Name: Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Naucz się tworzyć planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D. Ta metoda umożliwia śledzenie migracji komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Jonathanowi Reichnerowi i Angle'owi Byrdowi za wgląd w eksperyment komórkowy. Program stypendialny National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) wspierał te prace.

1. Projekt i części formy 3D
<ol>
	<li>Forma
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem pracy należy przygotować zestaw elastomeru silikonowego, komorę do obrazowania żywych komórek, szklaną lamellkę o średnicy 22 mm oraz obrobioną aluminiową kostkę o wymiarach 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Przygotować komorę do obrazowania żywych komórek do formowania, umieszczając lamellkę w dolnym uchwycie i montując resztę komory zgodnie z instrukcją producenta.</li>
		<li>Następnie, używając pincety, umieścić obrobioną aluminiową kostkę na środku obudowy komory do obrazowania żywych komórek, na wierzchu lamellki, a następnie odstawić.</li>
		<li>Wymieszać roztwory elastomeru silikonowego zgodnie z protokołem producenta, aby przygotować 5 ml elastomeru.</li>
		<li>Za pomocą jednorazowej szpatułki laboratoryjnej wlać roztwór elastomeru silikonowego do przygotowanej komory do obrazowania żywych komórek, uważając, aby nie przesunąć umieszczonej aluminiowej kostki. Umieścić system na blacie laboratoryjnym w bezpiecznym miejscu na noc (O/N) w celu utwardzenia.</li>
		<li>Następnego ranka rozłożyć komorę do obrazowania żywych komórek, zgodnie z zaleceniami producenta, i wyciągnąć formę za pomocą pincety. Używając pincety, ostrożnie wyjąć obrobioną aluminiową kostkę z formy. Płukać formę w zlewie wodą dejonizowaną. Położyć formę na ręczniku papierowym do wyschnięcia.</li>
		<li>Po wyschnięciu, za pomocą nożyka modelarskiego, wyciąć w formie nacięcia w odstępach 2,34 mm od każdego końca podłużnego, wewnątrz silikonowej formy. Przechowywać formę w bezpiecznym i suchym miejscu do czasu przygotowania systemu do eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie hydrofilowych i hydrofobowych szklanych lamellek
	<ol>
		<li>Aby umożliwić przyleganie macierzy kolagenowej do powierzchni, przygotować lamellki hydrofilowe:
		<ol>
			<li>Za pomocą jednorazowej pipety odmierzyć 150 µl 3-aminopropylotrimetoksysilanu i wlać roztwór do probówki 50 ml. Dodać 30 ml 100% etanolu do probówki 50 ml za pomocą drugiej jednorazowej pipety i zamknąć pokrywkę. Mieszać roztwór na wirówce typu vortex przez 2 min, aż do całkowitego wymieszania. Wlać roztwór do szklanej płytki Petriego i odstawić.</li>
			<li>Wlać 15 ml 100% alkoholu etylowego do drugiej płytki Petriego i odstawić (pamiętając o opisaniu płytek).</li>
			<li>Za pomocą nowej jednorazowej pipety odmierzyć 30 ml wody dejonizowanej i wlać roztwór do probówki 50 ml. Następnie, za pomocą nowej jednorazowej pipety, odmierzyć 1,875 µl glutaraldehydu i wlać roztwór do tej samej probówki 50 ml i zamknąć pokrywkę. Mieszać roztwór na wirówce typu vortex przez 2 min, aż do całkowitego wymieszania. Wlać mieszaninę do trzeciej płytki Petriego i odstawić.</li>
			<li>Używając pincety, wyjąć jedną okrągłą szklaną lamellkę o średnicy 22 mm i opłukać obie strony mieszaniną 100% etanolu za pomocą jednorazowej pipety.</li>
			<li>Umieścić opłukaną szklaną lamellkę w płytce z roztworem 3-aminopropylotrimetoksysilanu w 30 ml 100% etanolu i pozostawić w roztworze na 5 min.</li>
			<li>Wyjąć szklaną lamellkę pincetą i ponownie opłukać roztworem 100% etanolu za pomocą jednorazowej pipety.</li>
			<li>Włożyć opłukaną szklaną lamellkę do mieszaniny 1,875 µl glutaraldehydu i 30 ml wody dejonizowanej i odstawić na 30 min.</li>
			<li>Po 30 min wyjąć szklaną lamellkę pincetą, opłukać wodą dejonizowaną i położyć na suchej chusteczce na noc (O/N) do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (RT).</li>
			<li>Powtórzyć proces zanurzania i przenoszenia dla takiej liczby lamellek, jaka jest potrzebna, korzystając z tych samych przygotowanych roztworów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować lamellki hydrofobowe zgodnie z poniższym protokołem:
		<ol>
			<li>Dodać 500 µl tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylu, 100 µl kwasu octowego i 19,4 ml heksanu do probówki 50 ml i mieszać na wirówce typu vortex przez 2 min. Wlać roztwór do szklanej płytki Petriego i odstawić.</li>
			<li>Używając czystej pincety, wyjąć jedną szklaną lamellkę i zanurzyć w przygotowanym roztworze na 2 min. Po upływie 2 min wyjąć szklaną lamellkę pincetą, opłukać wodą dejonizowaną za pomocą jednorazowej pipety i położyć lamellkę na suchej chusteczce na noc (O/N) do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (RT). Przechowywać lamellki w plastikowych płytkach Petriego do momentu użycia.</li>
			<li>Powtórzyć proces zanurzania i przenoszenia dla takiej liczby lamellek, jaka jest potrzebna, korzystając z tych samych przygotowanych roztworów.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Montaż formy
<ol>
	<li>Przed użyciem form, za pomocą jednorazowej pipety przepłukać formę 90% etanolem nad pojemnikiem na odpady chemiczne. Następnie umieścić formę w szalce Petri wypełnionej wodą dejonizowaną i pozostawić na noc.</li>
	<li>Wyjąć formę z roztworu za pomocą pęsety i położyć na ręczniku do wyschnięcia przed rozpoczęciem montażu formy.</li>
	<li>Podczas wysychania formy, przy użyciu precyzyjnego diamentowego rysika, pociąć kwadratowe szkiełka zakrywkowe hydrofilowe na dwa prostokąty nieco większe niż 3,95 mm x 5,99 mm. Wsunąć każde pocięte prostokątne szkiełko w szczeliny wycięte w silikonowej formie.</li>
	<li>Odwrócić formę do góry dnem i za pomocą jednorazowej pipety nanieść smar próżniowy wzdłuż spodu silikonowej formy. Następnie odwrócić formę z powrotem i docisnąć jej spód do okrągłego hydrofilowego szkiełka zakrywkowego, aby stworzyć uszczelnienie.</li>
	<li>W jednorazowych rękawiczkach podnieść zmontowaną formę, umieścić w jednorazowej szalce Petri, a następnie włożyć do komory z laminarnym przepływem powietrza (bio-hood). Włączyć lampę UV w komorze na 1 hr w celu sterylizacji formy przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
</ol>
3. Mieszanina kolagenu i macierz 3D
<ol>
	<li>Przed przygotowaniem mieszaniny kolagenowej należy zbarwić i przygotować komórki do obrazowania zgodnie ze standardowymi protokołami28.</li>
	<li>Stosując standardowe techniki i protokoły laboratoryjne29,30, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, zmieszać pożywkę komórkową i chemoatraktant w probówce o objętości 15 ml do pożądanego stężenia chemoatraktanta. Pipetować 5 ml roztworu pożywki komórkowej o konkretnym stężeniu chemoatraktanta do probówki 15 ml i przenieść roztwór do podgrzewanej kąpieli wodnej.</li>
	<li>Za pomocą pipety pobrać 5 ml samej pożywki komórkowej do drugiej probówki 15 ml i umieścić w podgrzewanej kąpieli wodnej w celu ogrzania roztworu do eksperymentów mikroskopowych.</li>
	<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza pipetować 30 µl 10x roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) do probówki do mikrocentryfugi. Dodać 6 µl 1 N wodorotlenku sodu (NaOH) do tej samej probówki i mieszać w wortexie przez 15 s.</li>
	<li>Wyjąć z lodówki roztwór kolagenu I z ogona szczura i przenieść do komory z laminarnym przepływem powietrza, stosując standardowe techniki i protokoły laboratoryjne29. Upewnić się, że kolagen jest nadal zimny. Pipetować 168,3 µl kolagenu do tej samej probówki do mikrocentryfugi.</li>
	<li>Następnie, za pomocą pipety dodać 18 µl żółto-zielonych fluorescencyjnych mikrosfer modyfikowanych karboksylowo do tej samej probówki do mikrocentryfugi. Mieszać probówkę z wszystkimi roztworami w wortexie przez 30 s.</li>
	<li>Dodać 77,7 µl pożądanej mieszaniny pożywki i komórek (stężenie około 2 x 106 komórek/ml) do probówki do mikrocentryfugi i mieszać końcówką pipety przez 20 s. W razie potrzeby zmienić gęstość macierzy, korzystając z tabeli dostosowanej mieszaniny kolagenowej dla dodatku fluorescencyjnych kulek i żywotności komórek (Table 1).</li>
	<li>Pipetować 300 µl mieszaniny kolagenu i komórek do środkowej studni (studnia nr 2) przygotowanego zestawu formy. Umieścić formę na jednorazowej płytce Petriego i przenieść do standardowego inkubatora na 20 min w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.</li>
	<li>Wyjąć system z inkubatora i przenieść z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą pęsety usunąć obie hydrofobowe szkiełka nakrywki, chwytając za górną krawędź każdego szkiełka i pociągając je do góry, z dala od formy.</li>
	<li>Przenieść cały system pod wybrany mikroskop i wykonać obrazowanie, aby upewnić się, że ścianki formy kolagenowej są nadal proste, co zapewni planarny gradient dyfuzyjny.</li>
	<li>Przy systemie wciąż znajdującym się pod mikroskopem, za pomocą jednokanałowej pipety 100 µl, dodać 100 µl pożywki komórkowej do studni nr 1. Następnie, za pomocą jednokanałowej pipety 100 µl, dodać 100 µl pożywki komórkowej z pożądanym stężeniem chemoatraktanta do studni nr 3.</li>
	<li>Natychmiast po dodaniu roztworów do obu studni rozpocząć obrazowanie.</li>
</ol>
4. Obrazowanie i modelowanie dyfuzji
<ol>
	<li>Jeśli chce się wyznaczyć współczynnik dyfuzji dla konkretnej gęstości kolagenu w celu obliczenia specyficznego stężenia, należy postępować zgodnie z poniższym protokołem:
	<ol>
		<li>Zgodnie z opisanym powyżej protokołem zatytułowanym „Mieszanina kolagenu i macierz 3D”, zamiast przygotowywania pożywki komórkowej z pożądanym stężeniem chemoatraktanta, należy przygotować 5 µM rodaminy w probówce 15 ml, stosując standardowe obliczenia i protokoły30.</li>
		<li>Należy obrazować trójwymiarowe macierze kolagenowe za pomocą systemu konfokalnego zamontowanego na mikroskopie odwróconym, wykorzystując laser argonowy (488 nm) do rejestracji fluorescencji. Obrazowanie powinno odbywać się co 2 lub 3 s przez maksymalnie 7 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modelowanie dyfuzji: Wykorzystując przedstawiony poniżej model matematyczny, należy napisać kod oprogramowania obliczeniowego do przetwarzania i analizy danych, obejmujący następujące ogólne kroki. 
	<img alt="Równanie dyfuzji, C(x,t)=C1+(x/L)(C2-C1)+Σan*e^-n²π²α²t/L²*sin(nπx/L), formuła matematyczna." src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">
	<ol>
		<li>Zaimportować obrazy do oprogramowania obliczeniowego w celu przeskalowania i normalizacji według maksymalnej intensywności. Konwertować obrazy na mapę kolorów w skali szarości, aby wyznaczyć krawędź. Wybrać oś przebiegającą przez środek obrazu, po prawej i lewej stronie centrum.</li>
		<li>Za pomocą kodu oprogramowania obliczeniowego wykreślić znormalizowaną intensywność wraz z intensywnością rzeczywistą oraz różnicą między nimi.</li>
		<li>Następnie wprowadzić parametry niezbędne do dopasowania (stężenie, czas i długość).</li>
		<li>Wykreślić zależność znormalizowanego stężenia od czasu oraz profil stężenia wzdłuż osi x z dopasowaniem wielomianowym do danych.</li>
		<li>Obliczyć współczynnik dyfuzji przy użyciu kodu oprogramowania obliczeniowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pomiary eksperymentalne
<ol>
	<li>Nawiązując do równania dyfuzji, przekształć równanie, aby wyznaczyć konkretne stężenie w dowolnym miejscu w obrębie układu, zgodnie z poniższym wzorem. 
	<img alt="Równanie dyfuzji ciepła, analiza stanu nieustalonego, wzór matematyczny, obliczenia naukowe." src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2"> 
	Gdzie: 
	L = długość macierzy kolagenowej 
	x = badane miejsce 
	D = współczynnik dyfuzji 
	t = czas upływowy</li>
	<li>Podczas eksperymentów z chemotaksją należy dokładnie odnotować czas dodania chemokiny do układu. Po stwierdzeniu ruchu migracyjnego komórek należy rozpocząć rejestrację confocal time-lapse oraz odnotować dokładny czas i odległość od krawędzi, w której wykonano obrazowanie.</li>
	<li>Podczas analizy danych podstaw odnotowany czas upływowy, lokalizację oraz współczynnik dyfuzji dla danej komórki do równania, aby obliczyć znormalizowane stężenie w dowolnym punkcie w obrębie kolagenu zarówno dla eksperymentów dyfuzyjnych, jak i komórkowych.</li>
</ol>
6. Śledzenie migracji komórek z wykorzystaniem TFM
<ol>
	<li>Aby śledzić migrację komórek przy użyciu technik TFM/DVC, należy postępować zgodnie z poniższym protokołem:
	<ol>
		<li>Po dodaniu pożądanej stężenia chemoatraktanta do dołka nr 3, rozpocząć obrazowanie trójwymiarowych macierzy kolagenowych za pomocą systemu konfokalnego zamontowanego na mikroskopie odwróconym, aby zlokalizować komórkę do badania.</li>
		<li>Po znalezieniu przemieszczającej się komórki, umieścić ją w centrum pola widzenia i wykorzystując silnik piezoelektryczny (do obrazowania w osi z), wykonywać zdjęcia co 1 lub 2 min.</li>
		<li>W celu obliczenia generowanej siły i deformacji komórki, stworzyć kod obliczeniowy pozwalający wyznaczyć przemieszczenia kulek fluorescencyjnych zgodnie z protokołami TFM/DVC31.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Adzick, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+and+Cellular+Biology+of+Wound+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair.</a> Ann Surg. 225 (2), 236(1997).</li>
<li>Reddi, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+an+unconventional+approach+to+isolation+of+first+mammalian+morphogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+F.+R%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens.</a> Cytokine Growth F. R. 8 (1), 11-20 (1997).</li>
<li>Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cancer.</a> Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).</li>
<li>Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+effect+of+chemotaxis+on+glioblastoma+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression.</a> AIChE J. 57 (3), 778-792 (2011).</li>
<li>Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+gradient+sensing%3A+towards+building+predictive+models+of+chemotaxis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 284-291 (2012).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Cristini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+Instability+and+Cancer+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Morphologic Instability and Cancer Invasion.</a> Clin. Cancer Res. 11 (19), 6772-6779 (2005).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell%27s+sense+of+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell's sense of direction.</a> Science. 284 (5415), 765-770 (1999).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+under+agarose%3A+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li>
<li>Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+controlled+molecular+gradients+in+3D+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generating controlled molecular gradients in 3D gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 91 (6), 754-759 (2005).</li>
<li>Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor-induced+cell+motility+in+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Growth factor-induced cell motility in tumor invasion.</a> Acta Oncol. 41 (2), 124-130 (2002).</li>
<li>Wilkinson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+leukocyte+locomotion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 216 (1-2), 139-153 (1998).</li>
<li>Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multichamber+fluidic+device+for+3D+cultures+under+interstitial+flow+with+live+imaging%3A+development%2C+characterization%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications.</a> Biotechnol. Bioeng. 105 (5), 982-991 (2010).</li>
<li>Noo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotechnol. 20 (8), 826-830 (2002).</li>
<li>Shao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab Chip. 9 (21), 3118-3125 (2009).</li>
<li>Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+agarose-based+microfluidic+platform+with+a+gradient+buffer+for+3D+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies.</a> Biomed. Microdevices. 11 (4), 827-835 (2009).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat. Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Sixt, M., Lammermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+chemotactic+leukocyte+migration+in+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments.</a> Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J. Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell. Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).</li>
<li>Gilbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+diffusion+through+collagen+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Macromolecular diffusion through collagen membranes.</a> Int. J. Pharm. 47 (1-3), 79-88 (1988).</li>
<li>Ramanujan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+and+convection+in+collagen+gels%3A+implications+for+transport+in+the+tumor+interstitium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium.</a> Biophys. J. 83 (3), 1650-1660 (2002).</li>
<li>Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusivity+of+125I-calmodulin+through+collagen+membranes%3A+effect+of+source+concentration+and+membrane+swelling+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio.</a> Biomaterials. 7 (4), 263-267 (1986).</li>
<li>Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+modifications+of+collagen+gels%3A+impact+on+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion.</a> Biopolymers. 89 (2), 135-143 (2008).</li>
<li>Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-stimulated+chemotaxis+of+human+neutrophils+in+a+3-D+conjoined+fibrin+gel+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay.</a> J. Immunol. Methods. 180 (2), 193-211 (1995).</li>
<li>Sundd, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+paxillin+in+rolling+neutrophils+by+dual-color+quantitative+dynamic+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting.</a> Microcirculation. 18 (5), 361-372 (2011).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Volume+Transfers+with+Serological+Pipettes+and+Micropipettors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors.</a> J. Vis. Exp. (63), 2754(2012).</li>
<li>Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. , Elsevier Science. (2010).</li>
<li>Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fast+Iterative+Digital+Volume+Correlation+Algorithm+for+Large+Deformations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mech%22%5BJournal%5D)">A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations.</a> Exp. Mech. In press, (2014).</li>
<li>Shenoy, V., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Macromolecules+in+Collagen+and+Hyaluronic+Acid%2C+Rigid-Rod-Flexible+Polymer+Composite+Matrixes%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes.</a> Macromolecules. 28 (26), 8751-8758 (1995).</li>
<li>Leddy, H., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Molecular+Diffusion+in+Articular+Cartilage+Measured+using+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najważniejszymi krokami dla udanych eksperymentów dyfuzyjnych z komórkami lub bez nich są: prawidłowe ustawienie zespołu formy; rozwijanie niezbędnej sprawności manualnej, aby zapobiec uszkodzeniom podczas ekstrakcji hydrofobowych szkiełek nakrywkowych; zapewnienie znalezienia bardzo dobrej liniowej linii startowej w celu prawidłowego obliczenia współczynnika dyfuzji; prawidłowe obliczenia eksperymentalne zarówno kolagenu, jak i chemoatraktantu; prawidłowe stosowanie systemu obrazowania żywych komórek, aby zapewnić, że m...

Preferowany ruch komórek w kierunku gradientu stężeń, znany jako chemotaksja, odgrywa ważną rolę w procesach patologicznych i fizjologicznych w organizmie. Takimi przykładami są gojenie się ran skóry i błony śluzowej1, morfogeneza2, stan zapalny3 i wzrost guza4,5. Wykazano również, że komórki nowotworowe mogą migrować zarówno poprzez indywidualne, jak i zbiorowe strategie migracji komórek6. Co więcej, mechanizmy niestabilności dyfuzyjnej mogą indukować oddzielanie pojedynczych lub skupionych komórek od ciała/obiektu nowotworowego, a następnie mogą migrować w kierunku źródła składników odżywczych, a tym samym atakować szersze obszary i tkanki7.
Ponadto wykazano, że różne mechanizmy migracji mogą być aktywne w 2D i 3D, ze względu na różne role cząsteczek adhezyjnych8. W związku z tym przejście na fizjologicznie istotne testy in vitro w celu zbadania ruchliwości komórek w mierzalny i prosty sposób ma znaczenie dla zrozumienia zjawisk ruchu komórek9. Niestety, trudność w analizie migracji komórek, kompleksowy, ilościowy test chemotaksji zwykle wymaga długiej, pracochłonnej metody, opartej na pomiarze bezstronnych modeli ruchliwości komórek i zjawisk transportowych.
Wcześniejsze eksperymentalne podejścia do badania chemotaksji komórek obejmują komorę Boydena10 i test pod agarozą11. Jednak w tych wczesnych testach eksperymenty z migracją komórek nie monitorowały ruchu w odniesieniu do czasu. Co ważniejsze, gradienty stężeń użyte w eksperymentach nie były dobrze zdefiniowane ani w pełni zrozumiałe, a sygnalizacja utrzymywała się tylko przez nie więcej niż kilka godzin. Co więcej, wczesne próby komory chemotaksji ograniczyły migrację komórek do dwóch wymiarów i nie pozwoliły na monitorowanie kinetyki migracji12. Patrząc na komorę Boydena, test końcowy nie pozwoliłby badaczowi na wizualną obserwację migracji i nie mógłby bezpośrednio odróżnić chemotaksji (ruchu kierunkowego) od chemokinezy (ruchu losowego). Dodatkowo, kilka zmiennych – różnice w wielkości porów i grubości błon – sprawiło, że komora była bardzo trudna do łatwego odtworzenia i ukryła reakcję migracyjną komórek na chemokiny13,14.
Dzięki nowemu zrozumieniu mikrofluidyki, nowe komory i mikrourządzenia zostały zbadane jako instrument do badania lokomocji komórek w warunkach przepływu śródmiąższowego lub chemotaksji15,16. W ramach tych nowych urządzeń wprowadzono i zbadano nowe wskaźniki ogniw, takie jak wpływ naprężeń ścinających na ogniwo17,18. Niestety, przeszłe i obecne komory chemotaksji mikroprzepływowej ograniczały badania migracji komórek do substratów 2D - co jest ważnym niepowodzeniem, ponieważ wiele procesów biologicznych, w tym inwazja i przerzuty komórek nowotworowych oraz migracja komórek odpornościowych, obejmuje migrację 3D.
Bezpośrednie komory obserwacyjne - gdzie roztwór chemoatraktantu styka się z żelem 3D zawierającym komórki, również zostały zgłoszone19,20. Komory te mają dwa przedziały, jeden zawierający chemoatraktant, a drugi zawierający komórki, są połączone obok siebie poziomo21 lub jako koncentryczne pierścienie22. Systemy te są skierowane we właściwym kierunku, ale nie utrzymują systemu chemotaksji przez dłuższy czas.
Ponadto, naukowcy badali również dyfuzyjność przez błony kolagenowe w komórkach dializacyjnych, a także dyfuzję cząsteczek znacznikowych przez próbki kolagenu poddane ciśnieniu hydrostatycznemu23-25. Niektóre eksperymenty dyfuzyjne w żelach kolagenowych opierają się na fizycznych i chemicznych modyfikacjach żelu przy użyciu pól magnetycznych i inkorporacji chemicznej26. Popularna metoda modelowania dyfuzyjności w tkankach kolagenowych opiera się na obrazowaniu fluorescencyjnym ciągłego fotowybielania punktowego. Metoda ta wykazała anizotropię współczynników dyfuzji makrocząsteczek w zorientowanych tkankach kolagenowych. Jednak fotowybielanie było stosowane w chrząstkach stawowych, a nie w matrycach kolagenowych. Chociaż są podobne, niezbędne eksperymenty modelowe muszą być przeprowadzone poprzez dokładne zrozumienie współczynnika dyfuzji żeli kolagenowych. Co ważniejsze, systemy te nie wykorzystują metody pomiaru siły wytwarzanej przez ogniwo.
Niestety, większość systemów wydaje się brakować jednego lub dwóch kluczowych elementów idealnego systemu: umożliwienia śledzenia komórek, zrozumienia gradientu dyfuzji z czynnikiem chemotaktycznym przez matrycę, stosunkowo prostej konfiguracji z łatwością odtwarzalności, minimalizacji interakcji komórka-komórka oraz możliwości mierzenia jednostek wymiarowych do kwantyfikacji (tj. prędkość, siła, stężenie właściwe). Moghe i wsp.W ramach projektu 27 zaproponowano system, który spełniałby większość tych wymagań, w którym komórki były początkowo rozproszone w żelu, a nie skoncentrowane na powierzchni filtra, ale trudno było zmierzyć siły generowane przez ogniwo.
W tym celu prezentujemy system dyfuzji gradientu płaskiego do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, który pozwala przezwyciężyć ograniczenia nowoczesnej komory dyfuzyjnej istniejących testów, która opiera się na mikroskopii poklatkowej, w połączeniu z technikami analizy obrazu do pomiaru sił komórek w środowisku 3D. Protokół ten zapewnia prosty, ale innowacyjny sposób tworzenia prostej komory dyfuzyjnej 3D, która może być wykorzystana do badania chemotaksji 3D w różnych komórkach.

<table><tbody><tr><td>Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning Corp</td><td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td><td>dwuczęściowa mistura z mieszanką 10:1</td></tr><tr><td>Komora do obrazowania żywych komórek</td><td>Przyrząd</td> do obrazowania żywych komórek <td>CM-B18-1</td><td>CMB do 18&nbsp; mm szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>okrągłe 22&nbsp; mm Szkiełko nakrywkowe</td><td>szklane Fisher Scientific</td><td>NC0180281</td><td>Neuvitro Corp. szkiełko nakrywkowe 22&nbsp; mm 1,5</td></tr><tr><td>Obrabiana maszynowo aluminiowa metalowa kostka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nóż uniwersalny</td><td>Hobby X-Acto</td><td>X3201</td><td></td></tr><tr><td>3-(aminopropylo) trimetoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00216A-10</td><td>Aldehyd glutarowy, klasa EM,</td></tr> <tr><td>tubka 8%50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Podłoga standardowa model i wirówki stołowe</td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>Szalki Petriego wielokrotnego użytku: Kompletne (60 x 15&nbsp; mm)</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td>Kleszcze do cienkich końcówek</td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-105A</td><td>Prostokąt; 30 x 22&nbsp; Mm; Grubość nr 1</td></tr><tr><td>Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktyl</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Odczynnik ACS kwasu octowego, &ge; 99,7%</td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td>bezwodny, 95%</td></tr><tr><td>alkohol etylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, do biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Precyzyjna diamentowa trasarka do trasowania</td><td>Lunzer</td><td>PV-081-3</td><td>Prosta rysiarka z przedłużoną końcówką, .020" (.50&nbsp; mm) średnicy o .200" (5.0&nbsp; mm) długość końcówki</td></tr><tr><td>Smar próżniowy</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5C</td><td>Smar wysokopróżniowy</td></tr><tr><td>tubka 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>15 ml stożkowe probówki wirówkowe z hydrofobową, biologicznie obojętną powierzchnią</td></tr><tr><td>10x roztwór buforowany fosforanem</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td>1,37 M chlorek sodu, 0,027 M chlorek potasu i 0,119 M bufor fosforanowy</td></tr><tr><td>1&nbsp; N wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38215</td><td>Koncentrat wodorotlenku sodu</td></tr><tr><td>Kolagen I, ogon szczura</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>Ogon szczura&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroprobówka wirówkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-332</td><td>Pojemność: 2,0 ml; O.D. x L: 13&nbsp; x&nbsp; 40&nbsp; Mm; sterylny; pojedynczo owinięte</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Mikrosfery modyfikowane karboksylanem</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; F-8813</td><td>Mikrosfery modyfikowane karboksylanem, 0,5 i mikro; m, żółto-zielona fluorescencyjna (505/515), 2% ciał stałych</td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83689</td><td>Rhodamina B do fluorescencji</td></tr></tbody></table>

planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3d

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Znaczenie migracji komórek można dostrzec poprzez rozwój ludzkiego życia. Kiedy komórki migrują, generują siły i przenoszą te siły na otoczenie, co prowadzi do ruchu komórek i migracji. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać i/lub wpływać na migrację komórek, można badać te siły. Teoretycznie zrozumienie podstawowych mechanizmów i sił leżących u podstaw migracji komórek daje nadzieję na skuteczne podejścia do leczenia chorób i promowania przeszczepów komórkowych. Niestety, nowoczesne komory chemotaksyjne, które zostały opracowane, są zwykle ograniczone do dwóch wymiarów (2D) i mają złożone gradienty dyfuzji, które utrudniają interpretację eksperymentu. W tym celu opracowaliśmy i opisaliśmy w tym artykule komorę z bezpośrednim widokiem do badań nad chemotaksją, która pozwala na pokonanie nowoczesnych przeszkód w komorze chemotaksji, zdolnej do pomiaru sił komórkowych i stężenia właściwego w komorze w środowisku 3D w celu badania migracji komórek 3D. Co bardziej przekonujące, podejście to pozwala z powodzeniem modelować dyfuzję za pomocą matryc kolagenu 3D i obliczać współczynnik dyfuzji chemoatraktantu przez wiele różnych stężeń kolagenu, przy jednoczesnym zachowaniu prostoty i przyjazności dla użytkownika systemu do mikroskopii sił trakcyjnych (TFM) i analizy cyfrowej korelacji objętości (DVC).

Zdolność tego testu do dokładnej oceny migracji komórek zależy od prawidłowej konfiguracji układu. Dlatego kluczowe jest precyzyjne zaprojektowanie formy układu dyfuzyjnego oraz zachowanie szczególnej staranności podczas rozmieszczania szkiełek nakrywkowych hydrofobowych i hydrofilowych, jak pokazano na Rysunku 1. Jeśli układ zostanie odpowiednio zaprojektowany, a podczas etapu modelowania dyfuzji zostanie wyznaczona bardzo dobra linia startowa, możliwe jest uzyskanie wysokiej jakości obrazów fluorescenc...

Migracja komórek jest ważną częścią rozwoju i życia człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać migrację komórek, przedstawiamy planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, co pozwala przezwyciężyć nowoczesne ograniczenia komory dyfuzyjnej istniejących testów.

Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie płaskiej komory do dyfuzji gradientowej w celu zbadania chemotaksji w trójwymiarowej macierzy kolagenowej. Jest to realizowane poprzez wstępne wykonanie trójwymiarowej formy silikonowej z wykorzystaniem komory do obrazowania żywych komórek. Drugim krokiem jest przygotowanie hydrofilowych i hydrofobowych szkiełek podstawowych oraz wykorzystanie ich do montażu trójwymiarowej formy silikonowej.Następnie mieszaninę komórek z kolagenem dodaje się do komory centralnej i pozostawia do polimeryzacji. Ostatnim krokiem jest usunięcie hydrofobowych szkiełek zakrywających z formy po inkubacji oraz dodanie zwykłej pożywki do jednego zbiornika i pożywki z chemoatraktantem do drugiego zbiornika. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię konfokalną do śledzenia chemotaksji komórek w czasie i wizualizacji przemieszczenia komórek w obrębie macierzy kolagenowej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak komora Boydena i mikroatletyka, jest to, że umożliwia ona prostą konfigurację do badania migracji w przestrzeni 3D przy użyciu prostego gradientu dyfuzyjnego, korzystając z jednorazowej pipety. Odmierz 150 µL amino silanu A-P-T-M-S i wlej go do probówki o pojemności 50 mL. Następnie, używając drugiej jednorazowej pipety, dodaj do probówki 30 mL 100% ethanolu i zamknij pokrywkę.Mieszaj roztwór w wirówce vortex przez dwie minuty, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Następnie wlej roztwór do szklanej szalki Petriego i odstaw go. Następnie wlej 15 mililitrów 100% alkoholu etylowego do drugiej szalki Petriego i przenieś go do pierwszej szalki za pomocą nowej jednorazowej pipety.Odmierz 30 mililitrów wody dejonizowanej i wlej roztwór do probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie, używając nowej jednorazowej pipety, dodaj do probówki 1,875 mililitra glutaraldehydu i zamknij korek. Mieszaj roztwór w wstrząsarzu typu vortex przez dwie minuty, a następnie przelej mieszaninę do trzeciej szalki Petriego.Za pomocą pęsety wyjmij jedno okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 milimetrów i wypłucz obie jego strony mieszanką 100% etanolu. Za pomocą jednorazowej pipety umieść wypłukane szkiełko nakrywkowe w pierwszej płytce zawierającej amino selinę i pozostaw je w roztworze na pięć minut. Za pomocą pęsety wyjmij szkiełko nakrywkowe i ponownie wypłucz je 100% etanolem.Następnie opłukaną szklaną lamellkę należy przenieść do naczynia z glutaraldehydem i odstawić na 30 minut. Po 30 minutach należy wyjąć szklaną lamellkę pęsetą i opłukać ją wodą dejonizowaną. Opłukaną lamellkę należy położyć na chusteczce do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.Aby przygotować hydrofobowe szkiełka zakrywkowe, należy najpierw dodać 500 µL TTS, 100 µL kwasu octowego oraz 19,4 mL heksanu do probówki o pojemności 50 mL i mieszać na vortexu przez dwie minuty. Następnie należy przelać roztwór do szklanego naczynia Petriego i za pomocą czystej pęsety zanurzyć jedno szklane szkiełko zakrywkowe w przygotowanym roztworze, pozostawiając je w nim przez dwie minuty. Po dwóch minutach należy wyjąć szkiełko zakrywkowe pęsetą i wypłukać je wodą dejonizowaną za pomocą jednorazowej pipety, a następnie położyć szkiełko na chusteczce i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc.Wysuszone szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w plastikowej szalce Petri do momentu rozpoczęcia pracy, a następnie złożyć komorę do obrazowania żywych komórek zgodnie z opisem zawartym w towarzyszącym protokole tekstowym. Następnie należy wymieszać roztwory elastomeru silikonowego zgodnie z instrukcjami producenta, aby przygotować 5 mL elastomeru. Po tym użyć jednorazowej szpatułki laboratoryjnej, aby powoli wlać roztwór elastomeru silikonowego do przygotowanej komory do obrazowania żywych komórek, tak aby nie poruszyć elementów formy.Odstawić formę w bezpieczne miejsce, aby utrwalić ją w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego ranka wyjąć formę za pomocą pęsety i ostrożnie wyekstrahować z niej obrobioną aluminiową kostkę. Następnie udać się do zlewu, wypłukać formę wodą dejonizowaną, a następnie położyć ją na ręczniku papierowym do wyschnięcia.Po wyschnięciu należy użyć nożyka modelarskiego, aby wyciąć nacięcia w odstępach 2,34 milimetra od każdego podłużnego końca wewnątrz formy silikonowej. Przed użyciem należy upewnić się, że forma jest przechowywana w bezpiecznym i suchym miejscu do momentu rozpoczęcia eksperymentu. Formę należy przepłukać 90% etanolem, a następnie umieścić w szalce Petriego wypełnionej wodą dejonizowaną na całą noc.Następnego ranka przenieś formę na ręcznik papierowy i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Użyj precyzyjnego diamentowego rylca, aby wyciąć dwa prostokąty z hydrofilowych szkiełek nakrywkowych, nieco większe niż 3,95 mm na 5,99 mm.Następnie wsuń każde z wyciętych prostokątnych szkiełek zakrywek do szczelin wyciętych w formie silikonowej, odwróć formę do góry dnem i za pomocą jednorazowej pipety nałóż smar próżniowy wzdłuż dna formy silikonowej. Następnie ponownie odwróć formę stroną prawą do góry i dociśnij dno formy do okrągłego hydrofilowego szkiełka zakrywki. Aby stworzyć uszczelnienie, przygotuj w probówce o pojemności 15 ml mieszaninę pożywki i chemoatraktanta o pożądanym stężeniu, a następnie pipetą przenieś 5 ml mieszaniny do nowej probówki mililitrowej i 5 ml czystej pożywki do drugiej probówki.Przenieś obie probówki do kąpieli wodnej podgrzanej do 37 °C. Następnie pipetuj 30 µL 10 XPBS do probówki do mikrocentryfugi. Do tej samej probówki dodaj sześć µL 1 N roztworu wodorotlenku sodu i mieszaj w wodotrzepie przez 15 sekund.Następnie do probówki do mikrocentryfugi należy dodać 18 µL zmodyfikowanych mikrosfer z żółto-zielonym fluorescencyjnym karboksylanem oraz 168,3 µL lodowatego kolagenu typu I z ogona szczura. Mieszaninę należy wymieszać w wirówce Vortex przez 30 sekund.Następnie do probówki do wirówki dodaj 77,7 µL pożądanych komórek o stężeniu 2 × 10⁶ komórek/ml w medium i wymieszaj. Używając końcówki do pipety, przez 20 sekund pipetuj 300 µL mieszaniny kolagenu z komórkami do środkowego otworu przygotowanego zestawu formy.Następnie należy umieścić formę na jednorazowej szalce Petriego i przenieść ją do standardowego inkubatora na 20 minut w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide. Po zakończeniu inkubacji, za pomocą pęsety należy usunąć obie hydrofobowe szkiełka zakrywy, chwytając je za górną krawędź, a następnie pociągając w górę i odsuwając od formy. Cały układ należy przenieść pod mikroskop i sprawdzić komorę, aby upewnić się, że ścianki formy kolagenowej są nadal proste, co pozwoli na uzyskanie bardziej płaskiego gradientu dyfuzji, gdy układ wciąż znajduje się pod mikroskopem. Do pierwszej studni należy dodać 100 µL pożywki komórkowej.Następnie dodaj 100 µL pożywki komórkowej o pożądanym stężeniu chemoatraktanta do otworu po drugiej stronie macierzy. Monitoruj migrację komórek w odniesieniu do fluorescencyjnie znakowanych mikrosfer, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Przedstawiona tutaj seria obrazów ukazuje dyfuzję ruminu przemieszczającego się przez żel kolagenowy o stężeniu 1 mg/mL.Niniejszy przykład przedstawia rzeczywisty płaski gradient dyfuzyjny układu, którego można oczekiwać również w przypadku wszelkich wprowadzonych chemoatraktantów. W pokazanym tutaj przykładzie intensywność sygnału rumine mierzono w czasie w miejscach oznaczonych czerwonymi kwadratami. Stężenie w każdym z tych miejsc jest przedstawione na wykresie jako osobna linia, która w stanie stacjonarnym tworzy liniowy gradient stężeń w zależności od położenia w żelu.Relacja ta pozostaje liniowa w szerokim zakresie stężeń matrycy kolagenowej, co czyni ten układ bardzo użytecznym w eksperymentach komórkowych. Na tym obrazie przedstawiono neutrofil zabarwiony na czerwono wewnątrz matrycy kolagenowej z rozproszonymi fluorescencyjnymi zielonymi mikrosferami, które służą jako punkty odniesienia pozycji. Kolejne trzy obrazy pokazują kierunkową migrację neutrofila, który przemieszcza się w górę gradientu chemoatraktanta, co zostało zaznaczone białą strzałką.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć prostą komorę dyfuzyjną do badania migracji komórek w trójwymiarowej macierzy kolagenowej.

planar-gradient-diffusion-system-to-investigate-chemotaxis-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę przeprowadzania szybkiego testu chemotaksji neutrofili poprzez integrację wbudowanej izolacji neutrofili z krwi pełnej oraz testu chemotaksji na pojedynczym chipie mikroprzepływowym.

Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Tutaj udostępniamy metodę analizy zachowania rosnących aksonów w matrycach 3D, naśladując ich naturalny rozwój.

Generowanie hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu i zachowania aksonów podczas rozwoju układu nerwowego

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię poklatkową z kontrastem fazowym do obrazowania makrofagów otrzewnowych rezydujących myszy w chemotaktycznym gradiencie dopełniacza C5a. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki odpornościowe.

Obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy

Naucz się tworzyć planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D. Ta metoda umożliwia śledzenie migracji komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Przeglądaj więcej filmów