Name: Technika mikroprzepływowego osadzania genipiny do rozszerzonej hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Poznaj mikroprzepływową depozycję genipiny do hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych. Ta metoda umożliwia utrzymanie kontraktylności tkanek naczyniowych do dwóch tygodni w kulturze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe od American Heart Association Scientist Development Grant, 13SDG14670062 (PWA) oraz University of Minnesota Doctoral Dissertation Fellowship (ESH). Doceniamy również zasoby mikrofabrykacji Minnesota Nano Center (MNC) oraz zasoby przetwarzania obrazu University Imaging Center (UIC), oba na University of Minnesota. Część tych prac została przeprowadzona w Characterization Facility, University of Minnesota, który otrzymuje częściowe wsparcie od NSF w ramach programu MRS.

<ol><li>Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemomechanics+of+cerebral+vasospasm+and+its+resolution%3A+I.+A+new+hypothesis+and+theoretical+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework.</a> Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).</li>
<li>Hald, E. S., Alford, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+phenotype+switching+in+blast+traumatic+brain+injury-induced+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm.</a> Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).</li>
<li>Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometry+of+medial+hypertrophy+in+the+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta.</a> Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).</li>
<li>, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-241 (2000).</li>
<li>Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biohybrid+thin+films+for+measuring+contractility+in+engineered+cardiovascular+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle.</a> Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).</li>
<li>Rhodin, J. A. G. Architecture of the vessel wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRhodin%2C+JAG+%22Physiol.+Rev%22">Physiol. Rev</a>. ed, B. erne,R. ., , American Physiology Society. (1979).</li>
<li>Balachandran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+induces+dual-mode+endothelial-mesenchymal+transformation+of+the+cardiac+valve%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).</li>
<li>Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembles+of+engineered+cardiac+tissues+for+physiological+and+pharmacological+study%3A+heart+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip.</a> 11, 4165-4173 (2011).</li>
<li>Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+contractility+depends+on+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).</li>
<li>Win, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+architecture+within+cell-dense+vascular+tissues+influences+functional+contractility%29%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility).</a> Integr. Biol. (Camb). , (2014).</li>
<li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio%2Fnon-bio+interfaces%3A+a+straightforward+method+for+obtaining+long+term+PDMS%2Fmuscle+cell+biohybrid+constructs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+B%22%5BJournal%5D)">Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs).</a> Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).</li>
<li>Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-+and+time-dependent+effects+of+genipin+crosslinking+on+cell+viability+and+tissue+mechanics+-+Toward+clinical+application+for+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics - Toward clinical application for tendon repair.</a> Acta Biomater. , (2013).</li>
<li>Lima, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genipin+enhances+the+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage+and+protects+against+inflammatory+degradation+when+used+as+a+medium+supplement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).</li>
<li>Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadhavan%2C+K+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22">J. Biomed. Mater. Res. A</a>. , (2011).</li>
<li>Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSatyam%2C+A+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22">J. Tissue Eng. Regen. Med</a>. , (2012).</li>
<li>Alford, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast-induced+phenotypic+switching+in+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).</li>
<li>Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+system+for+controlling+reaction+networks+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A microfluidic system for controlling reaction networks in time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+vascular+contractility+assay+using+genipin-modified+muscular+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films.</a> Biofabrication. 6, 045005(2014).</li>
<li>Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+deprivation+results+in+redifferentiation+of+human+umbilical+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).</li>
<li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+thin+films+for+building+actuators+and+powering+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Muscular thin films for building actuators and powering devices.</a> Science. 317, 1366-1370 (2007).</li>
<li>Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+ordering+of+dense+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Biomechanical ordering of dense cell populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).</li>
<li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+remodeling+in+hypertension%3A+roles+of+apoptosis%2C+inflammation%2C+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis.</a> Hypertension. 38, 581-587 (2001).</li>
<li>Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+aneurysms+and+variations+in+the+circle+of+Willis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis.</a> Stroke. 15, 846-850 (1984).</li>
<li>McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolded+gelatin+hydrogels+for+extended+culture+of+engineered+cardiac+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues.</a> Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).</li>
<li>Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+vasospasm+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Time course of vasospasm in man.</a> 48, 173-178 (1978).</li>
<li>McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+maladaptive%2C+multiscale+remodeling+of+failing+myocardium+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).</li>
<li>Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+physiological+biomimicry%3A+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips.</a> Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).</li>
<li>Meer, A. D., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips%3A+breaking+the+in+vitro+impasse%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse.</a> Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy protokół, który opiera się na wcześniej opracowanej technologii vMTF, umożliwiając wydłużenie czasu eksperymentu, bardziej typowego dla szlaków przewlekłych chorób naczyniowych1,23,24. Aby to osiągnąć, opracowaliśmy mikrowzór genipiny, który, jak wykazano wcześniej, zapewnia długoterminową funkcjonalizację substratów PDMS11, wykorzystując technikę osadzania mikroprzepływowego w celu uzyskania zmodyfikowanych blaszek tętniczych o ulepszonej żywotności tkanki naczyniowej do...

Choroby naczyniowe, takie jak skurcz naczyń mózgowych1,2, nadciśnienie3 i miażdżyca4, rozwijają się powoli, są zazwyczaj przewlekłe i wiążą się z dysfunkcyjnym wytwarzaniem siły przez komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC). Naszym celem jest zbadanie tych wolno postępujących dysfunkcji naczyniowych przy użyciu metod in vitro z dokładniejszą kontrolą warunków eksperymentalnych niż modele in vivo. Wcześniej opracowaliśmy cienkie warstwy mięśni naczyniowych (vMTF) do pomiaru funkcjonalnej kurczliwości tkanek sercowo-naczyniowych zmodyfikowanych in vitro 5, ale ta metoda została ograniczona do stosunkowo krótkoterminowych badań. W tym miejscu przedstawiamy technikę modyfikacji podłoża, która rozszerza naszą dotychczasową technikę vMTF do pomiarów długoterminowych.
Chociaż śródbłonek jest również krytyczny dla ogólnej funkcji naczyń krwionośnych, zmodyfikowane blaszki tętnicze dostarczają użytecznego systemu modelowego do oceny zmian w kurczliwości naczyń podczas postępu choroby. Aby zaprojektować funkcjonalny model tkanki choroby naczyniowej, zarówno struktura, jak i funkcja blaszki tętniczej, podstawowej jednostki kurczliwej naczynia, muszą zostać odtworzone z dużą dokładnością. Blaszki tętnicze to koncentryczne, wyrównane obwodowo arkusze kurczliwych VSMC oddzielone arkuszami elastyny6. Mikrokontaktowe drukowanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na podłożach polidimetylosiloksanu (PDMS) było wcześniej wykorzystywane do dostarczania wskazówek dotyczących organizacji tkanek w celu naśladowania wyrównanej tkanki sercowo-naczyniowej5,7-10. Jednak tkanki wzorzyste za pomocą druku mikrokontaktowego mogą stracić integralność po 3-4 dniach w hodowli, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach przewlekłych. Protokół ten zapewnia rozwiązanie tego problemu poprzez zastąpienie poprzednich technik druku mikrokontaktowego nową techniką osadzania mikroprzepływowego.
Genchi et al. zmodyfikowali substraty PDMS za pomocą genipiny i stwierdzili przedłużoną żywotność miocytów do jednego miesiąca w hodowli11. Tutaj stosujemy podobne podejście do rozszerzenia hodowli wzorzystych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych na PDMS. Genipina, naturalna hydrolityczna pochodna owocu gardenii, jest pożądanym kandydatem do modyfikacji substratu ze względu na jej stosunkowo niską toksyczność w porównaniu z podobnymi środkami sieciującymi i jej rosnące zastosowanie jako biomateriał w dziedzinie naprawy tkanek12,13 i modyfikacji ECM14,15. W tym protokole fibronektyna jest wykorzystywana jako wskazówka naprowadzająca na komórkę, podobnie jak w poprzednich metodach drukowania mikrokontaktowego; jednak genipin jest osadzany na substratach PDMS przed modelowaniem fibronektyny. W ten sposób, gdy komórki degradują wzorzystą matrycę, nowo zsyntetyzowany ECM z przyłączonych VSMC może wiązać się z substratem PDMS pokrytym genipiną.
Ten protokół wykorzystuje urządzenie do mikroprzepływowego dostarczania do dwuetapowego osadzania genipiny i ECM. Konstrukcja urządzenia mikroprzepływowego naśladuje wzorce drukowania mikrokontaktowego stosowane w projektowanych blaszkach tętniczych we wcześniejszych badaniach16. W związku z tym spodziewamy się, że ten protokół da naśladownictwo blaszek tętniczych, które z powodzeniem rekapitulują wysoce wyrównaną strukturę in vivo i funkcję skurczową blaszek tętniczych. Oceniamy również kurczliwość tkanek, aby potwierdzić, że genipin jest odpowiednim związkiem modyfikującym substrat dla długoterminowych modeli chorób naczyniowych in vitro.

<table><tbody><tr><td>Stojak do barwienia szkiełek nakrywkowych</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com/</a></td><td>72239-04</td></tr><tr><td>Szkło pokrywowe mikroskopu - 25 mm</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com</a></td><td>12-545-102</td></tr><tr><td>Poli(N-izopropylokrylakamid) (PIPAAm)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>#21458</td></tr><tr><td>1-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>360465</td></tr><tr><td>Spincoater</td><td>Specialty Coating Systems, Inc.</td><td><a href="http://www.scscoatings.com/">www.scscoatings.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Kleje Ellsworth (Dow Corning)</td><td><a href="http://www.ellsworth.com/">www.ellsworth.com</a></td><td>184 ZESTAW SIL ELAST 0,5 KG</td></tr><tr><td>Mikrogranulki fluorescencyjne</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>17151</td></tr><tr><td>Wafle krzemowe</td><td>Wafer World, Inc.</td><td><a href="http://www.waferworld.com/">www.waferworld.com</a></td><td>2398</td></tr><tr><td>Fotorezystor&nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Nakładka do masek kontaktowych</td><td>Suss MicroTec</td><td><a href="http://www.suss.com/">www.suss.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Deweloper</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Tridecafluro-trichlorosilan</td><td>UCT Specialties, Inc.</td><td><a href="http://www.unitedchem.com/">www.unitedchem.com</a></td><td>T2492</td></tr><tr><td>Stempel do biopsji chirurgicznej</td><td>Integra LifeSciences Corp.</td><td><a href="http://www.miltex.com/">www.miltex.com</a></td><td>33-31AA-P/25</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Cayman Chemical</td><td><a href="http://www.caymanchem.com/">www.caymanchem.com</a></td><td>10010622</td></tr><tr><td>1X sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Mediatech, Inc.</td><td><a href="http://www.cellgro.com/">www.cellgro.com</a></td><td>21-031-CV</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Corning, Inc.</td><td><a href="http://www.corning.com/">www.corning.com</a></td><td>356008</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Life Technologies, Inc.</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">www.lifetechnologies.com</a></td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Komórki mięśni gładkich tętnicy pępowinkowej</td><td>Lonza</td><td><a href="http://www.lonza.com/">www.lonza.com</a></td><td>CC-2579</td></tr><tr><td>Składniki roztworu Tyrode'a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>różne</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td><td>4350020000000000</td></tr><tr><td>Platforma z kontrolowaną temperaturą</td><td>Warner Instruments</td><td><a href="http://www.warneronline.com/">www.warneronline.com</a></td><td>641659; 640352; 641922</td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>E7764-50UG</td></tr><tr><td>HA-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>H139-10MG</td></tr></tbody></table>

technika mikroprzepływowego osadzania genipiny do rozszerzonej hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

Przewlekła natura postępu choroby naczyniowej wymaga opracowania technik eksperymentalnych, które symulują fizjologiczne i patologiczne zachowania naczyń krwionośnych w skalach czasowych istotnych dla choroby. Wcześniej druk mikrokontaktowy był używany do wytwarzania dwuwymiarowych funkcjonalnych mimik tętnic poprzez tworzenie wzorów białka macierzy zewnątrzkomórkowej jako wskazówek dotyczących organizacji tkanek. Cienkie filmy mięśni naczyniowych wykorzystywały te mimiki do oceny funkcjonalnej kurczliwości. Jednak stosowana technika wytwarzania druku mikrokontaktowego zazwyczaj obejmuje hydrofobowe podłoża PDMS. Gdy tkanka przewraca się przez leżącą poniżej macierz zewnątrzkomórkową, nowe białka muszą przejść zmianę konformacyjną lub denaturację, aby wystawić hydrofobowe reszty aminokwasowe na hydrofobowe powierzchnie PDMS w celu przyłączenia, co powoduje zmienioną bioaktywność białka macierzy, delaminację i śmierć tkanek.
Tutaj prezentujemy technikę osadzania mikroprzepływowego do tworzenia wzorów genipiny związku sieciującego. Genipin służy jako pośrednik między tkankami wzorzystymi a substratami PDMS, umożliwiając komórkom zdeponowanie nowo zsyntetyzowanego białka macierzy zewnątrzkomórkowej na bardziej hydrofilowej powierzchni i pozostanie przyłączonym do substratów PDMS. Pokazujemy również, że białka macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane bezpośrednio na zdeponowanej genipinie, co pozwala na dyktowanie zmodyfikowanej struktury tkanki. Tkanki wytworzone tą techniką wykazują wysoką wierność zarówno w wyrównaniu strukturalnym, jak i funkcji skurczowej tkanki mięśni gładkich naczyń krwionośnych w modelu cienkowarstwowym mięśni naczyniowych. Technika ta może zostać rozszerzona o inne typy komórek i stanowi ramy dla przyszłych badań nad przewlekłą funkcjonalnością na poziomie tkanek i narządów.

Głównym celem niniejszej pracy było przedłużenie żywotności mikrostrukturalnych VSMCs na hydrofobowych podłożach z PDMS. Osiągnięto to poprzez zastosowanie mikrofluidycznego systemu dostarczania w celu osadzenia wzorowanej genipiny i fibronektyny na PDMS (Rycina 1). Osadzanie białek ECM przy użyciu dostarczania mikrofluidycznego pozwoliło na wierny transfer wzoru kanałów z obszarami czystego PDMS pomiędzy liniami genipiny i fibronektyny (Rycina 1D). Przytwierdzone komórki (Rycina...

Prezentujemy metodę mikroprzepływowego osadzania wzorzystej genipiny i fibronektyny na podłożach PDMS, pozwalając na przedłużoną żywotność tkanek gęstych od komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Ta metoda wytwarzania tkanek jest połączona z poprzednią technologią cienkich warstw naczyń mięśniowych w celu pomiaru kurczliwości naczyń w czasie istotnym dla choroby.

Technika mikroprzepływowego osadzania genipiny do rozszerzonej hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie modelu in vitro funkcji skurczowej mięśni gładkich, który może być wykorzystywany do badania mechanizmów dysfunkcji naczyniowych, takich jak skurcze naczyniowe mózgu, w skalach czasowych istotnych dla przebiegu choroby. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez stworzenie długoterminowych cienkich warstw mięśni naczyniowych, polegających najpierw na przygotowaniu podłoży elastomerowych poprzez seryjne nanoszenie metodą spin coatingu na szkiełka nakrywkowe paska piam, a następnie PDMS. Drugim krokiem jest wykorzystanie urządzenia do mikrofluidycznego osadzania w celu seryjnego naniesienia żelatyny i fibronektyny na powierzchnię.Aby zapewnić sygnały kierunkowe dla samoorganizacji tkanek na cienkich warstwach mięśniowo-naczyniowych, ostatnim krokiem jest przeprowadzenie testu kurczliwości poprzez indukowanie skurczu i rozkurczu cienkich warstw mięśniowo-naczyniowych podczas obrazowania próbki. Ostatecznie podejście to pozwala na uzyskanie tkanek, które zachowują wierność strukturalną i funkcjonalną kurczliwość do dwóch tygodni w hodowli. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikrodruk kontaktowy cienkich warstw mięśniowych, jest to, że integralność tkanki i funkcjonalna kurczliwość są utrzymywane przez tygodnie, podczas gdy tkanki wytworzone za pomocą poprzednich metod zaczynają ulegać degradacji po trzech lub czterech dniach.W hodowli metoda ta stanowi platformę do badania kluczowych kwestii dotyczących chorób naczyniowych, takich jak zmiany w mechanice funkcjonalnej tętnic podczas progresji choroby przewlekłej. W niniejszej pracy badamy mechanikę naczyniową, jednak metodę tę można zastosować w innych modelowych systemach narządowych, takich jak technologie organ-on-a-chip do odwzorowania funkcji mięśnia sercowego lub szkieletowego. Pomysł na opracowanie tej metody pojawił się, gdy dążyliśmy do zbadania wolno rozwijających się dysfunkcji naczyniowych i stwierdziliśmy, że istniejące metody albo nie pozwalają na ilościową ocenę funkcji komórek mięśni gładkich naczyń, albo nie zapewniają wystarczającej stabilności strukturalnej przez odpowiednio długi czas.Osadzanie mikrofluidyczne Jin zapewnia szablon dla samoorganizacji komórek w sposób podobny do mikrodruku kontaktowego, a jednocześnie pozwala tkance ułożonej w wzory zachować strukturę i integralność przez okresy czasu odpowiednie do badania przebudowy naczyniowej. Aby rozpocząć, należy oczyścić partię szkiełek nakrywkowych o średnicy 25 mm zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym; krawędzie oczyszczonych szkiełek nakrywkowych należy zabezpieczyć, naklejając taśmę klejącą po ich bokach, pozostawiając odsłonięty pasek szkła w centrum. Następnie należy wyciąć szkiełka nakrywkowe z naczynia i umieszczać je pojedynczo na uchwycie do powlekania wirowego.Za pomocą pęsety nanieś 150 µL 10% roztworu poli(N-izopropylakrylamidu), zwanego również poly PAM lub Piam, rozpuszczonego w 1-butanolu. Należy upewnić się, że odsłonięty obszar szkiełka nakrywnego został całkowicie przykryty.Następnie włącz pokrywacz wirujący i zwiększaj prędkość przez 10 s do 3000 RPM. Odczekaj pięć sekund, a następnie zwiększaj prędkość przez 10 s do 6, 000 RPM. Utrzymaj prędkość 6, 000 RPM przez jedną minutę, a następnie w ciągu 10 s zmniejsz ją z powrotem do 3000 RPM.Wytrzymać w tej pozycji przez pięć sekund przed zakończeniem cyklu powlekania wirowego. Po wyschnięciu ostrożnie usunąć taśmę klejącą ze wszystkich szkiełek cover slip, pozostawiając odsłonięte całe szkiełko z cienką warstwą powłoki piam w centrum szklanego szkiełka cover slip. Następnie na każde szkiełko nanosi się metodą powlekania wirowego warstwę odgazowanego PDMS.Wsuń je i utwardź w piecu w temperaturze 90 °C przez co najmniej 1,5 godziny. Zaprojektuj fotomaskę mikroprzepływową do tkanek, a następnie przygotuj wzorowany wafer krzemowy zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Po nadaniu wzoru poddaj wafer trawieniu przy użyciu standardowych technik i umieść go stroną z elementami do góry w szalce Petriego.Następnie wymieszaj 100 g PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1, wlej PDMS do szalki, całkowicie i równomiernie pokrywając wzorowany wafer. Umieść szalkę w eksykatorze próżniowym na około 30 minut, aż do usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza. Następnie utwardź PDMS w szalce w temperaturze 90 °C przez co najmniej 1,5 godziny.Po utwardzeniu odetnij nadmiar PDMS i powoli odklej pozostałą ustrukturyzowaną warstwę PDMS od strony wzoru na waflu. Za pomocą żyletki odetnij nadmiar PDMS wokół wzorów i nadaj urządzeniom kształt prostokątów, aby ułatwić ich usuwanie w późniejszych etapach. Następnie użyj jednofilowego chirurgicznego wycinaka do biopsji, aby utworzyć otwory wlotowe i wylotowe.Przed każdym użyciem urządzenia mikroprzepływowe należy poddać sonikacji w 70% etanolu przez co najmniej 30 minut. Do oczyszczacza ozonowego UV należy włożyć do 10 szkiełek nakrywkowych z podłożem z cienkiej warstwy mięśni naczyniowych na osiem minut. Następnie należy przygotować roztwór geniny o stężeniu 5 mg/mL, dodając 1 mL sterylnej wody dwukrotnie destylowanej do pojemnika zawierającego 5 mg liofilizowanej geniny.Wymieszaj roztwór za pomocą mieszadła vortex i odstaw fiolkę w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut. Umieść oczyszczone urządzenia mikroprzepływowe stroną z funkcjami skierowaną w dół na każdą pokrywkę. Wsuwaj je pojedynczo.Mocno dociśnij urządzenia, aby zapewnić szczelne przyleganie do szkiełek podstawowych pokrytych PDMS. W celu przygotowania urządzeń szybko nanieś kroplę 70% etanolu na wlot każdego z nich. Po pięciu do 10 minut uważnie odessij nadmiar etanolu z wlotu i natychmiast zastąp go około 100 µL PBS.Użyj podciśnienia, aby przepłukać urządzenia PBS przez wylot w celu usunięcia etanolu. Przerwij proces, gdy na wlocie pozostanie tylko niewielka ilość PBS. Następnie nanieś 60 µL roztworu geniny o stężeniu 5 mg/mL na każdy wlot i przeciągnij roztwór geniny przez urządzenia, stosując końcówkę aspiratora próżniowego na wylocie.Zatrzymaj ssanie, gdy przy wlocie pozostanie tylko niewielka ilość roztworu. Następnie nanieś krople PBS zarówno do wlotu, jak i wylotu, aby zapobiec wysychaniu roztworu. Podczas inkubacji przenieśy szalkę z urządzeniami do wilgotnej komory lub inkubatora ustawionego na 37 °C i inkubuj przez cztery godziny.W czasie inkubacji resuspendTime fibonektynę do stężenia 50 µg/mL w sterylnej wodzie dwukrotnie destylowanej i pozostaw ją w lodzie przez co najmniej 30 minut po inkubacji z Jin. Przepłucz wlot minimalną ilością PBS. Następnie nanieś 100 µL roztworu fibonektyny o stężeniu 50 µg/mL.Przy każdym wlocie należy zassać roztwór przez urządzenia, używając końcówki aspiratora próżniowego. Na wylocie należy przenieść nieprzykrytą szalkę zawierającą urządzenia do piekarnika lub inkubatora ustawionego na 37 °C i inkubować przez 24 godziny. Po inkubacji należy ostrożnie oddzielić urządzenia od szkiełek podstawowych, powoli odklejając urządzenie w jednym z narożników, jednocześnie lekko trzymając szkiełko podstawowe drugą ręką, a następnie umieścić szkiełka podstawowe w sterylnych płytkach 6-dołkowych.Do każdego dołka dodaj co najmniej 5 ml roztworu penicyliny i streptomycyny, a następnie umieść płytki w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C na co najmniej 30 minut. Po sterylizacji odessaj roztwór penicyliny i streptomycyny i zasiaj na szkiełkach nakrywkowych hodowlane ludzkie komórki mięśni gładkich tętnicy pępkowej w stężeniu 80 000 komórek na cm². Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 24 godziny przed przeprowadzeniem testów.Aby rozpocząć badanie, umieść próbkę tkanki w szalce o średnicy 100 mm. Dodaj sterylalny, uprzednio ogrzany roztwór tyro o pH 7.4, aby pokryć próbkę. Za pomocą żyletki wykonaj kilka równoległych nacięć w warstwie komórek, prostopadle do krawędzi ramienia rurki.Wykonaj cięcia tak, aby uzyskać szersze sekcje tkanki o grubości około dwóch milimetrów. Będą one stanowiły naczyniowo-mięśniowe cienkie warstwy, przeplatane cienkimi paskami, które zostaną usunięte w późniejszym etapie. Następnie obróć naczynie o 90 stopni i wykonaj dwa proste równoległe cięcia w środkowej części tkanki, równolegle do paska opony miękkiej.Usuń wąskie paski znajdujące się pomiędzy naczyniowymi, mięśniowymi i cienkimi błonami, aby zapobiec kontaktowi sąsiednich błon. Następnie umieść naczynie na platformie z kontrolą temperatury na stole mikroskopu stereoskopowego i rozpocznij rejestrację obrazów w trybie time-lapse, w świetle przechodzącym oraz fluorescencyjnym w pożądanych odstępach czasu podczas całego procesu badania. Poddawaj naczyniowe mięśniowe cienkie błony sekwencyjnej obróbce: najpierw 50 nanomolar endothelium, one przez 20 minut w celu wywołania skurczów, a następnie 100 micromolar HA 10 77 przez 30 minut w celu wywołania rozkurczu po ochłodzeniu poniżej 32 °C.Opona miękka rozpuszcza się, uwalniając cienkie warstwy mięśni naczyniowych. Pomiar długości rzutu można przeliczyć na promień krzywizny, który służy do obliczenia średniego naprężenia w warstwie komórek na filmie, przedstawionym tutaj na sekwencyjnych obrazach w świetle przechodzącym z reprezentatywnego testu kurczliwości. Obrazy te można przekształcić w wartości naprężeń, z których oblicza się tonus podstawowy oraz indukowaną kurczliwość.W tym filmie przedstawiono reprezentatywny zapis poklatkowy pełnego testu kurczliwości. Cienkie warstwy mięśniowe osiągają równowagę kurczową, a następnie kurczą się bardziej po dodaniu 50 nM endoteliny. Jedna z warstw rozkurcza się po dodaniu 100 µM ha 10 77.Lekki spadek napięcia podstawowego i kurczliwości tkanek pod koniec analizy jest prawdopodobnie bezpośrednim wynikiem zmniejszonej liczby komórek tworzących tkankę. Ponieważ komórki mięśni gładkich naczyń poddane głodzeniu surowiczemu nie proliferują, przedstawiono tutaj obrazy w kontraście fazowym komórek mięśni gładkich hodowanych na powierzchniach modyfikowanych geniną w różnych punktach czasowych uboju, od jednego dnia do dwóch tygodni. Zastosowano tutaj immunohistochemię w celu podkreślenia konfluencji i ustawienia komórkowego tkanek poprzez barwienie filamentów aktyny F na kolor zielony po jednym, czterech i siedmiu dniach głodzenia surowiczego.Ilościowa ocena konfluencji tkanki w tym zakresie czasowym wykazała minimalne pogorszenie na tych powierzchniach. Ilościowo określono orientację filamentów aktyny F i potwierdzono, że została ona zachowana przez okres dwóch tygodni. W warunkach hodowli, po opanowaniu tej techniki, wytwarzanie tkanki in vitro może zostać zrealizowane w ciągu dwóch dni.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o rozpoczęciu mikroprzepływowego osadzania na dzień przed planowanym wysiewem komórek oraz o utrzymywaniu stałej temperatury fizjologicznej podczas eksperymentów z błoną cienką. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić tradycyjne metody biochemiczne, takie jak Western blotting i PCR, aby zbadać zmiany w ekspresji białek i genów w celu skorelowania fenotypu komórek z ich zachowaniem funkcjonalnym. Technika ta otwiera przed badaczami drogę do analizy postępu powolnie rozwijających się dysfunkcji naczyniowych, takich jak skurcz naczyń mózgowych, nadciśnienie tętnicze i miażdżyca, a także do tworzenia modeli in vitro ludzkiej ściany tętnicy.

microfluidic-genipin-deposition-technique-for-extended-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Platforma mikrokanałów na chipie została opracowana przez połączenie techniki fotorezystu fotolitografii rozpływowej, miękkiej litografii i mikrofluidyki. Platforma mikrokanalizacyjna naśladuje trójwymiarową (3D) geometrię mikronaczyń in vivo, działa w kontrolowanym ciągłym przepływie perfuzyjnym, umożliwia wysokiej jakości obrazowanie w czasie rzeczywistym i może być stosowana do badań mikronaczyniowych.

Procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie

Tworzenie funkcjonalnych mikrotkanek w urządzeniach mikroprzepływowych wymaga stabilizacji fenotypów komórek poprzez dostosowanie tradycyjnych technik hodowli komórkowych do ograniczonych wymiarów przestrzennych w mikrourządzeniach. Modyfikacja kolagenu umożliwia osadzanie się warstwa po warstwie ultracienkich zespołów kolagenowych, które mogą stabilizować komórki pierwotne, takie jak hepatocyty, jako mikroprzepływowe modele tkankowe.

Osadzanie kolagenu warstwa po warstwie w urządzeniach mikroprzepływowych do stabilizacji mikrotkanek

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Ten protokół opisuje implementację sterowanej obrazem, laserowej degradacji hydrożelu do wytwarzania naczyniowych, biomimetycznych sieci mikroprzepływowych osadzonych w hydrożelach diakrylanowych z poli(glikolu etylenowego) (PEGDA). Te biomimetyczne systemy mikroprzepływowe mogą być przydatne w zastosowaniach inżynierii tkankowej, generowaniu modeli chorób in vitro i wytwarzaniu zaawansowanych urządzeń "na chipie".

Sterowane obrazem, laserowe wytwarzanie sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Tutaj prezentujemy protokół do generowania trójwymiarowego, uproszczonego i niezróżnicowanego modelu skóry za pomocą mikroobrabianej platformy mikroprzepływowej. Podejście oparte na przepływie równoległym pozwala na osadzanie na miejscu komory skórnej w celu wysiewu komórek nabłonka na wierzchu, a wszystko to kontrolowane przez pompy strzykawkowe.

Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

Poznaj mikroprzepływową depozycję genipiny do hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych. Ta metoda umożliwia utrzymanie kontraktylności tkanek naczyniowych do dwóch tygodni w kulturze.

Technika mikroprzepływowego osadzania genipiny do rozszerzonej hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych

Przeglądaj więcej filmów