Model udaru zakrzepowego oparty na przejściowym niedotlenieniu-niedokrwieniu mózgu
18 sierpnia 2015
Modele udaru zakrzepowo-zatorowego są kluczowymi narzędziami do optymalizacji terapii rekanalizacyjnej. W tym miejscu przedstawiamy mysi model udaru zakrzepowego oparty na przejściowym niedotlenieniu niedotlenienia i niedokrwieniu mózgu (tHI), które wywołuje zakrzepicę i zawał oraz pozytywnie reaguje na fibrynolizację za pośrednictwem tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) w oknie terapeutycznym podobnym do tych u pacjentów po udarze.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie prostego modelu udaru zakrzepowego ze stabilnym zawałem mózgu oraz ocena efektów ochronnych terapii aktywatorem plazminogenu tkankowego lub TPA. W pierwszej kolejności zaprezentowano indukcję przejściowej hipoksji niedokrwiennej mózgu lub THI poprzez podwójne podwiązanie prawej tętnicy szyjnej wspólnej lub RCCA oraz poddanie podwiązanego zwierzęcia warunkom hipoksji w celu wywołania zakrzepicy. Po 30 minutach przebywania w warunkach hipoksji dwa węzły na tętnicy szyjnej zostają rozwiązane.
W ostatnim kroku przedstawiono podanie leku oraz ocenę efektów terapii TPA. Alternatywnie można zbadać przepływ krwi mózgowej w czasie rzeczywistym, tworzenie się zakrzepu oraz stopień niedrożności naczynia. Ten model pozwala na wywołanie udaru zakrzepowego u dorosłych myszy z wykorzystaniem ich własnego układu krzepnięcia.
Chcemy wykorzystać ten model do zbadania, w jaki sposób mózg reguluje własny przepływ krwi w warunkach hipotetycznego niedokrwienia. Chcemy go również użyć do zbadania sposobów poprawy terapii przeciwzakrzepowej. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ podczas indukcji niedokrwienia mózgu może być trudno utrzymać prawidłową temperaturę ciała oraz miarowy oddech.
Kroki indukcji Co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem procedury. Umieść podłoże chirurgiczne na podkładce grzewczej, ustaw temperaturę 37 °C i połóż na podłożu wałek pod kark wykonany z korpusu strzykawki 3 mL. Ustaw system hipoksji tak, aby podawał 2% izofluranu w 7,5% tlenu zrównoważonego 92,5% azotem, a następnie wyreguluj sterowniki temperatury.
Umieść samca myszy szczepu C 57 black six w wieku od 10 do 13 tygodni i o masie od 22 do 30 g na stole operacyjnym. Po potwierdzeniu znieczulenia za pomocą testu uszczypnięcia palca, nałóż maść na oczy zwierzęcia. Wyprostuj cztery kończyny wzdłuż szyi, owiń je i przymocuj za pomocą taśmy medycznej.
Następnie, używając kremu do depilacji, usuń owłosienie z szyi zwierzęcia i oczyść pole operacyjne. Teraz przesuń stół operacyjny pod mikroskop stereoskopowy i wykonaj 0,5 centymetra nacięcia skóry w prawej części szyi wzdłuż linii środkowej. Za pomocą pęsety precyzyjnej rozsuń tchawicę i mięśnie, aby odsłonić prawą wspólną tętnicę szyjną, a następnie umieść dwa przecięte szwy jedwabne 5-0 pod tętnicą.
Należy uważać, aby oddzielić tętnicę szyjną od nerwu błędnego, a następnie zawiązać dwa wstępnie przecięte, uwalnialne szwy z jedwabiu 5-0 na prawej wspólnej tętnicy szyjnej (RCCA). Następnie należy użyć monofilamentowych szwów nylonowych 4-0 do zamknięcia skóry i szybko przenieść mysz do systemu hipoksji. Należy założyć maskę na nos i pysk zwierzęcia oraz wprowadzić sondę rektalną, aby podczas podawania hipoksji utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37,5 °C.
Po 30 minutach skoryguj ustawienie lamp grzewczych. Przenieś mysz z powrotem na stół operacyjny i rozluźnij dwa szwy. Następnie zamknij ranę za pomocą kleju tkankowego i umieść mysz w klatce, monitorując zwierzę aż do pełnego wybudzenia.
Alternatywnie, do badania przepływu krwi w mózgu podczas i po niedotlenieniu niedokrwiennym można zastosować obrazowanie kontrastowe plamek laserowych. Umieść zwierzę w pozycji brzusznej. Następnie wykonaj nacięcie w linii pośrodkowej skóry głowy o długości jednego centymetra, aby odsłonić, ale nie otwierać czaszki.
Następnie niezwłocznie przenieś zwierzę do obrazowca przepływu krwi i rozpocznij rejestrację mózgowego przepływu krwi. Przeglądaj obrazy mózgowego przepływu krwi zgodnie z instrukcjami producenta, korzystając z oprogramowania FLPI w celu analizy wybranych obszarów w czasie rzeczywistym. Aby ocenić efekty terapii TPA, wykonaj zwierzętom wstrzyknięcia dożylne do żyły ogonowej w odpowiednim czasie po przejściowym jednostronnym zamknięciu tętnicy szyjnej i hipoksji.
Następnie określ objętość zawału za pomocą badania TTC in vivo 24 godziny po przejściowym niedokrwieniu niedotlenowym mózgu. Następnego dnia użyj wibrotomu, aby uzyskać przekroje o grubości jednego milimetra. Na koniec wykonaj serię czterech obrazów przekrojów mózgu przy użyciu mikroskopii cyfrowej i wykorzystaj odpowiednie oprogramowanie do analizy obrazu, aby obliczyć objętość zawału jako stosunek białego obszaru zawałowego do powierzchni nieuszkodzonej przeciwległej półkuli.
W ramach tej procedury można zastosować inne metody trombolizy, aby ocenić ich efekty oraz potencjał kliniczny. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny udarów niedokrwiennych do badania terapii trombolitycznej w mózgu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia mysi model udaru zakrzepowego, który symuluje przejściowe warunki niedotlenienia i niedokrwienia mózgu (tHI). Model ten został opracowany w celu oceny skuteczności terapii aktywatorem plazminogenu tkankowego (tPA) w indukowaniu rekanalizacji oraz ograniczaniu obszaru zawału.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Modele udaru
- Interwencje terapeutyczne
Wstęp
- Modele udaru zakrzepowo-zatorowego są niezbędne do testowania terapii.
- Przejściowa hipoksja-ischemia mózgu (tHI) może indukować zakrzepicę.
- tPA jest powszechnie stosowanym lekiem w leczeniu pacjentów po udarze.
- Zrozumienie okna terapeutycznego jest kluczowe dla skutecznego leczenia.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego modelu udaru zakrzepowego u myszy.
- Ocena efektów ochronnych terapii tPA.
- Ocena czasu podania i skuteczności leczenia po udarze.
Zastosowane metody
- Indukcja tHI poprzez podwójne podwiązanie prawej wspólnej tętnicy szyjnej.
- Poddanie zwierzęcia warunkom hipoksji w celu wywołania zakrzepicy.
- Zwolnienie podwiązania po 30 minutach hipoksji.
- Podanie tPA i ocena jego wpływu na rekanalizację.
Główne wyniki
- Model ten pozwolił na skuteczne wywołanie stabilnego zawału mózgu.
- Terapia tPA wykazała korzystne efekty w obrębie okna terapeutycznego.
- Przepływ krwi w mózgu oraz tworzenie się zakrzepów były skutecznie monitorowane.
- Model ten umożliwia badanie mechanizmów udaru oraz skuteczności leczenia.
Wnioski
- Mysi model udaru zakrzepowego jest cennym narzędziem badawczym.
- Terapia tPA wykazuje potencjał w leczeniu udarów zakrzepowo-zatorowych.
- Dalsze badania mogą pogłębić zrozumienie metod leczenia udaru.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten model udaru zakrzepowego niweluje lukę translacyjną w przedklinicznych badaniach nad udarem, zapewniając system reagujący na tPA, który odzwierciedla kliniczną trombolizę. Umożliwia on mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku terapii neuroprotekcyjnych i trombolitycznych poprzez powtarzalną indukcję zakrzepicy bez konieczności stosowania zatorów chirurgicznych lub kraniektomii. Model ten zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów terapeutycznych oraz ocenie okna terapeutycznego w programach rozwoju leków na udar.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków zakrzepowych oraz hemodynamicznego wpływu na uszkodzenia niedokrwienne.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zstandaryzowany model dla spójnych odczytów wielkości zawału i śmiertelności w różnych laboratoriach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera priorytetyzację celów terapeutycznych poprzez modelowanie zakrzepicy wrażliwej na tPA, istotnej w kontekście klinicznego udaru zakrzepowo-zatorowego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie mierzalnych punktów końcowych, w tym objętości zawału, odkładania fibryny/płytek krwi oraz dynamiki przepływu krwi w mózgu.
- Wartość operacyjna: Ułatwia standaryzację testów poprzez zastosowanie przejściowej hipoksji-niedokrwienia i odwracalnego podwiązania tętnicy szyjnej.
- Gotowość do przesiewu: Umożliwia ocenę zależności dawka-odpowiedź dla środków trombolitycznych przy zastosowaniu tPA w zależności od czasu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodność translacyjna: Indukuje zakrzepicę w obszarze tętnicy środkowej mózgu, co odzwierciedla patologię udaru u ludzi.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia badanie endogennej fibrynolizy i szlaków krzepnięcia in vivo.
- Ciągłość przedkliniczna: Stanowi pomost między etapem odkrycia a walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie deficytów reperfuzji i ewolucji zawału.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków w udarach – od walidacji celu, przez optymalizację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności – umożliwiając iteracyjną ocenę kandydatów na leki trombolityczne i neuroprotekcyjne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących tworzenia zakrzepicy, uszkodzeń reperfuzyjnych oraz mechanizmów krążenia obocznego.
- Przesiew: Umożliwia standaryzowaną ocenę związków chemicznych, przyjmując redukcję wielkości zawału oraz poprawę przeżywalności jako punkty końcowe ilościowe.
- Analityka: Dostarcza mierzalnych wyników, w tym obrazowania kontrastowego plamek laserowych przepływu krwi w mózgu, barwienia TTC do ilościowego oznaczenia zawału oraz monitorowania śmiertelności.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez modelowanie odpowiedzi na tPA oraz efektów okna terapeutycznego obserwowanych w klinicznym udarze mózgu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do międzyprogramowej oceny strategii przeciwzakrzepowych, fibrynolitycznych i neuroprotekcyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w patologii udaru poprzez modelowanie klinicznie istotnej zakrzepicy oraz odpowiedzi na tPA.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanej ekspozycji na hipoksję, kontroli temperatury i odwracalnemu podwiązaniu tętnicy.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez identyfikację związków o skuteczności zależnej od czasu w modelu wrażliwym na trombolizę.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowanie postępów do poziomu ryzyka poprzez priorytetyzację środków redukujących wielkość zawału i śmiertelność w systemie odpowiadającym na tPA.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii gryzoni, obsługi systemów hipoksji oraz monitorowania fizjologicznego.
- Zależne od precyzyjnego utrzymania temperatury (37.5 ± 0.5°C) oraz dostarczania gazów hipoksyjnych (7.5% O2 w bilansie N2).
- Wymaga standaryzacji czasu ligacji/zwolnienia oraz okien podawania tPA (0.5, 1 lub 4 h po tHI).
- Kwestie adaptacyjne obejmują zmienność krzepnięcia specyficzną dla szczepu oraz walidację lokalizacji zawału.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność modelu od nienaruszonego endogennego układu krzepnięcia oraz wrażliwość na czas trwania hipoksji.
