Charakterystyczne działanie kapilarne przez mikrokanały w matrycach przypominających kości może poprawić rekrutację komórek w celu przywrócenia dużego ubytku kostnego

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie mikrośrodowiska szablonu kostnego, które ma zdolność do przywracania brakującej lub uszkodzonej kości. Osiąga się to poprzez uprzednie ukształtowanie i modyfikację gąbki poliuretanowej tak, aby pasowała do obszaru ubytku. Drugim krokiem jest równomierne pokrycie gąbki poliuretanowej lepką zawiesiną hydroksyapatytu i pozostawienie jej do wyschnięcia.

Ostatnim krokiem jest wyśrodkowanie powłoki hydroksyapatytu w wysokotemperaturowym piecu mięśniowym. Ostatecznie, szablon przypominający kość ze zmodyfikowanymi mikrokanalikami jest wytwarzany z wysokimi zdolnościami wchłaniania i zatrzymywania komórek. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak docieranie soli lub techniki druku 3D, jest to, że inżynier mikrokanalików w tra indukował działanie kapilarne.

Metoda ta może pomóc w sprostaniu głównym wyzwaniom w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takim jak rekonstrukcja ubytków kości czaszkowo-twarzowej i segmentowej. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii wad wrodzonych. Szablony są w pełni konfigurowalne pod względem kształtu i rozmiaru, a działanie kapilarne zachęca do migracji komórek na duże odległości.

Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w regenerację kości, można ją również zastosować do innych systemów hodowli, takich jak platforma hodowli nowotworów 3D. Zacznij od przycięcia gąbek poliuretanowych z 80 porami na cal w kształty mostów o wymiarach 3,5 centymetra wysokości, pięciu centymetrów szerokości i 1,5 centymetra głębokości. Następnie przygotuj 100 mililitrów 4% roztworu wodorotlenku sodu.

Za pomocą zlewki o pojemności 150 mililitrów. Zanurz gąbki w roztworze wodorotlenku sodu i wyciśnij powietrze pułapki, aż gąbki całkowicie nasiąkną. Po nasyceniu umieść zlewkę z gąbkami w ultradźwiękowym cieple o częstotliwości 42 kiloherców na 15 do 20 minut bez podgrzewania.

Po zakończeniu płucz gąbki wodą destylowaną przez pięć do 10 minut, podczas płukania ściśnij gąbki i pozwól im rozszerzyć się od pięciu do siedmiu razy, aby usunąć resztki wodorotlenku sodu znajdujące się wewnątrz gąbek. Usuń nadmiar wody z gąbek ręcznikami papierowymi, a następnie wstaw je do piekarnika w temperaturze od 60 do 80 stopni Celsjusza, aby zakończyć suszenie. Aby rozpocząć wytwarzanie zawiesiny hydroksyapatytu, najpierw zważ 50-mililitrową zlewkę z magnetycznym mieszadłem.

Następnie dodaj 20 mililitrów wody destylowanej do zlewki. Wypij wodę na gorącej płycie ustawionej na 120 do 140 stopni Celsjusza i wymieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego. Gdy woda zacznie wrzeć z 0,3 grama alkoholu poliwinylowego w proszku do wody destylowanej, mieszając przy 300 do 400 obr./min.

Mieszaj, aż proszek całkowicie się rozpuści, a roztwór będzie klarowny. Następnie wyłącz ogień i dodaj 0,1 grama proszku karboksymetylocelulozy sodowej o bardzo niskiej lepkości, kontynuując mieszanie z prędkością od 400 do 500 obr./min, aż roztwór stanie się klarowny. Ponownie, po rozpuszczeniu, ostudzić mieszaninę do temperatury pokojowej.

Następnie dodaj 0,3 grama dyspergatora amonowo-poliakrylowego, mieszając przy 300 do 400 obr./min. Mieszaj do całkowitego rozpuszczenia, a następnie dodaj 0,2 grama gliceryny, mieszając przy 300 do 400 obr./min. Mieszaj mieszaninę, aż całkowicie się rozpuści.

Następnie odważ 10 gramów proszku hydroksyapatytu o rozmiarach nano i powoli dodaj go do zlewki, mieszając z prędkością od 600 do 900 obr./min. Kontynuuj mieszanie przez pięć minut. Następnie umieść mieszaninę w ultradźwiękach i sonikuj przez pięć minut Aby zapewnić dyspersję dowolnej aglomeracji proszku hydroksylowego, dodaj dodatkowe pięć mililitrów wody destylowanej do mieszaniny, mieszając przy 600 do 900 obr./min i podgrzewaj w temperaturze od 90 do 100 stopni Celsjusza, mieszając mieszaninę za pomocą mieszania magnetycznego przy 600 do 800 obr./min w temperaturze od 90 do 100 stopni Celsjusza.

W celu odparowania zawartości wody należy od czasu do czasu odmierzać całą masę, łącznie ze zlewką i mieszanką, aż do uzyskania stosunku proszku do cieczy wynoszącego 1,75 do 1,80. Zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym, przed użyciem zawiesiny do ostygnięcia do temperatury pokojowej należy odczekać, aż zawiesina ostygnie do temperatury pokojowej, a przygotowane gąbki poliuretanowe z zawiesiną hydroxy appetite należy rozprowadzić za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej, aż zawiesina zostanie równomiernie rozprowadzona w gąbce poliuretanowej na szklanej płycie. Następnie delikatnie dmuchnij w gąbki za pomocą sprężarki powietrza, aby zapewnić wzajemne połączenie, jednorodność i otwarte pory.

Jeśli nie zostanie osiągnięty jednorodny CO, szablony pokryte hydrożelem zapadną się podczas procesu ING i mogą również pękać podczas obróbki ze względu na niskie ograniczenia wytwarzania. Dodatkowo, jednorodna powłoka ma kluczowe znaczenie dla tworzenia mikrokanałów w tally. Suszyć szablony pokryte kwasem hialuronowym przez co najmniej pięć godzin w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza przy delikatnej cyrkulacji powietrza.

Wydłuż ten czas w przypadku większych szablonów. Po zakończeniu procesu suszenia umieścić szablony pokryte kwasem hialuronowym w tyglu Illumina. Następnie umieść je w piecu wysokotemperaturowym i postępuj zgodnie z ośmiostopniowym profilem centrowania opisanym w dołączonym protokole tekstowym.

Dodaj 10 mililitrów pres osteoblastic mc trzy T trzy komórki w 1 milionie komórek do pojedynczej studzienki na płytce z sześcioma dołkami. Następnie umieść szablon w kształcie mostka o wymiarach trzy centymetry na cztery centymetry na jeden centymetr pionowo w płytce z sześcioma dołkami. Umieścić jedną nogę szablonu w studzience zawierającej zawiesinę komórek, a drugą nogę w sąsiednim pustym miejscu.

Dobrze, pozwól szablonowi wchłonąć zawiesinę komórek przez 10 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnie dodaj pięć mililitrów dodatkowej pożywki do studzienki, która była pierwotnie wypełniona zawiesiną komórkową. Po dodatkowych pięciu minutach dodaj pięć mililitrów pożywki do drugiego dołka, który nie był pierwotnie wypełniony zawiesiną komórkową.

Następnie umieść zestaw w inkubatorze. Zmieniaj nośnik co drugi dzień przez siedem dni. Pod koniec eksperymentu unieruchom komórki i rusztowanie na 20 do 30 minut, zanurzając je w zlewce wypełnionej 100% etanolem.

Spłukane rusztowanie należy zabarwić barwnikiem hemat toin przez jedną do dwóch minut. Następnie płucz je przez jedną do dwóch minut, ponownie zanurzając rusztowanie w zlewce z wodą destylowaną dwukrotnie po płukaniu, odwodnić rusztowanie w komórkach, zanurzając rusztowanie w 70% etanolu na jedną do dwóch minut. Następnie przenieś rusztowanie do 95% etanolu na dodatkową jedną do dwóch minut.

Na koniec umieść rusztowanie w 100% etanolu na dwie minuty. Następnie przebarwij konstrukcję za pomocą e, s i Y przez jedną do dwóch minut. Następnie płucz go przez jedną do dwóch minut, ponownie zanurzając rusztowanie w zlewce z wodą destylowaną dwukrotnie.

Po płukaniu odwodnić rusztowanie, zanurzając je w szeregu stopniowanego etanolu przed zatopieniem w żywicy. Na koniec osadź rusztowanie w żywicy akrylowej w celu przekrojenia i obrazowania. Pokazany tutaj szablon mikrośrodowiska biogennego na różnych etapach wytwarzania składa się z w pełni połączonej, porowatej sieci beleczkowej podobnej do tej z kości beleczkowej.

Ten szablon ma kilka elementów strukturalnych, w tym połączone ze sobą pory pierwotne o średnicy od 300 do 400 mikronów, mikrokanały o średnicy od 25 do 70 mikronów oraz nanopory o średnicy od 100 do 400 nanometrów na powierzchni, które umożliwiają zakotwiczenie komórek. Matryca mikrośrodowiska biogenicznego wspomaga wysiewanie komórek poprzez działanie kapilarne do wszystkich regionów rusztowania. Bezpośrednio po pełnym nasyceniu można wyraźnie zobaczyć rozmieszczenie komórek po barwieniu hematów, toiny i eoiny oraz cięciu rusztowania.

Numer komórki w każdym regionie matrycy określono ilościowo i śledzono po trzech dniach hodowli. Matryca została zajęta szybko proliferującymi komórkami Po siedmiu dniach hodowli każda beleczka została owinięta matrycami zewnątrzkomórkowymi i osadzona w komórkach. Po zmierzeniu tę technikę można wykonać w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu prawidłowego stosunku proszku do wody i utrzymaniu jednorodnej powłoki Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak dynamiczny system kołysania lub system wirowania kultur, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące odpowiedzi komórkowych.