Charakterystyka diagramu fazowego z wykorzystaniem kulek magnetycznych jako nośników cieczy

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest analiza objętości przeniesienia między sąsiednimi segmentami cieczy w urządzeniu typu lab-on-a-tube z wykorzystaniem kulek magnetycznych. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez stworzenie urządzenia z hydrofobowej rurki, załadowanej za pomocą pompy strzykawkowej w taki sposób, aby składało się ono z wielu segmentów cieczy oddzielonych zaworem powietrznym, przy czym do jednej z cieczy wprowadzono kulek magnetyczne oraz barwnik fluorescencyjny. W drugim kroku, po każdym przeniesieniu kulek magnetycznych za pomocą zewnętrznego magnesu, mierzy się intensywność fluorescencji sąsiednich segmentów cieczy przy użyciu mikroskopu.

Następnie przeprowadzono analizę numeryczną tych pomiarów intensywności fluorescencji w celu obliczenia objętości przeniesienia kulek magnetycznych. Wyniki pokazują, że analiza zmiany fazy w układzie wieloskładnikowym składającym się z dwóch cieczy jest możliwa dzięki zastosowaniu kulek magnetycznych jako metody przenoszenia objętości cieczy rzędu mikrolitrów między sąsiednimi zbiornikami. Jak mam nadzieję, przekonają się Państwo dzisiaj, pracujemy z tą niezwykle interesującą i prostą techniką wykorzystującą kulki magnetyczne do przenoszenia płynów wewnątrz prostej probówki, w przeciwieństwie do bardziej złożonych, konwencjonalnych układów mikrofluidycznych.

Początkowo zastosowaliśmy tę metodę w badaniu oddziaływań powierzchniowych między cieczami dopuszczalnymi, a obecnie rozszerzamy ją na inne zastosowania, w tym analizę diagnostyczną krwi pełnej, oddzielanie białek od erytrocytów, analizę moczu, testy immunoenzymatyczne i tak dalej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie kanałów mikroprzepływowych, jest jej prostota oraz niskie koszty wykonania. Oferuje ona wysoką elastyczność dla użytkownika w zależności od rodzaju eksperymentu oraz zapewnia powtarzalne wyniki.

Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji w zastosowaniach wymagających przemieszczania niewielkich, szczytowych objętości, może ona zostać zastosowana również w innych układach, takich jak separacja krwi, ukierunkowane dostarczanie leków czy środki kontrastowe. Aby przygotować rurkę, należy najpierw pociąć rurkę na segmenty o długości 15 centymetrów, zawiesić segmenty rurek pionowo za pomocą taśmy, kładąc pod nimi ręcznik papierowy w celu zebrania nadmiaru roztworu fluoropolimeru. Za pomocą pipety wstrzyknąć 100 µl roztworu fluoropolimeru do górnego otworu każdego segmentu rurki w taki sposób, aby roztwór zetknął się z całym obwodem wewnętrznej ścianki.

Pozostaw segmenty rurki w zawieszeniu na jedną godzinę, aby usunąć nadmiar roztworu polimeru fluorowego. Następnie umieść segmenty rurki w piekarniku w temperaturze 100 °C na jedną godzinę, aby utwardzić warstwę powłoki polimeru fluorowego. W kolejnym kroku przygotuj rozcieńczony roztwór kulek magnetycznych, kładąc fiolkę z próbką o pojemności 20 ml na mikrowadze i zerując urządzenie.

Wymieszaj roztwór kulek magnetycznych w pojemniku, a następnie pobierz 0,6 ml za pomocą mikropipety. Przenieś pobrany roztwór do fiolki z próbką znajdującej się na wadze i dodaj do niej 0,4 ml wody destylowanej. Przygotuj również barwnik fluorescencyjny, rozpuszczając 0,02% wagowo barwnika w wodzie dejonizowanej i mieszając roztwór na wirówce laboratoryjnej (vortexie) przez jedną minutę.

Aby przygotować urządzenie z drenem, załóż żeński konektor luer-lock na jeden koniec drenu. Umieść rurkę w strzykawce luer-lock o objętości 3 ml i podziałce 0,1 ml. Umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustaw szybkość podawania na 2 ml/h.

Wymieszaj naczynie z roztworem kulek magnetycznych na wirówce typu vortex przed wprowadzeniem 20 µL do probówki za pomocą pompy strzykawkowej. Po zakończeniu wprowadzania cieczy do komory testowej, pobierz sześć µL powietrza do probówki. Ta objętość powietrza utworzy później zawór pomiędzy dwoma segmentami cieczy.

Po zakończeniu wprowadzania przerwy powietrznej należy pobrać 180 µl cieczy z barwnikiem fluorescencyjnym. Na drugi koniec rurki nałożyć drugi żeński konektor typu lure lock, a następnie wyjąć urządzenie z rurką ze strzykawki. Następnie na obu końcach urządzenia należy umieścić nakrętki lure lock.

Wykonaj wstępny pomiar intensywności fluorescencji w komorze testowej i zbiorniku za pomocą mikroskopu odwróconego. Umieść urządzenie nad magnesem kostkowym w taki sposób, aby wszystkie koraliki magnetyczne zgromadziły się w jednym obszarze komory testowej. Przenieś koraliki do zbiornika, przesuwając urządzenie nad magnesem.

Po przeniesieniu skupiska kulek magnetycznych przez przerwę powietrzną do zbiornika, należy wymieszać kuleczki magnetyczne, umieszczając urządzenie nad magnesem i obracając je, aby uwolnić ciecz uwięzioną w skupisku, aż do pełnej homogenizacji zawartości zbiornika. Następnie należy umieścić urządzenie nad magnesem w taki sposób, aby wszystkie kulki magnetyczne w zbiorniku zgromadziły się w jednym obszarze. Przenieś skupisko kulek magnetycznych z powrotem do komory testowej.

Gdy skupisko dotrze do komory testowej, wymieszaj kulki magnetyczne, umieszczając urządzenie nad magnesem i obracając je. Uwolnij uwięzioną fluorescencyjną ciecz, aż do uzyskania homogenizacji zawartości komory testowej. Wykonaj pomiary intensywności fluorescencji zarówno w komorze testowej, jak i w zbiorniku, używając mikroskopu odwróconego.

Powtarzaj te kroki, aż oba segmenty cieczy osiągną zbliżoną intensywność fluorescencji. Aby przygotować urządzenie z rurką, zamontuj złączy Luer-lock żeńskie na jednym końcu rurki, a następnie umieść rurkę w strzykawce z złączem Luer-lock. Następnie umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustaw szybkość podawania na 2 mL/h.

Za pomocą pompy strzykawkowej wprowadź do probówki 20 µL mieszaniny kulek magnetycznych w wodzie i C 12 E 5 w stosunku 1:1. Po zakończeniu wprowadzania cieczy do komory testowej, wciągnij do probówki 6 µL powietrza w celu utworzenia przerwy powietrznej. Następnie wciągnij 180 µL czystego surfaktantu C 12 E 5 w celu ustawienia optyki.

Najpierw przesuń pompę strzykawkową wraz z urządzeniem rurkowym tak, aby komora testowa z kulkami magnetycznymi znajdowała się w polu widzenia stereomikroskopu, w którym zastosowano polaryzatory krzyżowe. Aby zwiększyć kontrast między wytrąconą fazą stałą a fazą ciekłą, umieść arkusz folii polaryzacyjnej na źródle światła LED. Wsuń źródło światła LED pod rurkę podłączoną do pompy strzykawkowej.

Do obiektywu stereomikroskopu przymocuj taśmą drugą folię polaryzacyjną, upewniając się, że obie folie polaryzacyjne są ustawione względem siebie pod kątem 90 stopni. Umieść magnes kostkowy obok komory testowej, korzystając z podstawki do magnesu. Gdy koraliki magnetyczne utworzą skupisko, rozpocznij pompowanie cieczy do rurki z prędkością przepływu 2 ml/h, tak aby skupisko koralików magnetycznych zostało przemieszczone z komory testowej przez szczelinę powietrzną do komory zbiornika z surfaktantem.

Gdy skupisko kulek magnetycznych osiągnie punkt środkowy komory zbiornika, należy zatrzymać pompowanie w pompie strzykawkowej. Odsuń magnes kostkowy od probówki, aby kulki magnetyczne oddzieliły się, co skróci czas dyfuzji cieczy uwięzionej w skupisku kulek magnetycznych. Po zakończeniu dyfuzji i zmiany fazy cieczy, przyłóż magnes z powrotem w poprzednim miejscu przy zbiorniku, aby kulki magnetyczne ponownie utworzyły skupisko.

Używając pompy strzykawkowej, odciągnij ciecze w taki sposób, aby skupisko kulek magnetycznych zostało przeniesione z zbiornika z surfaktantem przez przerwę powietrzną z powrotem do komory testowej. Po tym, jak skupisko kulek magnetycznych osiągnie środek komory testowej, zatrzymaj pompę strzykawkową i odsuń magnes kostkowy od probówki. Po zakończeniu dyfuzji i zmiany fazy cieczy, umieść magnes z powrotem w poprzednim miejscu przy zbiorniku, aby kulki magnetyczne ponownie utworzyły skupisko.

Powtarzaj te kroki, aż w komorze testowej pojawi się zmiana fazy. Przedstawiony tutaj obraz ukazuje kuleczki magnetyczne w wodzie oraz niejonowy surfaktant C 12 E pięć wewnątrz hydrofobowej rurki. Podczas początkowego procesu przenoszenia kuleczek magnetycznych są one utrzymywane w miejscu za pomocą zewnętrznego magnesu kostkowego.

Podczas gdy ciecze są tutaj pompowane w lewo, kuleczki opuszczają komorę testową i przedostają się do C 12 E 5. Po wprowadzeniu magnetycznych kuleczek woda z surfaktantem zaczyna dyfundować z ich struktury. Po pięciu sekundach przebywania magnetycznych kuleczek w komorze z surfaktantem, w dziesiątej sekundzie obserwowana jest jedynie niewielka zmiana fazy.

Kuleczki magnetyczne są całkowicie otoczone surfaktantem. Zmiana fazy trwa nadal do 92. znacznika w czwartej minucie. Zmiana fazy nasila się w dziewiątej minucie.

Horyzontalna zmiana fazy zaczyna maleć, podczas gdy struktura rośnie w pionie. O ile w 17. minucie obszar zmiany fazy drastycznie się skurczył, o tyle w 25. minucie widoczna pozostaje jedynie niewielka jej część. Przedstawiono tutaj stan początkowy komory testowej water C 12 V five z kulkami magnetycznymi w urządzeniu przed przeniesieniem surfaktantu.

Po sześciu cyklach transferu nastąpiła zmiana fazy. Odwrotnie, przy braku kulek magnetycznych w urządzeniu nie zaobserwowano zmiany fazy, co dowodzi, że uzyskane wyniki wynikały z przeniesienia kulek magnetycznych, a nie z obecności cieczy. Przyleganie do wewnętrznych ścianek rurek podczas próby przeprowadzenia tej procedury.

Przy stosowaniu tej procedury ważne jest zapewnienie odpowiedniej ilości czasu na zajście procesu dyfuzji podczas przenoszenia cieczy między sąsiednimi zbiornikami. W naszym systemie można zaimplementować inne rozwiązania, takie jak wykorzystanie elektromagnesu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące sposobów przyspieszenia procesu podziału oraz minimalizacji manipulacji manualnych. Aby osadzić to w kontekście, ta niezwykle prosta technika, opierająca się w zasadzie na plastikowej rurce, kulkach magnetycznych i zewnętrznym magnesie, została zastosowana do separacji różnych płynów oraz badania przestrzeni ich diagramów fazowych.

Jednakże wszechstronność i prostota tej techniki okażą się przydatne w wielu innych zastosowaniach, przede wszystkim w zakresie analizy diagnostycznej różnych płynów. Wykorzystując kuleczki magnetyczne do transportu małych objętości, bezpośrednio lub poprzez ich funkcjonalizację, możemy analizować składniki próbki płynu. Znajduje to zastosowanie w dowolnych obszarach.

Na przykład separacja i analiza białek z erytrocytów we krwi pełnej, analogicznie w moczu oraz w wielu innych płynach, które można w ten sposób analizować, stosując prostą technikę bez złożoności i kosztów związanych z konwencjonalnym wytwarzaniem urządzeń mikrofluidycznych.