Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie gradientowej komory dyfuzyjnej w celu zbadania podatków od chemioterapii w matrycy kolagenowej 3D. Osiąga się to poprzez najpierw wytworzenie silikonowej formy 3D przy użyciu komory do obrazowania żywych komórek. Drugim krokiem jest wykonanie hydrofilowych i hydrofobowych szkiełek nakrywkowych i wykorzystanie ich do montażu formy silikonowej 3D.

Następnie mieszaninę komórek kolagenowych dodaje się do środkowej komory i pozostawia do polimeryzacji. Ostatnim krokiem jest usunięcie hydrofobowych szkiełek okrywowych z formy po inkubacji i dodanie zwykłej pożywki do jednego zbiornika i pożywki z atraktantem chemioterapii do drugiego zbiornika. Ostatecznie mikroskopia konfokalna służy do śledzenia chemotaksji komórek w czasie i wizualizacji przemieszczenia ruchu komórek w macierzy kolagenowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak komora boina i mikrolekkoatletyka, jest to, że pozwala na prostą konfigurację do badania migracji w przestrzeni 3D z prostym gradientem dyfuzji, bez użycia jednorazowej pipety. Odmierz 150 mikrolitrów amino seline A-P-T-M-S i wlej do 50-mililitrowej probówki. Następnie dodaj 30 mililitrów 100% etanolu do probówki za pomocą drugiej jednorazowej pipety i zamknij pokrywkę.

Wiruj roztwór przez dwie minuty, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Następnie wlej roztwór do szklanej szalki Petriego i odłóż na bok. Następnie wlej 15 mililitrów 100% alkoholu etylowego do drugiej szalki Petriego i umieść ją z pierwszą szalką za pomocą nowej jednorazowej pipety.

Odmierz 30 mililitrów wody dejonizowanej i wlej roztwór do 50-mililitrowej probówki. Następnie użyj nowej jednorazowej pipety, aby dodać 1,875 mililitra aldehydu klejowego do probówki i zamknij pokrywkę. Wiruj roztwór przez dwie minuty, a następnie wlej mieszaninę do trzeciej szalki Petriego.

Za pomocą kleszczy wyjmij 1 22-milimetrową okrągłą szklaną szkiełko nakrywkowe i spłucz obie strony mieszanką 100% etanolu. Za pomocą jednorazowej pipety umieść szkiełko do płukania w pierwszym naczyniu zawierającym aminoselinę i pozostaw je w roztworze na pięć minut za pomocą kleszczy. Wyjmij szkiełko nakrywkowe i ponownie spłucz je 100% etanolem.

Następnie wrzuć spłukaną szklaną pokrywę do naczynia z aldehydem glutarowym i odstaw na 30 minut. Po 30 minutach usuń szklane szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i spłucz je wodą dejonizowaną. Umieść spłukany szkiełko nakrywkowe na chusteczce do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.

Aby przygotować hydrofobowe szkiełka nakrywkowe, najpierw dodaj 500 mikrolitrów TTS, 100 mikrolitrów kwasu octowego i 19,4 mililitrów heanu do 50-mililitrowej probówki i wiruj przez dwie minuty. Następnie wlej roztwór do szklanej szalki Petriego i za pomocą czystych kleszczyków wrzuć jedną szklaną szkiełko nakrywkowe do przygotowanego roztworu i pozostaw tam na dwie minuty. Po dwóch minutach wyjmij szklane szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i spłucz je wodą dejonizowaną za pomocą jednorazowej pipety, umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc.

Przechowywać wysuszone szkiełka nakrywkowe na plastikowej szalce Petriego do czasu, gdy będą potrzebne do rozpoczęcia, zmontuj komorę obrazowania żywych komórek zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie wymieszaj roztwory elastomeru silikonowego zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać pięć mililitrów elastomeru. Następnie użyj jednorazowej szpatułki laboratoryjnej, aby powoli wlać roztwór elastomeru silikonowego do zestawu komory obrazowania żywych komórek, aby nie naruszyć elementów formy.

Odłóż formę w bezpieczne miejsce, aby przez noc utrzymać temperaturę w pomieszczeniu. Następnego ranka wyciągnij formę za pomocą kleszczy i ostrożnie wyjmij z niej obrobioną aluminiową metalową kostkę. Następnie podejdź do zlewu i spłucz formę wodą dejonizowaną, a następnie połóż foremkę na ręczniku papierowym do wyschnięcia.

Po wyschnięciu użyj hobbystycznego noża uniwersalnego, aby wyciąć szczeliny w odległości 2.34 milimetra od każdego podłużnego końca wewnątrz silikonowej formy. Upewnij się, że forma pozostaje w bezpiecznym i suchym miejscu, dopóki nie będzie potrzebna do eksperymentu przed użyciem. Opłucz formę 90% etanolem i umieść formę na szalce Petriego wypełnionej wodą dejonizowaną, aby odstawić ją na noc.

Następnego ranka przenieś formę na ręcznik papierowy i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, podczas gdy forma wysycha. Użyj precyzyjnego diamentowego narzędzia do trasowania, aby wyciąć kwadrat. Hydrofilowa pokrywa wsuwa się w dwa prostokąty, nieco większe niż 3,95 milimetra na 5,99 milimetra.

Następnie wsuń każdą z wyciętych prostokątnych osłon w szczeliny, pokrój w silikonową formę, odwróć formę do góry nogami i nałóż tłuszcz próżniowy wzdłuż dna silikonowej formy za pomocą jednorazowej pipety. Następnie odwróć formę z powrotem prawą stroną do góry i dociśnij spód formy do okrągłego szkiełka nakrywkowego ze szkła hydrofilowego. Aby stworzyć uszczelnienie, przygotuj mieszaninę pożywki i atraktantu chemioterapii w 15-mililitrowej probówce o pożądanym stężeniu, odpipetuj pięć mililitrów mieszaniny do nowej mililitrowej probówki i pięć mililitrów zwykłego podłoża do drugiej probówki.

Przenieś obie rurki do łaźni wodnej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Następnie odpipetować 30 mikrolitrów 10 XPBS do mikroprobówki wirówkowej. Dodaj sześć mikrolitrów jednego normalnego roztworu wodorotlenku sodu do tej samej probówki do mikrowirówki i wiruj przez 15 sekund.

Następnie dodaj 18 mikrolitrów żółto-zielonego fluorescencyjnego karboksylanu, zmodyfikowane mikrosfery do mikroprobówki wirówkowej i 168,3 mikrolitrów lodowatego lodu. Typ jeden kolagen z ogona szczura. Mieszaj mieszaninę przez 30 sekund.

Następnie dodaj 77,7 mikrolitrów żądanej komórki. Wpisz dwa razy od 10 do sześciu komórek na mililitr w pożywce do probówki mikrowirówki i wymieszaj. Używając końcówki pipety przez 20 sekund, odpipetuj 300 mikrolitrów mieszaniny komórek kolagenowych do środkowej studzienki przygotowanego zespołu formy.

Następnie umieść formę na jednorazowej szalce Petriego i przenieś ją do standardowego inkubatora na 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla Po okresie inkubacji użyj kleszczy, aby usunąć oba hydrofobowe szkiełka nakrywkowe, zaciskając się na górnej części każdego szkiełka nakrywkowego, a następnie pociągając w górę i odsuwając od formy. Przenieś cały system do mikroskopu i zbadaj komorę, aby upewnić się, że boki formy kolagenowej są nadal proste, co pozwala na uzyskanie gradientu dyfuzji strugarki z systemem nadal pod mikroskopem. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki komórkowej do pierwszego dołka.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki komórkowej o pożądanym stężeniu atraktantu chemioterapii do studzienki po drugiej stronie matrycy. Śledź migrację komórek w odniesieniu do znakowanych fluorescencyjnie mikrosfer, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Seria prezentowanych tutaj zdjęć pokazuje dyfuzję żwacza poruszającego się w żelu kolagenowym o grubości jednego miligrama na mililitr

Ten przykład pokazuje prawdziwy gradient dyfuzji płaskiej systemu, którego można się również spodziewać po wszelkich wprowadzonych atraktantach chemioterapii. W przedstawionym przykładzie intensywność sygnału żwacza została zmierzona w czasie w miejscach oznaczonych czerwonymi kwadratami. Stężenie w każdym z tych miejsc jest pokazane na tym wykresie jako osobna linia, która po zmierzeniu w stanie ustalonym tworzy liniowy gradient stężenia w oparciu o położenie w żelu.

Zależność ta pozostaje liniowa w całym zakresie stężeń macierzy kolagenowej, co czyni ten system bardzo przydatnym do eksperymentów komórkowych. Na tym zdjęciu neutrofile w kolorze czerwonym są pokazane w matrycy kolagenowej rozproszonej fluorescencyjnymi zielonymi mikrosferami, które są używane jako odniesienia pozycji. Kolejne trzy zdjęcia pokazują ukierunkowaną migrację neutrofili w miarę ich przemieszczania się w górę gradientu atraktantu chemioterapii, który jest przedstawiony przez białą strzałkę.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć prostą komorę dyfuzyjną do badania migracji komórek w matrycy kolagenowej 3D.