Name: Charakterystyczne działanie kapilarne przez mikrokanały w matrycach przypominających kości może poprawić rekrutację komórek w celu przywrócenia dużego ubytku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metodę tworzenia biomimetycznych matryc kostnych z mikrokanałami wspierającymi działanie kapilarne i rekrutację komórek. Technika ta poprawia absorpcję osteoblastów w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

1. Przygotowanie gąbki poliuretanowej (PU) jako szablon
<ol>
	<li>Użyj gąbek PU do wytworzenia szablonów hydroksyapatytu zawierających łączące się pory. Użyj każdej gąbki, aby zapewnić pierwotne beleczki do tworzenia rozpórek szablonowych, a także do tworzenia mikrokanałów w beleczkach.</li>
	<li>Wytnij i przytnij gąbki o powierzchni 80 ppi (pory na cal) w 2 kształty mostków o wymiarach 3,5 cm wysokości x 5 cm długości x 1,5 cm szerokości. 
	Uwaga: Wymiary i kształty można wybrać zgodnie z żądanym rozmiarem porów podstawowych: 100 ppi, 80 ppi i 60 ppi.</li>
	<li>Przygotować 100 ml 4% (m/v) roztworu NaOH za pomocą zlewki o pojemności 150 ml; następnie zanurzyć i wycisnąć, aż przygotowane gąbki całkowicie nasiąkną.</li>
	<li>Po namoczeniu umieścić zlewkę z gąbkami w ultrasonografie (42 kHz).</li>
	<li>Ultradźwiękowo poddaj gąbki PU obróbce wstępnej przez 15-20 minut bez podgrzewania, aby zmodyfikować właściwości powierzchni.</li>
	<li>Płukać wodą destylowaną przez 5-10 min. Podczas płukania ściśnij gąbki i pozwól im rozszerzyć się 5 do 7 razy, aby usunąć resztki NaOH znajdujące się wewnątrz gąbek.</li>
	<li>Ściskaj gąbki ręcznikami papierowymi w celu usunięcia nadmiaru wody, a następnie susz je w piekarniku w temperaturze 60-80 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie gnojowicy hydroksyapatytu (HA) do powlekania
<ol>
	<li>Przed przygotowaniem zawiesiny kwasu hialuronowego należy zmierzyć wagę zlewki za pomocą mieszadła magnetycznego. Pomiar ten zostanie wykorzystany do obliczenia stosunku proszku do cieczy.</li>
	<li>Odmierz 10 g proszku HA o rozmiarach nano.</li>
	<li>Dodać 20 ml wody destylowanej do zlewki o pojemności 50 ml. Podgrzać do temperatury 120-140 °C i wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego z płytą grzejną.</li>
	<li>Dodaj 0,3 g (3% w/w) alkoholu poliwinylowego (PVA) (89 000-98 000 MW) na proszek do wody destylowanej, mieszając przy 300-400 obr./min.</li>
	<li>Mieszaj, aż PVA całkowicie się rozpuści. Roztwór powinien być klarowny po całkowitym rozpuszczeniu PVA.</li>
	<li>Wyłącz ogień i dodaj 0,1 g (1% w/w) karboksymetylocelulozy sodowej (CMC) (o bardzo niskiej lepkości) na proszek, mieszając przy 400-500 obr./min. Roztwór powinien być klarowny po całkowitym rozpuszczeniu PVA.</li>
	<li>Mieszaj, aż CMC całkowicie się rozpuści i ostudź do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Dodać 0,3 g (3% w/w) dyspergatora amonowo-poliakrylowego na proszek, mieszając przy 300-400 obr./min. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Dodaj 0,2 g (2% w/w) gliceryny na proszek, mieszając przy 300-400 obr./min. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Powoli rozprowadź proszek HA w roztworze, mieszając z prędkością 600-900 obr./min i mieszaj przez 5 minut.</li>
	<li>Sonikować przez 5 minut za pomocą ultradźwięków, aby zapewnić dyspersję jakiejkolwiek aglomeracji proszku HA.</li>
	<li>Dodać dodatkowe 5 ml wody destylowanej do mieszaniny, mieszając przy 600-900 obr./min i podgrzewać w temperaturze 90-100 °C.</li>
	<li>Mieszaj mieszaninę za pomocą mieszadła magnetycznego z prędkością 600-800 obr./min w temperaturze 90-100 °C, aby odparować zawartość wody.</li>
	<li>Od czasu do czasu odmierzać całą masę, łącznie ze zlewką i mieszanką, aż do uzyskania stosunku proszek/ciecz 1,75-1,8.</li>
	<li>Formatując stosunek proszku do cieczy, podzielić masę proszku przez całkowitą masę mieszaniny (2.14), łącznie z proszkiem, odczynnikami i wodą, pomniejszoną o masę zlewki i mieszadła (2.1) i pomniejszoną o proszek kwasu hialuronowego (2.2). 
	Uwaga: Na przykład: Jeśli A (cała mieszanina wraz z proszkiem, odczynnikami i wodą) wynosi 49,05 g, B (zlewka z mieszadłem) wynosi 33,5 g, a C (proszek HA) wynosi 10 g, 
	C/(A-B-C) = 10/(49,05-33,5-10) = 1,80</li>
	<li>Poczekaj, aż gnojowica ostygnie do temperatury pokojowej przed użyciem do powlekania.</li>
</ol>
3. Powlekanie HA, suszenie i spiekanie
<ol>
	<li>Przygotowane gąbki PU pokryć zawiesiną powlekającą HA za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej, aż gnojowica zostanie równomiernie rozprowadzona w gąbce PU na szklanej płycie. 
	Uwaga: Po usunięciu nadmiaru gnojowicy niektóre pory mogą być nadal zatkane gnojowicą ze względu na wysoką lepkość gnojowicy.</li>
	<li>Aby zapewnić wzajemne połączenia, jednorodność i otwarte pory, należy lekko przedmuchać szablony pokryte HA za pomocą sprężarki powietrza. Proces ten zapewnia, że szablony są jednorodnie pokryte zarówno na wewnętrznej, jak i zewnętrznej powierzchni gąbki PU. 
	Uwaga: Jeśli nie zostanie uzyskana jednorodna powłoka, szablony pokryte HA zapadną się podczas procesu spiekania, a także mogą pękać podczas przenoszenia z powodu niskiej wytrzymałości mechanicznej. Dodatkowo jednorodna powłoka ma kluczowe znaczenie w tworzeniu mikrokanalików w beleczkach.</li>
	<li>Szablony pokryte kwasem hialuronowym należy suszyć przez co najmniej 5 godzin w warunkach chłodzenia (20-25 °C) z delikatną cyrkulacją powietrza. Wydłuż jednak czas schnięcia w zależności od rozmiaru szablonu. 
	Uwaga: Po wyschnięciu szablony pokryte kwasem hialuronowym zazwyczaj kurczą się o około 8% do 10% w każdym wymiarze.</li>
	<li>Po zakończeniu procesu suszenia umieścić szablony pokryte kwasem hialuronowym w tyglu z tlenku glinu. Następnie umieść je w piecu wysokotemperaturowym i użyj następującego 8-stopniowego profilu spiekania.
	<ol>
		<li>Podgrzewać 2 °C/min do 230 °C.</li>
		<li>Podgrzewać 1 °C/min do 280 °C.</li>
		<li>Podgrzewać 0,5 °C/min do 400 °C.</li>
		<li>Podgrzewać 3 °C/min do 600 °C. Przechowywać w temperaturze 600 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Podgrzewać 5 °C/min do 1230 °C. Utrzymywać temperaturę 1 230 °C przez 3 godziny.</li>
		<li>Chłodzenie 5 °C/min do RT. 
		Uwaga: Spiekanie dodatkowo zmniejszy szablony gąbek pokrytych HA o około 22% – 25% w każdym wymiarze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wejście i zamieszkiwanie komórek do szablonu
<ol>
	<li>Hodowla przedosteoblastycznych komórek MC3T3 w pożywce nieosteogennej składającej się z α-MEM, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykami (streptomycyną i penicyliną) w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5%CO2.</li>
	<li>Dodać 10 ml zawiesiny komórek o gęstości 2 x 106 komórek do pojedynczego dołka w płytce 6-dołkowej.</li>
	<li>Umieść szablon w kształcie mostka o wymiarach 3 cm x 4 cm x 1 cm pionowo na płytce 6-dołkowej. Umieścić jedną nogę szablonu na płytce zawierającej zawiesinę komórek, a drugą nogę w sąsiednim pustym dołku.</li>
	<li>Pozostawić matrycę do wchłonięcia zawiesiny komórek przez 10 minut.</li>
	<li>Następnie dodać 5 ml pożywki do studzienki, która była pierwotnie wypełniona zawiesiną komórkową.</li>
	<li>Uzupełniaj pożywkę w obu studzienkach co 2 lub 3 dni, aż do upływu 7 dni.</li>
	<li>Określ skuteczność ruchliwości komórek za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną11.
	<ol>
		<li>Napraw komórki i rusztowanie, zanurzając je w 100% EtOH na 20-30 minut.</li>
		<li>Barwienie hematoksyliną przez 1-2 min.</li>
		<li>Płukać wodą destylowaną przez 1-2 minuty dwa razy.</li>
		<li>Odwodnić przez zanurzenie w 70%, następnie 95%, a następnie 100% EtOH przez 1-2 minuty każdy.</li>
		<li>Barwienie Eozyną przez 20-30 sek.</li>
		<li>Płukać wodą destylowaną przez 12 minut przez dwa razy.</li>
		<li>Odwodnić przez zanurzenie w 70%, 80%, 90% i 100% EtOH na 1-2 minuty każdy.</li>
		<li>Osadź rusztowanie w żywicy akrylowej w celu przekrojenia i obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określić żywotność komórek za pomocą testu żywotności komórek bromku 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ylo]-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) i testu żywych/martwych komórek (zestaw do barwienia żywych/martwych komórek) w punktach czasowych 3 i 711, 
	Uwaga: Schemat protokołów wytwarzania szablonów przypominających kości jest przedstawiony w sesji "Reprezentatywne wyniki".</li>
</ol>

<ol><li>Petrie Aronin, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+effects+of+scaffold+pore+size%2C+pore+volume%2C+and+total+void+volume+on+cranial+bone+healing+patterns+using+microsphere-based+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Comparative effects of scaffold pore size, pore volume, and total void volume on cranial bone healing patterns using microsphere-based scaffolds.</a> J Biomed Mater Res A. 89 (3), 632-641 (2009).</li>
<li>Guzmán, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+scaffolds+containing+calcium+phosphate+salts+and+rhBMP-2%3A+in+vitro+and+in+vivo+testing+for+bone+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chitosan scaffolds containing calcium phosphate salts and rhBMP-2: in vitro and in vivo testing for bone tissue regeneration.</a> PLoS One. 9 (2), e87149(1371).</li>
<li>Cha, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinus+augmentation+using+BMP-2+in+a+bovine+hydroxyapatite%2Fcollagen+carrier+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Sinus augmentation using BMP-2 in a bovine hydroxyapatite/collagen carrier in dogs.</a> J Clin Periodontol. 41 (1), 86-93 (2014).</li>
<li>Karageorgiou, V., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porosity+of+3D+biomaterial+scaffolds+and+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis.</a> Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).</li>
<li>Fisher, M. B., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+regenerative+medicine%3A+recent+innovations+and+the+transition+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation.</a> Tissue Eng Part B Rev. 19 (1), 1-13 (2013).</li>
<li>Manassero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+Sheep+Using+Acropora+Coral%2C+a+Natural+Resorbable+Scaffold%2C+and+Autologous+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Regeneration in Sheep Using Acropora Coral, a Natural Resorbable Scaffold, and Autologous Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Eng Part A. 19 (13-14), 1554-1563 (2013).</li>
<li>Reichert, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue+engineering+solution+for+segmental+defect+regeneration+in+load-bearing+long+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A tissue engineering solution for segmental defect regeneration in load-bearing long bones.</a> Sci Transl Med. 4 (141), 141ra93(2012).</li>
<li>Sachlos, E., Czernuszka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+Tissue+Engineering+Scaffolds+Work.+Review+on+The+Application+of+Solid+Freeform+Fabrication+Technology+to+The+Production+of+Tissue+Engineering+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on The Application of Solid Freeform Fabrication Technology to The Production of Tissue Engineering Scaffolds.</a> Eur Cell Mater. 5, 29-40 (2003).</li>
<li>Woodard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+and+osteoconductivity+of+hydroxyapatite+bone+scaffolds+with+multi-scale+porosity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties and osteoconductivity of hydroxyapatite bone scaffolds with multi-scale porosity.</a> Biomaterials. 28 (1), 45-54 (2007).</li>
<li>Correia, C., et al. Acta Biomater. 8 (7), 2483-2492 (2012).</li>
<li>Wang, H., Li, Y., Zuo, Y., Li, J., Ma, S., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+and+osteogenesis+of+biomimetic+nano-hydroxyapatite%2Fpolyamide+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic nano-hydroxyapatite/polyamide composite scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 28 (22), 3338-3348 (2007).</li>
<li>Oh, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+absorption+and+retention+properties+of+engineered+scaffolds+with+micro-channels+and+nano-pores+for+tissue+engineering%3A+a+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Ceram+Int%22%5BJournal%5D)">Bone marrow absorption and retention properties of engineered scaffolds with micro-channels and nano-pores for tissue engineering: a proof of concept.</a> Ceram Int. 39 (7), 8401-8410 (2013).</li>
<li>Hong, M. H., Kim, Y. H., Ganbat, D., Kim, D. G., Bae, C. S., Oh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+action%3A+enrichment+of+retention+and+habitation+of+cells+via+micro-channeled+scaffolds+for+massive+bone+defect+regeneration.J%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">Capillary action: enrichment of retention and habitation of cells via micro-channeled scaffolds for massive bone defect regeneration.J.</a> Mater Sci Mater Med. 25 (8), 1991-2001 (2014).</li>
<li>Volkmer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+in+static+and+dynamic+3D+culture+systems+for+tissue+engineering+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia in static and dynamic 3D culture systems for tissue engineering of bone.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (8), 1331-1340 (2008).</li>
<li>Malda, J., Klein, T. J., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+hypoxia+in+the+in+vitro+engineering+of+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">The roles of hypoxia in the in vitro engineering of tissues.</a> Tissue Eng. 13 (9), 2153-2162 (2007).</li>
<li>Macchetta, A., Turner, I. G., Bowen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+HA%2FTCP+scaffolds+with+a+graded+and+porous+structure+using+a+camphene-based+freeze-casting+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Fabrication of HA/TCP scaffolds with a graded and porous structure using a camphene-based freeze-casting method.</a> Acta Biomater. 5 (4), 1319-1327 (2009).</li>
<li>Cox, S. C., Thornby, J. A., Gibbons, G. J., Williams, M. A., Mallick, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+of+porous+hydroxyapatite+scaffolds+intended+for+use+in+bone+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">3D printing of porous hydroxyapatite scaffolds intended for use in bone tissue engineering applications.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 47, 237-247 (2015).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+proliferation+of+OCT-1+osteoblast-like+cells+on+micro-+and+nano-scale+topography+structured+poly%28l-lactide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like cells on micro- and nano-scale topography structured poly(l-lactide).</a> Biomaterials. 26 (21), 4453-4459 (2005).</li>
<li>Zhao, L., Mei, S., Chu, P. K., Zhang, Y., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+hierarchical+hybrid+micro%2Fnano-textured+titanium+surface+with+titania+nanotubes+on+osteoblast+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of hierarchical hybrid micro/nano-textured titanium surface with titania nanotubes on osteoblast functions.</a> Biomaterials. 31 (19), 5072-5082 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wieloskładnikowy szablon zawierający komórki, czynniki wzrostu, składniki odżywcze itp. jest potrzebny do skutecznej regeneracji kości i funkcjonalnego przywrócenia krytycznych ubytków kostnych o dużych rozmiarach. W ramach tych czynników niezbędne są anatomicznie zgodne właściwości biologiczne. Aby osiągnąć funkcjonalność biologiczną, matryca musi wykazywać biozgodność, przewodnictwo kostne, integralność mechaniczną, wystarczającą powierzchnię, odpowiednią teksturę powierzchni oraz środki transportu tlenu i składników odżywczych. Na poziomie komórkowym następujące cechy są szczególnie istotne dla funkcjonalnego przywrócenia masywnych ubytków kostnych: ułatwiona penetracja do matrycy (aktywna rekrutacja), równomierne rozmieszczenie w całej matrycy (retencja), przyspieszona proliferacja i wysoka żywotność (zamieszkiwanie). Wreszcie, późniejsze tworzenie znacznej macierzy zewnątrzkomórkowej i wyzwalanie ekspresji genów ma kluczowe znaczenie w podstawowych procesach biologicznych, takich jak szybkie unaczynienie i osteogeneza.
Zaproponowano wiele różnych rodzajów syntetycznych substytutów w celu zastąpienia przeszczepów auto-/allo-kostnych. Jednak obecna organizacja rusztowań nie wykazuje wewnętrznego mikrośrodowiska zawierającego mikrokanały i nanopory, a zatem nie ułatwia aktywnie infiltracji, dystrybucji i zasiedlenia komórek w głąb syntetycznych substytutów, które są większe niż 10 mm. Nie dostarczają one fizycznych wskazówek dla pionierskich komórek, aby wydajnie, szybko i równomiernie migrować w głąb matrycy kostnej. Zamiast tego ograniczona pasywna rekrutacja komórek tworzy nierównomiernie rozmieszczone populacje komórek między zewnętrznymi i wewnętrznymi obszarami rusztowania. To nie tylko pogarsza początkowe wyzwanie związane z dotarciem komórek do wewnętrznego rdzenia matrycy, ale także utrudnia przepływ składników odżywczych i komunikację komórek z drugim końcem syntetycznego substytutu. Ten rodzaj nieproporcjonalnej rekrutacji i zasiedlenia komórek powoduje śmierć komórki i niepełny wzrost kości po wszczepieniu rusztowania do organizmu14,15.
W związku z tym wprowadziliśmy koncepcję działania kapilarnego jako podstawową fizyczną wskazówkę do rozwiązania tych przeszkód. Dokładnie zaprojektowaliśmy mikrokanały w BMT, aby indukować działanie kapilarne, które będzie odpowiadać za główną siłę ciągnącą, odpowiedzialnie za aktywną rekrutację komórek w głąb BMT.
Technika powlekania gąbką PU ma kilka unikalnych właściwości. Po pierwsze, pozwala na łatwe przygotowanie dobrze kontrolowanych porowatych struktur beleczkowych, które z kolei zależą od predefiniowanych struktur szablonowych (tj. szablon 80 porów na cal dla 300-400 μm). Jest to bardzo ważne dla optymalizacji wielkości porów pod kątem infiltracji osteoblastów15. Po drugie, technika ta umożliwia budowę połączonych ze sobą mikrokanałów, które odpowiadają za znaczącą rolę inicjalizacji relokacji komórek11. Po trzecie, nie ma prawie żadnych ograniczeń podczas korzystania z gąbki PU w zakresie tworzenia niestandardowych kształtów i rozmiarów szablonów. Producent może użyć nożyczek do prostych kształtów, a nawet do komputerowego cięcia laserowego do skomplikowanych geometrii. Korzystając z tych precyzyjnie kontrolowanych technologii, stworzyliśmy BMT. Kwas hialuronowy został wybrany jako materiał wyjściowy ze względu na jego biokompatybilność i zdolność osteokondukcyjną17.
W tym badaniu należy zwrócić uwagę na kilka krytycznych kroków. Podczas przygotowywania zawiesiny kwasu hialuronowego, jeśli temperatura jest zbyt wysoka, a prędkość mieszania zbyt niska, gnojowica kwasu hialuronowego utknie na dolnych krawędziach zlewki i wyschnie. Po procesie powlekania podczas wydmuchiwania nadmiaru zawiesiny HA, zbyt wysokie ciśnienie powietrza może wywołać pęknięcia na powierzchni BMT. Ważne jest, aby utrzymać stosunkowo niskie ciśnienie powietrza, aby prawidłowo przewietrzyć tylko nadmiar gnojowicy HA. Wreszcie drugi i trzeci etap procesu spiekania są najważniejsze (podgrzewanie 1 °C/min do 280 °C i podgrzewanie 0,5 °C/min do 400 °C). W tym zakresie temperatur gąbka PU całkowicie się wypali, podczas gdy kwas hialuronowy stanie się gęsty. Jeśli ten protokół nie będzie ściśle przestrzegany, BMT zostanie zapadnięty lub pokruszony po spiekaniu się.
BMT opisany w tym badaniu ma kilka zalet. Po pierwsze, połączone ze sobą makropory (300-400 μm) naśladują te z ludzkiej kości beleczkowej i umożliwiają płynny przepływ szpiku kostnego. Po drugie, matryce składają się z mikrokanałów (25-50 μm) w każdej przegrodzie beleczkowej, aby przyspieszyć początkowe wnikanie komórek kostnych poprzez działanie kapilarne. Jak wykazano za pomocą symulacji obliczeniowej13, gdyby matryca miała tylko pory pierwotne 300 μm (pory pierwotne) i nie miała mikrokanałów, działanie kapilarne byłoby niewystarczające do pełnego nasycenia matrycy szpikiem kostnym. Dotyczy to zwłaszcza defektów o dużych rozmiarach, które wymagałyby szablonów o dużych rozmiarach. Kanały o rozmiarach mikrometrycznych wykazują wysoce efektywną absorpcję płynów, dlatego spodziewaliśmy się, że mikrokanały będą przede wszystkim odpowiedzialne za działanie kapilarne w naszym badaniu. Po trzecie, nasze BMT mają strategicznie rozmieszczone nanopory. Dane z literatury wskazują, że komórki są szczególnie wrażliwe na nanowzorce18,19; Dlatego spodziewaliśmy się, że nanopory na ściankach mikrokanałów będą odgrywać rolę w zwiększaniu przyczepiania komórek. Nanometryczne pory (100-400 nm) na powierzchni przegrody beleczkowej pozwoliły unieruchomionym komórkom zakotwiczyć się. Ogólnie rzecz biorąc, połączone efekty tych trzech wewnętrznych struktur skutkowały zwiększoną mobilizacją i adhezją komórek w całym szablonie. Istnieją jednak pewne ograniczenia protokołu i krytycznych kroków do wytworzenia idealnego BMT. Na przykład często przygotowuje się dużą ilość zawiesiny kwasu hialuronowego ze względu na trudności w utrzymaniu jednorodnej lepkości podczas powlekania. Istnieje również ograniczenie w wykonywaniu szablonów o objętości większej niż 5cm3 ze względu na czas pracy podczas powlekania. Grubość powłoki ma kluczowe znaczenie, które różni się w zależności od technik producenta.
Wyniki naszego badania sugerują, że BMT zdolne do wchłaniania i zatrzymywania komórek będzie oferować potencjalne korzyści w porównaniu z konwencjonalnymi rusztowaniami alloplastycznymi (lub syntetycznymi). Rozważane jest badanie prospektywne w celu zweryfikowania korzyści BMT dla osteogenezy i / lub angiogenezy wraz z czynnikami wzrostu związanymi z kośćmi. Dlatego twierdzimy, że nasze unikalne rusztowanie BMT może rozwiązać główne bariery związane z niewystarczającą infiltracją szpiku kostnego do syntetycznych konstruktów i niepełną regeneracją kości w dużych ubytkach.
Ostatecznym celem tego badania jest uproszczenie obecnego paradygmatu bioinżynierii w odbudowie kości i odbudowie funkcjonalnej w krytycznych ubytkach kostnych poprzez wyeliminowanie konieczności czasochłonnych / pracochłonnych procesów izolacji i ekspansji komórek zrębu szpiku kostnego. Wreszcie, naszym celem jest wykorzystanie anatomicznie zgodnych konstruktów 3D z mikrokanałami i nanoporami, które indukują szybką absorpcję komórek, jednorodną dystrybucję i zamieszkiwanie w celu rekonstrukcji kości.

Ostatecznym celem inżynierii tkanki kostnej za pomocą syntetycznych konstruktów jest włączenie konstruktów do kości gospodarza, ponowne zasiedlenie konstruktów komórkami gospodarza oraz odtworzenie wymiany gazów i płynów ustrojowych w celu przywrócenia normalnej funkcji kości. W ciągu ostatniej dekady przeprowadzono wiele badań nad zastosowaniem biomateriałów polimerowych i ceramicznych do produkcji rusztowań1,2. Jednak idealny materiał i technika wytwarzania dla optymalnej regeneracji tkanki kostnej nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Ponadto nie ma ogólnego sukcesu we wprowadzaniu tych technologii do kliniki, zwłaszcza w przypadku rekonstrukcji i odbudowy dużych ubytków kostnych. W związku z tym przywrócenie krytycznych ubytków kostnych nadal pozostaje wyzwaniem klinicznym1-5. 
Idealnie, rusztowania do regeneracji tkanki kostnej powinny wykazywać biokompatybilność bez powodowania reakcji zapalnych lub reakcji na ciała obce/toksyczne, mieć ściśle dopasowane właściwości mechaniczne w porównaniu do natywnych kości i posiadać mechanizm umożliwiający dyfuzję i/lub transport jonów i składników odżywczych. Równie pożądane jest silne wiązanie z kością gospodarza, dynamiczny wzrost kości, wrastanie naczyń krwionośnych i biodegradacja rusztowań. Chociaż zastosowanie biodegradowalnych rusztowań polimerowych wykazało postęp w zakresie wrastania tkanek, istnieją kontrowersje dotyczące ich stosowania do regeneracji kości. 
Pomimo tych rozległych wysiłków, wysoce zorganizowane strukturalne syntetyczne konstrukty nadal mają ograniczony potencjał w pokonywaniu przeszkód w postaci pasywnej penetracji komórek. Większość z tych podejść doprowadziła do wrastania tkanek in vitro o przekrojach od mniej niż kilku μm do kilku mm od powierzchni zewnętrznej, niepełnej integracji z kością gospodarza i tylko częściowej regeneracji kości in vivo6,7. Pionierskie komórki nie migrują głęboko w głąb konstruktów z powodu braku początkowej siły, która wciąga je do środka, zanim rozpocznie się kolonizacja komórki. W związku z tym kolonizacja komórek zachodzi ściśle na obrzeżach rusztowania, stając się przeszkodą od obwodu do środka rusztowania. W ten sposób dyfuzja tlenu i składników odżywczych do wewnętrznych części matryc staje się ograniczona8. Dlatego jasne jest, że architektura rusztowań (wielkość porów, porowatość, wzajemne połączenia i przepuszczalność), która wpływa na transport i dyfuzję substancji w rusztowaniach, ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia dobrze rozłożonej proliferacji i różnicowania komórek9,10. Chociaż fosforany wapnia były używane w przeszłości do produkcji rusztowań, różne procesy i procedury często skutkowały rusztowaniami z fosforanu wapnia o różnej architekturze. W związku z tym wybór procesu produkcyjnego staje się ważny w dyktowaniu architektury rusztowania potrzebnej do skutecznej regeneracji tkanki kostnej.
Podsumowując, nadal istnieją dwa główne niedociągnięcia inżynierii tkanki kostnej, którymi należy się zająć: początkowa rekrutacja komórek do matrycy przed przyłączeniem i kolonizacją komórki oraz jakość przepływu substancji zarówno do szablonu, jak i z niego.

<table><tbody><tr><td>gąbka poliuretanowa</td><td>Plastifoam</td><td>PU-3215</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>167176</td><td></td></tr><tr><td>Hydroksyapatyt w proszku</td><td>Ossgen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol poliwinylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>sól sodowa karboksymetylocelulozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360384</td><td></td></tr><tr><td>poliakrylan amonu</td><td>Vanderbilt</td><td>DARVAN 821A</td><td></td></tr><tr><td>Gliceryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2289</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyczne działanie kapilarne przez mikrokanały w matrycach przypominających kości może poprawić rekrutację komórek w celu przywrócenia dużego ubytku kostnego

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Bez aktywnej, dobrze rozwijającej się populacji komórek, która jest dobrze rozmieszczona i stabilnie zakotwiczona we wstawionym szablonie, wyjątkowa regeneracja kości nie następuje. W przypadku konwencjonalnych szablonów brak wewnętrznych mikrokanałów powoduje brak infiltracji komórek, dystrybucji i zasiedlenia głęboko w szablonach. W związku z tym wysoce porowaty i jednolicie połączony szablon przypominający beleczkowatą kość z mikrokanałami (matryca mikrośrodowiska biogennego; BMT) został opracowany w celu wyeliminowania tych przeszkód. Nowatorski BMT został stworzony w oparciu o innowacyjne koncepcje (działanie kapilarne) i wyprodukowany przy użyciu techniki powlekania gąbką i szablonem. BMT składa się z kilku elementów strukturalnych: połączonych ze sobą porów pierwotnych (300-400 μm), które naśladują pory w kości beleczkowej, mikrokanałów (25-70 μm) w każdej beleczce oraz nanoporów (100-400 nm) na powierzchni, które umożliwiają zakotwiczenie komórek. Co więcej, w badaniach testów mechanicznych udokumentowano, że BMT ma podobne właściwości wytrzymałości mechanicznej do ludzkiej kości beleczkowej (~3,8 MPa)12.
BMT wykazywało wysoką absorpcję, retencję i zamieszkiwanie komórek w szablonach w kształcie mostu (Π) (3 cm wysokości i 4 cm długości). Komórki, które początkowo zostały zasiane na jednym końcu matryc, natychmiast zmobilizowały się na drugi koniec (odległość 10 cm) przez kapilarne działanie BMT na pożywkę komórkową. Po 4 godzinach komórki jednorodnie zajmowały cały BMT i wykazywały normalne zachowanie komórkowe. Działanie kapilarne odpowiadało za infiltrację komórek zawieszonych w pożywce i dystrybucję (aktywną migrację) w całym BMT. Obserwując te możliwości BMT, przewidujemy, że BMT będą wchłaniać komórki szpiku kostnego, czynniki wzrostu i składniki odżywcze z obwodu w warunkach fizjologicznych.
BMT może rozwiązać obecne ograniczenia poprzez szybką infiltrację, jednorodne rozmieszczenie i zasiedlenie komórek w dużych, objętościowych szablonach w celu naprawy masywnych wad szkieletu.

Ogólna struktura BMT wykazuje unikalny trójwymiarowy szablon z wewnętrznymi strukturami przypominającymi kość beleczkową. BMT zawiera makropory, mikrokanały i nanopory. Wyraźne konfiguracje w pełni połączonych makroporów (średnia wielkość 320 µm), mikrokanałów (średnia średnica 50 µm) oraz nanoporów (średnia wielkość 100 nm) zostały zweryfikowane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (EVO-40; ZEISS) oraz mikrotomografii.
Rysunek 1 przedstawia szczegółowe protokoły krok po kroku tworzenia BMT. Dzięki precyzyjnej kontroli protokołów, od przygotowania gąbek z PU po proces spiekania (P1 – P7; Rysunek 1), można uzyskać następujące cechy: bardzo gęstą i gładką powierzchnię po powłoce z HA i suszeniu; precyzyjnie ukształtowany i wymiarowany szablon 3-D; w pełni połączoną porowatą sieć beleczkową podobną do tkanki kostnej beleczkowej oraz mikrokanały wewnątrz każdej beleczki, które naśladują kanały wewnątrzkostne, takie jak kanały Haversa i kanały Volkmanna (Rysunki 2 i 3). Ponadto, za pomocą testu wytrzymałości na ściskanie zmierzono stosunkowo wysoką wytrzymałość mechaniczną (~3.8 MPa), zbliżoną do wytrzymałości ludzkiej kości beleczkowej. Analiza mikro-CT potwierdziła wysoką zbieżność parametrów histomorfometrycznych z parametrami beleczkowej tkanki kostnej ludzkich kręgów lędźwiowych12. Różne stopnie działania kapilarnego dla różnych średnic kapilar zostały zaprezentowane na Rysunku 4 przy użyciu symulacji komputerowej. Na podstawie tych symulacji przewidzieliśmy, że BMT będzie wykazywać zróżnicowane szybkości absorpcji w porach pierwotnych (300-400 µm) i mikrokanałach (25-70 µm) w zależności od ich średnic. Mniejsze kapilary wykazywały silniejszą zdolność absorpcji. Założenie to zostało zweryfikowane w niniejszym eksperymencie, co pokazano na Rysunku 5.
BMT wykazało wysoką efektywność absorpcji i retencji płynów dzięki działaniu kapilarnemu struktur mikrokanalików; jako medium płynne, umożliwiające łatwe śledzenie przepływu, zastosowano barwnik błękit Stevenela (Rysunek 5). Na podstawie symulacji komputerowej stwierdzono, że BMT o takiej konfiguracji absorbują i zatrzymują zawiesiny komórkowe na całkowitym dystansie do 8,5 cm w ciągu 10 s. Dzięki silnemu działaniu kapilarnemu wywołanemu przez struktury wewnętrzne, zabarwione medium dotarło do przeciwległego końca szablonu w kształcie mostka o wymiarach 3 cm (wysokość) x 4 cm (długość) x 1 cm (szerokość) w ciągu 1 min i 40 s. Ponadto zaobserwowano aktywną mobilizację komórek i ich wbudowywanie w BMT (Rysunek 6). W konsekwencji homogeniczna mobilizacja i adhezja komórek doprowadziły do zwiększonej proliferacji i tworzenia macierzy w równomiernie rozłożonej formie. Co więcej, natychmiast po nasyceniu BMT zawiesiną komórkową potwierdzono migrację komórek na długi dystans (~ 10 cm) przez BMT. Zasiane komórki przetrwały w segmencie szablonu wystawionym na działanie powietrza i niezanurzonym w medium hodowlanym. W tym doświadczeniu medium hodowlane dostarczano komórkom wyłącznie w dołkach stykających się tylko z odnogami rusztowania. Działanie kapilarne mikrokanalików pozwoliło następnie świeżemu medium dotrzeć do górnej, mostkowej części rusztowania. Po 3 dniach hodowli szablon został wypełniony szybko proliferującymi komórkami. Po 7 dniach hodowli każda belka kostna została otoczona macierzą zewnątrzkomórkową z zatopionymi w niej komórkami13.
<img alt="Schemat przetwarzania gąbki poliuretanowej z wykorzystaniem sonikatora ultradźwiękowego, mieszania, PVA, CMC oraz wykresem profilu spiekania." src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ogólny protokół wytwarzania matrycy przypominającej strukturę kości, od wstępnej obróbki gąbki PU (P1) do końcowej obróbki termicznej (P7). Zachowanie precyzyjnego profilu spiekania po etapie P7 jest kluczowe dla uzyskania korzystnej wytrzymałości mechanicznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu starzenia pianki zIzmianą koloru materiału wskazującą etapy utleniania powierzchni." src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywne obrazy z mikroskopu stereoskopowego (AmScope; SM-2TZ-M) (x4) gąbki PU o rozmiarze 80 ppi (lewo), BMT powleczonego HA i wysuszonego (środek) oraz spieczonego BMT (prawo). (Wymiary: 3 cm wysokości x 4 cm długości x 1 cm szerokości). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porowata struktura mikrokanalików na obrazach SEM; schemat analizy materiałowej i techniki mikrograficznej." src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Obrazy SEM i mikro-CT matrycy biogenicznej: (A) ogólny obraz matrycy biogenicznej, (B, C, D) obrazy mikrokanalików. W celu uwidocznienia wyraźnych mikrokanalików w beleczkach, matryca została poddana granulacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat kapilarności; powietrze vs woda w mikrokanałach (30-300μm) z gradacją wysokości (0,5mm)." src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Obliczenia numeryczne kapilarności dla różnych średnic kanałów. W tym samym przedziale czasowym (0,4 ms), podczas gdy największa kapilara (d=300 µm: odnosi się do pora głównego) wchłonęła medium (kolor niebieski) na wysokość 0,16 mm, najmniejsza kapilara (d=30 µm: odnosi się do mikrokanału) wchłonęła medium na wysokość 0,415 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment z kapilarnością; paski pianki w roztworach barwnika, 60-100 ppi; schemat przedstawiający poziomy podsiąkania cieczy." src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Obrazy przedstawiają różnice w zdolnościach absorpcyjnych działania kapilarnego w zależności od różnych rozmiarów porów pierwotnych i mikrokanałów (rozmiar poru pierwotnego odnosi się do średniej średnicy: 60 ppi ≈ 470 µm, 80 ppi ≈ 320 µm, 100 ppi ≈ 200 µm). Żółte linie reprezentują działanie kapilarne wywołane kombinacją porów pierwotnych i mikrokanałów. Czerwone linie reprezentują działanie kapilarne wywołane głównie przez mikrokanały występujące w każdej beleczce. Jak pokazano na (F), matryca 100 ppi wywołała najsilniejsze działanie kapilarne, co doprowadziło do całkowitego nasycenia matrycy w ciągu 39 sec. Następnie przetestowano matryce 80 ppi i 60 ppi. (B) 0 sec, (C) 0,5 sec, (D) 1,5 sec, (E) 17,0 sec, (F) 39,0 sec, (G) 50,0 sec oraz (H) 1 min 18 sec po zanurzeniu. (Wymiary matrycy: sześcian o wymiarach 1 cm x 1 cm x 4 cm wysokości). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ eksperymentu z hodowlą komórek z wykresem wzrostu; analiza proliferacji komórek w ciągu 7 dni; obrazy mikroskopowe." src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Wnikanie i migracja komórek z zasianych studzienek (część I) do niezasianych studzienek (część V) poprzez matryce biogenne indukowane działaniem kapilarnym. Początkowo zasiane komórki dotarły do końca niezasianego odgałęzienia (część V) natychmiast po pełnym nasyceniu. Po 3 dniach konfluencja komórek była widoczna w całej matrycy. Po 7 dniach w obrębie populacji komórek nastąpiło spatiotemporalne tworzenie macierzy kolagenowej (barwienie H&amp;E). (Wymiary matrycy: 3 cm wysokości x 4 cm długości x 1 cm szerokości). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Przedstawiono ogólny proces tworzenia krok po kroku szablonu przypominającego kość z zaprojektowanymi mikrokanałami. Wysokie zdolności absorpcyjne i retencyjne matrycy wykazują działanie kapilarne za pośrednictwem mikrokanałów.

Charakterystyczne działanie kapilarne przez mikrokanały w matrycach przypominających kości może poprawić rekrutację komórek w celu przywrócenia dużego ubytku kostnego

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie mikrośrodowiska w postaci szablonu kostnego, który posiada zdolność do regeneracji brakującej lub uszkodzonej tkanki kostnej. Osiąga się to najpierw poprzez nadanie odpowiedniego kształtu i modyfikację gąbki poliuretanowej, aby pasowała ona do obszaru ubytku. Drugim krokiem jest równomierne pokrycie gąbki poliuretanowej lepka zawiesiną hydroksyapatytu i pozostawienie jej do wyschnięcia.Ostatnim krokiem jest umieszczenie powłoki z hydroksyapatytu w wysokotemperaturowym piecu muflowym. W efekcie powstaje przypominający kość szablon z zaprojektowanymi mikrokanałami, charakteryzujący się wysoką zdolnością absorpcji i retencji komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wymywanie soli czy techniki druku 3D, jest to, że konstrukcja mikrokanałów w strukturze indukuje działanie kapilarne.Ta metoda może pomóc w rozwiązaniu głównych problemów w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takich jak rekonstrukcja ubytków kostnych segmentowych oraz czaszkowo-twarzowych. Zastosowania tej techniki obejmują również terapię wad wrodzonych. Matryce są w pełni konfigurowalne pod względem kształtu i rozmiaru, a działanie kapilarne będzie sprzyjać migracji komórek na duże odległości.Chociaż metoda ta pozwala na analizę regeneracji kości, może być ona również zastosowana w innych systemach hodowli, takich jak platforma do hodowli nowotworów 3D. Rozpocznij od przycięcia gąbek poliuretanowych o gęstości 80 porów na cal do kształtu mostków o wymiarach 3,5 centymetrów wysokości, pięciu centymetrów szerokości oraz 1,5 centymetrów głębokości. Następnie przygotuj 100 mililitrów 4% roztworu wodorotlenku sodu.Używając zlewki o pojemności 150 ml, zanurz gąbki w roztworze wodorotlenku sodu i wyciśnij uwięzione powietrze, aż gąbki zostaną całkowicie nasączone. Po nasyceniu umieść zlewkę z gąbkami w myjce ultradźwiękowej przy częstotliwości 42 kHz na 15 do 20 minut bez podgrzewania.Po zakończeniu płucz gąbki wodą destylowaną przez 5 do 10 minut, wyciskając je i pozwalając im rozprężyć się od pięciu do siedmiu razy, aby usunąć pozostałości wodorotlenku sodu z wnętrza gąbek. Nadmiar wody z gąbek usuń za pomocą ręczników papierowych, a następnie umieść je w piekarniku w temperaturze od 60 do 80 °C w celu całkowitego wysuszenia. Aby rozpocząć przygotowanie zawiesiny hydroksyapatytu, najpierw zważ zlewkę o pojemności 50 ml z mieszadłem magnetycznym.Następnie do zlewki należy dodać 20 milliliters wody destylowanej. Wodę podgrzewamy na płycie grzejczej ustawionej na 120 do 140 degrees Celsius, mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Gdy woda zacznie wrzeć, do wody destylowanej dodaje się 0.3 grams proszku alkoholu poliwinylowego, mieszając z prędkością od 300 do 400 RPMs.Mieszać do całkowitego rozpuszczenia proszku i uzyskania klarownego roztworu. Następnie wyłączyć ogrzewanie i dodać 0,1 g proszku karboksymetylocelulozy sodowej o ultra niskiej lepkości, kontynuując mieszanie z prędkością od 400 do 500 RPM do momentu, aż roztwór stanie się klarowny. Po rozpuszczeniu ponownie schłodzić mieszaninę do temperatury pokojowej.Następnie, przy mieszaniu z prędkością 300 do 400 RPMs, dodaj 0,3 g dyspergentu poliakrylanu amonu. Mieszaj do całkowitego rozpuszczenia, a następnie ponownie przy mieszaniu z prędkością 300 do 400 RPMs dodaj 0,2 g gliceryny. Mieszaj roztwór do czasu całkowitego rozpuszczenia składników.Następnie odważ 10 g nanoproszku hydroksyapatytu i powoli dodaj go do zlewki, mieszając z prędkością od 600 do 900 RPM. Kontynuuj mieszanie przez pięć minut. Następnie umieść mieszaninę w myjce ultradźwiękowej i poddaj sonikacji przez pięć minut, aby zapewnić rozproszenie ewentualnych aglomeratów proszku hydroksyapatytu, po czym dodaj do mieszaniny dodatkowe 5 mL wody destylowanej, mieszając z prędkością od 600 do 900 RPM i podgrzewając do temperatury od 90 do 100 °C; nadal mieszaj mieszaninę za pomocą mieszadła magnetycznego z prędkością od 600 do 800 RPM w temperaturze od 90 do 100 °C.Aby odparować zawartość wody, należy okresowo pomiarze całkowitą masę, wliczając zlewkę i mieszaninę, aż do uzyskania stosunku proszku do cieczy od 1,75 do 1,80. Zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, należy pozwolić zawiesinie ostygnąć do temperatury pokojowej przed jej wykorzystaniem do powlekania; przygotowane gąbki poliuretanowe pokrywa się zawiesiną hydroksyapatytu za pomocą stalowej szpatułki na szklanej płytce, aż do momentu homogenicznego rozprzestrzenienia zawiesiny w całej gąbce poliuretanowej. Następnie należy lekko przedmuchać gąbki kompresorem powietrza, aby zapewnić łączność, jednorodność oraz otwarte pory.Jeśli nie zostanie osiągnięta jednorodna powłoka, matryce pokryte hydrożelem zapadną się podczas procesu ING i mogą również pękać podczas manipulowania nimi ze względu na niskie ograniczenia konstrukcyjne. Ponadto jednorodna powłoka jest kluczowa dla utworzenia mikrokanałów wewnątrz struktury. Suszyć matryce pokryte HA przez co najmniej pięć godzin w temperaturze od 20 do 25 °C przy łagodnej cyrkulacji powietrza.W przypadku większych matryc należy wydłużyć ten czas. Po procesie suszenia umieść matryce powlekane HA w tyglu Illumina. Następnie umieść je w piecu wysokotemperaturowym i postępuj zgodnie z ośmioetapowym profilem centrowania opisanym w towarzyszącym protokole tekstowym.Do pojedynczej studni płytki 6-dołkowej należy dodać 10 ml zawiesiny preosteoblastycznych komórek mc3t3 o stężeniu 1 milion komórek. Następnie w pionie do płytki 6-dołkowej należy umieścić szablon w kształcie mostka o wymiarach 3 cm x 4 cm x 1 cm. Jedną odnogę szablonu należy umieścić w studni zawierającej zawiesinę komórkową, a drugą w sąsiedniej pustej studni.Należy pozwolić matrycy na absorpcję zawiesiny komórkowej przez 10 minut w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie do dołka, który został pierwotnie wypełniony zawiesiną komórkową, należy dodać pięć mililitrów dodatkowego medium. Po kolejnych pięciu minutach do drugiego dołka, który nie był pierwotnie wypełniony zawiesiną komórkową, należy dodać pięć mililitrów medium.Następnie umieść układ w inkubatorze. Wymieniaj medium co drugi dzień przez siedem dni. Po zakończeniu eksperymentu utrwal komórki i rusztowanie przez 20 do 30 minut, zanurzając je w zlewce wypełnionej 100% etanolem.Barwić wypłukane rusztowanie barwnikiem hematoksyliną przez jedną do dwóch minut. Następnie płukać je przez jedną do dwóch minut, ponownie zanurzając rusztowanie dwukrotnie w zlewce z wodą destylowaną; po płukaniu odwadniać rusztowanie, zanurzając je w 70% etanolu na jedną do dwóch minut. Następnie przenieść rusztowanie do 95% etanolu na kolejne jedną do dwóch minut.Na koniec umieść rusztowanie w 100% etanolu na dwie minuty. Następnie przeprowadź przeciwbarwienie konstruktu za pomocą e, s i Y przez jedną do dwóch minut. Potem wypłucz go przez jedną do dwóch minut, ponownie zanurzając rusztowanie dwukrotnie w zlewce z wodą destylowaną.Po płukaniu odwodnij rusztowanie, zanurzając je w serii roztworów etanolu o rosnącym stężeniu przed zatopieniem w żywicy. Na koniec zatop rusztowanie w żywicy akrylowej w celu wykonania skrawków i obrazowania. Przedstawiony tutaj szablon biogenicznego mikrośrodowiska na różnych etapach wytwarzania składa się z w pełni połączonej, porowatej sieci beleczkowej, podobnej do struktury kości beleczkowej.Ten szablon składa się z kilku komponentów strukturalnych, w tym z połączonych ze sobą porów pierwotnych o średnicy od 300 do 400 µm, mikrokanałów o średnicy od 25 do 70 µm oraz nanoporów o średnicy od 100 do 400 nm na powierzchni, które umożliwiają zakotwiczenie komórek. Biogeniczny szablon mikrośrodowiska wspiera zasiew komórek we wszystkich obszarach rusztowania poprzez działanie kapilarne. Bezpośrednio po pełnym nasyceniu rozkład komórek można wyraźnie zaobserwować po barwieniu hematoksyliną i eozyną oraz wykonaniu przekrojów rusztowania.Liczbę komórek w każdym regionie matrycy określono ilościowo i monitorowano po trzech dniach hodowli. Po siedmiu dniach hodowli matryca została wypełniona szybko proliferującymi komórkami, a każda beleczka kostna została otoczona macierzą zewnątrzkomórkową i wypełniona komórkami. Po dopracowaniu metody, technika ta może zostać wykonana w ciągu trzech dni, jeśli jest prowadzona prawidłowo.Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zachować odpowiedni stosunek proszku do wody oraz zapewnić jednorodność powłoki po zakończeniu czynności. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące reakcji komórkowych można zastosować inne metody, takie jak dynamiczny system kołyszący lub system hodowli rotacyjnej.

distinctive-capillary-action-micro-channels-bone-like-templates-can

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Interesujące są rusztowania zdolne do dopasowania się do ubytków kostnych czaszkowo-szczękowo-twarzowych (CMF), wykazując jednocześnie osteoprzewodnictwo i bioaktywność. Protokół ten opisuje przygotowanie rusztowania z pamięcią kształtu na bazie dikrylanu polikaprolaktonu (PCL-DA) przy użyciu metody odlewania rozpuszczalnikiem i ługowania cząstek stałych (SCPL) z wykorzystaniem stopionej matrycy solnej i nałożeniu bioaktywnej powłoki polidopaminowej .

Produkcja bioaktywnego, opartego na PCL "samodopasowanego" rusztowania polimerowego z pamięcią kształtu

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

Komórki zrębu pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być przydatne do inżynierii nowej tkanki z własnych komórek pacjenta. Przedstawiamy protokół izolacji subpopulacji ludzkich komórek zrębu pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) o zwiększonym potencjale osteogennym, a następnie zastosowania komórek w teście gojenia kalwaryjnego in vivo.

Szybka izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków nazębnych

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Liczba nowatorskich biomateriałów zaprojektowanych do naprawy dużych uszkodzeń kości stale rośnie, mając na celu przyspieszenie gojenia kości i przezwyciężenie komplikacji związanych z przeszczepem kości. W tym miejscu przedstawiamy multidyscyplinarną strategię przedklinicznych badań biokompatybilności biomateriałów do naprawy kości.

Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości

W tym badaniu szczegółowo opisujemy metody decelularyzacji, charakterystyki fizycznej, obrazowania i implantacji in vivo biomateriałów pochodzenia roślinnego, a także metody sadzenia i różnicowania komórek w rusztowaniach. Opisane metody pozwalają na ocenę biomateriałów pochodzenia roślinnego do zastosowań w inżynierii tkanki kostnej.

Bezkomórkowe rusztowania pochodzące z jabłek do inżynierii tkanki kostnej in vitro i in vivo

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.

Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

Proponujemy protokół oceny regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych. To podejście multimodalne umożliwia analizę strukturalną na różnych skalach długości, skutecznie rozwiązując wyzwania związane z przygotowaniem próbek. Zapewnia również wiarygodny sposób oceny skuteczności biomateriałów w wspieraniu regeneracji kości.

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Poznaj metodę tworzenia biomimetycznych matryc kostnych z mikrokanałami wspierającymi działanie kapilarne i rekrutację komórek. Technika ta poprawia absorpcję osteoblastów w inżynierii tkankowej.

Charakterystyczne działanie kapilarne przez mikrokanały w matrycach przypominających kości może poprawić rekrutację komórek w celu przywrócenia dużego ubytku kostnego (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyczne działanie kapilarne przez mikrokanały w matrycach przypominających kości może poprawić rekrutację komórek w celu przywrócenia dużego ubytku kostnego

Przeglądaj więcej filmów