowiadają kontrolom miotu typu dzikiego (grupa A, Jagged1 flox/flox19) i dwóm warunkowym liniom myszy KO (grupa B, Jagged1ncKO i C, Jagged1gcKO).</li>
		<li>Trzymaj myszy w standardowych warunkach laboratoryjnych w wentylowanym pomieszczeniu, z 12-godzinnym kontrolowanym cyklem ciemności/światła i dostarczaj pożywienie i wodę ad libitum.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Konfiguracja eksperymentalna
<ol>
	<li>Arena eksperymentalna
	<ol>
		<li>Na arenie eksperymentalnej użyj czystej, wysterylizowanej klatki dla myszy (36 cm długości x 20,5 cm szerokości x 13,5 cm wysokości) (Rysunek 1A).</li>
		<li>Przypisz każdą mysz do numerowanej klatki ze świeżą ściółką o wysokości 3 cm. Jeśli klatki są ponownie używane, tak jak w teście wrażliwości na zapach, należy podjąć następujące środki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między zapachami a myszami.
		<ol>
			<li>Zaznacz stronę wody.</li>
			<li>Oczyść węższe ścianki klatek dwiema bibułkami spryskanymi 70% etanolem, po jednej na każdą stronę.</li>
			<li>Ułóż klatki zgodnie z genotypem myszy i przechowuj tymczasowo pod kapturem laminarnym.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>kamera
	<ol>
		<li>Zamontuj kamerę na niestandardowym statywie tak, aby obiektyw znajdował się w odległości 58 cm od spodu klatki (Rysunek 1A). Ustal pozycję statywu i klatki i rozgranicz za pomocą znaczników, aby umożliwić wyśrodkowanie aparatu na górze klatki.</li>
		<li>Nagrywaj filmy w rozdzielczości 320 x 240 pikseli, 15,08 klatek na sekundę jako pliki MOV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapachów
	<ol>
		<li>Zawiesić zapachy, jeśli jest to wskazane, w rozpuszczalniku, w którym są rozpuszczalne.</li>
		<li>Do testu preferencji użyj masła orzechowego. Ponownie zawiesić masło orzechowe w oleju arachidowym (10% w/v).</li>
		<li>Do testu unikania należy użyć czystego kwasu 2-metylomasłowyego (2-MB) (98%).</li>
		<li>Do testu wrażliwości należy użyć moczu samicy z tej samej kolonii myszy i tła (C57BL/6).
		<ol>
			<li>Dla wygody zbierz mocz 1-2 dni przed badaniem węchowym. Unieruchomić i trzymać mysz pod maską z brzuchem nad siatką klatki. Pod siatką klatki umieść plastikową szalkę Petriego, aby zebrać krople moczu.</li>
			<li>Zbierz mocz od każdej samicy do probówki o pojemności 1,5 ml i wymieszaj wszystkie próbki moczu, aby znormalizować zmienność między zwierzętami. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
			<li>W dniu eksperymentu rozmrozić mocz i wykonać 4 rozcieńczenia w podwójnie destylowanej wodzie o współczynniku rozcieńczenia 10 (1:10, 1:100; 1:10,000; 1:10,000).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Testy węchowe
Uwaga: W tym protokole celowo wybrano zapachy, które są odbierane jako silne atraktanty (masło orzechowe i żeński mocz) lub silne środki odstraszające (kwas 2-MB)15. Ważne jest, aby przed testem unikania przeprowadzić testy preferencji i wrażliwości na przyjemne zapachy, aby wyeliminować możliwość jakiejkolwiek ingerencji w zachowanie węchowe. Niemniej jednak, dla uproszczenia, w niniejszym artykule test preferencji i unikania zostanie opisany w ramach testu percepcji. Każda sesja behawioralna rozpoczyna się od fazy przyzwyczajenia.
<ol>
	<li>Faza przyzwyczajenia
	<ol>
		<li>Umieść zwierzę w czystej przypisanej klatce i pozwól mu eksplorować przez 5 minut (Rysunek 1B). Ponieważ środowisko klatki doświadczalnej jest znane klatce domowej, ten krótki czas wystarczy, aby umożliwić przyzwyczajenie.</li>
		<li>Jeśli test wrażliwości zostanie zakończony w ciągu jednego dnia, należy przeprowadzić habituację tylko raz przed zastosowaniem najbardziej rozcieńczonego zapachu. Jeżeli test wrażliwości jest przeprowadzany w różnych dniach, każdego dnia potrzebna jest faza przyzwyczajenia na nowej, czystej klatce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test Percepcji
	<ol>
		<li>Po przyzwyczajeniu włącz kamerę i natychmiast odpipetuj 60 μl przyjemnego zapachu (masło orzechowe) i 60 μl neutralnego zapachu (woda z kranu) na przeciwległe ścianki klatki w odległości około 10 cm od dna (rysunek 1C).</li>
		<li>Pozwól myszy badać zapachy przez 2 minuty (rysunek 1D). Następnie wyłącz aparat.</li>
		<li>W tym momencie przejdź do następnej myszy, zaczynając od fazy przyzwyczajenia. Dokładnie w ten sam sposób należy przeprowadzić test unikania, nakładając 60 μl środka odstraszającego (kwas 2 MB) i 60 μl wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test wrażliwości
	<ol>
		<li>Oceń próg przyciągania samców myszy do rosnących stężeń moczu samic w następującej kolejności: 1:10 000; 1:1,000; 1:100; 1:10 i czysty mocz.</li>
		<li>Po przyzwyczajeniu, wystawić każdą mysz na działanie najwyższego rozcieńczenia odpipetowanego przez eksperymentatora, jak opisano wcześniej w 3.2.1.</li>
		<li>Nagraj eksploracyjne zachowanie moczu w porównaniu z wodą w ciągu 2 minut na kamerze wideo. Po tym, jak wszystkie kohorty myszy są testowane pod kątem najwyższego rozcieńczenia (1: 10 000), należy wystawić je na działanie wyższego stężenia moczu, jak wskazano powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych post-hoc
Uwaga: Wszystkie opisane testy behawioralne są przetwarzane post hoc zgodnie z instrukcjami analizy danych.
<ol>
	<li>Otwórz pliki MOV w ImageJ dla systemów Windows
	<ol>
		<li>Zainstaluj program Quick Time for Java, korzystając z ustawień dostosowanych do programu http://www.apple.com/quicktime/download .</li>
		<li>Zainstaluj wtyczkę Quick Time ze strony ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).</li>
		<li>Zaimportuj plik QTJava.zip (C:\Program Files\QuickTime\QTSystem) do rozszerzenia biblioteki ImageJ (. ImageJ\jre\lib\ext).</li>
		<li>Skopiuj również QTJava.zip z folderu wtyczek i zmień jego nazwę na QTJava.jar.</li>
		<li>Zainstaluj sześć skryptów dołączonych do folderu Makra (ImageJ\plugins\Macros).</li>
		<li>Otwórz ImageJ, a następnie skompiluj i uruchom wtyczkę Quick Time, a następnie zamknij ImageJ.</li>
		<li>Otwórz ponownie ImageJ i otwórz plik MOV za pomocą polecenia Plik> importu> za pomocą funkcji Szybki czas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regulacja wideo
	<ol>
		<li>Po otwarciu pliku wideo w ImageJ, wytnij wideo, aby uzyskać stałą 2-minutową eksplorację od momentu, gdy eksperymentator odpipetował substancje zapachowe do klatki (T0). Zidentyfikuj klatkę odpowiadającą T0 i usuń poprzednie klatki, używając przyrostów 1 (narzędzie do usuwania ImageJ\Image\Stacks\ToolsSlice). Użyj tego samego polecenia, aby usunąć wszystkie klatki przekraczające 2 minuty eksploracji.</li>
		<li>Upewnij się, że klatka jest wyśrodkowana i w razie potrzeby użyj polecenia Image>Transform>Rotate, aby ją wyrównać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie wideo 
	Uwaga: Przetwarzanie wideo jest w pełni wspomagane komputerowo i wykorzystuje polecenia makr dołączone do tego dokumentu.
	<ol>
		<li>Aby ograniczyć obszar do klatki o rozmiarze 127 x 218 pikseli, uruchom makro Krok 1 z polecenia Plug>Macros>Run. Przesuń stały prostokąt nad klatką (Rysunek 2, Krok 1).</li>
		<li>Przytnij obszar klatki w obszarze zainteresowania (ROI) za pomocą makra Krok 2 (Rysunek 2, Krok 2).</li>
		<li>Użyj makra kroku 3, aby wyodrębnić obraz myszy z tła, przypisując sygnał progowy, usuwając plamki i filtrując wariancję sygnału. Wartości wyjściowe na wykresie osi Z wskazują średnie wartości szarości, odpowiadające intensywności cienia myszy poruszającego się w ROI "komory wodnej" podczas 2-minutowej eksploracji. Skopiuj wyniki do arkusza o nazwie zgodnej z ROI w pliku arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 2, Krok 3).</li>
		<li>Użyj makra kroku 4, aby wyodrębnić średnie wartości szarości myszy w "komorze zapachowej" ROI. Skopiuj wyniki do arkusza o nazwie zgodnej z ROI w tym samym pliku arkusza kalkulacyjnego, co w 4.3.3 (Rysunek 2, Krok 4).</li>
		<li>Aby jeszcze bardziej zawęzić analizę ruchu myszy w "obwodzie wody" ROI, należy użyć makra Krok 5. Skopiuj wynik do arkusza roboczego o nazwie zgodnej z ROI w tym samym pliku arkusza kalkulacyjnego, co w 4.3.3 (Rysunek 2, Krok 5).</li>
		<li>Aby ograniczyć analizę ruchu myszy w "obwodzie zapachu" ROI, użyj makra kroku 6. Skopiuj wynik do arkusza roboczego o nazwie zgodnej z plikiem arkusza kalkulacyjnego ROI, jak w 4.3.3 (Rysunek 2, Krok 6).</li>
		<li>Przetwarzaj wszystkie filmy i sprawdzaj spójność liczby klatek na zwierzę. Tutaj nagraj wszystkie zwierzęta przez 1,810 klatek odpowiadających 2-minutowej sesji eksploracyjnej.</li>
		<li>Dla każdego zwierzęcia i dla każdego ROI sortuj ramki ze średnimi wartościami szarości większymi niż 0. Podziel liczbę klatek przez wartości odpowiadające 1 sekundzie i uzyskaj sekundy spędzone w każdym ROI.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Dla każdego testu sprawdź jednorodność wariancji w obrębie grup/genotypów za pomocą testu Bartletta, korzystając ze wzoru dostępnego na http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/ .</li>
	<li>W teście przyciągania i unikania przeprowadź porównania między czasem spędzonym z wodą a zapachem w jednej grupie za pomocą bezkierunkowego testu t Studenta, zakładając równe lub nierówne wariancje w zależności od wyników testu Bartletta. Porównaj czas spędzony z zapachami odjęty przez czas spędzony z wodą między genotypami za pomocą jednokierunkowej ANOVA z testem post-hoc Bonferroniego.</li>
	<li>W teście wrażliwości przeanalizuj porównania czasu spędzonego z zapachem odjętym od czasu spędzonego z wodą między grupami przy określonym rozcieńczeniu moczu za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z testem post-hoc Bonferroniego. Porównaj wrażliwość między grupami na rosnące stężenia zapachów za pomocą 2-kierunkowej ANOVA z powtórzeniami z testem post-hoc Bonferroniego.</li>
	<li>Interakcja między genotypami i zabiegami w teście przyciągania i unikania jest badana za pomocą dwukierunkowej ANOVA z testem post-hoc Bonferroniego.</li>
</ol>

<ol><li>Doty, R. L., Kamath, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influences+of+age+on+olfaction%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cognitive+Science%22%5BJournal%5D)">The influences of age on olfaction: a review.</a> Cognitive Science. 5, 20(2014).</li>
<li>Mesholam, R. I., Moberg, P. J., Mahr, R. N., Doty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+in+neurodegenerative+disease%3A+a+meta-analysis+of+olfactory+functioning+in+Alzheimer%E2%80%99s+and+Parkinson%E2%80%99s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Olfaction in neurodegenerative disease: a meta-analysis of olfactory functioning in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases.</a> Archives of Neurology. 55 (1), 84-90 (1998).</li>
<li>Moberg, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Dysfunction+in+Schizophrenia%3A+A+Qualitative+and+Quantitative+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Olfactory Dysfunction in Schizophrenia: A Qualitative and Quantitative Review.</a> Neuropsychopharmacology. 21 (3), 325-340 (1999).</li>
<li>Kovács, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+olfactory+dysfunction+in+aging+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of olfactory dysfunction in aging and neurodegenerative disorders.</a> Ageing Research Reviews. 3 (2), 215-232 (2004).</li>
<li>Barrios, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+and+neurodegeneration+in+HD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Olfaction and neurodegeneration in HD.</a> Neuroreport. 18 (1), 73-76 (2007).</li>
<li>Doty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+in+Parkinson%E2%80%99s+disease+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Olfaction in Parkinson’s disease and related disorders.</a> Neurobiology of Disease. 46 (3), 527-552 (2012).</li>
<li>Doty, R. L., Shaman, P., Dann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+University+of+Pennsylvania+Smell+Identification+Test%3A+a+standardized+microencapsulated+test+of+olfactory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Development of the University of Pennsylvania Smell Identification Test: a standardized microencapsulated test of olfactory function.</a> Physiology & Behavior. 32 (3), 489-502 (1984).</li>
<li>Devanand, D. p, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Deficits+in+Patients+With+Mild+Cognitive+Impairment+Predict+Alzheimer%E2%80%99s+Disease+at+Follow-Up%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Olfactory Deficits in Patients With Mild Cognitive Impairment Predict Alzheimer’s Disease at Follow-Up.</a> American Journal of Psychiatry. 157 (9), 1399-1405 (2000).</li>
<li>Conti, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+Identification+Deficit+Predicts+Clinical+Conversion+from+Mild+Cognitive+Impairment+to+Dementia+Due+to+Alzheimer%E2%80%99s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Clinical+Neuropsychology%22%5BJournal%5D)">Odor Identification Deficit Predicts Clinical Conversion from Mild Cognitive Impairment to Dementia Due to Alzheimer’s Disease.</a> Archives of Clinical Neuropsychology. 28 (5), 391-399 (2013).</li>
<li>Keller, A., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+Smelling+Through+Genetics%3A+Mammalian+Odor+Perception%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Better Smelling Through Genetics: Mammalian Odor Perception.</a> Current opinion in neurobiology. 18 (4), 364-369 (2008).</li>
<li>Brai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+activity+in+the+olfactory+bulb+is+odour-dependent+and+contributes+to+olfactory+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Notch1 activity in the olfactory bulb is odour-dependent and contributes to olfactory behaviour.</a> European Journal of Neuroscience. 40 (10), 3436-3449 (2014).</li>
<li>Larson, J., Hoffman, J. S., Guidotti, A., Costa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+discrimination+learning+deficit+in+heterozygous+reeler+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Olfactory discrimination learning deficit in heterozygous reeler mice.</a> Brain Research. 971 (1), 40-46 (2003).</li>
<li>Alonso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Discrimination+Learning+Increases+the+Survival+of+Adult-Born+Neurons+in+the+Olfactory+Bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory Discrimination Learning Increases the Survival of Adult-Born Neurons in the Olfactory Bulb.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10508-10513 (2006).</li>
<li>Wesson, D. W., Keller, M., Douhard, Q., Baum, M. J., Bakker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+urinary+odor+discrimination+in+female+aromatase+knockout+%28ArKO%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+behavior%22%5BJournal%5D)">Enhanced urinary odor discrimination in female aromatase knockout (ArKO) mice.</a> Hormones and behavior. 49 (5), 580-586 (2006).</li>
<li>Kobayakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+versus+learned+odour+processing+in+the+mouse+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb.</a> Nature. 450 (7169), 503-508 (2007).</li>
<li>Witt, R. M., Galligan, M. R., Despinoy, J., Segal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Behavioral+Testing+in+the+Adult+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (23), (2009).</li>
<li>Lee, A. W., Emsley, J. G., Brown, R. E., Hagg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+olfactory+sensitivity+and+apparent+speed+of+forebrain+neuroblast+migration+in+three+inbred+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Marked differences in olfactory sensitivity and apparent speed of forebrain neuroblast migration in three inbred strains of mice.</a> Neuroscience. 118 (1), 263-270 (2003).</li>
<li>Page, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computerized+assessment+of+social+approach+behavior+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Computerized assessment of social approach behavior in mouse.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 3, 48(2009).</li>
<li>Nyfeler, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged1+signals+in+the+postnatal+subventricular+zone+are+required+for+neural+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Jagged1 signals in the postnatal subventricular zone are required for neural stem cell self-renewal.</a> Embo J. 24 (19), Available from:
	
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16163386"">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16163386"</a> 3504-3515 (2005).</li>
<li>Tong, M. T., Peace, S. T., Cleland, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+mechanisms+of+olfactory+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Properties and mechanisms of olfactory learning and memory.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li>
<li>Steinlechner, S. Chapter 2.12 - Biological Rhythms of the Mouse. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123820082000179">http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123820082000179</a> 383-407 (2012).</li>
<li>Corthell, J., Stathopoulos, A., Watson, C., Bertram, R., Trombley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Bulb+Monoamine+Concentrations+Vary+with+Time+of+Day%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory Bulb Monoamine Concentrations Vary with Time of Day.</a> Neuroscience. 247, 234-241 (2013).</li>
<li>Lehmkuhl, A. M., Dirr, E. R., Fleming, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+assays+for+mouse+models+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51804(2014).</li>
</ol>

Nie ma konfliktu interesów.

Testy zaproponowane w tym protokole pozwalają ocenić różne aspekty wrodzonych zachowań węchowych u myszy: percepcję zapachów, rozróżnienie zapachów od wody oraz wrażliwość na zapachy. Protokół ten może być stosowany do każdego zapachu zgodnie ze skalą preferencji i unikania pokazaną wcześniej15. Ponieważ protokół opiera się na aktywności eksploracyjnej, ważne jest, aby myszy nie wykazywały żadnych upośledzeń motorycznych ani niepokoju, które mogą wpływać na ich ruch i zakłócać eksplorację węchową. Opisane test...

Węch jest jedną z najbardziej rozwiniętych i ważnych funkcji sensorycznych u ssaków. Każde upośledzenie aktywności węchowej może wpływać na przyjmowanie pokarmu, zachowania społeczne, a w najgorszym przypadku nawet na przeżycie. U ludzi pogorszenie węchu jest zależne od wieku1 i jest uważane za silny predyktor zaburzeń neurologicznych 2-6. Test identyfikacji węchowej opracowany przez University of Pennsylvania jest obecnie jednym z najczęściej stosowanych, nieinwazyjnych i mierzalnych testów diagnostycznych, które mogą ocenić wczesne deficyty neurologiczne7 i przewidzieć z dużym prawdopodobieństwem postęp demencji8,9.
Dostępność układu węchowego i znaczenie węchu u gryzoni, wywołało intensywną linię badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw funkcji węchowych10. Wcześniej wykazaliśmy, że utrata funkcji receptora sygnalizacyjnego Notch1 wpływa na unikanie węchu11. W tym protokole używamy myszy pozbawionych liganda sygnałowego, Jagged1, w neuronach lub gleju do badania wydajności węchowej.
Wrodzony węch jest definiowany przez trzy parametry: percepcja, rozróżnianie zapachów i wrażliwość węchowa4. Testy węchowe u gryzoni można przeprowadzać na różne sposoby, a niektóre badania behawioralne wykorzystują olfaktometry, które dostarczają zwierzęciu zapach o określonym stężeniu pary i w precyzyjnych ramach czasowych12-14. Niemniej jednak oprzyrządowanie to jest drogie i może być dostępne tylko w specjalistycznych obiektach. W naszej pracy zapewniamy prosty, szybki i powtarzalny protokół badań węchowych, który przeprowadzany jest przy użyciu lotnych zapachów. Opisane testy mierzą percepcję zapachu atraktantu lub środka odstraszającego i oceniają rozróżnienie między zapachem a wodą11,15,16. Korzystając z tej samej konfiguracji, możemy również zmierzyć wrażliwość na zapach o różnych stężeniach16,17. Komputerowe przetwarzanie wideo post-hoc, zainspirowane pracą Page'a iwspółpracowników18, zapewnia bezstronne wyniki bez potrzeby eksperymentalnego zaślepienia i pozwala jednej osobie na przeprowadzenie całego eksperymentu.
Ten protokół ma na celu dostarczenie punktu wyjścia do badania zachowań węchowych u myszy.

<table><tbody><tr><td>Klatka dla myszy</td><td>Italplast (Włochy)</td><td>1144B</td><td>36 cm długość x 20,5 cm szerokość x 13,5 cm wysokość</td></tr><tr><td>Pościel z rozdrobnionego drewna</td><td>Abedd (Austria)</td><td>LTE E-001</td><td>3 cm wysokości</td></tr><tr><td>Masło orzechowe</td><td>Migros (Szwajcaria)</td><td>NA</td><td>1:10</td></tr><tr><td>2-metylomasłowy</td><td>Sigma Aldrich (Szwajcaria)</td><td>W269514</td><td>Czysty</td></tr><tr><td>mocz samic od płodnych samic tego samego szczepu myszy</td><td>Ameryka</td><td>Północna</td><td>Seria rozcieńczeń</td></tr><tr><td>Aparat</td><td>fotograficzny Olympus (USA)</td><td>Camedia C-8080</td><td>Pliki MOV</td></tr><tr><td>Quicktime dla Java (Windows)</td><td>Apple (USA)</td><td></td><td>Wtyczka wideo NA do wizualizacji plików MOV</td></tr><tr><td>ImageJ dla Windows</td><td>NIH (USA)</td><td>NA</td><td>Przetwarzanie/analiza wideo</td> NA</tr></tbody></table>

proste i wspomagane komputerowo testy węchowe dla myszy

Simple and Computer-assisted Olfactory Testing for Mice

Węch jest wysoce konserwatywny wśród gatunków i jest niezbędny do rozmnażania i przetrwania.
U ludzi węch jest również jednym ze zmysłów, na które wpływa starzenie się i jest silnym predyktorem chorób neurodegeneracyjnych. W związku z tym testy węchowe są stosowane jako nieinwazyjna metoda diagnostyczna do wczesnego wykrywania deficytów neurologicznych. Aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw podatności sieci węchowej, badania węchowe na gryzoniach nabrały tempa w ciągu ostatniej dekady.
Tutaj prezentujemy bardzo prostą, efektywną czasowo i powtarzalną metodę testowania węchu wrodzonej percepcji zapachu i wrażliwości u myszy bez konieczności wcześniejszego ograniczania jedzenia lub wody. Testy są wykonywane w środowisku znanym myszom, wymagają jedynie zapachów i 2-minutowej sesji ekspozycji na substancje zapachowe. Analiza jest wykonywana post hoc za pomocą poleceń wspomaganych komputerowo na ImageJ i dlatego może być przeprowadzona od początku do końca przez jednego badacza.
Ten protokół nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu ani konfiguracji i jest przeznaczony dla każdego laboratorium zainteresowanego testowaniem percepcji węchowej i wrażliwości.

Test percepcji mierzy atrakcyjność masła orzechowego oraz unikanie kwasu 2-MB. Badaniu poddano trzy grupy myszy i określono czas spędzony w „obwodzie zapachowym” w porównaniu do wody. W teście preferencji grupa kontrolna A wykazuje istotną preferencję zapachu w porównaniu do wody (t8 = 2,52, p &lt;0,05). Z kolei grupa B nie wykazuje istotnego przyciągania do masła orzechowego i spędza więcej czasu przy wodzie (t6 = 3,22, p &lt;0,05). Tym samym zachowuje się ona inaczej niż grupa kontrolna A (F1...

Przedstawiamy prosty i bezstronny test węchowy na myszach. Dzięki temu protokołowi dyskryminacja węchowa, preferencje, unikanie i wrażliwość na nowy zapach w porównaniu z wodą mogą być oceniane w pojedynczych sesjach behawioralnych. Ta metoda jest wskazana dla pojedynczego eksperymentatora, a analiza opiera się na komputerowym przetwarzaniu wideo.

Proste i wspomagane komputerowo testy węchowe dla myszy

Olfaction is highly conserved among species and is required for reproduction and survival.
In humans, olfaction is also one of the senses that is affected ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie wrodzonej dyskryminacji węchowej, preferencji lub unikania zapachów, a także wrażliwości węchowej u myszy. Osiąga się to poprzez narażenie myszy na nowy atraktant lub repelent oraz zapach neutralny, którym jest woda. W tym czasie kamera wideo rejestruje przebieg sesji behawioralnej.Następnie wideo jest analizowane w programie Image J przy użyciu dostarczonych makr w celu wyznaczenia czasu spędzonego w obszarach zapachu oraz wody. Wyniki, uzyskane dzięki komputerowej analizie post hoc, wskazują na zachowania preferencji lub unikania zapachów w porównaniu z wodą u różnych genotypów. Główną zaletą testów węchowych przeprowadzanych w ten sposób w stosunku do wykorzystania dedykowanej areny olfaktometrycznej jest użycie znanej zwierzętom areny, co przekłada się na szybką realizację badania i prostą konfigurację.Dodatkowo, wykorzystuje ono niedrogie urządzenia. Procedurę zaprezentuje Emmanuel Abry, student w moim laboratorium. W tym doświadczeniu należy użyć samców myszy szczepu C57BL/6 w wieku od trzech do pięciu miesięcy, zarówno typu dzikiego, jak i transgenicznych. W tej demonstracji wykorzystano dwie linie z nokautem oraz kontrole z tego samego miotu.W przypadku aren doświadczalnych należy użyć czystych, wysterylizowanych klatek dla myszy z trzymcentymetrową warstwą ściółki. Następnie należy przygotować zestaw z kamerą. Należy go umieścić 58 cm nad dnem klatki na dostosowanym statywie.Zaznacz na blacie miejsca, w których powinna znajdować się klatka. Aby uzyskać obraz centralny, ustaw kamerę na nagrywanie wideo w rozdzielczości 320 na 240 pikseli z prędkością około 15 klatek na sekundę. W celu przygotowania testu, o ile to możliwe, przechowuj koncentraty każdego zapachu w rozpuszczalniku.Do testu preferencji przygotuj 10% (masa/objętość) roztwór masła orzechowego w oleju orzechowym. Do testu unikania przygotuj roztwór kwasu metylobutyrowego o stężeniu 98%. Do testu wrażliwości pobierz mocz od samicy myszy tego samego szczepu na jeden do dwóch dni przed testem.Unieruchom samicę tak, aby jej brzuch znajdował się nad kratką klatki, i zbierz krople moczu do plastikowego naczynia. Pobierz próbki od kilku samic w celu normalizacji. Aby uwzględnić zmienność osobniczą, przenieś wszystkie próbki do probówki o pojemności 1,5 ml i przechowuj w temperaturze -20°C.Aby rozpocząć habituację zwierząt, umieść jedno z nich w wyczyszczonej klatce i pozwól mu na eksplorację. Przez pięć minut środowisko w klatce testowej powinno odpowiadać warunkom panującym w klatce domowej. Powtórz fazę habituacji raz w każdym dniu testowym; po zakończeniu okresu habituacji rozpocznij nagrywanie i nanieś pipetą 60 µL przyjemnego zapachu.W tym przypadku na jednej ścianie należy nanieść masło orzechowe, a na ścianie przeciwległej pipetą nanieść taką samą ilość wody. Jest to zapach neutralny; krople należy nanieść około 10 centymetrów powyżej każdej ze ścian. Następnie należy pozwolić zwierzęciu na eksplorację przez dwie minuty, po czym zatrzymać nagrywanie i przenieść mysz z powrotem do klatki domowej.Powtórz ten proces dla każdej myszy przeznaczonej do badania, za każdym razem używając nowych klatek testowych. Od trzech do pięciu dni po przeprowadzeniu wszystkich testów preferencji wykonaj test unikania, korzystając z nowej klatki testowej.Dla każdej myszy przeprowadź test unikania. Postępuj analogicznie jak w teście atrakcyjności, zastępując jedynie zapach przyjemny zapachem unikowym, którym jest kwas 2-metylomaślowy. W przypadku testu wrażliwości tę samą klatkę można wykorzystać ponownie podczas kolejnych prób dla tej samej myszy.Należy zatem oznaczyć stronę klatki sąsiadującą z wodą i przygotować papier nasączony 70% ethanolem do czyszczenia krótkich ścianek pomiędzy próbami. W dniu eksperymentu należy przygotować cztery stężenia moczu, stosując dziesięciokrotny szereg rozcieńczeń. Wykorzystując wodę dwukrotnie destylowaną, podobnie jak w teście unikania, należy poddać każde zwierzę habituacji do klatki testowej przez pięć minut.Następnie poddaj każdą mysz działaniu moczu w najpierwszej kolejności w najwyższym rozcieńczeniu, wynoszącym 1:10 000. Podczas rejestracji nanieś rozcieńczony mocz na ściankę klatki testowej, a wodę na ściankę przeciwległą. Podobnie jak w innych testach, pozwól zwierzęciu na eksplorację.Przez dwie minuty. Następnie przenieś zwierzę do czystej klatki dla myszy. Po tym, jak wszystkie zwierzęta zostaną poddane działaniu najniższego stężenia, wyczyść wszystkie ścianki klatek testowych i powtórz badanie na każdej myszy, używając kolejnego, wyższego stężenia moczu.Kontynuuj ten proces aż do przetestowania czystego moczu. Po zebraniu wszystkich danych dla danego eksperymentu, otwórz filmy w programie Image J w celu przeprowadzenia korekt i przetwarzania; szczegóły tych działań są opisane w protokole tekstowym z wykorzystaniem przedstawionych procedur. Dwie różne linie knockout.Grupy B i C porównano z grupą kontrolną A, złożoną z osobników z tego samego miotu. Dwustronny test t Studenta przy równej lub nierównej wariancji posłużył do porównania czasu spędzonego pomiędzy zapachem a wodą w obrębie genotypów. Zachowanie pomiędzy genotypami porównano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). Obie grupy eksperymentalne, B i C, nie wykazały preferencji dla zapachu atrakcyjnego. W teście unikania reakcja na odpychający zapach kwasu 2-metylomaślanowego była zgodna z oczekiwaniami dla grup A i B, natomiast grupa C nie wykazała zachowania unikania w stosunku do tego zapachu.W teście wrażliwości próg atrakcyjności uzyskano poprzez odjęcie czasu spędzonego z moczem od czasu spędzonego z wodą, przy czym preferencję wobec mocznia w stosunku do wody stwierdzono przy rozcieńczeniu 1:1000. Tymczasem obie grupy eksperymentalne, B i c, wymagały stężenia 100-krotnie większego, aby wykazać preferencję. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu kilku godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo; następnie, stosując tę procedurę, można przeprowadzić inne metody, takie jak uczenie olfaktoryczne i wygaszanie, w celu zbadania plastyczności i uczenia się w obrębie zmysłu węchu.

simple-and-computer-assisted-olfactory-testing-for-mice

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Fundamentalne, a zarazem unikalne właściwości układu węchowego gryzoni sprawiły, że staje się on coraz częściej przedmiotem badań biologów. Istnieje zatem potrzeba opracowania stosunkowo prostego sposobu oceny jego funkcji. W niniejszej pracy opisujemy czułe testy służące do charakterystyki wrażliwości i preferencji węchowych myszy.

Badanie zachowań węchowych u dorosłych myszy

Upośledzenie funkcji węchu jest powszechną cechą wielu zaburzeń neurodegeneracyjnych, w tym chorób Parkinsona, Alzheimera i Huntingtona. W niniejszym artykule opisujemy zestaw testów do oceny dyskryminacji i wykrywania węchu u myszy, które można wykorzystać do pomiaru zdolności węchowych w mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych.

Testy węchowe dla mysich modeli choroby neurodegeneracyjnej

Ten manuskrypt opisuje protokół badania układu węchowego gryzoni. Test przyzwyczajenia/dezhabituacji węchowej pozwoli badaczom określić, czy mysz przyzwyczaja się do wielokrotnie prezentowanego zapachu i czy mysz wykazuje nieprzyzwyczajenie, gdy przedstawia się jej nowy zapach.

Badanie dyskryminacji i habituacji zapachowej u myszy

Zaburzenia poznawcze związane z uwagą są podstawową cechą wielu chorób psychicznych. W tym miejscu przedstawiamy opracowanie nowatorskiego automatycznego systemu do skutecznego badania zdolności zmiany ustawień uwagi, funkcji wykonawczych i innych zdolności poznawczych u myszy o wysokiej trafności translacyjnej do badań na ludziach.

Operacyjne wewnątrz-/zewnątrzwymiarowe zadanie zmiany ustawień dla myszy

Tutaj szkolimy myszy w zadaniu uczenia asocjacyjnego, aby przetestować rozróżnianie zapachów. Protokół ten pozwala również na badania nad zmianami strukturalnymi w mózgu wywołanymi uczeniem się.

Obiektywny i powtarzalny test uczenia się węchu i dyskryminacji u myszy

Ten artykuł zawiera szczegółowy opis nowego protokołu błędu oceny myszy. Przedstawiono również dowody na wrażliwość tego zadania węchowego na stan afektywny i omówiono jego użyteczność w różnych dziedzinach badawczych.

Ocena błędu oceny myszy za pomocą zadania kopania węchowego

Ten artykuł zawiera szczegółowy opis testu zakopanego jedzenia i eksperymentu z dyskryminacją zapachów społecznych, aby ocenić wpływ narażenia na wdychane zanieczyszczenia środowiska na funkcje węchowe u myszy.

Badanie wpływu wdychanych zanieczyszczeń środowiska na funkcje węchowe u myszy

Protokół ten opisuje konstrukcję olfaktometru do eksperymentów z zachowaniami węchowymi go/no-go. Instrukcje krok po kroku wraz ze zdjęciami są dostarczane, aby zapewnić pomyślną konstrukcję olfaktometru. Dołączone są również informacje dotyczące rozwiązywania problemów napotkanych podczas procesu.

Konstruowanie olfaktometru do badań zachowań węchowych gryzoni

W tym miejscu przedstawiamy protokół testu preferencji węchowych, który pozwala na ocenę negatywnych uprzedzeń węchowych zarówno wobec apetytywnych, jak i awersyjnych bodźców zapachowych w mysich modelach depresji.

Test preferencji węchowych do pomiaru węchowych uprzedzeń hedonicznych w mysich modelach depresji

Ten artykuł przedstawia protokół dla kontekstowego i podpowiedzianego testu warunkowania strachu przy użyciu systemu analizy wideo do oceny uczenia się strachu i pamięci u myszy.

Kontekstowy i sygnalizowany test warunkowania strachu przy użyciu systemu analizy wideo u myszy

Poznaj proste testy węchowe dla myszy z analizą komputerową w ImageJ. Metoda ocenia dyskryminację zapachów, preferencje i unikanie u różnych genotypów w znajomej arenie.

Proste i wspomagane komputerowo testy węchowe dla myszy

Przeglądaj więcej filmów