Name: Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Poznaj metodę oznaczania utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy. Technika ta umożliwia badanie metabolizmu wątroby oraz ocenę interwencji farmakologicznych i genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Susan Gray i Umadevi Chalasani za pomoc w technicznych aspektach protokołu izolacji hepatocytów. Prace te były wspierane przez grant NIDDK 5R01DK089185 (dla M.P. Coopera) oraz Program Pilotażowy i Wykonalności DERC na UMMS (dla M.P. Coopera).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach powinny być przeprowadzane zgodnie z lokalnymi i federalnymi przepisami oraz za zgodą instytucjonalnej IACUC i administracji bezpieczeństwa radiacyjnego.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Na kilka dni przed testem rozmrozić 500 ml butelkę pożywki do trawienia wątroby (LDM) i ponownie zamrozić ~35 ml porcji w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne.</li>
	<li>Na dzień przed testem wstępnie wysterylizuj czyste narzędzia preparacyjne w autoklawie.</li>
	<li>W dniu testu należy potraktować kolagenem niezbędną ilość 24-dołkowych płytek hodowlanych.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 1 część 3 mg/ml kolagenu z ogona szczura z 50 częściami PBS. Dodać około 500 μl do każdego dołka na 24-dołkowej płytce i inkubować przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Usuń kolagen i pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu w kapturze. Powtórz co najmniej jeden dodatkowy raz. 
		Uwaga: Powlekanie kolagenem można wykonać z tygodniowym wyprzedzeniem, a płytki przechowywane w temperaturze 4 °C są szczelnie zamknięte w folii plastikowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować LDM do oznaczenia: rozmrozić LDM i ogrzać do 37 °C, a następnie dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 N KOH. Przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C z recyrkulacją.</li>
	<li>Podgrzać 25 ml pożywki do perfuzji wątrobowej do temperatury 42 °C w recyrkulacyjnej łaźni wodnej.</li>
	<li>Przygotować 90% krzemionkę koloidalną pokrytą roztworem poliwinylopirolidonu: Dodać 1 ml 10x DPBS do 9 ml krzemionki koloidalnej pokrytej poliwinylopirolidonem. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 0,1 N HCl. Filtruj sterylnym filtrem strzykawkowym 0,2 μm. Sklep w RT.</li>
	<li>Ciepłe podłoże galwaniczne do 37 °C.</li>
</ol>
2. Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy
<ol>
	<li>Ustaw pompę perystaltyczną, rurki i stół rozwarstwiający: Wysterylizuj rurki, przepłukując je 5 ml 70% etanolu w wodzie destylowanej, a następnie 10 ml sterylnej wody. Umieść rurkę w pożywce do perfuzji wątroby i uruchom pompę, aby wypełnić całą długość rurki.</li>
	<li>Złóż w ofierze mysz metodą zatwierdzoną przez instytucję.</li>
	<li>Rozwiń jamę brzuszną: Spryskaj obficie brzuch myszy 70% etanolem. Używając nożyczek z końcami, wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę właściwą na długości brzucha i odbij na boki. Wykonaj podobne nacięcie w otrzewnej, aby odsłonić wnętrzności.
	<ol>
		<li>Za pomocą narzędzia delikatnie przemieszcz jelita, aby odsłonić układ naczyniowy jamy brzusznej Zlokalizuj żyłę główną dolną brzucha (IVC) i umieść szew pod naczyniem krwionośnym, dystalnie do żyły nerkowej</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dystalnie do szwu, umieść igłę i cewnik w IVC, przesuwając go poza poziom szwu. Trzymając igłę nadal na miejscu, zawiąż szew wokół cewnika, aby utrzymać go na miejscu. Ostrożnie wyjąć igłę. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, krew przepływa przez cewnik.</li>
	<li>Za pomocą pipety wypełnij pozostały obszar cewnika środkiem perfuzyjnym, upewniając się, że nie ma powietrza. Z dużą ostrożnością przymocuj rurkę do cewnika.</li>
	<li>Wypreparuj jamę płuca: delikatnie odbij górne płaty wątroby, aby odsłonić przeponę. Ostrożnie przebij przeponę nożyczkami z ostrą końcówką, a następnie wykonaj boczne nacięcie, aby odsłonić jamę opłucnej, uważając, aby uniknąć pęcherzyka żółciowego i naczyń opłucnej. Umieść zacisk buldoga wokół żyły głównej piersiowej dolnej tuż proksymalnie do żyły wątrobowej.</li>
	<li>Przeciąć żyłę wrotną i włączyć pompę z prędkością 3 - 4 ml/min. Perfuzję wątroby za pomocą pożywki do perfuzji wątroby przez 5 minut, używając około 20 ml pożywki perfuzyjnej. 
	Uwaga: Wątroba powinna natychmiast zmienić kolor z czerwonego na szary/brązowy. Jeśli części wątroby pozostają czerwone, prawdopodobnie oznacza to słabą perfuzję, a prawdopodobieństwo udanej izolacji jest znacznie zmniejszone. Podczas perfuzji należy uważać, aby pożywka nie wypłynęła i aby żadne pęcherzyki nie dostały się do rurki.</li>
	<li>Po 5 minutowej inkubacji zatrzymać pompę i przenieść rurkę do pożywki do pożywki do trawienia wątroby. Ponownie uruchomić pompę i wysysać płuczki przez kolejne 10 - 15 minut (aż do wyczerpania pożywki).</li>
	<li>Pod koniec perfuzji zatrzymaj pompę. Wątroba powinna mieć różowawy odcień i wyglądać na nieco powiększoną. Wytnij wątrobę przez staranne wypreparowanie. Usuń woreczek żółciowy i przenieś wątrobę do 10 cm naczynia do hodowli tkankowych.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać 10 ml pożywki galwanicznej (Tabela 1) do wątroby. Delikatnie zeskrob wątrobę za pomocą kleszczy lub skalpela, aby usunąć hepatocyty. Przefiltrować zawiesinę za pomocą sitka o wielkości 100 μm i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Umyj płytkę dodatkowymi 10 ml pożywki galwanicznej i rozlej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 350 x g, 4 °C.</li>
	<li>Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w 10 ml podłoża galwanicznego i dodać 10 ml 90% krzemionki koloidalnej pokrytej poliwinylopirolidonem. Delikatnie wymieszać i odwirować jak w kroku 2.11. Po odwirowaniu warstwa martwych komórek będzie unosić się na wierzchu mieszaniny, podczas gdy żywe komórki będą opadać na dno.</li>
	<li>Odessać martwe komórki i pożywkę. Przemyć 2 razy 20 ml podłoża galwanicznego, odwirować jak w ppkt 2.11.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 10 ml podłoża galwanicznego. Policz komórki za pomocą hemocytometru i umieść 9 x 104 komórek/basenik w 24-dołkowych szalkach hodowlanych poddanych działaniu kolagenu. Inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Każda płytka może być używana do testu utleniania kwasów tłuszczowych LUB testu lipogenezy.</li>
	<li>Opcjonalnie należy zmienić studzienki na pożywkę konserwacyjną (tabela 1) i hodować w temperaturze 37 °C. Komórki można hodować przez 2-3 dni bez wpływu na wyniki testu.</li>
</ol>
3. Test utleniania kwasów tłuszczowych
Ostrzeżenie: Użycie radioaktywności może być niebezpieczne. Wszelkie zakupy, przechowywanie, obchodzenie się i usuwanie materiałów radioaktywnych powinny odbywać się zgodnie z przepisami i wytycznymi instytucjonalnymi, stanowymi i federalnymi.
<ol>
	<li>16 - 20 godzin przed testem umyj komórki 2 razy ciepłym PBS. Zmienić komórki na bezsurowicową pożywkę głodową surowicy (Tabela 1) z 20 nM glukagonem i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: Ponieważ płodowa surowica bydlęca zawiera nieznane stężenie hormonów metabolicznych (np. insuliny, glukagonu), surowica głodza komórki, aby usunąć wszelkie zakłócające skutki, jakie może to mieć na test. Komórki są żywotne w pożywce głodowej surowicy przez >24 godziny. Leczenie glukagonem stosuje się w celu stymulacji utleniania kwasów tłuszczowych w hepatocytach.</li>
	<li>Rano w dniu testu przygotować pożywkę do wstępnej inkubacji: Zawiesić odpowiednią ilość palmitynianu sodu w ultraczystej wodzie, aby uzyskać roztwór o stężeniu 100 mM i podgrzewać do temperatury 70 °C przez 10 minut. W międzyczasie przygotuj wymaganą ilość (0,5 ml na dołek na płytkę 24-dołkową) DMEM z 25 mM HEPES, 1% BSA frakcji V i 20 nM glukagonu. Podgrzać do 37 °C.
	<ol>
		<li>Po rozpuszczeniu dodać palmitynian do końcowego stężenia 250 μM do podłoża. Zmienić hepatocyty na pożywkę do inkubacji wstępnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Zachowaj trochę pożywki do wstępnej inkubacji w temperaturze 37 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas inkubacji wysuszyć odpowiednią ilość 14C-palmitynianu (0,5 μCi/studzienkę) przez odparowanie pod gazowym azotem.
	<ol>
		<li>Na przykład, aby zmierzyć 24 próbki na 24-dołkowej płytce, przenieś 120 μl 0,1 μCi/ml14 C-palmitynianu do probówki o pojemności 1,5 ml. Powoli odparować rozpuszczalnik etanolowy, wdmuchując gazowy azot nad roztwór z odległości 3-5 cm w dygestorium. Rozpuszczalnik powinien odparować w ciągu około 30 - 40 minut, pozostawiając suchy 14C-palmitynian na dnie probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na około 15 minut przed zakończeniem inkubacji ponownie zawiesić 14C-palmitynianu w 0,1 N NaOH (12,5 μl/μCi). Inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Dodać trzy objętości ciepłej pożywki do wstępnej inkubacji i mieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Do każdej studzienki należy dodać 25 μl rozcieńczonego 14C-palmitynianu. Wymieszać, delikatnie kołysząc płytką i inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut. To jest płytka testowa.</li>
	<li>Podczas inkubacji przygotuj płytkę z bibuły filtracyjnej (rysunek 1).
	<ol>
		<li>Zdejmij pokrywkę ze sterylnej płytki 24-dołkowej. Umieść jeden kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 2 cm x 2 cm na dnie każdej ze studzienek. Na płytkę nałożymy kawałek parafilmu o wymiarach 4" x 7".</li>
		<li>Używając dużego prostokątnego przedmiotu, takiego jak pudełko z końcówką do mikropipet, przetrzyj parafilm o dołki, aby przebić parafilm w otworach studzienek i stworzyć uszczelnienie na pozostałej części płytki. Usuń perforowane kręgi parafilmu pokrywające teraz studzienki. Płytka powinna być teraz szczelnie pokryta parafilmem we wszystkich obszarach z wyjątkiem otworów studzienek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10 minut przed końcem inkubacji dodać 200 μl 3 N NaOH do każdego dołka płytki z bibuły filtracyjnej, upewniając się, że bibuła filtracyjna wchłonęła całą ciecz.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie przed zamrożeniem przenieś pożywkę na świeżą płytkę 24-dołkową. Po jednokrotnym umyciu PBS poddać lizie pozostałe komórki w 0,1 N HCl i obliczyć zawartość białka za pomocą testu BCA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod koniec inkubacji zamrozić szalkę testową w ciekłym azocie. Uważaj, aby upewnić się, że każda studzienka jest całkowicie zamrożona przed kontynuowaniem.</li>
	<li>Dodać 100 μl 70% kwasu nadchlorowego do każdego dołka płytki testowej. Natychmiast przykryj płytką z bibuły filtracyjnej. Umieść płytki na wytrząsarce orbitalnej i kołysz prędkością orbitalną 80 obr./min przy RT przez 2 godziny.</li>
	<li>Po inkubacji próbki należy przetworzyć:
	<ol>
		<li>Aby zmierzyć frakcję CO2 , przenieś kwadraty bibuły filtracyjnej do 4 ml płynnego płynu scyntylacyjnego w fiolce scyntylacyjnej i zmierz sygnał 14C.</li>
		<li>Aby zmierzyć materiał rozpuszczalny w kwasach, przenieś 400 μl pożywki do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Wirować z maksymalną prędkością przez 10 min. Dodać 100 μl otrzymanego supernatantu do 500 μl chloroformu-metanolu (v/v) w proporcji 2:1 i krótko odwirować.
		<ol>
			<li>Dodaj 250 μl wody do mieszaniny i ponownie zwiruj. Odwirować próbki przez 10 minut przy 3 000 x g. Przenieść 200 μl górnej fazy do 4 ml płynnego płynu scyntylacyjnego w fiolce scyntylacyjnej i zmierzyć sygnał 14C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test lipogenezy
<ol>
	<li>Wieczorem przed rozpoczęciem testu przemyj komórki 2 razy ciepłym PBS. Zmień hepatocyty na pożywkę głodową surowicy z insuliną 100 nM. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: Ponieważ płodowa surowica bydlęca zawiera nieznane stężenie hormonów metabolicznych (np. insuliny, glukagonu), surowica głodza komórki, aby usunąć wszelkie zakłócające skutki, jakie może to mieć na test. Komórki są żywotne w pożywce głodowej surowicy przez >24 godziny. Insulina jest stosowana w tym teście w celu stymulacji lipogenezy.</li>
	<li>Wykonaj pożywkę do lipogenezy: pożywkę do głodzenia surowicy ze 100 nM insuliny, 10 μM zimnego octanu i 0,5 μCi 3H-octanu na studzienkę. Zmień komórki na pożywkę lipogenezę i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Należy uwzględnić wszelkie związki będące przedmiotem zainteresowania, które mają być badane.</li>
	<li>Po okresie inkubacji przemyć komórki 2 razy PBS. Lizować komórki przez zeskrobanie 120 μl 0,1 N HCl. Zarezerwować 10 μl do oznaczania białka (ocenić za pomocą testu BCA) i przenieść 100 μl do 1,5 ml probówki do mikrofuge.</li>
	<li>Ekstrahować lipidy przez dodanie 500 μl chloroformu metanolu w proporcji 2:1 (v/v). Krótko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać 250 μl wody, wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 5 minut. Odwirować próbki przez 10 minut przy 3 000 x g, RT. Ostrożnie przenieść dolną fazę do 4 ml płynnego płynu scyntylacyjnego w fiolce scyntylacyjnej i zmierzyć aktywność 3H.</li>
</ol>

<ol><li>Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+and+etiology+of+elevated+aminotransferase+levels+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).</li>
<li>Lazo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+nonalcoholic+Fatty+liver+disease+in+the+United+States%3A+the+third+national+health+and+nutrition+examination+survey%2C+1988-1994%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+epidemiology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994.</a> American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).</li>
<li>Angulo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic fatty liver disease.</a> The New England journal of medicine. 346, 1221-1231 (2002).</li>
<li>Adams, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+a+population-based+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study.</a> Gastroenterology. 129, 113-121 (2005).</li>
<li>Feldstein, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+apoptosis+and+fas+expression+are+prominent+features+of+human+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).</li>
<li>Day, C. P., James, O. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steatohepatitis%3A+a+tale+of+two+%27hits%27%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Steatohepatitis: a tale of two 'hits'.</a> Gastroenterology. 114, 842-845 (1998).</li>
<li>Donnelly, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+fatty+acids+stored+in+liver+and+secreted+via+lipoproteins+in+patients+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease.</a> The Journal of clinical investigation. 115, 1343-1351 (2005).</li>
<li>Lambert, J. E., Ramos-Roman, M. A., Browning, J. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+de+novo+lipogenesis+is+a+distinct+characteristic+of+individuals+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Increased de novo lipogenesis is a distinct characteristic of individuals with nonalcoholic fatty liver disease.</a> Gastroenterology. 146, 726-735 (2014).</li>
<li>Parks, E. J., Hellerstein, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+patient-oriented+research.+Recent+advances+in+liver+triacylglycerol+and+fatty+acid+metabolism+using+stable+isotope+labeling+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques.</a> Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).</li>
<li>Befroy, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+assessment+of+hepatic+mitochondrial+oxidative+and+anaplerotic+fluxes+in+humans+using+dynamic+13C+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy.</a> Nature medicine. 20, 98-102 (2014).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+journal%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malaria journal. 6, 169(2007).</li>
</ol>

Autorzy zaznaczają, że nie mają konfliktu interesów.

Czas od złożenia ofiary do perfuzji powinien być krótszy niż 3 minuty, aby uzyskać idealną perfuzję i trawienie kolagenazy w wątrobie. Po rozpoczęciu perfuzji za pomocą pożywki perfuzyjnej wątroba powinna natychmiast zmienić wygląd z czerwonego na blady. Po około 10 minutach inkubacji z LDM wątroba będzie obrzęknięta i zaróżowiona. W przypadku, gdy perfuzja jest niewystarczająca, wątroba może nie wykazywać tych zmian, co zazwyczaj skutkuje niższą wydajnością hepatocytów.
Po etapach mycia, wyiz...

Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby jest jedną z głównych przyczyn chorób wątroby w kulturach zachodnich1,2. Akumulacja lipidów w wątrobie jest związana ze śmiercią komórki, zwłóknieniem i niewydolnością wątroby poprzez nieznane jeszcze mechanizmy3-6. W stłuszczeniowej chorobie wątroby utlenianie β kwasów tłuszczowych za pośrednictwem hepatocytów i lipogeneza de novo są ważnymi determinantami akumulacji lipidów netto7,8. W tym artykule skupimy się zatem na izolacji hepatocytów, a następnie na ilościowym określeniu utleniania β-kwasów tłuszczowych i lipogenezie de novo.
Liczne metodologie zostały opracowane do badania metabolizmu lipidów w hepatocytach. Chociaż możliwe jest zmierzenie metabolizmu tłuszczu in vivo przy użyciu stabilnych izotopów9,10, metody te są kosztowne i wymagają dużej liczby zwierząt. Ponadto możliwość zbadania wpływu egzogennych substancji chemicznych jest ograniczona ze względu na charakter eksperymentów in vivo. W przeciwieństwie do tego, izolacja pierwotnych hepatocytów z wątroby myszy zapewnia przystępną cenowo drogę do realizacji11. Co więcej, badanie hepatocytów w hodowli pozwala badaczom badać wpływ różnych substancji chemicznych na przetwarzanie lipidów przy jednoczesnym obejściu trudności związanych z eksperymentami in vivo. Wreszcie, izolowane hepatocyty unikają wszelkich zakłóceń wynikających z różnych genetyk, ponieważ pochodzą z wątroby jednego zwierzęcia.
Tutaj izolujemy i hodujemy hepatocyty, a następnie mierzymy utlenianie β-kwasów tłuszczowych i lipogenezę de novo, używając radioznakowanego palmitynianu. Protokół opisany poniżej jest prosty, skuteczny i powtarzalny.

<table><tbody><tr><td>Liver Perfusion Medium</td><td>Life Technologies</td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td>Aliquot i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10X DPBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140079&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Technologie Collagen</td><td>Life</td><td>A1048301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Krzemionka koloidalna pokryta poliwinylopirolidonem</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Insulina Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Albumina (BSA), Frakcja V</td><td>MP Biomedicals</td><td>103703</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe naczynie hodowlane</td><td>Corning Falcon</td><td>353047&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Tygon S3&nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06460-34</td><td></td></tr><tr><td>Męski Leur Lock do 200 łączników kolczastych</td><td>Cole Parmer</td><td>45518-00</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik 24 G x 3/4" SurFlo</td><td></td><td>SROX2419CA</td><td></td></tr> Jedwabny <tr><td>szew Perma-Hand</td><td>Ethicon</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>Corning Falcon</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 3013HD Kąpiel recyrkulacyjna</td><td>Fisher</td><td>13-874-3</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna MasterFlex C/L MasterFlex</td><td></td><td>HV-77122-24</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozacisk</td><td>Roboz</td><td>RS-7438</td><td>Wstępna sterylizacja w autoklawie</td></tr><tr><td>5" Proste, tępo-nożyczki operacyjne</td><td>Roboz</td><td>RS-6810</td><td>Wstępna sterylizacja w autoklawie</td></tr><tr><td>Ostrze 24 mm Proste, ostro zakończone nożyczki do mikropreparacji</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Wstępna sterylizacja w autoklawie</td></tr><tr><td>Kleszcze do mikropreparacji 4 "0,8 mm Roboz</td><td></td><td>RS-5130</td><td>Wstępna sterylizacja w autoklawie</td></tr><tr><td>4" 0,8 mm Końcówka z pełną krzywą Kleszcze do mikropreparacji</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td>Wstępna sterylizacja w autoklawie</td></tr><tr><td>Strzykawka 60 ml</td> Probówki stożkowe <td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Test białka Corning Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td><td></td>bezpieczeństwa biologicznego</tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td></td>CO2 </tr><tr><td>Serologiczny pipety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000, 200, 20 &mu; l Pipeta i końcówki</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Metabolizm lipidów w wątrobie jest złożony. Oprócz importu i eksportu lipidów za pośrednictwem lipoprotein, hepatocyty mogą utleniać lipidy poprzez utlenianie kwasów tłuszczowych lub alternatywnie syntetyzować nowy lipid poprzez lipogenezę de novo. Suma netto tych szlaków jest podyktowana wieloma czynnikami, co w niektórych stanach chorobowych prowadzi do stłuszczenia wątroby. Nadmierne gromadzenie lipidów w wątrobie jest związane z insulinoopornością całego organizmu i chorobą niedokrwienną serca. Narzędzia do badania metabolizmu lipidów w hepatocytach są przydatne do zrozumienia roli metabolizmu lipidów w wątrobie w niektórych zaburzeniach metabolicznych.
W wątrobie hepatocyty regulują rozkład i syntezę kwasów tłuszczowych odpowiednio poprzez utlenianie β tłuszczowe i lipogenezę de novo. Kwantyfikacja metabolizmu w tych szlakach dostarcza informacji na temat postępowania z lipidami w wątrobie. W przeciwieństwie do kwantyfikacji in vitro, przy użyciu hepatocytów pierwotnych, wykonywanie pomiarów in vivo jest technicznie trudne i wymaga dużych zasobów. W związku z tym ilościowe określenie utleniania β-kwasów tłuszczowych i lipogenezy de novo w hodowanych hepatocytach myszy zapewnia prostą metodę oceny postępowania z lipidami w hepatocytach. 
Tutaj opisujemy metodę izolacji pierwotnych mysich hepatocytów i demonstrujemy ilościowe oznaczanie utleniania β-kwasów tłuszczowych i lipogenezy de novo, używając radioznakowanych substratów.

Izolacja hepatocytów zazwyczaj pozwala na uzyskanie od 1 do 3 x 107 komórek łącznie. Po całonocnej inkubacji komórki będą miały kształt sześciokątny, przy czym wiele z nich będzie dwojądrzastych (Rysunek 2). Zdrowe komórki nie powinny wykazywać granulacji ani pęcherzyków, które świadczą o śmierci komórkowej.
Zasadniczo test utleniania kwasów tłuszczowych przeprowadza się w trzech lub czterech powtórzeniach dla każdego testowanego związku. Liczba zliczeń dla próbek C...

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena metabolizmu kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach mysich. Jest to realizowane poprzez perfuzję wątroby mysiej medium trawiennym, wyjęcie narządu, a następnie izolację hepatocytów. Drugim krokiem jest hodowla hepatocytów na płytkach pokrytych kolagenem.Następnie hepatocyty poddaje się działaniu testowanych interwencji eksperymentalnych. Ostatnim krokiem jest inkubacja komórek w obecności znakowanego radioaktywnie substratu. Ostatecznie analiza w ciekłym scyntylatorze służy do wykazania wpływu różnych interwencji farmakologicznych lub genetycznych na utlenianie kwasów tłuszczowych lub lipogenezę w pierwotnych hepatocytach.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kilka kluczowych pytań z zakresu metabolizmu i cukrzycy, w tym na pytanie, jak określone interwencje farmakologiczne i genetyczne wpływają na biologię hepatocytów. Wizualna demonstracja tej metody jest istotna z dwóch powodów. Po pierwsze, trudne jest uzyskanie specyficznych warunków perfuzji wpływających na stan zdrowotny hepatocytów, a po drugie, konieczna jest kwantyfikacja uwalnianego dwutlenku węgla.Zachowanie gazów nie jest intuicyjne. Procedurę tę zademonstr

determination-fatty-acid-oxidation-lipogenesis-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

Tutaj prezentujemy protokół izolacji zdrowych i funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy. Opracowano instrukcje dotyczące wykrywania powstającej syntezy białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego, aby pomóc w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw syntezy białek w kontekście homeostazy metabolizmu energetycznego w wątrobie.

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.

Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy

Ten artykuł zawiera trzy łatwe i łatwo dostępne testy do oceny metabolizmu lipidów u myszy.

Ocena zdolności całego organizmu do obsługi lipidów u myszy

Ten protokół ma być narzędziem do badania stłuszczenia i molekularnych, biochemicznych, komórkowych zmian spowodowanych nadmierną ekspozycją hepatocytów na lipidy in vitro.

Model eksperymentalnego stłuszczenia in vitro: hodowla komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym szlakiem metabolicznym odpowiedzialnym za wytwarzanie energii w wielu różnych typach komórek, w tym w hepatocytach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach pierwotnych przy użyciu 14znakowanych C kwasów palmitynowych.

Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

Lipoliza triglicerydowa w adipocytach jest ważnym procesem metabolicznym, w wyniku którego uwalniane są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru podstawowej i stymulowanej lipolizy w adipocytach i tkance tłuszczowej ex vivo od myszy.

Pomiar częstości lipolizy w mysiej tkance tłuszczowej ex vivo i pierwotnych preadipocytach zróżnicowanych in vitro

Ten artykuł opisuje użycie komórek HepG2 indukowanych kwasem oleinowym jako modelu dla stłuszczeniowej choroby wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną.

Modelowanie in vitro odkładania się tłuszczu w stłuszczeniowej chorobie wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną

Opis ilościowej procedury fosforylacji z wykorzystaniem kriolizy, solubilizacji mocznikiem, frakcjonowania HILIC oraz wzbogacania peptydów fosforylowanych metodą IMAC.

Ilościowa fosfoproteomika w Saccharomyces cerevisiae stymulowanych kwasami tłuszczowymi

Ortotopowe modele zwierzęce raka jajnika lepiej odwzorowują przebieg choroby u ludzi, a tym samym zwiększają naszą wiedzę na temat progresji nowotworu i odpowiedzi guza na terapię. W modelu mysim wykonuje się wstrzyknięcie do wnętrza woreczka otrzewnej komórek nowotworu jajnika wykazujących ekspresję lucyferazy. Leczenie podaje się poprzez zgłębnik żołądkowy. Wzrost guza monitoruje się za pomocą systemu obrazowania in vivo.

Obrazowanie in vivo i leczenie terapeutyczne w ortotopowym modelu raka jajnika u myszy

Poznaj metodę oznaczania utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy. Technika ta umożliwia badanie metabolizmu wątroby oraz ocenę interwencji farmakologicznych i genetycznych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Przeglądaj więcej filmów