Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Ogólnym celem tej procedury jest ocena metabolizmu kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy. Osiąga się to poprzez najpierw perfuzję, wątrobę myszy z trawieniem, pożywkę, usunięcie jej, a następnie wyizolowanie hepatocytów. Drugim krokiem jest hodowla hepatocytów na płytkach pokrytych kolagenem.

Następnie hepatocyty są traktowane interwencjami eksperymentalnymi, które mają być przetestowane. Ostatnim krokiem jest inkubacja komórek w obecności substratu znakowanego radiowo. Ostatecznie analiza scyntylacji cieczy służy do wykazania wpływu różnych interwencji farmakologicznych lub genetycznych na utlenianie kwasów tłuszczowych lub lipogenezę w pierwotnych hepatocytach.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kilka kluczowych pytań w dziedzinie metabolizmu i cukrzycy, w tym na to, jak określone interwencje farmakologiczne i genetyczne wpływają na biologię hepatocytów. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie z dwóch powodów. Po pierwsze, specyficzne warunki perfuzji, które wpływają na zdrowie hepatocytów, są trudne do uzyskania, a po drugie, określenie ilościowe uwalniania dwutlenku węgla.

Gaz nie jest intuicyjny. Zademonstruje tę procedurę Tom Akey, doktorant z mojego laboratorium. Ustaw pompę perystaltyczną, umieszczając jeden koniec sterylnego rurki w wstępnie rozgrzanej pożywce do perfuzji wątroby, a drugi w pojemniku na odpady.

Uruchom pompę, aż cała długość rurki zostanie wypełniona medium. Po złożeniu ofiary z interesującej nas myszy, spryskaj odwłok myszy obficie 70% etanolem. Następnie użyj nożyczek z końcami, aby wykonać nacięcie w linii środkowej przez skórę właściwą, długość brzucha i odbić się na boki.

Wykonaj podobne nacięcie w otrzewnej, aby odsłonić wnętrzności. Za pomocą narzędzia delikatnie przemieszcz jelita. Aby odsłonić naczynia krwionośne w jamie brzusznej, zlokalizuj żyłę główną dolną jamy brzusznej i umieść szew pod naczyniem krwionośnym dystalnie do żyły nerkowej, dystalnie do szwu.

Umieść igłę i cewnik w żyle głównej dolnej i wysuń je poza szew. Trzymając igłę nadal na miejscu, zawiąż szew wokół cewnika, aby utrzymać go na miejscu, a następnie ostrożnie wyjmij igłę. Jeśli zrobisz to prawidłowo, krew będzie przepływać przez cewnik za pomocą pipety.

Wypełnij pozostały obszar cewnika medium perfuzyjnym i upewnij się, że nie ma powietrza. Następnie z wielką ostrożnością przymocuj rurkę do cewnika. Następnie ostrożnie nakłuj przeponę nożyczkami z ostrą końcówką i wykonaj boczne nacięcie, aby odsłonić jamę opłucnej.

Uważając, aby uniknąć unaczynienia pęcherzyka żółciowego i opłucnej, umieść zacisk buldoga wokół żyły głównej dolnej klatki piersiowej tuż obok żyły wątrobowej. Następnie przetnij żyłę wrotną i włącz pompę z prędkością od trzech do czterech mililitrów na minutę. Perfuzję wątroby za pomocą pożywki do perfuzji wątroby przez pięć minut przy użyciu około 20 mililitrów pożywki perfuzyjnej.

W tym czasie obserwuj natychmiastową zmianę koloru wątroby z czerwonego na szary brąz. Jeśli części wątroby pozostają czerwone, oznacza to słabą perfuzję i prawdopodobieństwo udanej izolacji jest znacznie zmniejszone. Po pięciominutowej perfuzji zatrzymać pompę i przenieść rurkę do pożywki do trawienia wątroby.

Uruchom ponownie pompę i wykonuj płuca wątroby przez kolejne 10 do 15 minut. W tempie od trzech do czterech mililitrów na minutę, aż pożywka zostanie wyczerpana. Pod koniec perfuzji zatrzymaj pompę.

Wątroba powinna mieć różowawy odcień i wyglądać na nieco powiększoną. W tym momencie wyciąć wątrobę przez staranną sekcję. Przenieś do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej i usuń woreczek żółciowy.

Następnie dodaj 10 mililitrów podłoża galwanicznego do wątroby i zacznij delikatnie zeskrobywać wątrobę za pomocą skalpela. Aby usunąć hepatocyty, przefiltruj zawiesinę za pomocą sitka do komórek o wielkości 100 mikronów i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Umyj płytkę dodatkowymi 10 mililitrami środka galwanicznego i wciągnij płyn do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Następnie osadzać komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, centrować przez pięć minut W temperaturze 350 Gs, odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach pożywki galwanicznej. Następnie dodaj 10 mililitrów 90% krzemionki koloidalnej pokrytej delikatnie zmieszanym poliwinylem peronem, a następnie peletki komórek jak poprzednio. Po odwirowaniu odessać warstwę martwych komórek unoszących się na wierzchu mieszaniny.

Następnie umyj żywe granulowane komórki dwukrotnie 20 mililitrami posiewu. Średnia resus. Zawieś ostateczną osadkę komórkową w 10 mililitrach pożywki galwanicznej i policz komórki za pomocą cytometru hemocytometru, umieść 90 000 komórek na studzienkę w pokrytych kolagenem 24 dobrze naczyniach hodowlanych inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny, 16 do 20 godzin przed rozpoczęciem testu.

Umyj komórki dwa razy ciepłym PBS i zmień komórki na głód surowicy bez surowicy. Pożywka z 20 nanomolami glukagonu. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla rano w dniu testu.

Przygotuj pożywkę do inkubacji, a następnie zmień głód surowicy. Pożywka do pożywki do wstępnej inkubacji. Inkubuj komórki w tej mieszaninie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny podczas inkubacji.

Wysuszyć 0,5 mikrokiurów na studzienkę palmitynianu C 14 poprzez odparowanie rozpuszczalnika etanolu pod azotem na około 15 minut przed końcem inkubacji, ponownie zawiesić palmitynian C 14 w ilości 12,5 mikrolitra na mikrocurie w 0,1. Normalny wodorotlenek sodu inkubować mieszaninę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie dodać trzy objętości ciepłej inkubacji wstępnej, pożywki i mieszać, pipetując w górę iw dół.

Wypełnij każdą studzienkę 25 mikrolitrami rozcieńczonej mieszanki palmitynianu C 14, delikatnie kołysząc płytką i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut. To jest płytka testowa Podczas inkubacji zdejmij pokrywę ze sterylnej płytki 24-dołkowej i umieść jeden kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach dwa centymetry na dwa centymetry na dnie każdej z studzienek. Następnie nałóż na płytkę kawałek parametru o wymiarach cztery cale na siedem cali za pomocą dużego prostokątnego przedmiotu, takiego jak pudełko na końcówki do mikropipet.

Pocieraj paraformę o dołki, aby przebić paraformę w otworach studzienek i utworzyć uszczelnienie na pozostałej części płytki. Następnie usuń perforowane kręgi perfum. Teraz przykrywając studzienki na 10 minut przed końcem inkubacji, dodaj 200 mikrolitrów trzech normalnych wodorotlenków sodu do każdej studzienki płyty z bibuły filtracyjnej, upewniając się, że bibuła filtracyjna wchłonęła całą ciecz.

Pod koniec inkubacji zatrzaskowo zamrozić płytkę testową w ciekłym azocie. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 70% na kwas kaloryczny do każdej studzienki płytki testowej. Natychmiast przykryj płytką z bibuły filtracyjnej i umieść płytki na wytrząsarce orbitalnej.

Kołysz płytami z prędkością orbitalną 80 obr./min w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie zmierz frakcję dwutlenku węgla, przenosząc kwadraty bibuły filtracyjnej do czterech mililitrów ciekłego płynu scyntylacyjnego w fiolkach scyntylacyjnych i zmierz sygnał C 14 na liczniku scyntylacyjnym, aby zmierzyć materiał rozpuszczalny w kwasie. Przenieś 400 mikrolitrów pożywki do 1,5 mililitrowej wirówki z mikro fuge z maksymalną prędkością przez 10 minut, a następnie dodaj 100 mikrolitrów powstałego supernatantu do 500 mikrolitrów mieszaniny chloroformu i metanolu dwa do jednego.

Krótko zmieszaj mieszaninę, a następnie dodaj 250 mikrolitrów wody do mieszaniny i wiruj. Ponownie odwiruj próbki przez 10 minut w temperaturze tysiąca Gs, a następnie przenieś 200 mikrolitrów górnej fazy do czterech mililitrów płynnego płynu scyntylacyjnego w fiolce scyntylacyjnej i zmierz sygnał C 14 po głodzeniu komórek w surowicy. Zamień komórki w pożywkę lipogenezy.

Dodaj dowolne związki interesujące do testowania, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny po okresie inkubacji. Umyj komórki dwa razy PBS przed lizą komórek, dodając 120 mikrolitrów 0,1 normalnego kwasu solnego. Do każdego dobrze zeskrob studzienki, aby uwolnić lizat, a następnie pipetuj 100 mikrolitrów lizatu do 1,5 mililitrowej rurki mikrofuge.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów mieszaniny chloroformu i metanolu dwa do jednego do każdej probówki. Krótko wirować, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po inkubacji w 250 mikrolitrach wiru wodnego, a następnie inkubować próbkę przez dodatkowe pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 3000 Gs. Ostrożnie przenieść dolną fazę oddzielonej cieczy do czterech mililitrów ciekłego płynu scyntylacyjnego w fiolce scyntylacyjnej i zmierzyć aktywność trytu za pomocą licznika scyntylacyjnego. Ta procedura zwykle powoduje izolację od 10 do 30 milionów hepatocytów na mysz. Po całonocnej inkubacji zdrowe komórki wydają się sześciokątne, z których wiele będzie jądrzastych.

Niezdrowe kultury często zawierają ziarniny lub pęcherzyki, które wskazują na śmierć komórki. Przedstawiono tutaj wyniki testu utleniania kwasów tłuszczowych, w którym dodatek promotora oddychania komórkowego F-C-C-P-A i oligo mycyny, inhibitora oddychania, porównano z kontrolą nośnika w celu zmierzenia całkowitego utlenienia. Obliczany jest stosunek dwutlenku węgla do materiału rozpuszczalnego w kwasach.

Substancje, które wspomagają oddychanie komórkowe, takie jak FCCP, przesuną ten stosunek w kierunku dwutlenku węgla, wskazując na większe utlenianie przez TC. Inhibitory cyklu oddechowego zmniejszają utlenianie w całości, gdy są mierzone. W przypadku związków o aktywności lipo, które zwiększają utlenianie kwasów tłuszczowych, takich jak FCCP lub zmniejszają syntezę TP, takich jak oligo mycyna, zmniejszą aktywność lipo w hodowanych hepatocytach w porównaniu z kontrolami nośnika. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby upewnić się, że obfitość następuje całkowicie i w odpowiednim czasie po uśmierceniu zwierząt.

Dodatkowo, podczas testu utleniania kwasów tłuszczowych, całkowite zamrożenie pożywki ma kluczowe znaczenie dla powtarzalnych pomiarów gazowego dwutlenku węgla. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować pierwotne hepatocyty, a także używać tych komórek do analizy utleniania kwasów tłuszczowych i lipogenezy in vitro.