Name: Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj test drażniący oczu wykorzystujący trójwymiarowy model tkanki nabłonka rogówki RhCE. Ta metoda pozwala klasyfikować substancje chemiczne bez użycia zwierząt zgodnie z wytycznymi OECD.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Johnowi Harbellowi za jego wsparcie naukowe i czas poświęcony projektowi EIT. Autorzy pragną również podziękować firmom Beiersdorf AG (Niemcy), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter & Gamble/Cosmital (Szwajcaria), Laboratoire Pierre Fabre (Francja), Harlan Laboratories (Wielka Brytania) i LVMH Parfume (Francja) za udział w wieloośrodkowych międzynarodowych badaniach prewalidacyjnych i walidacyjnych testu podrażnienia oczu15.

<ol><li>National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Request+for+Ocular+Irritancy+Test+Data+From+Human%2C+Rabbit%2C+and+In+Vitro+Studies+Using+Standardized+Testing+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Federal+Register%22%5BJournal%5D)">Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods.</a> Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).</li>
<li>Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ. L396 (49), European Commission. 1-849 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Globally+Harmonized+System+of+Classification+and+Labelling+of+Chemicals+%28GHS%29%22">Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS)</a>. , Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).</li>
<li>Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+Study+of+Irritation+and+Toxicity+of+Substances+Applied+Topically+to+the+Skin+and+Mucous+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther+November%22%5BJournal%5D)">Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes.</a> J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).</li>
<li>Adriaens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+analysis+of+the+Draize+test+for+serious+eye+damage%2Feye+irritation%3A+importance+of+understanding+the+in+vivo+endpoints+under+UN+GHS%2FEU+CLP+for+the+development+and+evaluation+of+in+vitro+test+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+tox%22%5BJournal%5D)">Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods.</a> Arch tox. 88, 701-723 (2014).</li>
<li>Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EC%2FHO+international+validation+study+on+alternatives+to+the+Draize+eye+irritation+test%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.</a> Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).</li>
<li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+safety%3A+a+silent+%28in+vitro%29+success+story%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Ocular safety: a silent (in vitro) success story.</a> Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).</li>
<li>Wilhelmus, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Draize+Eye+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The Draize Eye Test.</a> Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).</li>
<li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+alternatives+for+ocular+irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+health+persp%22%5BJournal%5D)">In vitro alternatives for ocular irritation.</a> Environ health persp. 106, 485-492 (1998).</li>
<li>McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+ocular+irritation+ranges+of+market-leading+cosmetic+and+personal-care+products+using+an+in+vitro+tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent.</a> Toxicologist. 66, 243(2002).</li>
<li>Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+EpiOcular+assay+for+preclinical+qualification+of+formulas+for+human+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies.</a> Toxicologist. 96, 249(2007).</li>
<li>Yin, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+ocular+irritation+potential+of+surfactants-based+formulations+at+different+concentrations+using+the+EpiOcular+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model.</a> Toxicologist. 108, 378(2009).</li>
<li>Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarbell%2C+J+%22Handbook+of+Toxicology%22">Handbook of Toxicology</a>. , 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).</li>
<li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+EpiOcular%28TM%29+eye+irritation+test+for+hazard+identification+and+labelling+of+eye+irritating+chemicals+in+response+to+the+requirements+of+the+EU+cosmetics+directive+and+REACH+legislation%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation.</a> Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).</li>
<li>Pfannenbecker, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cosmetics+Europe+Multi-Laboratory+Pre-Validation+of+the+EpiOcular+Reconstituted+Human+Tissue+Test+Method+for+the+Prediction+of+Eye+Irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation.</a> Toxicol in vitro. , (2013).</li>
<li>MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , MatTek Corporation. (2014).</li>
<li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiOcular+Eye+Irritation+Test+%28EIT%29+for+Hazard+Identification+and+Labeling+of+Eye+Irritating+Chemicals%3A+Protocol+Optimization+for+Solid+Materials+and+Extended+Shipment+Times%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times.</a> Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).</li>
<li>Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-house+validation+of+the+EpiOcular%28TM%29+eye+irritation+test+and+its+combination+with+the+bovine+corneal+opacity+and+permeability+test+for+the+assessment+of+ocular+irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation.</a> Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).</li>
<li>Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guideline+for+the+Testing+of+Chemicals%22">OECD Guideline for the Testing of Chemicals</a>. , (2014).</li>
<li>Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, , (2003).</li>
<li>Kandarova, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+Upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests+%E2%80%94+An+Assessment+of+the+Performance+of+the+Optimised+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test.</a> Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).</li>
</ol>

Opłaty za publikację tego artykułu zostały opłacone przez MatTek Corporation. Autorzy są pracownikami firmy MatTek Corporation.

Przedstawiliśmy Test Podrażnienia Oczu (Ryc. 1), który został opracowany dla modelu tkanki EpiOcular . EIT jest w stanie oddzielić substancje drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od materiałów, które nie wymagają oznakowania (kategoria nr GHS) o wysokim stopniu czułości i swoistości17. EIT w przedstawionej formie nie dyskryminuje substancji chemicznych kategorii 1 GHS od substancji chemicznych kategorii 2. EIT został zatwierdzony pod kątem klasyfikacji i oznakowania potencjału drażniącego na oczy szerokiej gamy substancji chemicznych, w tym składników kosmetycznych i farmaceutycznych. W połączeniu z innymi badaniami in vitro EIT będzie służył jako zamiennik badania in vivo działania drażniącego na oczy królika.
EIT stosuje dwa podobne, ale odrębne protokoły dla materiałów płynnych i stałych, które różnią się długością ekspozycji i okresami inkubacji po ekspozycji (rys. 1). Punktem końcowym stosowanym w EIT jest żywotność tkanek, określona za pomocą testu MTT, który był wcześniej stosowany w zwalidowanych modelach ludzkich tkanek nabłonkowych20,21. Do wykonania tego testu nie jest potrzebny żaden specjalny sprzęt poza standardowym sprzętem do hodowli komórek. Ze względu na wysoki poziom odtwarzalności tkanka-tkanka stosuje się n = 2 tkanki zamiast zwykle zalecanego n = 3. Możliwość wykorzystania n= 2 tkanek jest krytycznym aspektem protokołu, ponieważ pozwala doświadczonemu operatorowi na jednoczesne przetwarzanie dwóch tkanek, minimalizując w ten sposób zmienność testu, która może powstać z powodu różnego obchodzenia się z poszczególnymi tkankami14. Ponadto, stosując n = 2 tkanki na badany artykuł, można ocenić podrażnienie 10 badanych substancji o tym samym stanie fizycznym (ciekłym lub stałym), wraz z kontrolami pozytywnymi i ujemnymi, przy użyciu jednego zestawu (24 tkanki).
Innymi kluczowymi punktami, które zapewniają wiarygodną klasyfikację materiałów, są specyfikacje substancji służącej do kontroli dodatniej (żywotność tkanek ≤50,0%), odtwarzalność między zduplikowanymi tkankami (różnica <20,0%) oraz odczyty OD w ramach kontroli ujemnej (>0,8 i <2,5).
Podczas przeprowadzania testu EIT ważne jest przestrzeganie zatwierdzonego protokołu oraz sugerowanych schematów dawkowania i płukania (tabele 3 i 4), ponieważ odchylenie od protokołu lub zmiany w okresach inkubacji mogą skutkować zmianą wyniku. Podobnie, odchylenia od 3-godzinnego czasu inkubacji MTT spowodują różne odczyty MTT i mogą wpłynąć na wynik testu.
Czasami badana substancja chemiczna może mieć właściwości optyczne lub inne, które mogą zakłócać test żywotności tkanek MTT lub powodować zmniejszenie MTT. Na przykład badana substancja chemiczna może bezpośrednio redukować MTT do niebiesko-fioletowego produktu reakcji lub może być barwną substancją, która pochłania światło w tym samym zakresie co formazan MTT (~570 nm). Te badane substancje chemiczne będą jednak stanowić problem tylko wtedy, gdy w czasie przeprowadzania testu MTT wystarczająca ilość materiału jest nadal obecna w tkance (lub jest przez nią wchłaniana). Aby uniknąć tych zakłóceń, do protokołu EIT włączono obszerne procedury płukania. Jeśli płukanie nie usunie TA, a TA zakłóca redukcję MTT, należy zastosować dodatkowe kontrole w celu wykrycia i skorygowania tego. Krótko mówiąc, jeżeli podejrzewa się bezpośrednie zmniejszenie MTT badanej substancji chemicznej, 50 μl (lub 50 mg w przypadku ciał stałych) danej substancji chemicznej inkubuje się przez 3 godziny z roboczym roztworem MTT w SCC (NC, 50 μl sterylnej wody dejonizowanej, należy uruchomić jednocześnie). Jeśli roztwór MTT zmieni kolor na niebiesko-fioletowy, zakłada się, że badany artykuł zmniejszył MTT. W takim przypadku należy przeprowadzić kontrolę funkcjonalną z wykorzystaniem zamrożonych tkanek kontrolnych, aby ocenić, czy badany materiał wiąże się z tkanką i prowadzi do fałszywego sygnału redukcji MTT. W przypadku znacznego zmniejszenia MTT w kontroli tkanek zabitych narażonych na działanie TA (w stosunku do ilości w tkance żywotnej niepoddanej działaniu substancji czynnej), średnia żywotność badanego elementu musi zostać skorygowana poprzez odjęcie średniej żywotności zabitej grupy kontrolnej.
EIT popełnia błędy po stronie bezpieczeństwa, o czym świadczy niska liczba fałszywie ujemnych klasyfikacji14,15,18. Co ważne, żadna z substancji chemicznych kategorii 1 GHS, które działają żrąco na oczy i stanowią najpoważniejsze zagrożenie dla oczu, nie została sklasyfikowana jako niedrażniąca w tym teście14,15,18,19. Wreszcie, jedną z głównych zalet metody badania in vitro RhCE jest możliwość badania czystych materiałów ciekłych i stałych (co nie jest możliwe w przypadku dwuwymiarowych, zanurzonych kultur komórkowych).
EIT w znacznym stopniu przyczyni się do określenia potencjału drażniącego na oczy szerokiej gamy materiałów zgodnie z systemem klasyfikacji i oznakowania GHS ONZ. Zastąpienie zwierząt w celu określenia toksyczności ocznej jest celem badań toksykologicznych od wielu lat. W 2014 r. metoda badawcza EIT przeszła formalne badanie walidacyjne wspierane przez EURL ECVAM, a w 2015 r. metoda badawcza EIT została wdrożona do wytycznych OECD dotyczących badań jako OECD TG 492.

Produkty konsumenckie, takie jak kosmetyki, detergenty i domowe środki czyszczące, zawierają różne substancje chemiczne, które mogą spowodować poważne uszkodzenia, jeśli dotkną oczy. W związku z tym amerykańskie i unijne agencje regulacyjne wymagają testowania tych środków pod kątem działania drażniącego na oczy w celu zapewnienia bezpieczeństwa konsumentów1. Ocena potencjału działania drażniącego na oczy mieszanin i preparatów jest również wymogiem zgodności z przepisami REACH (Registration, Evaluation, Authorization, and Restriction of Chemicals) w zakresie etykietowania składników kosmetycznych zgodnie z dyrektywą kosmetyczną UE w zakresie transportu chemikaliów oraz etykietowania pestycydów i artykułów gospodarstwa domowego2. Obecnie agencje regulacyjne wymagają oceny zagrożeń dla oczu przy użyciu Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS)3. GHS opiera się głównie na teście podrażnienia oczu Draize'a, najczęściej stosowanym teście podrażnienia oczu, w którym obce substancje i mieszaniny są wprowadzane bezpośrednio do worka spojówkowego oka królika4. Zgodnie z klasyfikacją GHS kategoria 1 GHS (substancje na oczy) odnosi się do badanych substancji chemicznych, które powodują poważne początkowe uszkodzenie tkanek oka lub poważne uszkodzenie oka i wzroku, które nie jest w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po narażeniu3,5. Kategoria 2 GHS odnosi się do badanych substancji chemicznych, które powodują znaczące zmiany w oku, które są w pełni odwracalne w ciągu 21 dni od narażenia. Badane substancje chemiczne, które nie są substancjami ani drażniącymi, określa się mianem nr kategorii GHS.
Przez ponad 40 lat, test Draize na oku królika był krytykowany za brak odtwarzalności, przecenianie ludzkich reakcji i wykorzystanie żywych zwierząt5-8. Obawy te zachęciły do wielu propozycji udoskonalenia, ograniczenia i zastąpienia testu in vivo 9. Potrzeba zatwierdzonych alternatyw niewymagających wykorzystania zwierząt została dodatkowo wzmocniona przez przyjęcie siódmej poprawki do dyrektywy kosmetycznej, która zakazała wykorzystywania zwierząt w ocenie bezpieczeństwa produktów kosmetycznych (w 2005 r.) i składników (w 2009 r.)2.
Od 1996 roku, zrekonstruowany model tkanki rogówkowej jest szeroko stosowany przez przemysł kosmetyczny do oceny potencjału drażniącego surowców, preparatów na bazie środków powierzchniowo czynnych i mieszanin złożonych, które są przeznaczone do stosowania w okulub w jego pobliżu. Zastosowanie modelu tkankowego RhCE pozwala na bezpośrednią miejscową aplikację badanego materiału na powierzchnię tkanki w jego natywnej, nierozcieńczonej postaci. W ten sposób preparaty nierozpuszczalne w wodzie mogą być testowane bez rozcieńczania ich rozpuszczalnikami. W odpowiedzi na wniosek EURL ECVAM (Laboratorium Referencyjne Unii Europejskiej, Europejskie Centrum Walidacji Metod Alternatywnych) dotyczący szeroko stosowanej, prostej i ekonomicznej metody, opracowano Test Podrażnienia Oczu (EIT), który wykorzystuje pojedynczy czas ekspozycji i jest w stanie oddzielić substancje drażniące i dla oczu od materiałów, które nie wymagają oznakowania (Rysunek 1)14. Na podstawie wyników dla 83 substancji chemicznych (44 ciecze i 39 ciał stałych), EIT osiągnął 95,5/68,2/ i 81,8% czułości/swoistości i dokładności (SS&A) dla cieczy, 100,0/68,4/ i 84,6% SS&A dla ciał stałych oraz 97,6/68,3/ i 83,1% dla ogólnego SS&A.
W 2007 roku, wielolaboratoryjne badanie prewalidacyjne sponsorowane przez Cosmetics Europe (dawniej Colipa) pod auspicjami EURL ECVAM oceniło znaczenie i wiarygodność EIT w celu doprowadzenia go do formalnej walidacji15. W tym badaniu przeprowadzono 298 niezależnych badań w siedmiu niezależnych laboratoriach. Wyniki badania wykazały 99,7% zgodność w przewidywaniach przy niskich współczynnikach zmienności we wszystkich uczestniczących laboratoriach15. W związku z tym w 2010 r. protokół EIT został włączony do formalnego programu walidacji EURL ECVAM. W badaniu walidacyjnym wykorzystano 104 zakodowane badane substancje chemiczne, w tym pojedyncze substancje i mieszaniny chemiczne, dla których dostępne były dane referencyjne in vivo (dane dotyczące działania drażniącego na oczy Draize'a). Opierając się na sukcesie tych prac, w 2014 r. przedłożono projekt wytycznych OECD dotyczących badań. Oczekuje się, że EIT w znacznym stopniu przyczyni się do klasyfikacji potencjału działania drażniącego na oczy szerokiej gamy materiałów zgodnie z systemem klasyfikacji i oznakowania GHS ONZ.

test działania drażniącego na oczy (eit) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (rhce)

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Aby spełnić wymagania Siódmej Poprawki do Dyrektywy Kosmetycznej UE i prawodawstwa UE REACH, potrzebne są sprawdzone alternatywne metody wiarygodnej i dokładnej oceny toksyczności dla oczu u człowieka. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowaliśmy test podrażnienia oczu (EIT), który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE), który jest oparty na normalnych komórkach ludzkich. EIT jest w stanie oddzielić substancje drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) oraz te, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS). Test wykorzystuje dwa oddzielne protokoły, jeden przeznaczony dla ciekłych chemikaliów i drugi, podobny protokół dla stałych artykułów testowych. Model predykcyjny EIT wykorzystuje pojedynczy okres ekspozycji (30 minut dla cieczy, 6 godzin dla ciał stałych) i granicę żywotności pojedynczej tkanki (60,0% zgodnie z testem MTT). Na podstawie wyników dla 83 substancji chemicznych (44 ciecze i 39 ciał stałych) EIT osiągnął 95,5/68,2/ i 81,8% czułości/swoistości i dokładności (SS&A) dla cieczy, 100,0/68,4/ i 84,6% SS&A dla ciał stałych oraz 97,6/68,3/ i 83,1% dla ogólnego SS&A. EIT w znacznym stopniu przyczyni się do sklasyfikowania potencjalnego działania drażniącego na oczy przez szeroką gamę ciekłych i stałych substancji chemicznych bez wykorzystania zwierząt, aby spełnić wymogi regulacyjne w zakresie badań. Metoda EpiOcular EIT została wdrożona w 2015 r. do wytycznych OECD dotyczących badań jako TG 492.

Opracowaliśmy test podrażnienia oczu, który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE). Test jest w stanie odróżnić materiały drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od tych, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS).

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Ogólnym celem testu podrażnienia oka jest klasyfikacja i etykietowanie substancji oraz mieszanin zgodnie z ich potencjałem do wywoływania podrażnień oka. Procedura ta wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki przypominającej rogówkę. Po otrzymaniu zestawu testowego, przeprowadza się inkubację wstępną przez noc w medium do analizy, a następnego dnia tkanki są nawadniane, po czym następuje miejscowe naniesienie kontroli pozytywnej i negatywnej oraz badanych substancji chemicznych na powierzchnie tkanek w dwóch powtórzeniach.Po ustalonym czasie ekspozycji substancje testowe są usuwane poprzez płukanie. Tkanki poddawane są inkubacji poekspozycyjnej w świeżej pożywce testowej, a następnie toksyczność substancji ocenia się za pomocą testu MTT. Ostatecznie potencjał drażniący badanych artykułów można ocenić, porównując względną żywotność tkanek traktowanych badanym artykułem do żywotności tkanek traktowanych kontrolą negatywną.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak szybkie testy podrażnienia śluzówek, jest fakt, że nie wymaga ona wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystuje ona in vitro zrekonstruowany model tkanki rogówki, który składa się z normalnych ludzkich komórek. Jest ona możliwa do zastosowania dla wszystkich rodzajów substancji i mieszanin oraz pozwala odróżnić substancje chemiczne wywołujące podrażnienie oczu lub poważne uszkodzenie oka od pozostałych materiałów.Substancje niedrażniące, które nie wymagają klasyfikacji i etykietowania. Rekonstruowana tkanka nabłonkowa przypominająca ludzką rogówkę lub epi. Ocular jest przygotowywana w insertach z porowatą membraną, przez którą składniki odżywcze przenikają do komórek.Zrekonstruowana tkanka tworzy nieukerninizowany nabłonek, który modeluje nabłonek rogówki z postępująco warstwowymi, ale nieorożowiałymi komórkami. Po otrzymaniu zestawu do hodowli nabłonka przypominającego ludzką rogówkę, należy doprowadzić tkanki w 24-dołkowym pojemniku transportowym do temperatury pokojowej. Po 15 minutach, w warunkach sterylnych, należy otworzyć worek zawierający 24-dołkową płytkę z tkankami i sprawdzić, czy między żelem agros a wkładkami nie ma pęcherzyków powietrza. Przeciąć. Odkleić taśmę.Zdejmij pokrywkę za pomocą sterylnej gazy i obejrzyj powierzchnię tkanki. Następnie odmień jeden mililitr podłoża do testu z zestawu o temperaturze 37°C do dołków wcześniej oznakowanych płytek sześciodołkowych. Następnie za pomocą sterylnej pęsety delikatnie osusz wkłady zawierające tkankę na sterylnej gazie, aby usunąć pozostałe środki transportowe, i umieść je w poszczególnych dołkach płytek sześciodołkowych.Po jednej godzinie należy wymienić pożywkę na jeden mililitr świeżej pożywki do analizy o temperaturze 37°C i inkubować tkanki w standardowych warunkach hodowli przez noc. Następnego dnia nanosi się 20 µL DPBS pozbawionego wapnia i magnezu na powierzchnię apikalną każdej tkanki. Jeśli DPBS nie rozprzestrzeni się po tkankach, należy delikatnie przytrzymać insert pęsetą i ostukać płytkę, aby upewnić się, że sól fizjologiczna zwilży całą powierzchnię tkanki.Inkubuj płytki przez 30 minut. Następnie, aby poddać tkanki działaniu ciekłych substancji badawczych, nanieś 50 µL kontroli negatywnej, kontroli pozytywnej oraz odpowiednich substancji badawczych w duplikacie zgodnie z harmonogramem. Upewnij się, że preparaty pokrywają całe powierzchnie tkanek, a następnie inkubuj inserty przez 30 minut, aby poddać tkanki działaniu stałych substancji badawczych.Najpierw przenieś wkłady na sterylną powierzchnię. Pozostaw płytkę przykrytą, aby zapobiec zanieczyszczeniu cząstkami stałymi przenoszonymi przez powietrze. Następnie, używając wyrównanej łyżeczki, nanieś miejscowo 50 milligrams substancji badanej na powtórne próbki tkanek zgodnie z harmonogramem, dbając o to, aby preparat pokrył całą powierzchnię tkanki.Alternatywnie można użyć wstępnie napełnionej strzykawki o pojemności 1 mL z odciętą przednią częścią, aby nanieść proszki bezpośrednio na kulturę. Należy nacisnąć tłok, aby aplikować proszek bezpośrednio po naniesieniu stałych substancji badawczych, a następnie umieścić wkłady z powrotem w płytkach 6-dołkowych i inkubować tkanki przez 6 godzin w celu ich wypłukania.Po zakończeniu traktowania, pod koniec inkubacji ekspozycyjnej, napełnić 3 zlewki o pojemności 150 ml na każdy badany produkt 100 ml DPBS. Za pomocą zakrzywionej pęsety chwycić górną krawędź wkładów, aby wyjąć je z dołków. Następnie, używając pęsety, podnieść dwa wkłady z tej samej grupy traktowania za ich górne krawędzie i odlać pozostałości preparatów na czysty materiał chłonny.Następnie zanurz wkłady w pierwszym beczkerze z DPBS, płukząc tkanki kolistymi ruchami przez dwie sekundy. Po czym podnieś wkłady tak, aby były w większości wypełnione DPBS, i odlej płyn z powrotem do beczkera. Powtórz płukanie dwukrotnie w pierwszym beczkerze.Następnie w ten sam sposób, jak przy ostatnim płukaniu, wypłucz wkładki w drugim i trzecim zlewkach z DPB S po 3 razy każda. Obróć każdą wkładkę pod kątem około 45 stopni, skierowując otwarty koniec w dół, i dotknij górnej krawędzi materiału chłonnego, aby odlać pozostały DPBS. Następnie natychmiast zanurz tkanki w pięciu mililitrach pożywki assay w temperaturze pokojowej.Po zakończeniu okresu imersji po namaczaniu, w uprzednio oznakowanej płytce 12-dołkowej, odlej medium do analizy i osusz wkłady za pomocą materiału absorbującego. Następnie przenieś wkłady do nowej płytki 6-dołkowej zawierającej 1 ml ciepłego medium do analizy w każdym dołku i umieść płytki w inkubatorze, aby rozpocząć test żywotności MTT. Przenieś wkłady do płytki 24-dołkowej zawierającej 0,3 ml świeżo przygotowanego roztworu MTT.Przed przeniesieniem osusz wkłady na materiale chłonnym. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione pod wkładami i po trzech godzinach przenieś tkanki z powrotem do inkubatora, kładąc dno wkładów na materiale chłonnym. Następnie, w przypadku ekstrakcji zanurzeniowej niebarwnych ciekłych próbek testowych, zanurz wkłady w wcześniej oznakowanej płytce 24-dołkowej zawierającej dwa mililitry odpowiedniego roztworu ekstrakcyjnego na dołek; w przypadku ekstrakcji niezanurzeniowej stałych lub ciekłych barwników postęp zgodnie z procedurą.Przenieś wkłady do wcześniej oznakowanej płytki sześciodołkowej zawierającej jeden mililitr roztworu do ekstrakcji w każdym dołku. Następnie uszczelnij płytki za pomocą zgrzewarki termicznej lub parafirmu, aby zapobiec odparowywaniu, i inkubuj na wytrząsarce orbitalnej przez dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej, stosując delikatne wytrząsanie pod koniec ekstrakcji w zanurzeniu. Przebij tkanki, a następnie zlej ciecz z każdego wkładu z powrotem do dołka, po czym wyrzuć wkłady wraz z tkankami.Wymieszaj roztwór ekstraktu w każdej studzience i przenieś dwie 200 µL alikwoty każdej próbki do odpowiednich studzienek wcześniej oznakowanej płytki 96-dołkowej, zgodnie ze schematem przedstawionym na końcu etapu ekstrakcji bez zanurzenia. Usuń wkłady i tkanki bez ich przebijania i dodaj 1 mL roztworu ekstrahującego do każdej studzienki. Dokładnie wymieszaj roztwór ekstrahujący w studzienkach i przenieś dwie 200 µL alikwoty z każdej próbki do odpowiednich studzienek wcześniej oznakowanej płytki 96-dołkowej, tak jak pokazano przed chwilą.Na koniec odczytaj gęstość optyczną próbek w spektrofotometrze do płytek 96-dołkowych przy długości fali 570 nanometrów, nie używając filtra referencyjnego, a następnie wprowadź wyniki do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć odpowiednią żywotność tkanek. Uwzględnij korekty wynikające z interferencji substancji testowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym; w tym eksperymencie przedstawiono reprezentatywne wyniki testu drażnienia oczu przeprowadzonych z 10 badanymi artykułami oraz kontrolami negatywną i pozytywną. Zaobserwowano średnią gęstość optyczną 1,31 dla kontroli negatywnej, odpowiadającą 100% żywotności tkanek, przy względnej żywotności tkanek na poziomie 31,2% dla kontroli pozytywnej. Artykuły testowe 1, 2, 4, 7 i 8 wykazały żywotność tkanek powyżej 60%, co klasyfikuje te artykuły jako niedrażniące, natomiast artykuły testowe 3, 5, 6, 9 i 10.Z drugiej strony, wykazano zmienność tkanek mniejszą lub równą 60%, co skutkowało ich zaklasyfikowaniem jako substancje drażniące. Różnica w żywotności tkanek między dubletami tkanek w tym eksperymencie była mniejsza niż 20% dla wszystkich badanych artykułów testowych z wyjątkiem artykułu testowego dwa. W związku z tym wyniki dla wszystkich artykułów testowych, z wyjątkiem artykułu testowego dwa, uznano za kwalifikowalne, ponieważ spełniały one wszystkie kryteria akceptacji testu drażnienia oczu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania testu DICATION z wykorzystaniem in vitro rekonstrukcyjnego modelu tkanki przypominającej ludzką rogówkę numer cztery, w celu etykietowania substancji chemicznych pod kątem identyfikacji zagrożeń. Procedura ta została wdrożona w wytycznych testowych EOC D jako element strategii testowania wielopoziomowego.

eye-irritation-test-eit-for-hazard-identification-eye-irritating

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie prezentujemy test podrażnienia skóry EpiDerm (EpiDerm SIT), opracowany i zwalidowany do badań podrażnienia skóry in vitro w przypadku substancji chemicznych, w tym składników kosmetycznych i farmaceutycznych.

Test podrażnienia skóry in vitro (SIT) z wykorzystaniem modelu zrekonstruowanej ludzkiej naskórka (RHE) EpiDerm

Przedstawiamy powtarzalną metodę hodowli konfluentnych monowarstw ludzkich płodowych komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (hfRPE), które wykazują morfologię, fizjologię, polarność oraz wzorce ekspresji białek i genów charakterystyczne dla natywnej tkanki dorosłego organizmu. Praca ta została rozszerzona o model zwierzęcy kilku chorób oczu.

Modele eksperymentalne do badania fizjologii i patofizjologii nabłonka pigmentowego siatkówki

Ten raport opisuje metodę wywoływania przewlekłego eksperymentalnego autoimmunologicznego suchego oka u szczurów Lewisa poprzez immunizację emulsją ekstraktu z gruczołu łzowego szczura, albuminy jaja kurzego i kompletnego adiuwantu Freunda, a następnie wstrzyknięcie ekstraktu z gruczołu łzowego i albuminy jaja kurzego do otworu podspojówkowego i gruczołów łzowych sześć tygodni później.

Przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem ze wzrostem liczby efektorowych limfocytów T pamięci w tkance gałki ocznej

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe RNA hamującego małą próbę jest ważnym narzędziem, które może pomóc w szybszym wyjaśnieniu molekularnych mechanizmów chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki. W niniejszym artykule przedstawiono rozwój i walidację modeli i metod ekspozycji do wysokoprzepustowych badań przesiewowych uszkodzeń nabłonka rogówki wywołanych fluorowodorem i chloropikryną.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

Ten artykuł opisuje rozwój metody wywoływania ostrej lub przewlekłej choroby suchego oka u królików poprzez wstrzykiwanie konkanawaliny A do wszystkich części układu gruczołu łzowego oczodołu. Ta metoda, lepsza od już opisanych, generuje powtarzalny, stabilny model suchego oka, odpowiedni do badania środków farmakologicznych.

Króliczy model zespołu suchego oka z niedoborem wody wywołanej wstrzyknięciem konkanawaliny A do gruczołów łzowych: zastosowanie do badań skuteczności leków

Celem tego protokołu jest ocena, czy różne preparaty sztucznych łez mogą chronić ludzkie komórki nabłonka rogówki przed wysuszeniem za pomocą modelu in vitro. Po wystawieniu na działanie preparatów sztucznych łez i wysuszeniu, ludzkie komórki nabłonka rogówki są oceniane pod kątem aktywności metabolicznej.

Wpływ preparatów sztucznych łez na aktywność metaboliczną ludzkich komórek nabłonka rogówki po ekspozycji na wysuszenie

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

Ten artykuł opisuje procedury używane do oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn chemicznych na pierwotnej i nieśmiertelnej linii komórkowej.

Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Hodowla narządów ex vivo rogówki świń i gojenie ran nabłonkowych dostarczają ekonomicznego, etycznego, powtarzalnego i ilościowego sposobu testowania toksyczności ocznej chemikaliów. Pomagają również w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw regulacji nabłonka i naprawy tkanek oraz w ocenie terapii stosowanych w leczeniu keratopatii cukrzycowej i opóźnionego gojenia się ran.

Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych

Przedstawiono protokół powtarzalny do przygotowania, wzbogacania i zastosowania in situ żelu żelatynowo-ryboflawinowego krzyżowalnego światłem niebieskim do naprawy ran stromalnych rogówki u królików, w tym kroki proceduralne dotyczące postępowania chirurgicznego, częściowej tarzoraphii i opieki pooperacyjnej.

Produkcja i chirurgiczne zastosowanie wzbogaconych żeli żelatynowych przekształconych światłem i riboflawiny do naprawy ran rogówki u królików

Poznaj test drażniący oczu wykorzystujący trójwymiarowy model tkanki nabłonka rogówki RhCE. Ta metoda pozwala klasyfikować substancje chemiczne bez użycia zwierząt zgodnie z wytycznymi OECD.

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE) (Wideo) | JoVE Journal

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

Przeglądaj więcej filmów