Proste i wspomagane komputerowo testy węchowe dla myszy
June 15th, 2015
Przedstawiamy prosty i bezstronny test węchowy na myszach. Dzięki temu protokołowi dyskryminacja węchowa, preferencje, unikanie i wrażliwość na nowy zapach w porównaniu z wodą mogą być oceniane w pojedynczych sesjach behawioralnych. Ta metoda jest wskazana dla pojedynczego eksperymentatora, a analiza opiera się na komputerowym przetwarzaniu wideo.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przetestowanie wrodzonej dyskryminacji węchowej, preferencji węchowej lub unikania i wrażliwości węchowej u myszy. Osiąga się to poprzez wystawienie myszy na działanie nowego atraktantu lub apelu oraz neutralnego zapachu, którym jest woda. W tym czasie kamera wideo rejestruje sesję behawioralną.
Następnie wideo jest analizowane na obrazie J za pomocą dostarczonych makr w celu uzyskania czasu spędzonego w parametrach zapachu i wody. Wyniki pokazują preferowanie lub unikanie zapachów w porównaniu z wodą wśród różnych genotypów w oparciu o analizę wspomaganą komputerowo post hoc. Główną zaletą testów węchowych w porównaniu z wykorzystaniem dedykowanej areny i węchu jest to, że wykorzystuje ono znaną arenę, a zatem jest szybkie i proste w konfiguracji.
Ponadto wykorzystuje niedrogi sprzęt, który demonstruje, że procedura będzie Emmanuelem Abry, według studenta w moim laboratorium. Do tego eksperymentu użyj trzy- do pięciu miesięcznych samców, czarnych C 57, sześciu myszy typu dzikiego i transgenicznych. W tej demonstracji wykorzystano dwie linie nokautu i kontrole kolegów.
Na arenach eksperymentalnych używaj czystych, wysterylizowanych klatek dla myszy z trzema centymetrami ściółki. Następnie przygotuj konfigurację kamery. Umieść go 58 centymetrów nad podłogą klatki na niestandardowym uchwycie do statywu.
Zrób kilka znaków na blacie, aby wskazać, gdzie powinna znajdować się klatka. Aby uzyskać centralny obraz, ustaw aparat tak, aby nagrywał wideo o wymiarach 320 na 240 pikseli z około 15 klatkami na sekundę. Aby się przygotować, osoba badana powinna przechowywać koncentraty każdego zapachu w rozpuszczalniku, gdy tylko jest to możliwe.
Do testu preferencji przygotuj 10% wagowy roztwór masła orzechowego w oleju arachidowym. Do testu unikania należy spożyć roztwór 98% kwasu metylomasłowego. Do testu wrażliwości należy pobrać mocz samicy myszy tego samego szczepu na jeden do dwóch dni przed badaniem.
Skrępuj samicę brzuchem nad siatką klatki i zbieraj krople jej moczu do plastikowego naczynia. Zbierz próbki od kilku samic w celu normalizacji. Aby uzyskać indywidualną zmienność, należy pobrać wszystkie próbki do 1,5-mililitrowej probówki i przechowywać ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
Aby zacząć się przyzwyczajać, zwierzęta umieść je w oczyszczonej klatce i pozwól mu eksplorować. Przez pięć minut środowisko klatki testowej powinno być takie samo jak w klatce domowej. Powtórz fazę habituacji raz w każdym dniu testu, po zakończeniu okresu przyzwyczajenia rozpocznij zapis i odpipetuj 60 mikrolitrów przyjemnego zapachu.
W takim przypadku masło orzechowe wyłóż na jedną ścianę na przeciwległej ściance, odpipetuj taką samą ilość wody. Neutralny zapach, nałóż krople około 10 centymetrów w górę każdej ściany. Teraz pozwól zwierzęciu eksplorować przez dwie minuty, a następnie zatrzymaj nagrywanie i wróć mysz do klatki domowej.
Powtórz ten proces dla każdej myszy, która ma być testowana. Zawsze używaj nowych klatek testowych. Trzy do pięciu dni Po wykonaniu wszystkich testów preferencji przeprowadź test unikania przy użyciu nowej klatki testowej.
Dla każdej myszy wykonaj test unikania. Podobnie jak w przypadku testu przyciągania, zastąp przyjemny zapach tylko zapachem unikania, którym są dwa kwasy metylomasłowy. Do testu wrażliwości jedna klatka może być ponownie użyta między próbami dla tej samej myszy.
Dlatego zaznacz klatkę od strony wody i przygotuj się do czyszczenia krótkich ścian papierem nasączonym 70% etanolem między próbami. W dniu eksperymentu wykonaj cztery stężenia moczu z dziesięciokrotną serią rozcieńczeń. Używając podwójnie destylowanej wody, takiej jak w teście unikania, przyzwyczaj każde zwierzę do klatki testowej na pięć minut.
Następnie wystawiaj każdą mysz na działanie moczu w najwyższym rozcieńczeniu na początku, czyli od 1 do 10 000. Podczas nagrywania nałóż rozcieńczony mocz do klatki testowej i nałóż wodę na przeciwległą ścianę. Podobnie jak w przypadku innych testów, pozwól zwierzęciu eksplorować.
Przez dwie minuty. Następnie przenieś zwierzę do czystej klatki dla myszy. Po tym, jak wszystkie zwierzęta doświadczą najniższego stężenia, wyczyść wszystkie ściany klatki testowej i powtórz test na każdej myszy, używając następnego najbardziej zagęszczonego moczu.
Kontynuuj ten proces, aż czysty mocz zostanie przetestowany. Po zebraniu wszystkich danych do eksperymentu otwórz filmy na obrazie J w celu dostosowania i przetworzenia, których szczegóły są podane w protokole tekstowym przy użyciu opisanych protokołów. Dwie różne linie nokautu.
Grupy B i C porównano z grupą kontrolną wykonaną w miocie, grupa A.A bezkierunkowy test T studenta o równej lub nierównej wariancji porównuje czas spędzony między zapachem a wodą w genotypach. Porównaj zachowanie między genotypami za pomocą jednokierunkowej inova. Obie grupy eksperymentalne, B i C, nie wykazały preferencji dla atrakcyjnego zapachu W teście unikania reakcja na odpychający zapach kwasu metylomasłowyego była zgodna z oczekiwaniami dla grup A i B, ale grupa C nie wykazała zachowania unikającego tego zapachu.
W teście wrażliwości próg przyciągania uzyskano poprzez odjęcie czasu spędzonego z moczem od czasu spędzonego z wodą, przy czym mocz był preferowany do wody w rozcieńczeniu od jednego do 1000. Podczas gdy obie grupy eksperymentalne, B i C potrzebowały 100-krotnie większego stężenia, aby wykazać preferencje. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, a następnie zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak uczenie się węchu i wygaszanie, aby zbadać plastyczność węchową i uczenie się.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia prosty test węchowy zaprojektowany dla myszy, umożliwiający ocenę dyskryminacji węchowej, preferencji, unikania i wrażliwości na nowy zapach w porównaniu z wodą. Metoda jest wydajna dla pojedynczego eksperymentatora i opiera się na komputerowej analizie wideo.
Główne elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Analiza zachowania
- Testy węchowe
Tło
- Celem eksperymentu jest ocena wrodzonych zachowań węchowych u myszy.
- Zawierają ekspozycję na nowy zapach i neutralną kontrolę (wodę).
- Zachowanie jest nagrywane i analizowane w celu określenia preferencji lub antypatii.
- Ta metoda wykorzystuje znane dla myszy środowisko, co zwiększa wiarygodność wyników.
Cel badania
- Ocena dyskryminacji węchowej u myszy.
- Ocena preferencji i zachowań unikania węchowych.
- Pomiar wrażliwości węchowej na nowe zapachy.
Stosowane metody
- Myszy są eksponowane na nowy atrakcyjny lub przyciągający zapach i wodę.
- Sesje behawioralne są nagrywane za pomocą kamery wideo.
- Analiza wideo jest przeprowadzana za pomocą oprogramowania Image J z makrami.
- Wyniki są analizowane, aby określić czas spędzony przy każdym zapachu.
Główne wyniki
- Wyniki wskazują na zachowania preferencji lub unikania w stosunku do zapachów w porównaniu z wodą.
- Reakcje behawioralne różnią się wśród różnych genotypów.
- Metoda pozwala na szybkie przygotowanie i zakończenie eksperymentów.
- Komputerowa analiza zwiększa dokładność wyników.
Wnioski
- Test węchowy jest wiarygodną metodą oceny zachowania węchowego u myszy.
- Wykorzystanie znanej aren dla myszy upraszcza proces eksperymentalny.
- To podejście może być korzystne dla różnych badań behawioralnych w neuronauce.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Olfactory dysfunction is an early biomarker in neurodegenerative disease models, making reliable rodent olfaction assays critical for target validation in CNS drug discovery. This method enables rapid, reproducible assessment of innate odor perception and sensitivity without food/water restriction, supporting high-throughput screening of genetic or pharmacological interventions. By quantifying behavioral responses to attractants, aversants, and sensitivity thresholds, it provides mechanistic de-risking for targets implicated in olfactory network dysfunction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking genotype to olfactory behavior, enabling functional validation of targets in olfactory pathways.
- Operational Value: Uses familiar environments and minimal habituation, reducing stress-induced variability and improving assay reproducibility across genotypes.
- Predictive Value: Detects altered odor preference or avoidance in knockout models, supporting early de-risking of targets associated with neurodegenerative or psychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative time-spent metrics via computer-assisted ImageJ analysis, enabling objective comparison of odor responses across experimental groups.
- Operational Value: Requires only standard cages, bedding, scents, and a video camera, allowing scalable implementation in discovery labs without specialized equipment.
- Predictive Value: Supports dose-response characterization in sensitivity testing, informing lead optimization by defining effective concentration ranges for odorant-evoked behaviors.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with human olfactory deficits as prodromal biomarkers, enhancing translational relevance of mouse models in neurodegenerative disease research.
- Operational Value: Enables longitudinal sensitivity testing through serial dilution series, supporting progression tracking in preclinical efficacy studies.
- Predictive Value: Identifies genotype-specific thresholds for odor detection, aiding in patient stratification and biomarker-aligned target selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing behavioral readouts that inform go/no-go decisions prior to compound investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring innate olfactory discrimination and preference, clarifying gene function in sensory processing pathways.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (time in odor vs. water zones) that enable reliable comparison of compound or genotype effects.
- Analytics: Computer-assisted analysis provides reproducible, threshold-based measurements that support statistical comparison across treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling olfactory sensitivity loss, a feature predictive of clinical neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Reusable across multiple test types (preference, avoidance, sensitivity) and mouse strains, functioning as a platform capability rather than a single-use assay.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in olfactory circuit function.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through fixed exposure times, blinded video analysis, and internal water controls.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of targets using low-cost, high-reproducibility behavioral phenotyping.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying targets whose modulation rescues or recapitulates olfactory phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, behavioral observation, and basic video tracking software (ImageJ).
- Dependent on consistent lighting, camera positioning (58 cm above cage), and odorant preparation (e.g., peanut butter oil dilutions, urine dilution series).
- Necessitates cross-team standardization of habituation protocols and blind analysis to minimize operator bias.
- Adaptation across model systems requires validation of odorant relevance (e.g., species-specific pheromones or aversants).
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on accurate odorant delivery and cleanup between trials to prevent cross-contamination, particularly in sensitivity testing.
