Limfocyty T wychwytują bakterie przez transinfekcję z komórek dendrytycznych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie transinfekcji bakteryjnej limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem modelu komórkowego mysiego. In vivo niektóre bakterie patogenne, takie jak Listeria monocytogenes i Salmonella enteritidis, są w stanie zainfekować limfocyty T i zmodyfikować ich zachowanie. Jednakże in vitro limfocyty T nie są łatwe do zainfekowania.

W oparciu o tę obserwację zbadaliśmy, czy limfocyty T potrafią przejmować bakterie z zainfekowanych komórek dendrytycznych podczas prezentacji antygenu, podobnie jak ma to miejsce w przypadku infekcji wirusowych. Stwierdziliśmy, że limfocyty T przechwytują bakterie, a następnie je zabijają. Co więcej, odkryliśmy, że limfocyty T robią to skuteczniej niż wyspecjalizowane fagocyty.

Wyniki te przeczą centralnej zasadzie immunologii, wykazując, że komórki odporności adaptacyjnej mogą pełnić funkcje rzekomo zarezerwowane wyłącznie dla odporności wrodzonej. Przedstawiamy dziś protokół wykorzystywany do badania procesu transinfekcji bakteryjnej w modelu mysim. Ja oraz Esteban Veiga zademonstrujemy tę procedurę wraz z Guillermo Ramirez-Santiago i Raquelle Garcia-Ferreras, dwojgiem doktorantów, oraz Monicą Torres-Torresano, technikiem.

Należy pamiętać, że wszystkie procedury opisane w tym filmie powinny być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przy użyciu wyłącznie sterylnych mediów, narzędzi, końcówek do pipet oraz naczyń hodowlanych. Do sterylnej szalki Petriego o średnicy 15 cm, która nie była traktowana do hodowli tkanek, dodaj 1 µL lipopolisacharydu o stężeniu 1 mg/mL do komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego jednej myszy. Inkubuj komórki przez 24 h w celu zwiększenia ekspresji głównego układu zgodności tkankowej klasy II, czyli MHC II.

Po inkubacji przeprowadź cytometrię przepływową, aby potwierdzić ekspresję MHC II oraz różnicowanie. Po potwierdzeniu ekspresji MHC II, jak pokazano tutaj, przenieś komórki do sterylnej polipropylenowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj 10 ml PBS zawierającego 5 mM EDTA, a następnie odwiruj komórki z prędkością 600 x g.

Po zakończeniu wirowania należy przeprowadzić przemywanie poprzez ponowne zawieszenie komórek w pożywce RPMI z 10% FBS, a następnie ponownie je odwirować. Po przemyciu należy dodać jeden mililitr RPMI z 10% FBS na każde 5 × 10⁶ komórek dendrytycznych i wymieszać za pomocą pipety, aby je resuspenderować. Następnie resuspenderowane komórki dendrytyczne należy rozdzielić do dwóch probówek o równej objętości.

Do jednej probówki należy dodać 10 µg/mL OT-II OVAp. Drugą probówkę pozostawić niepoddaną działaniu odczynnika; będzie ona służyć jako kontrola negatywna obciążenia antygenem.

Inkubować probówki przez co najmniej jedną godzinę, aby załadować peptyd OVA na cząsteczki MHC II komórek dendrytycznych. W międzyczasie przygotować Salmonella enteritidis do infekcji, przemywając je trzy razy roztworem PBS. Po każdym przemyciu wirować z prędkością 1800 x g, aby usunąć podłoże LB oraz wszelkie wydzielone toksyny.

Następnie bakterie należy resuspendować w pożywce RPMI. Po inkubacji należy zainfekować każdą probówkę z komórkami dendrytycznymi przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10, a następnie inkubować komórki przez jedną godzinę. Po zainfekowaniu komórek należy je trzykrotnie przemyć PBS, a następnie raz pożywką RPMI z 10% FBS.

Wiruj próbki pomiędzy kolejnymi etapami przemywania z prędkością 450 x g, aby usunąć większość bakterii pozakomórkowych z rozpuszczalnego OVAp. Po ostatnim wirowaniu resuspenduj komórki w pożywce RPMI z 10% FBS do stężenia 20 × 10⁶ komórek na ml. Do 24-dołkowej płytki hodowlanej dodaj dwie miliony komórek CD4+T w objętości 0,5 ml do każdego z pięciu dołków.

Następnie, aby kontrolować wpływ kontaktu fizycznego, umieść poliwęglanowe bariery trans-well o rozmiarze porów 3 µm w trzecim i czwartym dołku. Do pierwszego dołka dodaj 0,1 ml zakażonych, przeładowanych komórek dendrytycznych. Do drugiego dołka dodaj 0,1 ml zakażonych, nieprzeładowanych komórek dendrytycznych.

Do jednego dołka dodaj 0,1 ml zakażonych, obciążonych komórek dendrytycznych, a do drugiego dołka 0,1 ml zakażonych, nieobciążonych komórek dendrytycznych. Na koniec, jako kontrolę negatywną, bezpośrednio zakaż piąty dołek zawierający komórki CD4+T przy MOI wynoszącym 10. Następnie uzupełnij całkowitą objętość w dołku do 0,6 ml za pomocą RPMI.

Inkubuj płytkę przez 30 minut, aby umożliwić sformowanie synaps immunologicznych. Po inkubacji dodaj do każdej studni 100 µg Gentamycyny na 1 ml pożywki i inkubuj przez jedną godzinę. Gentamycyna jest antybiotykiem aminoglikozydowym, który nie przenika do komórek eukariotycznych.

W związku z tym na tym etapie aminoglikozydy zabiją bakterie zewnątrzkomórkowe, ale nie bakterie wewnątrzkomórkowe. Po inkubacji zebrać nieprzylegające komórki do probówek o pojemności 15 ml i resuspender je w 10 ml buforu PBS BSA EDTA. Plastykową płytkę hodowlaną, do której przylegają większość komórek dendrytycznych, należy usunąć.

Następnie delikatnie wymieszaj zawartość probówek na wortexie, aby zapewnić desegregację komórek. Odwiruj probówki z prędkością 600 x g. Następnie z dowolnej probówki odessaj 500 µL supernatantu komórkowego i przenieś go pipetą do nowej probówki.

Posłuży to jako kontrola w celu wykazania skuteczności leczenia Gentamycyną. Wszystkie próbki należy umieścić w lodzie. Na tym etapie znajdują się sześć probówek: cztery probówki z próbkami badawczymi i dwie kontrole.

Choć większość komórek dendrytycznych została usunięta wraz z płytką, próbki, które nie zostały oddzielone barierami transwell, mogą nadal je zawierać. Aby zmniejszyć zanieczyszczenie, należy zastosować magnetyczną izolację komórek lub sortowanie komórek w celu ponownej izolacji limfocytów T CD4+ z próbek, które nie zostały oddzielone barierami transwell. Końcowy izolat powinien zawierać mniej niż 2% komórek dendrytycznych.

Pozostałe próbki należy przechowywać w lodzie. Po uprzednim oczyszczeniu limfocytów T CD4+ można przystąpić do oceny stopnia zakażenia bakteriami. Można to przeprowadzić poprzez liczenie kolonii lub za pomocą cytometrii przepływowej.

W tym miejscu pokażemy, jak przeprowadzić zliczanie kolonii. Przemyj transinfekowane komórki CD4+T dwukrotnie roztworem PBS. Pomiędzy przemyciami wirówkę ustaw na 600 x g.

Następnie należy policzyć komórki i resuspendować je w PBS do stężenia 2×10⁶ komórek/ml. Do 500 µl limfocytów T należy dodać 500 µl 0,1% Triton X-100 w celu ich lizy. Proces ten uwalnia bakterie wewnątrzkomórkowe z limfocytów T.

Dla każdej próbki lizowanych komórek przygotuj trzy rozcieńczenia seryjne. Następnie podziel płytkę z agarem LB na cztery ćwiartki i nanieś 50 µL każdego rozcieńczenia, w tym zawiesiny nierozcieńczonej, na każdą z sekcji płytki. Na oddzielnej płytce z agarem LB nanieś przechowywany nadsącz komórkowy jako kontrolę skuteczności Gentamycyny.

Następnie, na innej płytce, wysiej bezpośrednio zainfekowane limfocyty T jako dodatkową kontrolę. Inkubuj przez noc. Następnego dnia oblicz liczbę kolonii w każdej sekcji płytki i wyznacz liczbę jednostek tworzących kolonie dla każdej próbki.

W przypadku wystąpienia niskiego poziomu zanieczyszczenia komórkami dendrytycznymi, zdefiniowanego jako mniej niż 2%, należy odjąć jednostki tworzące kolonie odpowiadające temu zanieczyszczeniu. Transinfekcję limfocytów T przeprowadzono z wykorzystaniem Salmonella enteritidis i ilościowo określono za pomocą testu przeżywalności z gentamycyną, zgodnie z opisem w tym filmie. Po wysianiu bezpośrednio zainfekowanych limfocytów T, jak pokazano po lewej stronie, nie zaobserwowano wzrostu kolonii, co wskazuje, że limfocyty T są oporne na bezpośrednie infekcje bakteryjne.

Po wysiewaniu supernatantu z testów transinfekcji, jak pokazano po prawej stronie, nie zaobserwowano kolonii, co wskazuje na prawidłowe działanie gentamyciny. Tutaj przedstawiono wyniki testów transinfekcji przeprowadzonych z zastosowaniem barier trans-well. W nierozcieńczonej zawiesinie z próbek załadowanych OVA oraz próbek niezaładowanych zaobserwowano tylko trzy kolonie.

Z kolei w przypadku bezpośredniego kontaktu limfocytów T z zakażonymi komórkami dendrytycznymi widoczne są liczne kolonie. Co więcej, gdy komórki dendrytyczne obciążone OVAp inkubowano z limfocytami T, pobieranie bakterii wzrosło około pięciokrotnie. Wspólnie dane te wskazują, że bezpośredni kontakt zakażonych komórek dendrytycznych z limfocytami T ułatwia pobieranie bakterii, a transinfekcja komórkowa jest nasilona podczas rozpoznawania antygenu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ilościowo określić transinfekcję z wykorzystaniem morskich limfocytów T. Zaletą ilościowego oznaczania transinfekcji za pomocą testu przeżywalności z gentamycyną jest jego bardzo wysoka czułość. Jesteśmy w stanie wykryć pojedynczą bakterię zakaźną.

Ważne jest, aby pamiętać, że etap oczyszczania w tej procedurze jest krytyczny. Czystość musi być bardzo wysoka, jeśli do wyznaczenia wskaźnika transinfekcji mają zostać użyte zliczenia kolonii. Kwantyfikacja metodą cytometrii przepływowej nie posiada tego ograniczenia, ponieważ można łatwo odróżnić komórki dendrytyczne od limfocytów T, jednak warunkiem jest, aby bakterie wykazujące ekspresję GFP były wystarczająco jasne, by umożliwić wykrycie zainfekowanych komórek na tle zewnętrznej fluorescencji.

Należy pamiętać, że praca z patogenami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać odpowiednich środków ostrożności.