Proste i wspomagane komputerowo testy węchowe dla myszy
15 czerwca 2015
Przedstawiamy prosty i bezstronny test węchowy na myszach. Dzięki temu protokołowi dyskryminacja węchowa, preferencje, unikanie i wrażliwość na nowy zapach w porównaniu z wodą mogą być oceniane w pojedynczych sesjach behawioralnych. Ta metoda jest wskazana dla pojedynczego eksperymentatora, a analiza opiera się na komputerowym przetwarzaniu wideo.
Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie wrodzonej dyskryminacji węchowej, preferencji lub unikania zapachów, a także wrażliwości węchowej u myszy. Osiąga się to poprzez narażenie myszy na nowy atraktant lub repelent oraz zapach neutralny, którym jest woda. W tym czasie kamera wideo rejestruje przebieg sesji behawioralnej.
Następnie wideo jest analizowane w programie Image J przy użyciu dostarczonych makr w celu wyznaczenia czasu spędzonego w obszarach zapachu oraz wody. Wyniki, uzyskane dzięki komputerowej analizie post hoc, wskazują na zachowania preferencji lub unikania zapachów w porównaniu z wodą u różnych genotypów. Główną zaletą testów węchowych przeprowadzanych w ten sposób w stosunku do wykorzystania dedykowanej areny olfaktometrycznej jest użycie znanej zwierzętom areny, co przekłada się na szybką realizację badania i prostą konfigurację.
Dodatkowo, wykorzystuje ono niedrogie urządzenia. Procedurę zaprezentuje Emmanuel Abry, student w moim laboratorium. W tym doświadczeniu należy użyć samców myszy szczepu C57BL/6 w wieku od trzech do pięciu miesięcy, zarówno typu dzikiego, jak i transgenicznych. W tej demonstracji wykorzystano dwie linie z nokautem oraz kontrole z tego samego miotu.
W przypadku aren doświadczalnych należy użyć czystych, wysterylizowanych klatek dla myszy z trzymcentymetrową warstwą ściółki. Następnie należy przygotować zestaw z kamerą. Należy go umieścić 58 cm nad dnem klatki na dostosowanym statywie.
Zaznacz na blacie miejsca, w których powinna znajdować się klatka. Aby uzyskać obraz centralny, ustaw kamerę na nagrywanie wideo w rozdzielczości 320 na 240 pikseli z prędkością około 15 klatek na sekundę. W celu przygotowania testu, o ile to możliwe, przechowuj koncentraty każdego zapachu w rozpuszczalniku.
Do testu preferencji przygotuj 10% (masa/objętość) roztwór masła orzechowego w oleju orzechowym. Do testu unikania przygotuj roztwór kwasu metylobutyrowego o stężeniu 98%. Do testu wrażliwości pobierz mocz od samicy myszy tego samego szczepu na jeden do dwóch dni przed testem.
Unieruchom samicę tak, aby jej brzuch znajdował się nad kratką klatki, i zbierz krople moczu do plastikowego naczynia. Pobierz próbki od kilku samic w celu normalizacji. Aby uwzględnić zmienność osobniczą, przenieś wszystkie próbki do probówki o pojemności 1,5 ml i przechowuj w temperaturze -20°C.
Aby rozpocząć habituację zwierząt, umieść jedno z nich w wyczyszczonej klatce i pozwól mu na eksplorację. Przez pięć minut środowisko w klatce testowej powinno odpowiadać warunkom panującym w klatce domowej. Powtórz fazę habituacji raz w każdym dniu testowym; po zakończeniu okresu habituacji rozpocznij nagrywanie i nanieś pipetą 60 µL przyjemnego zapachu.
W tym przypadku na jednej ścianie należy nanieść masło orzechowe, a na ścianie przeciwległej pipetą nanieść taką samą ilość wody. Jest to zapach neutralny; krople należy nanieść około 10 centymetrów powyżej każdej ze ścian. Następnie należy pozwolić zwierzęciu na eksplorację przez dwie minuty, po czym zatrzymać nagrywanie i przenieść mysz z powrotem do klatki domowej.
Powtórz ten proces dla każdej myszy przeznaczonej do badania, za każdym razem używając nowych klatek testowych. Od trzech do pięciu dni po przeprowadzeniu wszystkich testów preferencji wykonaj test unikania, korzystając z nowej klatki testowej.
Dla każdej myszy przeprowadź test unikania. Postępuj analogicznie jak w teście atrakcyjności, zastępując jedynie zapach przyjemny zapachem unikowym, którym jest kwas 2-metylomaślowy. W przypadku testu wrażliwości tę samą klatkę można wykorzystać ponownie podczas kolejnych prób dla tej samej myszy.
Należy zatem oznaczyć stronę klatki sąsiadującą z wodą i przygotować papier nasączony 70% ethanolem do czyszczenia krótkich ścianek pomiędzy próbami. W dniu eksperymentu należy przygotować cztery stężenia moczu, stosując dziesięciokrotny szereg rozcieńczeń. Wykorzystując wodę dwukrotnie destylowaną, podobnie jak w teście unikania, należy poddać każde zwierzę habituacji do klatki testowej przez pięć minut.
Następnie poddaj każdą mysz działaniu moczu w najpierwszej kolejności w najwyższym rozcieńczeniu, wynoszącym 1:10 000. Podczas rejestracji nanieś rozcieńczony mocz na ściankę klatki testowej, a wodę na ściankę przeciwległą. Podobnie jak w innych testach, pozwól zwierzęciu na eksplorację.
Przez dwie minuty. Następnie przenieś zwierzę do czystej klatki dla myszy. Po tym, jak wszystkie zwierzęta zostaną poddane działaniu najniższego stężenia, wyczyść wszystkie ścianki klatek testowych i powtórz badanie na każdej myszy, używając kolejnego, wyższego stężenia moczu.
Kontynuuj ten proces aż do przetestowania czystego moczu. Po zebraniu wszystkich danych dla danego eksperymentu, otwórz filmy w programie Image J w celu przeprowadzenia korekt i przetwarzania; szczegóły tych działań są opisane w protokole tekstowym z wykorzystaniem przedstawionych procedur. Dwie różne linie knockout.
Grupy B i C porównano z grupą kontrolną A, złożoną z osobników z tego samego miotu. Dwustronny test t Studenta przy równej lub nierównej wariancji posłużył do porównania czasu spędzonego pomiędzy zapachem a wodą w obrębie genotypów. Zachowanie pomiędzy genotypami porównano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). Obie grupy eksperymentalne, B i C, nie wykazały preferencji dla zapachu atrakcyjnego. W teście unikania reakcja na odpychający zapach kwasu 2-metylomaślanowego była zgodna z oczekiwaniami dla grup A i B, natomiast grupa C nie wykazała zachowania unikania w stosunku do tego zapachu.
W teście wrażliwości próg atrakcyjności uzyskano poprzez odjęcie czasu spędzonego z moczem od czasu spędzonego z wodą, przy czym preferencję wobec mocznia w stosunku do wody stwierdzono przy rozcieńczeniu 1:1000. Tymczasem obie grupy eksperymentalne, B i c, wymagały stężenia 100-krotnie większego, aby wykazać preferencję. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu kilku godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo; następnie, stosując tę procedurę, można przeprowadzić inne metody, takie jak uczenie olfaktoryczne i wygaszanie, w celu zbadania plastyczności i uczenia się w obrębie zmysłu węchu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia prosty test węchowy przeznaczony dla myszy, umożliwiający ocenę dyskryminacji węchowej, preferencji, unikania oraz wrażliwości na nowy zapach w porównaniu z wodą. Metoda ta jest wydajna dla pojedynczego eksperymentatora i opiera się na komputerowej analizie wideo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Badania węchowe
Wstęp
- Celem eksperymentu jest ocena wrodzonych zachowań węchowych u myszy.
- Procedura polega na ekspozycji na nowy zapach oraz neutralną kontrolę (wodę).
- Zachowanie jest rejestrowane i analizowane w celu określenia preferencji lub awersji.
- Metoda ta wykorzystuje znane myszom środowisko, co zwiększa wiarygodność wyników.
Cel badania
- Ocena dyskryminacji węchowej u myszy.
- Ocena zachowań preferencji i unikania zapachów.
- Pomiar wrażliwości węchowej na nowe zapachy.
Zastosowane metody
- Myszy są eksponowane na nowy atraktant lub repelent oraz wodę.
- Sesje behawioralne są rejestrowane za pomocą kamery wideo.
- Analiza wideo jest przeprowadzana przy użyciu oprogramowania Image J z wykorzystaniem makr.
- Wyniki są analizowane w celu określenia czasu spędzonego przy każdym zapachu.
Główne wyniki
- Wyniki wskazują na zachowania preferencji lub unikania w stosunku do zapachów w porównaniu z wodą.
- Reakcje behawioralne różnią się w zależności od genotypu.
- Metoda ta umożliwia szybkie przygotowanie i przeprowadzenie eksperymentów.
- Analiza wspomagana komputerowo zwiększa dokładność wyników.
Wnioski
- Test węchowy jest niezawodną metodą oceny zachowań węchowych u myszy.
- Wykorzystanie znanej areny upraszcza proces eksperymentalny.
- Podejście to może być korzystne w przypadku różnych badań behawioralnych w neuronauce.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zaburzenia węchu stanowią wczesny biomarker w modelach chorób neurodegeneracyjnych, co sprawia, że wiarygodne testy węchu u gryzoni są kluczowe dla walidacji celów w procesie odkrywania leków na schorzenia OUN. Metoda ta umożliwia szybką i powtarzalną ocenę wrodzonego postrzegania zapachów oraz wrażliwości węchowej bez konieczności ograniczania dostępu do pokarmu lub wody, co wspiera wysokoprzepustowe przesiewanie interwencji genetycznych lub farmakologicznych. Poprzez kwantyfikację reakcji behawioralnych na substancje wabiące, odstraszające oraz progi wrażliwości, metoda ta pozwala na mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku celów związanych z dysfunkcją sieci węchowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez powiązanie genotypu z zachowaniem węchowym, umożliwiając funkcjonalną walidację celów w szlakach węchowych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje znane środowiska i minimalną habituację, co redukuje zmienność indukowaną stresem i poprawia powtarzalność testów dla różnych genotypów.
- Wartość prognostyczna: Wykrywa zmienioną preferencję lub unikanie zapachów w modelach knockout, co wspiera wczesną redukcję ryzyka dla celów związanych z wskazaniami neurodegeneracyjnymi lub psychiatrycznymi.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe metryki czasu spędzonego w określonych strefach za pomocą analizy w programie ImageJ wspomaganej komputerowo, co umożliwia obiektywne porównanie reakcji na zapachy pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
- Wartość operacyjna: Wymaga jedynie standardowych klatek, ściółki, zapachów i kamery wideo, co pozwala na skalowalną implementację w laboratoriach badawczych bez konieczności posiadania specjalistycznego sprzętu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera charakterystykę zależności dawka-odpowiedź w testach wrażliwości, dostarczając informacji do optymalizacji związków wiodących poprzez określenie efektywnych zakresów stężeń dla zachowań wywołanych przez substancje zapachowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zgodność z ludzkimi deficytami węchowymi jako biomarkerami prodromalnymi, co zwiększa relewantność translacyjną modeli mysich w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne badanie czułości poprzez seryjne rozcieńczenia, co wspiera monitorowanie progresji w przedklinicznych badaniach skuteczności.
- Wartość prognostyczna: Identyfikacja genotypowo swoistych progów detekcji zapachów, co pomaga w stratyfikacji pacjentów i wyborze celów terapeutycznych zgodnych z biomarkerami.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu po identyfikację związku wiodącego – dostarczając odczytów behawioralnych, które stanowią podstawę do podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac przed zainwestowaniem w konkretny związek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez pomiar wrodzonej dyskryminacji i preferencji węchowych, wyjaśniając funkcję genów w szlakach przetwarzania sensorycznego.
- Screening: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe wyniki (czas spędzony w strefach zapachu i wody), które umożliwiają wiarygodne porównanie efektów działania związków lub genotypów.
- Analityka: Analiza wspomagana komputerowo zapewnia powtarzalne pomiary oparte na wartościach progowych, co wspiera porównania statystyczne między różnymi warunkami traktowania.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie utraty wrażliwości węchowej, która jest cechą prognostyczną dla klinicznej neurodegeneracji.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Możliwość ponownego wykorzystania w wielu typach testów (preferencja, unikanie, wrażliwość) oraz w różnych szczepach myszy, co czyni tę metodę platformą badawczą, a nie jednorazowym testem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w funkcjonowaniu obwodów węchowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki stałym czasom ekspozycji, ślepej analizie wideo oraz wewnętrznym kontrolom wodnym.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając szybką selekcję celów przy użyciu niskokosztowego i wysoce powtarzalnego fenotypowania behawioralnego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka poprzez identyfikację celów, których modulacja przywraca lub odtwarza fenotypy węchowe.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu pracy z gryzoniami, obserwacji behawioralnej oraz podstawowej obsługi oprogramowania do śledzenia wideo (ImageJ).
- Wyniki zależą od stałego oświetlenia, ustawienia kamery (58 cm nad klatką) oraz przygotowania substancji zapachowych (np. rozcieńczeń oleju z masła orzechowego, serii rozcieńczeń moczu).
- Konieczna jest standaryzacja protokołów habituacji w obrębie zespołu oraz analiza ślepa w celu zminimalizowania błędu operatora.
- Adaptacja metody do różnych systemów modelowych wymaga walidacji istotności substancji zapachowych (np. feromonów specyficznych dla gatunku lub substancji awersyjnych).
- Ograniczenie praktyczne: czułość testu zależy od dokładnego podania substancji zapachowych oraz dokładnego oczyszczania aparatury pomiędzy próbami w celu zapobiegania kontaminacji krzyżowej, szczególnie podczas testów czułości.
