Technika mikroprzepływowego osadzania genipiny do rozszerzonej hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych

Prezentujemy metodę mikroprzepływowego osadzania wzorzystej genipiny i fibronektyny na podłożach PDMS, pozwalając na przedłużoną żywotność tkanek gęstych od komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Ta metoda wytwarzania tkanek jest połączona z poprzednią technologią cienkich warstw naczyń mięśniowych w celu pomiaru kurczliwości naczyń w czasie istotnym dla choroby.

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie modelu in vitro funkcji kurczliwości mięśni gładkich, który można wykorzystać do badania mechanizmów dysfunkcji naczyń krwionośnych, takich jak skurcze naczyń mózgowych w skalach czasowych istotnych dla choroby. Osiąga się to za pomocą długotrwałych cienkich warstw mięśni naczyniowych, najpierw przygotowując podłoża elastomerowe poprzez seryjne wirowanie szkiełek nakrywkowych z paskiem piam, a następnie PDMS. Drugim krokiem jest użycie urządzenia do osadzania mikroprzepływowego w celu seryjnego osadzania geniny i fibronektyny na powierzchni.

W celu dostarczenia wskazówek dotyczących samoorganizacji tkanek na cienkich warstwach naczyniowych, mięśniowych, ostatnim krokiem jest wykonanie testu kurczliwości poprzez przeklinanie naczyniowych, mięśniowych cienkich filmów wywołujących skurcz i rozluźnienie skurczu podczas obrazowania próbki. Ostatecznie dzięki takiemu podejściu uzyskuje się tkanki, które zachowują wierność strukturalną i funkcjonalną kurczliwość przez okres do dwóch tygodni w hodowli. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak cienkie warstwy z nadrukiem mięśniowym z mikrokontaktem, jest to, że integralność tkanek i funkcjonalna kurczliwość są utrzymywane przez tygodnie, podczas gdy tkanki zbudowane przy użyciu poprzednich metod zaczynają ulegać degradacji po trzech do czterech dniach.

W hodowli metoda ta stanowi platformę do badania kluczowych pytań w chorobach naczyniowych, takich jak to, w jaki sposób mechanika funkcjonalna tętnic ulega zmianie podczas postępu choroby przewlekłej. Tutaj badamy mechanikę naczyniową, ale ta metoda może być zastosowana do innych modelowych układów narządów, takich jak technologie chipów narządowych do rekapitulacji, funkcji serca lub mięśni szkieletowych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy chcieliśmy zbadać wolno rozwijające się dysfunkcje naczyń krwionośnych i stwierdziliśmy, że obecne metody albo nie mogą być stosowane do ilościowego określania funkcji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, albo nie zachowują integralności przez wystarczający okres czasu.

Osadzanie mikroprzepływowe Jin zapewnia szablon samoorganizacji komórek w sposób podobny do drukowania mikrokontaktowego, ale także pozwala tkankom wzorcowym zachować swoją strukturę i integralność w skalach czasowych odpowiednich do badania przebudowy naczyń. Aby rozpocząć czyszczenie partii szklanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 25 milimetrów, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym, zakryj krawędzie oczyszczonych szkiełek nakrywkowych, umieszczając taśmę klejącą po ich bokach, pozostawiając odsłonięty pasek szkła pośrodku. Następnie odetnij szkiełka pokrywy od naczynia i umieść je pojedynczo na wirującym uchwycie.

Za pomocą kleszczy dodaj 150 mikrolitrów 10% roztworu profilu poli N ipop. Akrylamid zwany również poly pam lub Piam rozpuszczony w jednym butanolu. Upewnij się, że całkowicie zakryłeś odsłonięty obszar szkiełka nakrywkowego.

Następnie włącz wirowanie i zwiększ prędkość na 10 sekund do 3000 obr./min. Poczekaj pięć sekund, a następnie zwiększ na 10 sekund do 6 000 obr./min. Poczekaj na 6 000 obr./min przez minutę, a następnie zmniejsz z powrotem do 3000 obr./min w ciągu 10 sekund.

Przytrzymaj go tam przez pięć sekund przed zakończeniem cyklu wirowania. Po wyschnięciu ostrożnie usuń taśmę samoprzylepną ze wszystkich szkiełek nakrywkowych, pozostawiając całe szkiełko nakrywkowe odsłonięte z cienką warstwą powłoki piam pośrodku szklanego szkiełka nakrywkowego. Następnie wirowanie pokrywa warstwę Degas PDMS na każdej okładce.

Wsuwamy je i utwardzamy w piekarniku w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez co najmniej 1,5 godziny. Zaprojektuj tkankową mikroprzepływową fotomaskę, a następnie przygotuj wzór płytki krzemowej zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Po uformowaniu wafla zjedz przy użyciu standardowych technik i umieść go stroną do góry na szalce Petriego.

Następnie wymieszaj i DGA 100 gramów PDMS Przy stosunku sieciowania opartym na 10 do jednego, wciągnij PDMS do naczynia całkowicie i równomiernie pokrywając wzorzystą płytkę. Umieść naczynie w suszarce próżniowej, wysuszaj na około 30 minut, aż wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte. Następnie utwardź PDMS w naczyniu w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez co najmniej 1,5 godziny.

Po utwardzeniu odetnij nadmiar PDMS i powoli oderwij pozostałą wzorzystą PDMS od strony wzoru płytki. Odetnij nadmiar PDMS z okolic wzorów za pomocą żyletki i uformuj urządzenia w prostokąty, aby ułatwić usunięcie urządzenia w późniejszych krokach. Następnie użyj jednomilimetrowego stempla do biopsji chirurgicznej, aby uformować zarówno otwory wlotowe, jak i wylotowe.

Sonikuj urządzenia mikroprzepływowe w 70% etanolu przez co najmniej 30 minut przed każdym użyciem. Umieść do 10 naczyniowych, muskularnych, cienkowarstwowych szkiełek nakrywkowych podłoża w urządzeniu do czyszczenia ozonem ultrafioletowym na osiem minut. Następnie przygotuj roztwór geniny o stężeniu pięciu miligramów na mililitr, dodając jeden mililitr sterylnej podwójnie destylowanej wody do pięciomiligramowego pojemnika liofilizowanej geniny.

Wymieszać roztwór za pomocą mieszalnika wirowego i odstawić fiolkę w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut. Umieść oczyszczone urządzenia mikroprzepływowe stroną z funkcją do dołu na każdej pokrywie. Poślizgnij się pojedynczo.

Mocno dociśnij urządzenia, aby zapewnić szczelne uszczelnienie szkiełek nakrywkowych pokrytych PDMS. Szybko umieść kroplę 70% etanolu na wlocie każdego urządzenia w celu zalania urządzenia. Po pięciu do 10 minutach ostrożnie odessać nadmiar etanolu na wlocie i natychmiast zastąpić go około 100 mikrolitrami PBS.

Użyj próżni, aby przeciągnąć PBS do wylotu urządzeń, aby wypłukać etanol. Zatrzymaj się, gdy na wlocie pozostanie tylko niewielka ilość PBS. Następnie umieść 60 mikrolitrów roztworu geniny o stężeniu pięciu miligramów na mililitr na każdym wlocie, przeciągnij roztwór geniny przez urządzenia, zastępując końcówkę aspiratora próżniowego na wylocie.

Zatrzymaj ssanie, gdy na wlocie pozostanie tylko niewielka ilość roztworu. Następnie umieść krople PBS zarówno na wlocie, jak i wylocie, aby zapobiec wysychaniu roztworu. Podczas inkubacji przenieś naczynie zawierające urządzenia do nawilżonego piekarnika lub inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez cztery godziny.

Podczas inkubacji zawiesić fibronektynę do stężenia 50 mikrogramów na mililitr w sterylnej podwójnie destylowanej wodzie i umieścić ją na lodzie na co najmniej 30 minut po inkubacji z Jin. Przeciągnąć lub tylko minimalną ilość PBS na wlocie. Następne miejsce, 100 mikrolitrów 50 mikrogramów na mililitr roztworu fibronektyny.

Na każdym wlocie przeciągnij roztwór przez urządzenia za pomocą końcówki aspiratora próżniowego. Na wylocie przenieś odkryte naczynie zawierające urządzenia do piekarnika lub inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez 24 godziny. Po inkubacji ostrożnie wyjmij wyroby z szkiełek nakrywkowych, powoli odrywając urządzenie w rogu, jednocześnie lekko chwytając szkiełko nakrywkowe w przeciwnej ręce, umieść szkiełka nakrywkowe w sterylnych naczyniach z sześcioma dołkami.

Dodaj co najmniej pięć mililitrów roztworu streptomycyny penicyliny do każdej studzienki, a następnie umieść naczynia w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut. Po sterylizacji odessać roztwór streptomycyny penicyliny i wysiać szkiełka nakrywkowe hodowanymi ludzkimi komórkami mięśni gładkich naczyń krwionośnych tętnicy pępowinowej w stężeniu 80 000 komórek na centymetr kwadratowy. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej 24 godziny przed badaniem.

Aby rozpocząć badanie, umieść próbkę tkanki w 100-milimetrowym naczyniu. Dodać sterylny, wstępnie ciepły roztwór tyro o pH 7,4, aby przykryć próbkę. Za pomocą żyletki wykonuje się kilka równoległych nacięć w arkuszu komórek prostopadle do krawędzi ramienia rury.

Wykonuj cięcia, które dają szersze odcinki tkanki o grubości około dwóch milimetrów. Będą to cienkie warstwy naczyń krwionośnych na przemian z cienkimi paskami, które zostaną później usunięte. Następnie obróć naczynie o 90 stopni i wykonaj dwa proste równoległe nacięcia w środku tkanki równolegle do paska piam.

Usuń cienkie paski pomiędzy cienkimi warstwami naczyniowymi, mięśniowymi, aby zapobiec kontaktowi sąsiednich folii. Następnie umieść szalkę na platformie o kontrolowanej temperaturze na stoliku mikroskopu stereoskopowego i zacznij rejestrować obrazy poklatkowe, transmitowane i fluorescencyjne w pożądanych odstępach czasu podczas całego testu leczenia. Seryjnie traktuj cienkie warstwy mięśni naczyniowych 50 nanomolami śródbłonka, jeden przez 20 minut, aby wywołać skurcze, a następnie 100 mikromolów HA 10 77 przez 30 minut, aby wywołać relaksację po schłodzeniu do poniżej 32 stopni Celsjusza.

Piam rozpuszcza się, uwalniając cienkie warstwy naczyń krwionośnych. Pomiar długości projekcji można przeliczyć na promień krzywizny, służy do obliczenia średniego naprężenia w warstwie komórki na pokazanej tutaj folii na sekwencyjnych obrazach światła przechodzącego reprezentatywnego testu kurczliwości. Obrazy te można przekształcić w wartości naprężeń, na podstawie których obliczany jest ton podstawowy i kurczliwość indukowana.

Na tym filmie pokazany jest reprezentatywny upływ czasu pełnego testu kurczliwości. Cienkie warstwy mięśni osiągają równowagę skurczową, a następnie kurczą się dalej po dodaniu 50 nyla molowego śródbłonka. Jeden film rozluźnia się po dodaniu 100 mikromolowców ha 10 77.

Niewielki spadek tonu podstawowego i kurczliwości tkanek pod koniec testu jest prawdopodobnie bezpośrednim wynikiem zmniejszonej liczby komórek tworzących tkankę. Ponieważ komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych pozbawione surowicy nie namnażają się, pokazano tutaj obrazy kontrastu fazowego komórek mięśni gładkich wyhodowanych na powierzchniach zmodyfikowanych geninami w różnych punktach czasowych poświęcenia, od jednego dnia do dwóch tygodni. Zastosowano tutaj immunohistochemię, aby podkreślić zbieg i wyrównanie komórkowe tkanek poprzez barwienie włókien aktyny F na zielono po jednym, czterech i siedmiu dniach głodu surowicy.

Ilościowa ocena zbiegu tkanek w tym zakresie czasu wykazała minimalne pogorszenie na tych powierzchniach. Wyrównanie włókien f aktyny zostało określone ilościowo i potwierdzono, że wyrównanie zostało utrzymane przez dwa tygodnie. W hodowli, Po opanowaniu tej techniki wytwarzania tkanek in vitro można wykonać w ciągu dwóch dni.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby rozpocząć osadzanie mikroprzepływowe na dzień przed przewidywanym wysiewem komórek i utrzymywać stałą temperaturę fizjologiczną podczas eksperymentów z folią żeberkową. Zgodnie z tą procedurą, tradycyjne metody biochemiczne, takie jak Western blotting i PCR, mogą być wykonywane w celu zbadania zmian w ekspresji białek i genów w celu skorelowania fenotypu komórki z zachowaniem funkcjonalnym. Technika ta toruje naukowcom drogę do badania progresji wolno rozwijających się dysfunkcji naczyniowych, takich jak skurcz naczyń mózgowych, nadciśnienie i miażdżyca, a także modeli in vitro ludzkiej ściany tętnicy.