Obserwacja ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza ruchu komórki nabłonkowej splotu naczyniówkowego, Celia ex vivo. Osiąga się to poprzez najpierw wycięcie mózgu z zarodka myszy lub szczeniaka w celu wyizolowania tkanki splotu naczyniówkowego. Ruch mo ciliary jest wizualizowany za pomocą różnicowego kontrastu interferencyjnego lub mikroskopii DIC, a następnie pozyskiwany jest cyfrowy film końcówek rzęsek w celu ręcznego śledzenia pozycji końcówek rzęsek.

Ostatecznie zrekonstruowane ruchy końcówek Celii są kategoryzowane i określane ilościowo na podstawie wzorców ich ruchów. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórki, takie jak: W jaki sposób śmiertelność celii jest kontrolowana podczas rozwoju i jak zmienia się wzorzec mobilności w czasie? Implikacją zakresu tych technik była analiza fizjologiczna ścieżki i diagnoza.

Choroby związane z Syrią jako nasze fundamentalne rozumienie kinetycznej Syrii wciąż są ostróg. Zacznij od umieszczenia myszy noworodkowej płukanej 70% etanolem, głowy w lodowato zimnym liebovitz L 15, podłożu w sterylnym 10-centymetrowym naczyniu natychmiast po ścięciu. Następnie użyj kleszczy zegarmistrzowskich, aby usunąć skórę głowy z czaszki.

Następnie rozetnij czaszkę przez przekrój środkowy wzdłuż szwu podłużnego, aby odsłonić mózg, a następnie przeciąć nerwy czaszkowe, aby pobrać cały narząd. Przenieś izolowany mózg do nowego naczynia wypełnionego świeżym lodem, zimnym podłożem, z grzbietową stroną skierowaną do góry i umieść naczynie pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie ustaw tkankę tak, aby opuszki węchowe znalazły się na godzinie trzeciej i delikatnie chwyć mózg kleszczami zegarmistrzowskimi.

Z drugiej strony użyj cienkich kleszczy preparacyjnych, aby przeciąć poony mózgowe łączące półkule mózgowe z pniem mózgu. Ściśnij Dion Cephalon, aby jeszcze bardziej oddzielić półkule i umieść powierzchnię cięcia skierowaną do góry, a następnie pociągnij za blaszkę afia, aby usunąć boczny splot naczyniówkowy komorowy przymocowany do bocznej strony hipokampa. Po wyizolowaniu splotu naczyniówkowego przenieś tkankę do 35-milimetrowego szklanego naczynia z dnem zawierającego świeżą pożywkę i umieść ciężarek na tkance, aby delikatnie utrzymać ją na miejscu w ciągu 25 do 60 minut od eutanazji, rozpocznij obrazowanie na żywo komórki nabłonka splotu naczyniówkowego Celia, regulując ostrość soczewki obiektywu za pomocą oka.

Wyreguluj kondensator tak, aby środek i ostrość były zgodne z oświetleniem Kula. Następnie włóż odpowiednie elementy optyczne do ścieżki światła, aby były zgodne z optyką DIC. Przesuń pryzmat DIC, aby dostosować kontrast obrazów do pozycji, w której struktura powierzchni tkanki będzie wyraźnie rozpoznawalna.

Następnie przełącz ścieżkę światła na kamerę wideo i zwiększ moc światła. Po usunięciu filtrów o neutralnej gęstości dostosuj pole obserwacji i ostrość, ustawiając rozdzielczość czasową kamery wideo na 200 Hz, a czas ekspozycji na 0,1 milisekundy dla żądanego okresu obrazowania. Następnie uzyskaj obrazy po uzyskaniu stosu obrazów, każda pojedyncza klatka wyświetli wyraźny obraz Celii, aby ręcznie śledzić wzorce bicia każdej rzęski.

Użyj wskaźnika myszy, aby zaznaczyć położenie końcówek rzęsek w każdej klatce. Następnie, za pomocą odpowiedniego oprogramowania, przeanalizuj dane o trajektorii i sklasyfikuj trajektorie do jednego z dwóch trybów ruchu tam iz powrotem lub obrotowego na oko. Korzystając ze wzoru, oblicz częstotliwość dudnienia rzęsek dla wielu cykli dudnienia rzęsek.

Podobnie jak inne Celia na tej samej komórce może zakłócać ruch każdej rzęski. Następnie, aby przeanalizować jednorodność kątową osi bicia rzęsek w pojedynczej komórce. W przypadku trajektorii tam iz powrotem dopasuj pozycje końcówek Celii do linii prostej, definiując theta jako kąt, jaki linia tworzy z osią X.

W przypadku trajektorii obrotowych dopasuj pozycje do elipsy, definiując theta jako kąt, pod jakim oś główna elipsy tworzy się z osią x. Na koniec, aby uzyskać ilościowy opis każdej trajektorii, obróć trajektorie za pomocą theta, definiując ich proporcje jako stosunki między szerokościami ich rozkładu wzdłuż osi x i y. W tym pierwszym klipie pokazano widok z góry komórek nabłonka splotu naczyniówkowego z Celią od szczeniaka myszy w drugim dniu po urodzeniu, zobrazowanego za pomocą szybkiej mikroskopii wideo, nieregularna powierzchnia tkanki splotu naczyniówkowego sprawia, że jest ona widoczna zarówno w płaszczyźnie ostrości, jak i nieostrości.

W tym drugim klipie pokazany jest powiększony widok obszaru ramkowego z poprzedniego filmu, co umożliwia bliższą obserwację ruchów obrotowych i w przód iw tył wykazywanych przez poszczególne rzęski. Tutaj trajektorie reprezentatywnych ruchów końcówki rzęsek odtworzone z zapisów filmowych w wielu cyklach są przedstawione z przebiegami czasowymi współrzędnych x i y pozycji końcówek wykreślonych na wykresach. Aby zademonstrować przesunięcie fazowe między dwiema współrzędnymi na tych wykresach, współrzędne x i Y zostały znormalizowane i nałożone.

Podczas gdy ruchliwe CLIA są łatwo rozpoznawane przez obrazowanie na żywo, nie jest łatwo zidentyfikować nieruchliwe CLIA za pomocą tej metody. Aby przezwyciężyć tę trudność, skaningowa mikroskopia elektronowa może być niezbędna do uzyskania całych obrazów clia, niezależnie od ich ruchliwości. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o tym, aby przeprowadzić sekcję na tyle szybko, aby zachować świeżość próbki i ruchliwość Syrii.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki tkanek z wirusowym zbożem, a także jak monitorować i określać ilościowo śmiertelność CX vivo.