Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

Ogólnym celem badania działania drażniącego na oczy jest klasyfikacja i oznakowanie substancji i mieszanin zgodnie z ich potencjałem działania drażniącego na oczy. Procedura ta wykorzystuje trójwymiarowy, zrekonstruowany model tkanki przypominający rogówkę. Po przybyciu zestaw testowy jest wstępnie inkubowany przez noc w pożywce do oznaczania następnego dnia, następnego dnia tkanki są nawadniane, a następnie następuje miejscowe nanoszenie kontroli dodatnich i ujemnych oraz badanych substancji chemicznych na powierzchnię tkanek w dwóch egzemplarzach.

Po ustalonym okresie narażenia badane substancje chemiczne są usuwane przez mycie. Tkanki są następnie inkubowane w świeżej pożywce testowej, a następnie ocenia się toksyczność substancji chemicznych za pomocą testu MTT. Ostatecznie potencjał drażniący badanych artykułów można ocenić, porównując względną żywotność tkanek poddanych działaniu badanego wyrobu z tkankami poddanymi kontroli ujemnej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak szybkie testy podrażnień śladowych, jest to, że nie angażuje ona zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystuje zdekonstruowany in vitro model tkanki rogówkowej przypominający okular, który składa się z normalnych komórek ludzkich. Ma zastosowanie do wszystkich rodzajów substancji i mieszanin i może rozróżniać substancje chemiczne, które wywołują podrażnienie oczu lub poważne uszkodzenie oczu spowodowane materiałami.

Nie powoduje działania drażniącego, które nie wymagają klasyfikacji i oznakowania. Zrekonstruowana ludzka rogówka, taka jak tkanka nabłonkowa lub epi. Oko przygotowuje się we wkładkach z porowatą membraną, przez którą składniki odżywcze przechodzą do komórek.

Zrekonstruowana tkanka tworzy niezrogowaciały nabłonek, który modeluje nabłonek rogówki z stopniowo rozwarstwionymi, ale nie zrogowaciałymi komórkami. Po otrzymaniu ludzkiego zestawu nabłonkowego przypominającego rogówkę zrównoważ tkanki w 24-dołkowym pojemniku transportowym do temperatury pokojowej Po 15 minutach otwórz worek zawierający 24-dołkową płytkę tkankową w sterylnych warunkach i sprawdź wszystkie tkanki pod kątem pęcherzyków powietrza między żelem agros a wkładkami. Ciąć. Otwórz taśmę.

Zdejmij osłonę sterylną gazą i sprawdź powierzchnię tkanki. Następnie podwielokrotność jednego mililitra pożywki testowej zestawu o temperaturze 37 stopni Celsjusza do studzienek wstępnie oznakowanych płytek sześciodołkowych. Następnie użyj sterylnych kleszczy, aby delikatnie osuszyć tkankę zawierającą wkładki na sterylnej gazie, aby usunąć wszelkie pozostałe aros transportowe i umieść je w indywidualnych dołkach sześciu płytek dołkowych.

Po godzinie zastąp pożywkę jednym mililitrem świeżej pożywki testowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj tkanki w standardowych warunkach hodowli przez noc. Następnego dnia głaszczę 20 mikrolitrów DPBS bez wapnia i magnezu na wierzchołkowej powierzchni każdej tkanki. Jeśli DPBS nie rozprzestrzenia się po tkankach, delikatnie przytrzymaj wkładkę kleszczami i postukaj w płytkę, aby upewnić się, że sól fizjologiczna zwilży całą powierzchnię tkanki.

Inkubuj płytki przez 30 minut. Następnie, aby poddać tkanki działaniu płynnych artykułów testowych, należy zastosować 50 mikrolitrów kontroli ujemnej, kontroli pozytywnej i odpowiednich artykułów testowych w dwóch egzemplarzach zgodnie z harmonogramem. Należy upewnić się, że zabiegi obejmują całą powierzchnię tkanki, a następnie inkubować wkładki przez 30 minut, aby potraktować tkanki stałymi artykułami testowymi.

Najpierw przenieś wkładki na sterylną powierzchnię. Płytkę należy przykryć, aby zapobiec zanieczyszczeniu unoszącymi się w powietrzu cząstkami stałymi. Następnie za pomocą wypoziomowanej łyżki nałóż miejscowo 50 miligramów badanego artykułu na zduplikowane tkanki zgodnie z harmonogramem, uważając, aby zabieg objął całą powierzchnię tkanki.

Alternatywnie użyj ampułkolitrowej strzykawki o pojemności jednego mililitra z odciętą głowicą. Aby umieścić proszki bezpośrednio na kulturze. Nacisnąć tłok, aby nałożyć proszek natychmiast po nałożeniu stałych części testowych, umieścić wkładki z powrotem na płytkach z sześcioma dołkami i inkubować tkanki przez sześć godzin w celu wypłukania tkanek.

Po poddaniu działaniu substancji napełnić 3 150-mililitrowe zlewki na badany przedmiot 100 mililitrami DPBS pod koniec inkubacji ekspozycji. Chwyć górną krawędź wkładek zakrzywionymi kleszczami, aby usunąć je z dołków. Następnie za pomocą kleszczyków podnieś dwie wkładki z tego samego zabiegu za ich górne krawędzie i zdekantuj zabiegi na czysty materiał chłonny.

Następnie zanurz wkładki w pierwszej zlewce DPBS, myjąc tkanki okrężnymi ruchami wirowymi przez dwie sekundy. Następnie podnieś wkładki tak, aby były w większości wypełnione DPBS i zdekantuj płyn z powrotem do zlewki. Powtórz mycie dwa razy w pierwszej zlewce.

Następnie po ostatnim umyciu wypłucz wkładki w drugiej i trzeciej zlewce DPB S3 razy w ten sam sposób. Obróć każdą wkładkę pod kątem około 45 stopni z otwartym końcem skierowanym w dół i dotknij górną krawędzią materiału chłonnego, aby zdekantować pozostały DPBS. Następnie natychmiast zanurz tkanki w pięciu mililitrach pożywki testowej o temperaturze pokojowej.

Na wstępnie oznakowanej płytce 12-dołkowej pod koniec okresu zanurzania po namaczaniu, zdekantować pożywkę testową i osuszyć wkładki na materiał chłonny. Następnie przenieś wkładki do nowej sześciodołkowej płytki zawierającej jeden mililitr ciepłej pożywki testowej na studzienkę i umieść płytki w inkubatorze, aby rozpocząć test żywotności MTT. Przenieść wkładki do 24-dołkowej płytki zawierającej 0,3 mililitra świeżo przygotowanego roztworu MTT.

Przed przeniesieniem nanieś wkładki na materiał chłonny. Uwolnij wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione pod wkładkami i po trzech godzinach włóż tkanki z powrotem do inkubatora, ułóż spody wkładów na materiale chłonnym. Następnie, w celu ekstrakcji zanurzonej niebarwiących płynnych artykułów testowych, zanurz wkładki we wstępnie oznakowanej 24-dołkowej płytce zawierającej dwa mililitry odpowiedniego roztworu ekstrakcyjnego na studzienkę do niezanurzonej ekstrakcji stałych lub ciekłych barwników.

Przenieś wkładki do wstępnie oznakowanej płytki sześciodołkowej zawierającej jeden mililitr roztworu ekstrakcyjnego na studzienkę. Następnie uszczelnij płytki zgrzewarką lub paraformem, aby zahamować parowanie i ekstrahuj na wytrząsarce orbitalnej przez dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem pod koniec ekstrakcji zanurzonej. Przekłuć tkanki, a następnie zdekantować płyn z każdej wkładki z powrotem do środka, a następnie wyrzucić wkładki z chusteczkami.

Wymieszać roztwór ekstraktu w każdym dołku i przenieść dwie podwielokrotności każdej próbki o pojemności 200 mikrolitrów do odpowiednich dołków wstępnie znakowanej płytki 96-dołkowej, jak pokazano na schemacie na końcu ekstrakcji bez zanurzenia. Wyrzuć wkładki i chusteczki bez przekłuwania i dodaj do każdej z nich jeden mililitr roztworu ekstrakcyjnego. Dobrze wymieszać roztwór ekstrakcyjny w studzienkach i przenieść dwie podwielokrotności o pojemności 200 mikrolitrów z każdej próbki do odpowiednich dołków wstępnie znakowanej płytki 96-dołkowej, jak właśnie pokazano.

Na koniec odczytaj gęstość optyczną próbek w 96-dołkowym spektrofotometrze o długości fali 570 nanometrów bez użycia filtra referencyjnego i wprowadź wyniki do arkusza kalkulacyjnego w celu obliczenia odpowiedniej odpowiedzialności tkankowej. W tym eksperymencie uwzględniono korekty wynikające z interferencji badanej substancji chemicznej, jak wskazano w protokole tekstowym, w niniejszym eksperymencie przedstawiono reprezentatywne wyniki badań działania drażniącego na oczy przeprowadzone na 10 badanych artykułach oraz kontrole ujemne i dodatnie. Zaobserwowano średnią gęstość optyczną wynoszącą 1,31 dla kontroli ujemnej odpowiadającą 100% żywotności tkanek przy względnej żywotności tkanek wynoszącej 31,2%Dla badań kontroli dodatniej artykuły 1, 2, 4, 7 i 8 wykazywały zmienność tkanek większą niż 60%, klasyfikując te artykuły jako artykuły 3, 5, 6, 9 i 10 niepowodujące działania drażniącego.

Z drugiej strony wykazywały zmienność tkanek mniejszą lub równą 60%, co skutkuje ich klasyfikacją jako drażniące. Różnica w żywotności tkanek między zduplikowanymi tkankami w tym eksperymencie wyniosła mniej niż 20% dla wszystkich badanych artykułów z wyjątkiem artykułu testowego drugiego. W związku z tym wyniki dla wszystkich badanych artykułów, z wyjątkiem artykułu drugiego, uznano za kwalifikowane, ponieważ spełniały one wszystkie kryteria akceptacji testu działania drażniącego na oczy.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób powinien on przeprowadzić test DICATION, wykorzystując in vitro rekonstrukcyjny ludzki model tkanki rogówkowej przypominającej czwartą próbkę, oznaczanie zagrożeń związanych z substancją chemiczną. Procedura ta została zaimplementowana w wytycznych dotyczących testów EOC D jako część strategii testowania poziomów.