Izolacja komórek Kupffera do badania toksyczności nanocząstek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyizolowanie i oczyszczenie bańki myszy pod kątem dużej liczby komórek w celu zbadania toksyczności nanocząstek. Osiąga się to poprzez perfuzję wątroby myszy roztworem H-B-S-S-E-G-T-A i kolagenem, roztworem delikatnie trawiącym tkankę wątroby. Następnie komórki wątroby są oczyszczane przez gęstość, wirowanie i selektywną adhezję w celu uzyskania kultury oczyszczonego kubka na komórki.

Następnie przeprowadzana jest analiza cytometrii przepływowej w celu potwierdzenia czystości i właściwości kwasowych kubka F dla komórek. Uzyskano wyniki, które pokazują, że funkcjonalizowaną toksyczność nanorurek węglowych można zmierzyć w kubku dla komórek. Na podstawie zmodyfikowanego L-D-H-S-A potwierdzającego, że model ten może być stosowany do badania toksyczności nanocząstek.

Metoda, którą zamierzamy dzisiaj pokazać, może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nanotoksykologii, takie jak ocena toksyczności niedawno opracowanych nośników leków, co jest dość ważne, ponieważ większość użytych unieśmiertelnionych linii komórkowych wykazuje znacznie inne właściwości niż tkanki, z których pochodzą. Kluczowe znaczenie ma wizualna demonstracja tej metody. Jeśli metoda zostanie przeprowadzona pomyślnie, spowoduje to uzyskanie wysokiej wydajności i czystości komórek ke, które można następnie wykorzystać jako model do badania przesiewowego szeregu nanocząstek pod kątem tej toksyczności.

Po świeżo przygotowanym wszystkich odczynników wymienionych w tabeli materiałów i odczynników znajdującej się wraz z dołączonym protokołem tekstowym, podgrzej roztwór E-G-T-A-H-B-S-S i roztwór kolagenazy w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 30 minut, użyj 70% etanolu do przepłukania elastycznej rurki pompy. Następnie wlej 40 mililitrów roztworu E-G-T-A-H-B-S-S do probówki wirówkowej zanurzonej w łaźni wodnej i użyj wstępnie podgrzanego E-G-T-A-H-B-S-S do przepłukania elastycznego przewodu pompy. Po eutanazji płyty CD jedna mysz, zgodnie z protokołem tekstowym, ogolić włosy na brzuchu i użyć 70% etanolu do dezynfekcji powierzchni brzucha.

Potwierdź znieczulenie, szczypiąc palec u nogi. Przeciąć jamę brzuszną i odsłonić żyłę wrotną i żyłę główną dolną, przesuwając jelito na boki po lewej stronie brzucha. Uruchom pompę z prędkością od jednego do trzech mililitrów na minutę za pomocą roztworu E-G-T-A-H-B-S-S i za pomocą igły motylkowej o rozmiarze 23 kanuluj żyłę wrotną, zaciskaj kaniulowany odcinek żyły wrotnej, a następnie odwróć kleszczyki sinusoidalne na powierzchni otwartego brzucha myszy.

Wątroba powinna zblednąć w ciągu pierwszych 30 sekund perfuzji, szybko naciąć dolną część żyły głównej dolnej, aby uniknąć nadmiernego wzrostu ciśnienia w wątrobie i stopniowo zwiększać szybkość przepływu do siedmiu mililitrów na minutę w ciągu pierwszej minuty perfuzji. Gdy w probówce wirówkowej pozostało mniej niż pięć mililitrów roztworu E-G-T-A-H-B-S-S. Dodaj 40 do 50 mililitrów kolagenu roztworu, a następnie stopniowo zwiększaj natężenie przepływu do 10 mililitrów na minutę w ciągu 30 sekund.

Spraw, aby wątroba puchła, używając pęsety do okresowego wywierania nacisku na żyłę główną dolną w odstępach od 10 do 32. Poprawi to dysocjację komórek i skróci czas perfuzji z kolagenazą. Gdy w probówce wirówkowej pozostanie mniej niż 10 mililitrów roztworu kolagenazy, dodaj do probówki dodatkowe 40 do 50 mililitrów wstępnie ciepłego roztworu kolagenazy.

Następnie, po perfuzji od 70 do 80 mililitrów, użyj kleszczy, aby lekko docisnąć powierzchnię. Znak depresji wskazuje, że komórki wątroby są zdysocjowane. Usuń wątrobę z jamy brzusznej jako jeden kawałek i umieść ją w probówce wirówkowej zawierającej od 20 do 30 mililitrów kubka do izolacji komórek. Średni.

Utrzymuj komórki wątroby na lodzie do trzech godzin i zbierz do trzech wątrób w celu oczyszczenia, aby oczyścić kubek na komórki. Umieść jedną perfundowaną wątrobę na szalce Petriego z 15 mililitrami kubka do izolacji komórek, pożywki za pomocą nożyczek lub pęsety. Rozerwij błyszczącą torebkę i uwolnij wszystkie komórki wątroby do pożywki.

Przefiltrować roztwór przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do probówki wirówkowej. Następnie odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 50 GS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie minuty. Komórki miąższowe będą znajdować się w osadzie, a komórki niemiąższowe będą w supernatancie.

Zebrać sklarowany osad w czystej probówce wirówkowej i wirować z stężeniem 50 g przez dwie minuty. Powtórz tę czynność, co daje w sumie cztery transfery i obroty. Następna wirówka.

Supernat na 1,350 GS przez 15 minut. Aby osadzać komórki niemiąższowe, odrzuć supernat i ponownie zawieś osad w 10 mililitrach kubka na pożywkę do izolacji komórek, dodaj niemiąższowy roztwór komórek do nieciągłego 25 50% gradientu izotonicznego przygotowanego wcześniej zgodnie z protokołem tekstowym i odwiruj przy 850 GS przez 15 minut bez przyspieszania lub przerwy. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej odessać około 12 mililitrów wzbogaconego kubka dla frakcji komórek, która wydaje się mętna w obrębie frakcji 25% SIP w pobliżu granicy faz 25-50%.

Przenieś komórki do probówki wirówkowej zawierającej od 35 do 40 mililitrów kubka do izolacji komórek, pożywki i delikatnie wymieszaj, a następnie odwiruj w temperaturze 1, 350 GS i czterech stopniach Celsjusza, aby osadzać komórki, odrzuć super nazwany i użyj od pięciu do 10 mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża do ponownego zawieszenia komórek za pomocą hemocytometru. Policz komórki i użyj barwienia trian blue, aby zmierzyć płytkę żywotności. Oczyszczone niemiąższowe komórki w 24 dołkach o gęstości pięć razy 10 do piątej komórki na dołek.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. Następnie delikatnie usuń podłoże. Użyj wstępnie podgrzanego HBSS do umycia komórek i zastąp go 500 mikrolitrami na studzienkę świeżego podgrzewanego kubka na pożywkę do hodowli komórkowych.

Przywróć komórki do 37 stopni Celsjusza na co najmniej cztery godziny, aby umożliwić komórkom przyleganie przed traktowaniem cząsteczkami nanocząstek. Po scharakteryzowaniu czystości i aktywności fagocytarnej C dla komórek i inkubacji z funkcjonalizowanymi nanorurkami węglowymi lub fct, jak opisano w protokole tekstowym, odrzucić supernatant i dodać 200 mikrolitrów na studzienkę buforu do lizy. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut, przeprowadzić energiczne pipetowanie i zebrać zużyty kubek na komórki w probówkach do mikrowirówek.

Następnie odwirować przy 20 000 GS przez 10 minut, aby wyciągnąć fcn ts, które zostały wchłonięte przez komórki na szczątkach komórek. Zebrać supernatant do mikroprobówek wirówkowych i przechowywać go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Alternatywnie, przenieś 50 mikrolitrów do płytki 96-dołkowej i dodaj równą objętość roztworu mieszającego substrat z zestawu dehydrogenazy mleczanowej.

Dołączyć trzy egzemplarze studzienek ślepych zawierających 50 mikrolitrów buforu do lizy i 50 mikrolitrów roztworu mieszaniny substratów. Następnie przykryj płytkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut przed dodaniem 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego. Na koniec odczytaj absorbancję przy 490 nanometrach w czytniku mikropłytek i użyj poniższego wzoru, aby obliczyć procentową żywotność komórki.

Rysunek ten ilustruje, że liczba oczyszczonych komórek niemiąższowych waha się od ośmiu do 14 razy 10 do sześciu komórek na mysz i trian. Niebieskie barwienie wykazało około 95% żywotności komórek. Przylegający kubek na komórki przybrał okrągły kształt w ciągu 30 minut od inkubacji, a po czterech godzinach komórki rozprzestrzeniły się i zaczęły tworzyć się klastry, jak pokazano tutaj.

Komórki barwiono przeciwciałem F four 80 w celu wykazania czystości komórek, która była mierzona powyżej 95% za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto, po 12 godzinach w hodowli, analiza niskiej cytometrii wykazała, że 85% komórek było zdolnych do kwaśnej aktywności PHA dzięki zdolności do pobierania kulek fluorescencyjnych o długości jednego mikrometra. Jednak liczba ta spadła po 72 godzinach w hodowli, kiedy tylko 40% komórek było fagocytarnych.

Kubek dla komórek inkubowanych z funkcjonalizowanymi nanorurkami węglowymi przez 24 i 72 godziny miał podobną morfologię w porównaniu z komórkami naiwnymi. W przeciwieństwie do tego, kubek dla komórek inkubowanych z 10% DMSO stosowany jako kontrola pozytywna wykazywał nekrotyczną morfologię po analizie zmodyfikowanego kubka testowego LDH dla komórek traktowanych 10% DMSO przez 24 i 72 godziny wykazał wysoką toksyczność w porównaniu, fcts powodowały niewielkie, ale znaczące zmniejszenie żywotności komórek tylko wtedy, gdy komórki były wystawione na działanie 50 mikrogramów na mililitr przez 72 godziny. Zgodnie z tą metodą, inne SC oparte na komórkach i wszystkie rodzaje nanocząstek mogą być testowane przy użyciu izolowanych komórek ke.

Pozwala to na gromadzenie wiarygodnych danych przy jednoczesnym zminimalizowaniu wykorzystania zwierząt. Mamy nadzieję, że ta technika pomoże naukowcom zajmującym się psychologią nanotechnologii w badaniach przesiewowych bezpieczeństwa wielu obiecujących nanonośników, które są coraz częściej opracowywane.