Name: Limfocyty T wychwytują bakterie przez transinfekcję z komórek dendrytycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Poznaj metodę pomiaru transinfekcji bakteryjnej limfocytów T CD4+ z komórek dendrytycznych w modelu mysim. Ta technika pozwala badać mechanizmy odpowiedzi immunologicznej na patogeny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC z hiszpańskiego Ministerstwa Nauki i Innowacji oraz PIES201020I046 z Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).

Uwaga: Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Badań Naukowych Universidad Autònoma de Madrid i przeprowadzone pod nadzorem Dyrektora ds. Dobrostanu i Zdrowia Zwierząt Universidad Autònoma de Madrid zgodnie z hiszpańskimi i europejskimi wytycznymi. Myszy hodowano w pomieszczeniach wolnych od specyficznych patogenów (SPF) i poddano eutanazji przez przeszkolony i wykwalifikowany personel przy użyciu metody inhalacji dwutlenkiem węgla (CO2 ).
1. Różnicowanie i infekcja DCs pochodzących ze szpiku kostnego myszy
Uwaga: Rysunek 1 podsumowuje ten pierwszy krok. Od tego momentu wszystkie procedury powinny być wykonywane w kapturze, przy użyciu wyłącznie sterylnych pożywek, narzędzi, końcówek pipet i naczyń hodowlanych.
<ol>
	<li>Różnicowanie DC pochodzących ze szpiku kostnego myszy
	<ol>
		<li>Wypreparuj piszczele i kości udowe jednej myszy C57/BL6 22 i przenieś do plastikowego naczynia z 10 ml pożywki RPMI.</li>
		<li>Odetnij każdą nasadę sterylnymi nożyczkami i odsłoń szpik kostny, który ma charakterystyczny jaskrawoczerwony kolor.</li>
		<li>Wprowadzić do wnętrza kości 10 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (bufor PBS/BSA/EDTA) za pomocą sterylnej strzykawki umieszczonej na sterylnej szalce Petriego.</li>
		<li>Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować w probówce o stężeniu 600 x g w wirówce z chłodzeniem (4 °C).</li>
		<li>Zawiesić komórki w 1 ml buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) (0,15 M NH4Cl, 10 mMKHCO3 i 0,1 mM EDTA) i inkubować przez 30 sekund w temperaturze pokojowej w celu wyeliminowania czerwonych krwinek.</li>
		<li>Dodać 10 ml pożywki RPMI 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i przefiltrować przez sitko komórkowe (70 μm) w celu usunięcia fragmentów kości i grudek komórek przed odwirowaniem z tą samą prędkością (600 xg), ponieważ grudki zostały wyeliminowane przez filtrowanie.</li>
		<li>Policz komórki i dostosuj do 5 x 105 komórek/ml za pomocą RPMI 10% FBS (zawierającego 50 μM B-merkaptoetanolu, 1 mM pirogronianu sodu) i dodaj 20 ng / ml rekombinowanego mysiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (rm-GM-CSF) jako stężenie końcowe.</li>
		<li>Zawiesinę tę dodać do sterylnej, mikrobiologicznej szalki Petriego o średnicy 15 cm i wyhodować w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2 ).</li>
		<li>Co trzy dni odwirować zarówno nieprzylegające komórki, jak i odłączone komórki za pomocą 5 mM EDTA w PBS i ponownie zawiesić przy 5 x 105 komórek/ml gęstości komórek, ze świeżą pożywką zawierającą 20 ng/ml rm-GM-CSF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dojrzewanie DC i ładowanie antygenów
	<ol>
		<li>W 9 dniu ponownie zawiesić komórki w gęstości 5 x 105 komórek/ml w pożywce zawierającej 20 ng/ml rm-GM-CSF. Następnie dodać 20 ng/ml lipopolisacharydu (LPS), aby umożliwić wysoką ekspresję MHC-II na komórkach i inkubować na sterylnej szalce Petriego o średnicy 15 cm bez hodowli tkankowej przez 24 godziny.</li>
		<li>Po jednym dniu stymulacji LPS wybarwić niektóre komórki DC przeciwciałami przeciwko mysim CD11c, MHCII i Gr-1, aby sprawdzić różnicowanie DC za pomocą cytometrii przepływowej. Przykład analizy cytometrii przepływowej prądu stałego przedstawiono na rysunkach 3A i 3B.
		<ol>
			<li>Inkubować DC (5 x 105 komórek/próbkę) z przeciwciałem monoklonalnym anty-mysim-CD16/CD32 w stężeniu końcowym 2,5 μg/ml w 50 μl buforu PBS/BSA/EDTA na próbkę. Następnie dodać 50 μl przeciwciał przeciwko MHCII (I-A/I-E), CD11c i Gr-1 sprzężonych z różnymi fluorochromami odpowiednio w stosunku 1:100, 1:200 i 1:500 w buforze PBS/BSA/EDTA.</li>
			<li>Na koniec przemyć DC buforem PBS/BSA/EDTA i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie z protokołem producenta. 
			Uwaga: Jeśli komórki są dobrze zróżnicowane, komórki są gotowe do obciążenia antygenem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przemyć DC za pomocą RPMI 10% FBS (bez antybiotyków) i inkubować je z 10 μg/ml OTII OVAp (OVA 323-339; I S Q A V H A A H A E I N E A G R) na plastikowej probówce w 1 ml pożywki RMPI 10% FBS na 5 x 106 DCs przez minimum 1 godzinę w temperaturze 37 ºC. Jako kontrolę ujemną pozostawić DC bez inkubacji z OVAp.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie DC
	<ol>
		<li>Infekować DC przy wielokrotności infekcji (MOI) 10 bakterii (10 bakterii na DC) przez 1 godzinę w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2).</li>
		<li>Umyj komórki DC 3x w PBS i 1x w RMPI 10% FBS i odwiruj przy 450 x g w celu umycia większości bakterii zewnątrzkomórkowych. Na koniec ponownie zawiesić komórki w pożywce RMPI 10% FBS (bez antybiotyków) w ilości 20 x 106 komórek/ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja limfocytów CD4 + T od myszy transgenicznych OTII
Uwaga: Rysunek 1 podsumowuje ten drugi krok. Do izolacji limfocytów T CD4 + należy użyć węzłów chłonnych zamiast śledziony, ponieważ udział limfocytów CD4 + w węzłach chłonnych (~50%) jest większy niż w śledzionie (~25%) i dlatego oczyszczanie byłoby bardziej skuteczne.
<ol>
	<li>Wykonaj jednokomórkową zawiesinę węzłów chłonnych
	<ol>
		<li>Usuń pachwinowe, pachowe, ramienne, szyjne i krezkowe węzły chłonne 23 od myszy transgenicznych OTII i przenieś do plastikowego naczynia z 10 ml pożywki RPMI 10% FBS.</li>
		<li>Zmiel węzły chłonne pod sterylnym kapturem za pomocą dwóch matowych szkiełek mikroskopowych. Umieść węzły chłonne na oszronionej stronie jednego szkiełka mikroskopowego i pocieraj matową stroną drugiego szkiełka, aż narządy zostaną zmielone.</li>
		<li>Przemyć zawiesinę jednokomórkową w buforze PBS/BSA/EDTA.</li>
		<li>Przefiltrować komórki przez sitko (70 μm) w celu usunięcia tkanki łącznej i przemyć buforem PBS/BSA/EDTA.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy ACK i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w celu wyeliminowania czerwonych krwinek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja limfocytów T CD4+
	<ol>
		<li>Umyj ponownie jak w kroku 2.1.3 i policz komórki, aby ponownie je zawiesić w 100 x 106 komórek/ml w buforze PBS/BSA/EDTA. Dodaj biotynylowane przeciwciała przeciwko CD8, IgM, B220, CD19, MHC klasy II (I-Ab), CD11b, CD11c i DX5 w 1:250 przez 30 minut na lodzie w celu późniejszej ujemnej selekcji limfocytów T CD4 +.</li>
		<li>Umyć komórki w buforze PBS/BSA/EDTA i inkubować komórki (100 x 106 komórek/ml) mikrogranulkami streptawidyny w stężeniu zalecanym w protokole producenta przez 15 min na lodzie.</li>
		<li>Umyj komórki w buforze PBS/BSA/EDTA i przefiltruj je przez sitko komórkowe (30 μm) przed izolacją limfocytów T CD4 +.</li>
		<li>Wyizoluj limfocyty T CD4 + przez selekcję negatywną za pomocą magnetycznej maszyny do separacji komórek zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Policz komórki i dostosuj do 4 x 106 komórek/ml z pożywką RPMI 10% FBS (bez antybiotyków).</li>
		<li>Utrwalić i trzymać na lodzie izolowane limfocyty T CD4 + (3 x 105 komórek) w celu sprawdzenia czystości za pomocą cytometru przepływowego, jak opisano24. Przykład oczyszczania limfocytów T CD4 + pokazano na rysunku 3C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiar transinfekcji limfocytów T za pomocą testu ochrony gentamycyny
Uwaga: Rysunek 2 podsumowuje ten trzeci krok protokołu.
<ol>
	<li>Transinfekcja limfocytów T
	<ol>
		<li>Inkubować izolowane limfocyty T CD4 + z zakażonymi komórkami DC (1:1) (DC były zakażone przez 1 godzinę i myte w celu wyeliminowania wolnych bakterii) przez 30 minut, aby umożliwić tworzenie synaps immunologicznych w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2).</li>
		<li>Dodać 0,5 ml wyizolowanych limfocytów T CD4 + (2 x 106 komórek) i 0,1 ml zakażonych DC (2 x 106 komórek) na 24-dołkowej płytce hodowlanej. Jako kontrolę ujemną należy zainfekować bezpośrednio 0,5 ml limfocytów T CD4 + w MOI 10 bakterii przez 30 minut.</li>
		<li>Uwzględnij dodatkowe kontrole oddzielające zakażone DC od limfocytów T za pomocą poliwęglanowej bariery transwell (o wielkości porów 3 μm), utrudniającej fizyczny kontakt DC-T. Dodać 0,1 ml DC do transwella i 0,5 ml limfocytów T CD4+ do dolnej komory studzienki (płytka 24-dołkowa).</li>
		<li>Na koniec uzupełnij pożywką RMPI, aż w każdym dołku będzie 0,6 ml, aby uzyskać równe objętości we wszystkich próbkach.</li>
		<li>Po 30 minutach tworzenia synaps immunologicznych dodać 100 μg/ml gentamycyny i inkubować przez 1 godzinę przed pobraniem komórek w inkubatorze CO2 (37°C, 5% CO2 ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponowna izolacja limfocytów T CD4+
	<ol>
		<li>Zebrać nieprzylegające komórki i ponownie zawiesić je w buforze PBS/BSA/EDTA. Większość DC pozostaje przymocowana do plastikowej płytki hodowlanej. Delikatnie wiruj rurki, aby zapewnić dezagregację komórek. Zachowaj 500 μl supernatantu komórkowego jako kontrolę, aby pokazać, że gentamycyna działa dobrze.</li>
		<li>Ponownie wyizoluj limfocyty T CD4 + z próbek, które zawierają razem DC i limfocyty T, jak w kroku 2.2, chociaż większość DC powinna była przyczepić się na płytce. Próbki kontrolne należy przechowywać na lodzie. Weź pod uwagę tylko eksperymenty z mniej niż 2% zanieczyszczeniem. Przykład oczyszczania limfocytów T CD4 + po transinfekcji pokazano na rysunku 3D.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lizuj limfocyty T i wysiewaj je na płytkach z pożywką bakteryjną.
	<ol>
		<li>Umyj limfocyty T CD4 + dwukrotnie PBS.</li>
		<li>Policz komórki i ponownie je zawiesić w stężeniach 2 x 106 komórek/ml w PBS.</li>
		<li>Dodaj 500 μl 0,1% Triton X-100 w 500 μl limfocytów T, aby poddać je lizie w stężeniu 1 x 106 komórek/ml, uwalniając bakterie wewnątrzkomórkowe z limfocytów T.</li>
		<li>Wykonać 3 kolejne rozcieńczenia dziesiętne lizowanych komórek i zasiać 50 μl każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych z pożywką bakteryjną. Podziel płytki na 4 porcje i zasiej różne rozcieńczenia lizowanych komórek w każdej części. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na rysunku 4.
		<ol>
			<li>Jako kontrolę, należy również umieścić na agarze przechowywany supernatant komórkowy koniugatów, aby upewnić się, że gentamycyna działa dobrze. Również zainfekowane DC jako dodatkowa kontrola. W przypadku wystąpienia niskiego zanieczyszczenia DC (<2%), odejmij jednostki tworzące kolonie (CFU) odpowiadające niskiemu zanieczyszczeniu DC.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja transinfekcji limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej
Uwaga: Rysunek 2 podsumowuje ten krok.
<ol>
	<li>Transinfekcja limfocytami T
	<ol>
		<li>Infekuj BMDC jak w kroku 1.3, ale w tym przypadku użyj bakterii wykazujących ekspresję GFP.</li>
		<li>Limfocyty T CD4 + (wyizolowane z węzłów chłonnych w kroku 2.2) za pomocą znacznika komórek chlorometyloaminokumaryny (CMAC) przez 30 minut w temperaturze 37 ºC zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Znakowane limfocyty T CD4+ przemyć dwukrotnie RMPI 10% FBS (bez antybiotyków).</li>
		<li>Inkubować zakażone DC (po 1 godzinie inkubacji z bakteriami) ze znakowanymi limfocytami T CD4 + przez 30 minut, aby umożliwić tworzenie synaps immunologicznych w temperaturze 37 ºC, w tym wszystkie kontrole wyjaśnione w kroku 3.1.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie zakażonych limfocytów T CD4+
	<ol>
		<li>Po 30 minutach tworzenia synaps immunologicznych DC-T zbierz komórki i umyj je w PBS/BSA/EDTA.</li>
		<li>Po dwukrotnym przemyciu buforem PBS/BSA/EDTA, oddziel zagregowane komórki, delikatnie wirując rurki.</li>
		<li>Umieścić próbki w 0,2 ml/probówkę PBS zawierającego 3% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj je w PBS.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem monoklonalnym anty-mysim-CD16/CD32 (2,5 μg/ml) w 50 μl/próbkę PBS/BSA/EDTA przez 15 minut na lodzie w celu zablokowania receptorów Fc komórek dendrytycznych.</li>
		<li>Dodać królicze przeciwciało przeciwbakteryjne (10 μg/ml jako stężenie końcowe) do 50 μl/próbkę PBS/BSA/EDTA przez 30 minut na lodzie, aby zabarwić bakterie zewnątrzkomórkowe.</li>
		<li>Umyj komórki PBS/BSA/EDTA i inkubuj z przeciwciałem przeciwko mysiemu CD11c sprzężonemu z fikoerytryną (PE) i drugorzędowym przeciwciałem przeciwko królikowi sprzężonemu z innym fluorochromem, takim jak Alexa-Fluor 647, w stosunku 1:200 w 100 μl/próbkę PBS/BSA/EDTA przez 30 minut na lodzie.</li>
		<li>Umyj komórki i przeanalizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Nie należy zapomnieć o dołączeniu próbki transzakażonych limfocytów T wykorzystujących bakterie niefluorescencyjne jako kontrolę ujemną oraz próbek znakowanych tylko jednym z każdego fluorochromu użytego w eksperymencie w celu skompensowania próbek i dostosowania ustawień cytometrii przepływowej25. Reprezentatywną analizę przedstawiono na rysunku 5. 
		Uwaga: Jeśli bakterie nie wykazują ekspresji GFP, w celu odróżnienia bakterii wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych należy oznaczyć bakterie zewnątrzkomórkowe, utrwalić i przepuszczalnie próbki za pomocą Triton X-100 w stężeniu 0,5% w PBS przez 5 minut. Następnie wybarwić bakterie ogółem (wewnątrzkomórkowe + zewnątrzkomórkowe) innym fluorochromem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+microorganisms+and+activation+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of microorganisms and activation of the immune response.</a> Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).</li>
<li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+biology+of+the+cell%22">Molecular biology of the cell</a>. , Garland Science. New York. (1989).</li>
<li>Pancer, Z., Cooper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The evolution of adaptive immunity.</a> Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).</li>
<li>Rhoades, R. A., Bell, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRhoades%2C+RA+%22Medical+Phisiology%22">Medical Phisiology</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).</li>
<li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Invasion%3A+The+Paradigms+of+Enteroinvasive+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens.</a> Science. 304 (5668), 242-248 (2004).</li>
<li>Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+and+recognition+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation and recognition in bacterial infections.</a> Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Adhesion+and+Entry+into+Host+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells.</a> Cell. 124 (4), 715-727 (2006).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).</li>
<li>Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+clathrin+drives+actin+accumulation+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse.</a> Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).</li>
<li>Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+bone+marrow-derived+dendritic+cells+and+macrophages+to+productive+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes.</a> Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).</li>
<li>Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN%2C+a+dendritic+cell-specific+HIV-1-binding+protein+that+enhances+trans-infection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells.</a> Cell. 100 (5), 587-597 (2000).</li>
<li>Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+mature+dendritic+cells%3A+Trojan+exosomes+riding+the+Trojan+horse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse.</a> PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740(2010).</li>
<li>Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+communication%3A+diverse+structures+for+exchange+of+genetic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information.</a> Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).</li>
<li>McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+serve+as+a+reservoir+for+Listeria+monocytogenes+growth+during+infection+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice.</a> Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).</li>
<li>Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+impairs+T+lymphocyte+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).</li>
<li>Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+kill+bacteria+captured+by+transinfection+from+dendritic+cells+and+confer+protection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice.</a> Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).</li>
<li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).</li>
<li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bone+marrow+derived+murine+dendritic+cells+for+use+in+2-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).</li>
<li>Inaba, K., Inaba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-isolation+of+Salmonella-infected+cells+with+defined+bacterial+load+from+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).</li>
<li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).</li>
<li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+X+%22Current+protocols+in+immunology%22">Current protocols in immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1(2008).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+th17+differentiation+of+na%C3%AFve+CD4+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765(2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li>
<li>Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+operation+of+a+flow+cytometric+immunophenotyping+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+diagnostic+pathology%22%5BJournal%5D)">Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory.</a> Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).</li>
<li>Itano, A. A., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+to+naive+CD4+T+cells+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node.</a> Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Limfocyty T lub limfocyty T to rodzaj leukocytów, które odgrywają kluczową rolę w odporności komórkowej i należą do adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej26. Limfocyty T są oporne na zakażenie in vitro , ale niektóre doniesienia wskazują, że mogą być zakażone in vivo14,15. Bliskie kontakty limfocytów APC i T podczas synapsy immunologicznej służą jako platformy do wymiany materiałubiologicznego13, w tym niektórych wirusów, takich jak HIV11. Niedawno wykazano, ...

Gdy patogen infekuje swojego gospodarza, zwykle następuje aktywacja wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, niezbędnej do usunięcia bakteryjnego. Odporność wrodzona jest pierwszą linią obrony, która zapobiega większości infekcji. Odporność wrodzona wyróżnia w precyzyjny sposób elementy, które są konserwatywne wśród szerokich grup mikroorganizmów (wzorce molekularne związane z patogenami, PAMPS)1. Mechanizmy odporności wrodzonej obejmują bariery fizyczne, takie jak skóra, bariery chemiczne (peptydy przeciwdrobnoustrojowe, lizozym) i wrodzone leukocyty, do których należą fagocyty (makrofagi, neutrofile i komórki dendrytyczne), komórki tuczne, eozynofile, bazofile i komórki NK2. Komórki te identyfikują i eliminują patogeny, atakując je przez kontakt lub poprzez fagocytozę, która obejmuje pochłanianie i zabijanie patogenów. System ten nie pozwala na obronę przez całe życie, w przeciwieństwie do odporności adaptacyjnej, która nadaje pamięć immunologiczną przeciwko patogenom. Adaptacyjny układ odpornościowy jest drugą linią obrony i jest w stanie rozpoznawać i reagować na określone antygeny wielu substancji drobnoustrojowych i niedrobnoustrojowych3. Głównymi składnikami adaptacyjnego układu odpornościowego są limfocyty, do których należą limfocyty B i T. Limfocyty B biorą udział w odpowiedzi humoralnej, wydzielając przeciwciała przeciwko patogenom lub białkom egzogennym. Jednak limfocyty T reprezentują odporność komórkową, modulując odpowiedź immunologiczną za pomocą wydzielania cytokin lub zabijając komórki zakażone patogenem4.
Komórki prezentujące antygen (APC), w tym komórki dendrytyczne lub makrofagi, składniki wrodzonego układu odpornościowego, mogą rozpoznawać patogeny fagocytozy i przetwarzać składniki bakteryjne na antygeny, które są prezentowane na powierzchni komórki przez główny kompleks zgodności tkankowej (MHC)5-7. Po tym, jak APC mają fagocytowane patogeny, zwykle migrują do drenujących węzłów chłonnych, gdzie wchodzą w interakcję z limfocytami T. Limfocyty T mogą rozpoznawać specyficzne kompleksy peptyd-MHC po ich receptorach limfocytów T. Synapsa immunologiczna (IS) występuje w granicy faz między APC załadowanym antygenem a limfocytami podczas prezentacji antygenu8,9. Niektóre bakterie mogą przetrwać fagocytozę i systematycznie rozprzestrzeniać się w obrębie APC. Z tego punktu widzenia zainfekowane APC służą jako rezerwuary bakteryjne lub "konie trojańskie", które ułatwiają rozprzestrzenianie się bakterii10. Bliski kontakt między APC a limfocytami, który ma miejsce w trakcie tworzenia IS, funkcjonuje również jako platforma wymiany części błon, materiału genetycznego i egzosomów i może zostać przejęty przez niektóre wirusy w celu zakażenia limfocytów T; Proces ten nazywa się transinfekcją11-13.
Niektóre bakterie chorobotwórcze (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica i Shigella flexneri) są w stanie atakować limfocyty T in vivo i modyfikować ich zachowanie14-16 . Niedawno opisaliśmy, że limfocyty T są również zdolne do wychwytywania bakterii poprzez transinfekcję z wcześniej zakażonych komórek dendrytycznych (DC) w trakcie prezentacji antygenu16. Wychwytywanie bakterii przez transinfekcję jest niezwykle skuteczne (1000-4000x) niż infekcje bezpośrednie. Limfocyty T wychwytują bakterie chorobotwórcze i niepatogenne, co wskazuje, że transinfekcja jest procesem napędzanym przez limfocyty T. Uderzające jest to, że transinfekowane limfocyty T (tiT) szybko zabijały wychwycone bakterie i robiły to skuteczniej niż profesjonalne fagocyty16. Wyniki te, które łamią dogmat immunologii, pokazują, że komórki odporności nabytej mogą pełnić funkcje, które rzekomo były wyłączne dla odporności wrodzonej. Ponadto wykazaliśmy, że limfocyty tiT wydzielają duże ilości cytokin prozapalnych i chronią przed infekcjami bakteryjnymi in vivo.
Tutaj prezentujemy różne protokoły używane do badania procesu transinfekcji bakteryjnej w modelu mysim. Model ten opiera się na wykorzystaniu limfocytów T CD4 + od transgenicznych myszy OTII, które mają specyficzny TCR dla peptydu 323-339 OVA (OVAp) w kontekście I-Ab17, które oddziałują specyficznie z zakażonymi bakteriami DC pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMDC)18,19 załadowanymi OVAp, tworząc stabilne synapsy odpornościowe.
 może być wizualizowana i śledzona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dodatkowo cytometria przepływowa może być stosowana do wykrywania zakażonych komórek poprzez wykorzystanie fluorescencji emitowanej przez bakterie wykazujące ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP)16,20. Co więcej, transinfekcję limfocytami T można określić ilościowo za pomocą bardziej czułego podejścia, testu przeżycia gentamycyny, który umożliwia pomiar dużej liczby zdarzeń. Gentamycyna jest antybiotykiem, który nie może przenikać do komórek eukariotycznych. Dlatego stosowanie tego antybiotyku pozwala na odróżnienie bakterii wewnątrzkomórkowych, które przeżyły dodanie antybiotyku, od bakterii zewnątrzkomórkowych, które zostały zabite21.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>r-GMCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>SIGMA</td><td>L2630-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Na Pirogronian</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3023901</td><td></td></tr><tr><td>2-ME</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>OVAp OTII (323&ndash; 339)</td>Filtr siatkowy <td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70uM</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 30 uM Strzykawka Filcons Sterylna</td><td>BD</td><td>340598</td><td></td></tr><tr><td>AutoMacs Classic</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-088-887</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Normon</td><td>624601.6</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Costar</td><td>3415</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Pronadisa</td><td>1231</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Pronadisa</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16%</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>IgM Biot</td><td>ImmunoStep</td><td>Klon RMM-1</td><td></td></tr><tr><td>B220 Biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td></td></tr><tr><td>CD19 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553784</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II Biot (I-A/I-E)</td><td>BD Biosciences</td><td>553622</td><td></td></tr><tr><td>CD11b biot</td><td>Immunostep</td><td>11BB-01mg</td><td></td></tr><tr><td>CD11c biot</td><td>Immunostep</td><td>11CB3-01mg</td><td></td></tr><tr><td>DX5 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553856</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32</td><td>ImmunoStep</td><td>M16PU-05MG</td><td></td></tr><tr><td>przeciw Salmonelli</td><td>ABD Serotec</td><td>8209-4006</td><td></td></tr><tr><td>CD11cPE</td><td>BD Biosciences</td><td>553802</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0041-U100</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553129</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II (I-A/I-E) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553623</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647 Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L), wysoce adsorbowane krzyżowo</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td></td></tr><tr><td>CMAC (7-amino-4-chlorometylokumaryna)Technologie</td> <td>życiowe</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki streptawidyny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

limfocyty t wychwytują bakterie przez transinfekcję z komórek dendrytycznych

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Ostatnio pokazaliśmy, w przeciwieństwie do tego, co jest opisane, że limfocyty T CD4+, paradygmat adaptacyjnych komórek odpornościowych, wychwytują bakterie z zakażonych komórek dendrytycznych (DC) w procesie zwanym transinfekcją. W tym miejscu opisujemy analizę procesu transinfekcji, który zachodzi w trakcie prezentacji antygenu. Proces ten został ujawniony przy użyciu limfocytów T CD4 + od transgenicznych myszy OTII, które mają receptor limfocytów T (TCR) specyficzny dla peptydu owoalbuminy (OVAp), który w związku z tym może tworzyć stabilne kompleksy immunologiczne z zakażonymi komórkami dendrytycznymi załadowanymi tym specyficznym OVAp. Dynamikę bakterii wykazujących ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) podczas transmisji komórek DC-T można monitorować za pomocą obrazowania żywych komórek, a ilościowe określenie transinfekcji bakteryjnej można przeprowadzić za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto transinfekcję można określić ilościowo za pomocą bardziej czułej metody opartej na użyciu gentamycyny, nieprzepuszczalnego antybiotyku aminoglikozydowego zabijającego bakterie zewnątrzkomórkowe, ale nie wewnątrzkomórkowe. Ta klasyczna metoda była już wcześniej stosowana w mikrobiologii do badania skuteczności infekcji bakteryjnych. Niniejszym wyjaśniamy protokół całego procesu, od izolacji komórek pierwotnych do ilościowego określenia transinfekcji.

W niniejszej pracy opisaliśmy sposób przeprowadzania transinfekcji bakteryjnej komórek T myszy z zainfekowanych komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego (DCs) oraz metody pomiaru transinfekcji bakteryjnej za pomocą dwóch różnych podejść: cytometrii przepływowej i testu przeżywalności z użyciem gentamycyny. Rysunek 1 podsumowuje procedurę pozyskiwania komórek. Komórki DC generuje się poprzez inkubację komórek szpiku kostnego z GM-CSF przez 9 dni. Następnie kom...

Tutaj przedstawiono protokół pomiaru wychwytywania bakterii przez limfocyty T CD4+, które następuje podczas prezentacji antygenu poprzez transinfekcję z wcześniej zainfekowanych komórek dendrytycznych (DC). Pokazujemy, jak wykonać niezbędne kroki: izolację komórek pierwotnych, zakażenie DC, tworzenie koniugatu limfocytów DC/T oraz pomiar transfekcji bakteryjnych limfocytów T.

Limfocyty T wychwytują bakterie przez transinfekcję z komórek dendrytycznych

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie transinfekcji bakteryjnej limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem modelu komórkowego mysiego. In vivo niektóre bakterie patogenne, takie jak Listeria monocytogenes i Salmonella enteritidis, są w stanie zainfekować limfocyty T i zmodyfikować ich zachowanie. Jednakże in vitro limfocyty T nie są łatwe do zainfekowania.W oparciu o tę obserwację zbadaliśmy, czy limfocyty T potrafią przejmować bakterie z zainfekowanych komórek dendrytycznych podczas prezentacji antygenu, podobnie jak ma to miejsce w przypadku infekcji wirusowych. Stwierdziliśmy, że limfocyty T przechwytują bakterie, a następnie je zabijają. Co więcej, odkryliśmy, że limfocyty T robią to skuteczniej niż wyspecjalizowane fagocyty.Wyniki te przeczą centralnej zasadzie immunologii, wykazując, że komórki odporności adaptacyjnej mogą pełnić funkcje rzekomo zarezerwowane wyłącznie dla odporności wrodzonej. Przedstawiamy dziś protokół wykorzystywany do badania procesu transinfekcji bakteryjnej w modelu mysim. Ja oraz Esteban Veiga zademonstrujemy tę procedurę wraz z Guillermo Ramirez-Santiago i Raquelle Garcia-Ferreras, dwojgiem doktorantów, oraz Monicą Torres-Torresano, technikiem.Należy pamiętać, że wszystkie procedury opisane w tym filmie powinny być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przy użyciu wyłącznie sterylnych mediów, narzędzi, końcówek do pipet oraz naczyń hodowlanych. Do sterylnej szalki Petriego o średnicy 15 cm, która nie była traktowana do hodowli tkanek, dodaj 1 µL lipopolisacharydu o stężeniu 1 mg/mL do komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego jednej myszy. Inkubuj komórki przez 24 h w celu zwiększenia ekspresji głównego układu zgodności tkankowej klasy II, czyli MHC II.Po inkubacji przeprowadź cytometrię przepływową, aby potwierdzić ekspresję MHC II oraz różnicowanie. Po potwierdzeniu ekspresji MHC II, jak pokazano tutaj, przenieś komórki do sterylnej polipropylenowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj 10 ml PBS zawierającego 5 mM EDTA, a następnie odwiruj komórki z prędkością 600 x g.Po zakończeniu wirowania należy przeprowadzić przemywanie poprzez ponowne zawieszenie komórek w pożywce RPMI z 10% FBS, a następnie ponownie je odwirować. Po przemyciu należy dodać jeden mililitr RPMI z 10% FBS na każde 5 × 10⁶ komórek dendrytycznych i wymieszać za pomocą pipety, aby je resuspenderować. Następnie resuspenderowane komórki dendrytyczne należy rozdzielić do dwóch probówek o równej objętości.Do jednej probówki należy dodać 10 µg/mL OT-II OVAp. Drugą probówkę pozostawić niepoddaną działaniu odczynnika; będzie ona służyć jako kontrola negatywna obciążenia antygenem.Inkubować probówki przez co najmniej jedną godzinę, aby załadować peptyd OVA na cząsteczki MHC II komórek dendrytycznych. W międzyczasie przygotować Salmonella enteritidis do infekcji, przemywając je trzy razy roztworem PBS. Po każdym przemyciu wirować z prędkością 1800 x g, aby usunąć podłoże LB oraz wszelkie wydzielone toksyny.Następnie bakterie należy resuspendować w pożywce RPMI. Po inkubacji należy zainfekować każdą probówkę z komórkami dendrytycznymi przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10, a następnie inkubować komórki przez jedną godzinę. Po zainfekowaniu komórek należy je trzykrotnie przemyć PBS, a następnie raz pożywką RPMI z 10% FBS.Wiruj próbki pomiędzy kolejnymi etapami przemywania z prędkością 450 x g, aby usunąć większość bakterii pozakomórkowych z rozpuszczalnego OVAp. Po ostatnim wirowaniu resuspenduj komórki w pożywce RPMI z 10% FBS do stężenia 20 × 10⁶ komórek na ml. Do 24-dołkowej płytki hodowlanej dodaj dwie miliony komórek CD4+T w objętości 0,5 ml do każdego z pięciu dołków.Następnie, aby kontrolować wpływ kontaktu fizycznego, umieść poliwęglanowe bariery trans-well o rozmiarze porów 3 µm w trzecim i czwartym dołku. Do pierwszego dołka dodaj 0,1 ml zakażonych, przeładowanych komórek dendrytycznych. Do drugiego dołka dodaj 0,1 ml zakażonych, nieprzeładowanych komórek dendrytycznych.Do jednego dołka dodaj 0,1 ml zakażonych, obciążonych komórek dendrytycznych, a do drugiego dołka 0,1 ml zakażonych, nieobciążonych komórek dendrytycznych. Na koniec, jako kontrolę negatywną, bezpośrednio zakaż piąty dołek zawierający komórki CD4+T przy MOI wynoszącym 10. Następnie uzupełnij całkowitą objętość w dołku do 0,6 ml za pomocą RPMI.Inkubuj płytkę przez 30 minut, aby umożliwić sformowanie synaps immunologicznych. Po inkubacji dodaj do każdej studni 100 µg Gentamycyny na 1 ml pożywki i inkubuj przez jedną godzinę. Gentamycyna jest antybiotykiem aminoglikozydowym, który nie przenika do komórek eukariotycznych.W związku z tym na tym etapie aminoglikozydy zabiją bakterie zewnątrzkomórkowe, ale nie bakterie wewnątrzkomórkowe. Po inkubacji zebrać nieprzylegające komórki do probówek o pojemności 15 ml i resuspender je w 10 ml buforu PBS BSA EDTA. Plastykową płytkę hodowlaną, do której przylegają większość komórek dendrytycznych, należy usunąć.Następnie delikatnie wymieszaj zawartość probówek na wortexie, aby zapewnić desegregację komórek. Odwiruj probówki z prędkością 600 x g. Następnie z dowolnej probówki odessaj 500 µL supernatantu komórkowego i przenieś go pipetą do nowej probówki.Posłuży to jako kontrola w celu wykazania skuteczności leczenia Gentamycyną. Wszystkie próbki należy umieścić w lodzie. Na tym etapie znajdują się sześć probówek: cztery probówki z próbkami badawczymi i dwie kontrole.Choć większość komórek dendrytycznych została usunięta wraz z płytką, próbki, które nie zostały oddzielone barierami transwell, mogą nadal je zawierać. Aby zmniejszyć zanieczyszczenie, należy zastosować magnetyczną izolację komórek lub sortowanie komórek w celu ponownej izolacji limfocytów T CD4+ z próbek, które nie zostały oddzielone barierami transwell. Końcowy izolat powinien zawierać mniej niż 2% komórek dendrytycznych.Pozostałe próbki należy przechowywać w lodzie. Po uprzednim oczyszczeniu limfocytów T CD4+ można przystąpić do oceny stopnia zakażenia bakteriami. Można to przeprowadzić poprzez liczenie kolonii lub za pomocą cytometrii przepływowej.W tym miejscu pokażemy, jak przeprowadzić zliczanie kolonii. Przemyj transinfekowane komórki CD4+T dwukrotnie roztworem PBS. Pomiędzy przemyciami wirówkę ustaw na 600 x g.Następnie należy policzyć komórki i resuspendować je w PBS do stężenia 2×10⁶ komórek/ml. Do 500 µl limfocytów T należy dodać 500 µl 0,1% Triton X-100 w celu ich lizy. Proces ten uwalnia bakterie wewnątrzkomórkowe z limfocytów T.Dla każdej próbki lizowanych komórek przygotuj trzy rozcieńczenia seryjne. Następnie podziel płytkę z agarem LB na cztery ćwiartki i nanieś 50 µL każdego rozcieńczenia, w tym zawiesiny nierozcieńczonej, na każdą z sekcji płytki. Na oddzielnej płytce z agarem LB nanieś przechowywany nadsącz komórkowy jako kontrolę skuteczności Gentamycyny.Następnie, na innej płytce, wysiej bezpośrednio zainfekowane limfocyty T jako dodatkową kontrolę. Inkubuj przez noc. Następnego dnia oblicz liczbę kolonii w każdej sekcji płytki i wyznacz liczbę jednostek tworzących kolonie dla każdej próbki.W przypadku wystąpienia niskiego poziomu zanieczyszczenia komórkami dendrytycznymi, zdefiniowanego jako mniej niż 2%, należy odjąć jednostki tworzące kolonie odpowiadające temu zanieczyszczeniu. Transinfekcję limfocytów T przeprowadzono z wykorzystaniem Salmonella enteritidis i ilościowo określono za pomocą testu przeżywalności z gentamycyną, zgodnie z opisem w tym filmie. Po wysianiu bezpośrednio zainfekowanych limfocytów T, jak pokazano po lewej stronie, nie zaobserwowano wzrostu kolonii, co wskazuje, że limfocyty T są oporne na bezpośrednie infekcje bakteryjne.Po wysiewaniu supernatantu z testów transinfekcji, jak pokazano po prawej stronie, nie zaobserwowano kolonii, co wskazuje na prawidłowe działanie gentamyciny. Tutaj przedstawiono wyniki testów transinfekcji przeprowadzonych z zastosowaniem barier trans-well. W nierozcieńczonej zawiesinie z próbek załadowanych OVA oraz próbek niezaładowanych zaobserwowano tylko trzy kolonie.Z kolei w przypadku bezpośredniego kontaktu limfocytów T z zakażonymi komórkami dendrytycznymi widoczne są liczne kolonie. Co więcej, gdy komórki dendrytyczne obciążone OVAp inkubowano z limfocytami T, pobieranie bakterii wzrosło około pięciokrotnie. Wspólnie dane te wskazują, że bezpośredni kontakt zakażonych komórek dendrytycznych z limfocytami T ułatwia pobieranie bakterii, a transinfekcja komórkowa jest nasilona podczas rozpoznawania antygenu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ilościowo określić transinfekcję z wykorzystaniem morskich limfocytów T. Zaletą ilościowego oznaczania transinfekcji za pomocą testu przeżywalności z gentamycyną jest jego bardzo wysoka czułość. Jesteśmy w stanie wykryć pojedynczą bakterię zakaźną.Ważne jest, aby pamiętać, że etap oczyszczania w tej procedurze jest krytyczny. Czystość musi być bardzo wysoka, jeśli do wyznaczenia wskaźnika transinfekcji mają zostać użyte zliczenia kolonii. Kwantyfikacja metodą cytometrii przepływowej nie posiada tego ograniczenia, ponieważ można łatwo odróżnić komórki dendrytyczne od limfocytów T, jednak warunkiem jest, aby bakterie wykazujące ekspresję GFP były wystarczająco jasne, by umożliwić wykrycie zainfekowanych komórek na tle zewnętrznej fluorescencji.Należy pamiętać, że praca z patogenami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać odpowiednich środków ostrożności.

t-cells-capture-bacteria-by-transinfection-from-dendritic-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Źródło: Cruz-Adalia, A., et al. Limfocyty T wychwytują bakterie przez transinfekcję z komórek dendrytycznych. J. Vis. Exp. (2016).Ten film pokazuje transinfekcję bakteryjną poprzez interakcje limfocytów T i komórek dendrytycznych specyficznych dla antygenu. Zakażone bakteriami komórki dendrytyczne prezentujące peptyd albuminy jaja kurzego są inkubowane z limfocytami T, bezpośrednio lub oddzielone błoną. Bezpośredni kontakt umożliwia tworzenie synaps immunologicznych, umożliwiając przenoszenie...

Transinfekcja bakteryjna limfocytów T in vitro poprzez tworzenie synaps immunologicznych

Ten film demonstruje metodę przekształcania komórek dendrytycznych (DC) w tolerogenne DC (TolDCs) za pomocą immunomodulującego środka farmakologicznego. Konwersja ta jest potwierdzana przez ocenę funkcji TolDC poprzez ich immunosupresyjne działanie na limfocyty T CD4 +.

Wpływ immunomodulującego środka farmakologicznego na interakcję między komórkami dendrytycznymi a limfocytami T CD4+

Tutaj używamy transdukcji retrowirusowej i transfekcji konkategomerycznej, aby stworzyć linię komórkową, która może wyrażać składniki wektora lentiwirusowego (LV) przy braku tetracykliny. Ten LV koduje GFP i jest pseudotypowany glikoproteiną SVGmu, która jest specyficzna dla receptora na komórkach dendrytycznych.

Linia komórkowa regulowana tetracykliną wytwarza wektory lentiwirusowe o wysokim mianie, które są specyficznie ukierunkowane na komórki dendrytyczne

W przeciwieństwie do bezkomórkowych cząsteczek HIV-1, zakażone limfocyty T CD4+ są skutecznie wykrywane przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC). Niniejszy manuskrypt opisuje metodę, w której jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) lub izolowane pDC są hodowane wspólnie z limfocytami T zakażonymi wirusem HIV-1 w celu oceny wrodzonego wykrywania przez pDC, oceniane przez uwalnianie IFN typu I.

Ocena wrodzonego wyczuwania limfocytów T CD4 + zakażonych wirusem HIV-1 przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne przy użyciu systemu kohodowli ex vivo.

Tutaj opisujemy test wysokiej wydajności chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) do ilościowego oznaczania immunosupresyjnego takrolimusu w wysuszonych plamach krwi przy użyciu prostego ręcznego etapu wytrącania białka i ekstrakcji kolumnowej online.

Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS

W tym protokole opisany jest model adoptywnego transferowego zapalenia jelita grubego dla antygenu mikrobioty jelitowej z limfocytów T. Limfocyty T CD4 + izoluje się od myszy transgenicznych CBir1 TCR. Są one specyficzne dla immunodominującego antygenu mikrobioty jelitowej CBir1 flageliny, który jest przenoszony do myszy biorcy Rag1-/-, prowadząc do zapalenia jelit.

Indukcja zapalenia jelit przez adoptywny transfer transgenicznych limfocytów T CD4 + CBir1 TCR do myszy z niedoborem odporności

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Protokół ten opisuje przeprogramowanie in vivo mysich komórek rakowych na komórki dendrytyczne typu 1 w mikrośrodowisku guza poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych PU.1, IRF8 i BATF3.

Wykonalne przeprogramowanie in vivo komórek nowotworowych na konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1

Niniejszy artykuł opisuje procedurę przygotowania znakowanej fluorescencyjnie wersji bakteriofaga lambda, zakażania bakterii E. coli, obserwowania efektów zakażenia pod mikroskopem oraz analizy wyników infekcji.

Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda

Poznaj metodę pomiaru transinfekcji bakteryjnej limfocytów T CD4+ z komórek dendrytycznych w modelu mysim. Ta technika pozwala badać mechanizmy odpowiedzi immunologicznej na patogeny.

Limfocyty T wychwytują bakterie przez transinfekcję z komórek dendrytycznych

Przeglądaj więcej filmów