Name: Obserwacja ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę obserwacji ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo u myszy przy użyciu mikroskopii DIC. Technika ta umożliwia analizę wzorców ruchu i częstotliwości rzęsek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Projekt dla Prywatnych Uniwersytetów: dotacja z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) Japonii (T.I.) oraz Grants-in-Aid na badania naukowe (C) z MEXT (S.T. i K.N.).

Protokoły i wykorzystanie zwierząt doświadczalnych zostały zatwierdzone przez instytucjonalne komitety ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania na Uniwersytecie Yamanashi i Uniwersytecie Waseda. Opieka nad zwierzętami odbywała się zgodnie z wytycznymi instytucji.
1. Przygotowanie do CPEC
<ol>
	<li>Przygotuj następujące aparaty i materiały: mikroskop stereoskopowy, najlepiej zdolny do przekazywania światła od dołu; parę kleszczyków zegarmistrzowskich (Dumont #3 lub #4), sterylizowane płomieniem, proste nożyczki do sterylizacji płomieniowej; dwie sterylne 10 cm plastikowe naczynia zawierające 20 ml lodowatego podłoża Leibovitz L-15; naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm zawierające 2 ml pożywki RT Leibovitz L-15; zlewkę o pojemności 100 ml zawierającą 70% etanolu; nowonarodzone młode myszy.</li>
	<li>Zanurz na krótko nowonarodzoną mysz w 70% etanolu i szybko poddaj eutanazji przez ścięcie głowy za pomocą nożyczek operacyjnych.</li>
	<li>Natychmiast umieść głowę w lodowatym podłożu Leibovitz L-15 w sterylnym naczyniu o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Usuń skórę z kalwarii za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich, rozetnij czaszkę, aby odsłonić mózg, a następnie przetnij nerwy czaszkowe, aby odizolować cały mózg.</li>
	<li>Przenieś mózg do nowego naczynia zawierającego lodowatą pożywkę Leibovitz L-15 i obserwuj pod mikroskopem stereoskopowym, upewniając się, że mózg jest całkowicie zanurzony w pożywce.</li>
	<li>Ustaw grzbietową część mózgu skierowaną do góry i ustaw mózg tak, aby opuszki węchowe znajdowały się w pozycji godziny trzeciej (dla osób praworęcznych). Chwyć delikatnie mózg kleszczami w lewej ręce.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych (Dumont #3 lub #4) w prawej ręce, przeciąć ciało modzelowate i pod spodem miąższ łączący półkule mózgowe, wzdłuż podłużnej szczeliny mózgu.</li>
	<li>Delikatnie odepchnij półkule mózgowe na boki i odsłoń poprzeczną szczelinę mózgowia.</li>
	<li>Oddziel półkule, ściskając miąższ między półkulą a wzgórzem.</li>
	<li>Delikatnie wyciągnij boczny splot naczyniówkowy komory, który jest przymocowany do bocznej strony hipokampa za pomocą blaszki afiksa.</li>
	<li>Przenieść izolowany splot naczyniówkowy do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm zawierającego świeżą pożywkę Leibovitz L-15 i delikatnie nałożyć na nią ciężarek (Wykaz materiałów), aby utrzymać tkankę na miejscu.</li>
</ol>
2. Obrazowanie na żywo rzęsek CPEC
<ol>
	<li>Upewnij się, że filtry odcinające w ultrafiolecie (UV) i wywnioskowanym (IR) są prawidłowe w celu zablokowania światła krótszego niż 400 nm i dłuższego niż 700 nm oraz że filtry o neutralnej gęstości (ND) (25% i 6%) są umieszczone na ścieżce światła mikroskopu odwróconego.</li>
	<li>Wyreguluj ostrość soczewki obiektywu mniej więcej na oko, a następnie wyreguluj kondensor tak, aby środek i ostrość były zgodne z oświetleniem Köhlera. Włóż odpowiedni pryzmat różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), element DIC, a także elementy analizatora i polaryzatora w ścieżce światła, aby zachować zgodność z optyką DIC.</li>
	<li>Dostosuj kontrast widoku przez położenie pryzmatu DIC, aby struktura powierzchni tkanki była jak najbardziej rozpoznawalna. Jeśli wszystkie rzęski komórek docelowych są ruchliwe, nie można uzyskać wyraźnego obrazu ruchliwych rzęsek na oko ze względu na ich ruch.</li>
	<li>Zmień ścieżkę światła do kamery wideo i usuń filtry ND, aby zwiększyć moc światła.</li>
	<li>Użyj aparatu w trybie ustawiania ostrości, aby dostosować pole view i ostrość. Podczas ustawiania ostrości, w którym obrazy wideo są wyświetlane w czasie rzeczywistym na monitorze, wyraźny widok ruchliwych rzęsek nie jest dostępny.</li>
	<li>Używaj aparatu przy 200 Hz z czasem naświetlania 0.1 ms przez żądany okres (sekundy do minut). Po pozyskaniu stosu obrazów, pojedyncze klatki będą wyświetlać wyraźne struktury rzęskowe. Jeśli krawędzie rzęsek są rozmyte, zwiększ liczbę klatek na sekundę lub użyj krótszego czasu ekspozycji.</li>
	<li>Rejestruj ruch rzęsek CPEC w ciągu 25–60 minut po eutanazji w pożywce Leibovitz L-15.</li>
</ol>
3. Analiza ruchu rzęsek
<ol>
	<li>Ręcznie śledź wzorce dudnienia każdej rzęski na monitorze komputera. Zaznacz pozycje końcówek rzęsek w każdej ramce za pomocą wskaźnika myszy, który jest zmontowany w celu uzyskania informacji o trajektorii każdej rzęski. Albo przeanalizuj informacje o trajektorii za pomocą tego samego oprogramowania, albo wyeksportuj je do innych, bardziej ogólnych aplikacji w celu dalszej analizy. Skuteczność tego etapu analizy została opisana w Dyskusji.</li>
	<li>Sklasyfikuj trajektorie na dwa tryby ruchu, w przód iw tył lub obrotowy, na oko.</li>
	<li>Oblicz częstotliwość dudnienia rzęsek (CBF) za pomocą następującego wzoru: [CBF = (liczba klatek na sekundę)/(średnia liczba klatek na jedno uderzenie)]14, którą można uzyskać z diagramu ruchu końcówki rzęski (rysunek 3). Powtórz to obliczenie dla wielu cykli dudnienia rzęsek, ponieważ inne rzęski na tej samej komórce mogą zakłócać ruch każdej rzęski, powodując nieregularność.</li>
	<li>Aby przeanalizować jednorodność kątową osi dudnienia rzęsek w pojedynczej komórce, zdefiniuj kąt dudnienia θ dla każdej trajektorii (ryc. 4). W przypadku trajektorii tam iz powrotem dopasuj położenie końcówki rzęsek do linii prostej i zdefiniuj θ jako kąt, jaki tworzy linia z osią x. W przypadku trajektorii obrotowych dopasuj pozycje do elipsy i zdefiniuj θ jako kąt, pod jakim oś główna elipsy tworzy się z osią x. Szczegóły dotyczące dopasowania są opisane w sekcji Reprezentatywne wyniki.</li>
	<li>Aby uzyskać ilościowy opis każdej trajektorii, oblicz uogólniony współczynnik kształtu AR. Krótko mówiąc, obróć trajektorię o -θ i zdefiniuj AR jako stosunek szerokości rozkładu wzdłuż osi x i y (rysunek 4B). Szczegóły są przedstawione w sekcji Reprezentatywne wyniki, a interpretacja, znaczenie i ograniczenie parametru są opisane w Dyskusji.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki do SEM
Uwaga: SEM jest ważną metodą oceny stanu rzęsek na CPEC w kompleksowy sposób. Do przygotowania próbek do SEM stosuje się standardową procedurę opisaną wcześniej15 z niewielkimi modyfikacjami.
<ol>
	<li>Przed wycięciem tkanki z mózgu należy przygotować utrwalacz w szklanej fiolce o pojemności 5 ml z polietylenową nakrętką. Utrwalacz składa się z 2% paraformaldehydu, 2,5% aldehydu glutarowego (połowa roztworu Karnovsky'ego16) w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4.</li>
	<li>Wypreparuj tkankę z mózgu, jak opisano w kroku 1.</li>
	<li>Krótko przepłucz wyizolowaną tkankę zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) w nowym naczyniu, a następnie utrwal tkankę w utrwalaczu w szklanej fiolce na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Używaj jednorazowych pipet transferowych i delikatnie obchodź się z próbkami. Po spłukaniu w HBSS tkanka staje się lepka.
	<ol>
		<li>Aby przenieść próbki do roztworu utrwalającego, należy powoli usunąć niewielką ilość roztworu zawierającego tkankę z pipety transferowej w postaci kropelki i dodać do utrwalacza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po utrwaleniu wyrzucić utrwalacz i trzykrotnie przepłukać tkankę buforem fosforanowym.</li>
	<li>Zanurz tkankę w 10% roztworze sacharozy, aby wypłukać pozostałe aldehydy. Aby zapewnić całkowitą eliminację aldehydów, zanurz próbki w roztworze na 10 minut, a następnie powtórz dwukrotnie ze świeżą 10% sacharozą. Ten krok jest ważny, aby osiągnąć prawidłowe utrwalenie w kolejnych krokach.</li>
	<li>Zanurz tkankę w roztworze 1% tetratlenku osmu w buforze fosforanowym na 30 minut, a następnie umieść na lodzie w celu utrwalenia. Oceń stopień osmizacji na podstawie koloru próbki: gdy aldehydy zostaną całkowicie usunięte, próbka jest.</li>
	<li>Kilkakrotnie dokładnie przemyć próbki tkanek po utrwaleniu wodą podwójnie destylowaną.</li>
	<li>Odwodnić próbki przez zanurzenie w stopniowanych stężeniach etanolu, zwykle 65%, 75%, 85%, 95%, 99% i 100%, przez 10 minut każda. Otrzymaj bezwodny etanol, umieszczając sita molekularne w 99,5% etanolu z nowo zakupionej butelki. Powtórz odwodnienie bezwodnym etanolem trzy razy.</li>
	<li>Odwodnione próbki należy umieścić w octanie izoamylu, odczynniku podstawienia do suszenia w punkcie krytycznym, na 10 minut. Powtórz ten krok dwukrotnie. Odczynnik ten szybko odparowuje, a próbka może stać się sucha, co powoduje zniszczenie przez napięcie powierzchniowe. Dlatego nie należy całkowicie suszyć próbki.</li>
	<li>Po ostatecznej wymianie octanu izoamylu należy usunąć większość rozpuszczalnika, natychmiast owinąć otwartą szklaną fiolkę folią aluminiową i umieścić fiolkę na suchym lodzie. Za pomocą igły lub cienkich kleszczyków należy wykonać kilka otworów w folii zakrywającej otwór fiolki, tak aby ciekły dwutlenek węgla łatwo spływał do fiolki w suszarce w punkcie krytycznym. Przejdź do następnego kroku tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Na tym etapie należy zminimalizować przenoszenie octanu izoamylu do komory osuszacza, ale nie należy dopuścić do całkowitego wyschnięcia próbki przed wysuszeniem w punkcie krytycznym. Ponadto nie należy pozostawiać próbki na suchym lodzie przez niepotrzebnie długi czas, aby uniknąć tworzenia się szronu na fiolce.</li>
	<li>Szklane fiolki owinięte folią zawierające próbki tkanek należy przenieść do suszarki w punkcie krytycznym, która zapewnia, że struktura powierzchniowa tkanki pozostaje nienaruszona, jednocześnie usuwając wodę zawartą w tkance. Szczegółowe informacje na temat obsługi osuszacza punktu krytycznego można uzyskać w instrukcji producenta.</li>
	<li>Z próbkami należy obchodzić się ostrożnie za pomocą wykałaczki, aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne. Powstałe w ten sposób wysuszone próbki tkanek są delikatne. Zamontuj próbki na metalowych klockach i pokryj złotem-palladem za pomocą rozpylania jonowego.</li>
</ol>
5. Obserwacja przez SEM
<ol>
	<li>Obserwuj za pomocą SEM i rejestruj obrazy za pomocą kamery cyfrowej wyposażonej w skaningowy mikroskop elektronowy.</li>
	<li>Przesyłaj cyfrowe dane obrazu do komputera w celu analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+ciliary+motility+on+choroid+plexus+epithelial+cells+during+the+perinatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period.</a> Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).</li>
<li>Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+cilia+in+developmental+disorders+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The roles of cilia in developmental disorders and disease.</a> Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).</li>
<li>Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+cilia+go+bad%3A+cilia+defects+and+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).</li>
<li>Oh, E. C., Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+in+vertebrate+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia in vertebrate development and disease.</a> Development. 139 (3), 443-448 (2012).</li>
<li>Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+cilia+of+human+airway+epithelia+are+chemosensory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory.</a> Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).</li>
<li>Kiprilov, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+in+culture+possess+primary+cilia+with+hedgehog+signaling+machinery%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery).</a> The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).</li>
<li>Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+flow+and+the+generation+of+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal flow and the generation of left-right asymmetry.</a> Cell. 125 (1), 33-45 (2006).</li>
<li>Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+multiple+primary+cilia+reveals+a+novel+mode+of+ciliary+development+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals.</a> Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).</li>
<li>Takeda, S., Narita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+vertebrate+cilia%2C+towards+a+new+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).</li>
<li>Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+polyglutamylation+is+essential+for+airway+ciliary+function+through+the+regulation+of+beating+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).</li>
<li>Foster, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+ciliary%2Fflagellar+beating+of+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the ciliary/flagellar beating of Chlamydomonas.</a> Methods in Cell Biology. 91, 173-239 (2009).</li>
<li>Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+digital+imaging+of+ependymal+cilia+in+the+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain.</a> Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).</li>
<li>Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nodal+cilia+movement+and+measurement+of+nodal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow.</a> Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).</li>
<li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beat+pattern+is+associated+with+specific+ultrastructural+defects+in+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+and+kinesin+superfamily+protein+KIF3A%3A+new+insights+in+determination+of+laterality+and+mesoderm+induction+by+kif3A-%2F-+mice+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis.</a> The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).</li>
<li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolarity+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Niniejsza praca ma na celu przedstawienie szczegółowej metodyki obserwacji ruchliwości rzęsek w izolowanych tkankach splotu naczyniówkowego. Nowinki naukowe zostały zgłoszone we wcześniejszych badaniach1,8.

Perspektywy tej metody
Chociaż opisana tutaj technika nie zapewnia bardziej szczegółowej analizy rzęsek niż wcześniej opublikowane metody, znaczenie tej techniki polega na prostocie systemu i efektywności kosztowej, które można łatwo zastosować do badań przesiewowych każdego rodzaju ruchliwości rzęsek ex vivo. W szczególności TI Workbench zapewnia prosty i przyjazny dla użytkownika interfejs, który umożliwia badaczom łatwiejszą obserwację i analizę ruchliwości rzęsek. Nie opracowano s...

Rzęski to przypominające włosy wypustki na powierzchni większości komórek kręgowców, które przyciągnęły uwagę badaczy medycznych ze względu na klasę chorób określanych jako ciliopatie 2-4. Pomimo wszechobecnej ekspresji organelli odnotowano szeroką gamę funkcji rzęskowych, w tym ruchliwość i bioczujniki. Na przykład ruchliwe rzęski na powierzchni błony śluzowej transportują śluz5 i resztki nabłonka do ujścia przewodów, zapobiegając w ten sposób chorobie poprzez oczyszczanie powierzchni nabłonka. Ponadto we wczesnych okresach rozwojowych i stadiach embrionalnych rzęski regulują proliferację komórek macierzystych6 i biorą udział w określaniu asymetrii lewo-prawej strony ciała kręgowców7. 
Komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CPECs) są pochodnymi komórek neuroepitelialnych, które pokrywają powierzchnię tkanki splotu naczyniówkowego w mózgu, które odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostazy środowiska wewnątrzczaszkowego poprzez produkcję płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Wcześniej wykazano, że CPEC mają wiele nieruchliwych rzęsek, które regulują produkcję płynu mózgowo-rdzeniowego poprzez receptory sprzężone z białkiem G, które są specyficznie skoncentrowane na rzęskach8. Chociaż rzęski te były uważane za spokojne rzęski nieruchome, odkryto, że niektóre rzęski CPEC wykazują przejściową ruchliwość w okresie noworodkowym1. Odkrycie to było dość ważne, ponieważ ujawniło, że tak zwane rzęski nieruchome niekoniecznie są nieruchome od początku rozwoju i mogą wykazywać przejściową ruchliwość w określonych oknach czasowych, prawdopodobnie w odpowiedzi na określone wymagania i funkcje fizjologiczne9. Aby precyzyjnie opisać ruchliwą naturę rzęsek CPEC, konieczne jest opracowanie systemu obserwacji ex vivo, który obejmuje analizę profili kinetycznych unikalnych dla rzęsek CPEC. 
Jeśli chodzi o ruchliwość, chociaż kilka raportów technicznych opisywało obserwacje ruchliwych rzęsek nabłonka tchawicy5,10, ruchliwych jednokomórkowych wici11, tak zwanych konwencjonalnych rzęsek ruchliwych12 i rzęsek węzłowych13, szczegółowe metody analityczne mające zastosowanie do stosunkowo pofałdowanych struktur, takich jak splot naczyniówkowy, nie zostały do tej pory dobrze udokumentowane. Co więcej, do analizy ruchu rzęsek CPEC wymagana jest wysoka rozdzielczość czasowa, w której niezbędne są drogie kamery szybkoobrotowe. Aby obejść tę konieczność i uprościć monitorowanie ruchliwości rzęsek różnych typów komórek, wprowadzono tanią, szybką kamerę oraz opracowano łatwo dostępną i wygodną metodę rejestrowania ruchliwości rzęsek, zwłaszcza w celu opisania prędkości i wzorca ruchu każdej rzęski1. Ponadto zastosowano tu autorskie oprogramowanie do analizy obrazu "TI Workbench", które ułatwia szczegółową analizę ruchliwości. Podsumowując, metoda ta zapewnia nową, zwięzłą strategię analizy ruchu rzęsek wraz z korelacyjną skaningową mikroskopią elektronową (SEM), która może być zastosowana w szerokim zakresie badań rzęsek.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Wymagane odczynniki</td></tr><tr><td colspan="4">do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">do przygotowania SEM</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka</td><td>Life Technologies</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>aldehyd glutarowy&nbsp;</td><td>Nacalai tesque</td><td>17003-05</td><td></td></tr><tr><td>octan izoamylu</td><td>Nacalai tesque</td><td>02710-95</td><td></td></tr><tr><td>Sita molekularne 4A 1/8&nbsp;</td><td>Wako Chemicals</td><td>130-08655</td><td>do przygotowania bezwodnego</td></tr><tr><td>buforu fosforanowego etanolu soli fizjologicznej (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>bufor fosforanowy, 0,1 M</td><td></td><td></td><td>Aby przygotować 100 ml, wymieszaj 19,0 ml 0,1&nbsp; M NaH2PO4 i 81,0 ml 0,1&nbsp; M Na2HPO4</td></tr><tr><td>monosodium fosforan (dwuwodny)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31718-15</td><td></td></tr><tr><td>fosforan disodowy (bezwodny)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31801-05</td><td></td></tr><tr><td>suclose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td></td></tr><tr><td>tetratlenek osmu</td><td>Nisshin EM</td><td>300</td><td></td></tr><tr><td>suchy lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td colspan="4">Narzędzia i materiały do sekcji</td></tr><tr><td colspan="4">zarówno do obrazowania na żywo, jak i przygotowania SEM</td></tr><tr><td>stereoskop</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>płaski ręcznik</td><td></td><td></td><td></td> papierowy</tr><tr><td>&Phi; Naczynie</td><td></td><td></td><td></td>plastikowe 10</tr><tr><td>cm Zlewka</td><td></td><td></td><td></td>100 ml</tr><tr><td>Nożyczki proste</td> Szczypce zegarmistrzowskie <td>Sansyo</td><td>S-2B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>No.DU-3 lub -4, INOX</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>szklane naczynie dolne</td><td>Matsunami Glass</td><td>D110300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">do przygotowania SEM</td></tr><tr><td>alminum flainka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szklana 5 ml z polietylenowym nasadką</td><td>Nichiden Rika-Glass</td><td>PS-5A</td><td></td></tr><tr><td>pipeta transferowa</td><td>Samco</td><td>Scientific SM251-1S</td><td>do transportu próbek</td></tr><tr><td>Wykałaczka</td><td></td><td></td><td>do przenoszenia próbek</td></tr><tr><td>Napylanie jonowe ze złotem i palladem</td><td>Hitachi</td><td>Suszarka punktu krytycznego E-1030</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hitachi</td><td>HCP-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Mikroskopijny sprzęt i materiały</td></tr><tr><td colspan="4">do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>100 W obudowa i zasilacz z bryłami rtęci</td><td>Olympus</td><td>Lampa rtęciowa U-ULH i BH2-RFL-T3</td><td></td></tr><tr><td>100 W</td><td></td><td>Kondensator Ushio</td> USH103D <td></td></tr><tr><td>DIC, nie dotyczy 0,55</td> Można zastosować migawkę elektryczną <td>Olympus</td><td>IX-LWUCD</td><td></td></tr><tr><td></td> Vincent <td>Associates</td><td>VS35S22M1R3-24 i VMM-D1</td><td>.</td></tr><tr><td>filtr pasmowo-przepustowy (400-700&nbsp; nm, &Phi; 45&nbsp; mm)</td> <td>Filtr ND Koshin Kagaku</td><td>C10-110621-1</td><td></td></tr><tr><td>(&Phi; 45 mm)</td><td>Olympus</td><td>45ND6, 45ND25</td><td>kombinacja filtrów 25% i 6% ND to soczewka</td></tr><tr><td>obiektywu (zanurzenie w wodzie) z elementem DIC</td><td>Olympus</td><td>UApo 40XW/340, n.a., 1.15 z szybką kamerą wideo IX-DPAO40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Allied Vision Technologies</td><td>GE680</td><td>&#8805; Częstotliwość odświeżania 200 Hz i czas naświetlania 1 ms</td></tr><tr><td>oprogramowanie do akwizycji / analizy obrazu</td> w <td>domu, oprogramowanie</td><td>TI Workbench</td><td>zdolne do akwizycji z dużą liczbą klatek na sekundę.</td></tr><tr><td>Komputer do sterowania / analizy kamery</td><td>Stół</td> izolacyjny drgań Apple <td>Mac Pro</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Meiritsu Seiki</td><td>AD0806</td><td></td></tr><tr><td>waga do tkanek</td><td>Zestawy kotew krojonych</td><td>Warner Instruments</td><td>Może być wykonany z nylonowej siatki przyklejonej do zgniecionego w kształcie litery U i Phi; 0,5&nbsp; mm drut platynowy.</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (alternatywna waga dla chusteczek)</td><td>Matsunami</td><td>na zamówienie</td><td>Szkło nakrywkowe może być używane jako odważnik do chusteczek.</td></tr><tr><td colspan="4">dla SEM</td></tr><tr><td>inverted mikroskop</td> skaningowy <td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td></td><td>JEOL</td><td>JSM-6510</td><td></td></tr></tbody></table>

obserwacja ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Splot naczyniówkowy znajduje się w ścianie komorowej mózgu, której główną funkcją uważa się za produkcję płynu mózgowo-rdzeniowego. Komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CPEC) pokrywające powierzchnię tkanki splotu naczyniówkowego zawierają wiele unikalnych rzęsek, ale większość funkcji tych rzęsek pozostaje do zbadania. Aby odkryć funkcję rzęsek CPEC ze szczególnym uwzględnieniem ich ruchliwości, opracowano system obserwacji ex vivo do monitorowania ruchliwości rzęsek w okresie embrionalnym, okołoporodowym i poporodowym. Splot naczyniówkowy wypreparowano z komory mózgowej i obserwowano pod mikroskopem kontrastowym ze wzmocnieniem wideo, wyposażonym w dyferencyjną optykę kontrastową. W tych warunkach opracowano prostą i ilościową metodę analizy profili ruchliwych rzęsek CPEC przez kilka godzin ex vivo. Następnie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej obserwowano zmiany morfologiczne rzęsek podczas ich rozwoju, aby wyjaśnić związek między dojrzałością morfologiczną rzęsek a ruchliwością. Co ciekawe, metoda ta może nakreślić zmiany w liczbie i długości rzęsek, które osiągnęły szczyt w dniu pourodzeniowym (P) 2, podczas gdy częstotliwość bicia osiągnęła maksimum w P10, po którym nastąpiło nagłe ustanie w P14. Techniki te umożliwią wyjaśnienie funkcji rzęsek w różnych tkankach. Podczas gdy podobne techniki zostały opublikowane w poprzednim raporcie1, obecne badanie koncentruje się na szczegółowych technikach obserwacji ruchliwości i morfologii rzęsek CPEC ex vivo.

Przegląd przebiegu pracy przedstawiono na Rysunku 1, wraz z obrazami urządzeń.
Obserwacje ruchu CPECs w czasie rzeczywistym
Film 1 przedstawia komórki CPECs wyizolowane z myszy w okresie okołoporodowym, a Film 2 pokazuje powiększony widok obrazów z Filmu 1. Należy zauważyć, że poszczególne końcówki rzęsek są mniej wyraźne na obrazach statycznych w porównaniu do filmów. Rycina 2 prze...

W tym badaniu, szczegółowa technika mikroskopii świetlnej została zoptymalizowana do obserwacji i analizy ruchu rzęsek CPEC w czasie rzeczywistym ex vivo wraz z metodą mikroskopii elektronowej do analizy ultrastrukturalnej.

Obserwacja ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest analiza ruchu rzęsek komórek nabłonkowych splotu naczyniówkowego ex vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie wycięcie mózgu z zarodka lub noworodka myszy w celu wyizolowania tkanki splotu naczyniówkowego. Ruch rzęsek jest wizualizowany za pomocą mikroskopii kontrastowo-fazowej (DIC), a następnie rejestrowany jest cyfrowy film końcówek rzęsek w celu ręcznego śledzenia pozycji tych końcówek.Ostatecznie zrekonstytuowane ruchy końcówek rzęsek są kategoryzowane i kwantyfikowane na podstawie wzorców ich przemieszczania się. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki, takie jak: w jaki sposób kontrolowana jest śmiertelność rzęsek podczas rozwoju oraz jak wzorzec mobilności zmienia się w czasie? Zastosowanie tych technik rozciąga się na analizę patofizjologiczną oraz diagnostykę.Choroby związane z Syrią, ponieważ nasza podstawowa wiedza na temat kinetyki Syrii jest wciąż ograniczona. Rozpocznij od umieszczenia noworodka myszy przepłukanego 70% etanolem, głową w lodowatym medium Liebovitz L 15, w sterylnej szalce 10 cm bezpośrednio po dekapitacji. Następnie, używając pęsety zegarmistrzowskiej, usuń skórę z czaszki.Następnie naciąć czaszkę wzdłuż szwu podłużnego, wykonując przekrój pośrodkowy w celu odsłonięcia mózgu, a następnie przeciąć nerwy czaszkowe, aby wyizolować cały organ. Przenieść wyizolowany mózg do nowej szalki wypełnionej świeżym, schłodzonym w lodzie medium, stroną grzbietową do góry, i umieścić szalkę pod stereomikroskopem. Następnie zorientować tkankę tak, aby opary węchowe znajdowały się na godzinie trzeciej, i delikatnie chwycić mózg pęsetą zegarmistrzowską.Drugą ręką, używając precyzyjnej pęsety anatomicznej, przetnij połączenia łączące półkule mózgu z pniem mózgu. Rozdziel Dion Cephalon, aby dodatkowo odseparować półkule, a następnie ułóż preparat powierzchnią cięcia skierowaną do góry i pociągnij za lamina afia, aby usunąć splot naczyniowy komór bocznych przytwierdzony do bocznej strony hipokampa. Po wyizolowaniu splotu naczyniowego przenieś tkankę do szalki z szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów zawierającej świeże medium i umieść na tkance obciążnik, aby delikatnie ją unieruchomić. W czasie od 25 do 60 minut po eutanazji rozpocznij obrazowanie na żywo rzęsek komórek nabłonkowych splotu naczyniowego, dostosowując ostrość obiektywu metodą wizualną.Wyreguluj kondensator tak, aby środek i ostrość były zgodne z oświetleniem Köhlera. Następnie wprowadź do toru optycznego odpowiednie elementy optyczne, aby dostosować go do optyki DIC. Przesuń pryzmat DIC, aby dostosować kontrast obrazu do pozycji, w której struktura powierzchni tkanki będzie wyraźnie rozpoznawalna.Następnie należy przełączyć ścieżkę światła na kamerę wideo i zwiększyć moc oświetlenia. Po usunięciu filtrów neutralnej gęstości należy ustawić pole obserwacji oraz ostrość, konfigurując rozdzielczość czasową kamery wideo na 200 hertz, a czas ekspozycji na 0.1 milliseconds dla pożądanego okresu obrazowania. Następnie należy zarejestrować obrazy; po uzyskaniu stosu obrazów każda pojedyncza klatka będzie wyświetlać wyraźny obraz rzęsek, co umożliwi ręczne śledzenie wzorców uderzeń każdego cilium.Użyj wskaźnika myszy, aby zaznaczyć pozycję wierzchołków rzęsek w każdej klatce. Następnie, korzystając z odpowiedniego oprogramowania, przeanalizuj dane dotyczące trajektorii i dokonaj wizualnej klasyfikacji trajektorii do jednego z dwóch trybów ruchu: posuwisto-zwrotnego lub rotacyjnego. Stosując wzór, oblicz częstotliwość uderzeń rzęsek dla wielu cykli uderzeń rzęsek.Ponieważ inne rzęski w tej samej komórce mogą zakłócać ruch każdej z nich. Następnie, aby przeanalizować jednorodność kątową osi uderzeń rzęsek w obrębie pojedynczej komórki. Dla trajektorii ruchu w przód i w tył dopasowano pozycje końców rzęsek do linii prostej, definiując theta jako kąt, jaki linia ta tworzy z osią X.W przypadku trajektorii rotacyjnych dopasowano pozycje do elipsy, definiując theta jako kąt, jaki oś wielka elipsy tworzy z osią x. Na koniec, w celu ilościowego opisu każdej trajektorii, obrócono trajektorie o kąt theta, definiując ich współczynniki kształtu jako stosunki szerokości ich rozkładu wzdłuż osi x i y. W tym pierwszym klipie pokazany jest widok z góry na komórki nabłonka splotu naczyniówkowego z rzęskami u mysiego szczenięcia w drugim dniu po urodzeniu, obrazowany za pomocą szybkoklatkowej mikroskopii wideo; nieregularna powierzchnia tkanki splotu naczyniówkowego sprawia, że jest ona widoczna zarówno w płaszczyźnie ostrości, jak i poza nią.W tym drugim klipie przedstawiono powiększony widok obszaru zaznaczonego ramką w poprzednim filmie, co umożliwia dokładniejszą obserwację ruchów rotacyjnych oraz posuwisto-zwrotnych pojedynczego rzęski. Tutaj zaprezentowano trajektorie reprezentatywnych ruchów końcówek rzęsek zrekonstruowane z zapisów filmowych z wielu cykli, a na wykresach naniesiono przebiegi czasowe współrzędnych x i y pozycji końcówek. Aby zademonstrować przesunięcie fazowe między dwiema współrzędnymi na tych wykresach, współrzędne x i Y zostały znormalizowane i nałożone na siebie.Podczas gdy ruchome CLIA są łatwo rozpoznawalne w obrazowaniu na żywo, identyfikacja CLIA nieruchomych za pomocą tej metody nie jest prosta. Aby pokonać tę trudność, niezbędne może być zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej w celu uzyskania pełnych obrazów clia, niezależnie od ich ruchliwości. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o wykonaniu sekcji wystarczająco szybko, aby zachować świeżość próbki oraz ruchliwość Syria.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania próbek tkanek z użyciem wirusowego cerealia, a także sposobów monitorowania i ilościowego określania śmiertelności w układzie CX vivo.

observation-ciliary-movement-choroid-plexus-epithelial-cells-ex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje rozwój modelu kiełkowania naczyniówki ex vivo do badania angiogenezy mikronaczyniowej oka. Test polega na hodowli eksplantatów oka myszy zawierających tkankę naczyniówki przyczepioną do twardówki i nabłonka barwnikowego siatkówki w określonych warunkach, które sprzyjają kiełkowaniu mikronaczyniówki przez naczyniówkę.

Test kiełkowania naczyniówki w celu zbadania proliferacji mikrokrążenia gałki ocznej ex vivo

Ten film demonstruje procedurę izolowania komórek odpornościowych od mysich splotów naczyniówkowych. Ta procedura jest stosowana w badaniach neuroimmunologicznych, aby zrozumieć, w jaki sposób komórki odpornościowe w splocie naczyniówkowym wpływają na zdrowie mózgu i różne choroby neurologiczne.

Izolowanie komórek odpornościowych z mysich splotów naczyniówkowych

Źródło: Al Omran, A. J., et al. Obrazowanie na żywo rzęsek wyściółki w komorach bocznych mózgu myszy. J. Vis. exp. (2015).  Ten film demonstruje technikę obrazowania na żywo przy użyciu mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC) do obserwacji bicia rzęsek wyściółki w strzałkowych odcinkach mózgu myszy. Rzęski wyściółki napędzają płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), a ich aktywność jest rejestrowana w sekcjach mózgu utrzymywanych w pożywce bogatej w składniki odżywcze i obrazowanych w komorze o...

Obrazowanie na żywo aktywności rzęsek komórek wyściółki w wycinku mózgu myszy

Źródło: Van Wonterghem, E., et al. Mikrodysekcja i wizualizacja skaningowej mikroskopii elektronowej myszy z całego mocowania. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia przygotowanie i obrazowanie tkanki splotu naczyniówkowego z mózgu myszy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Proces obejmuje utrwalanie, odwadnianie i powlekanie tkanki przewodzącą warstwą platyny w celu stabilizacji i przygotowania próbki do obrazowania. SEM rejestruje szczegółowe obrazy komórek nabłonka z...

Wizualizacja splotu naczyniówkowego mózgu myszy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Korzystając z mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC) o wysokiej rozdzielczości, obserwuje się ex vivo bicie ruchliwych rzęsek wyściółki znajdujących się w komorach mózgu myszy za pomocą obrazowania na żywo. Technika ta pozwala na rejestrację unikalnej częstotliwości i kąta dudnienia rzęsek, a także ich właściwości stymulacyjnych wewnątrzkomórkowych oscylacji wapnia.

Obrazowanie na żywo rzęsek wyściółki w bocznych komorach mózgu myszy

Komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CP) tworzą barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (BCSFB). Model in vitro BCSFB wykorzystuje ludzkie komórki brodawczaka splotu naczyniówkowego (HIBCPP). W artykule opisano hodowlę i infekcję podstawno-boczną komórek HIBCPP przy użyciu systemu wkładek filtrujących do hodowli komórkowych.

Model nabłonka splotu naczyniówkowego oparty na komórkach ludzkiej bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy do badania infekcji bakteryjnej od strony podstawno-bocznej

Celem tego protokołu jest pokazanie hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) na starzejącej się i/lub chorej ludzkiej błonie Brucha. Ta metoda jest odpowiednia do badania zachowania komórek RPE na uszkodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na modelu ex vivo starzejącej się błony błony mięśniowej człowieka

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie nowego modelu neurodegeneracji jaskry opartej na 360° termicznej kauteryzacji rąbkowego splotu naczyniowego, wywołującej podostre nadciśnienie oczne.

Kauteryzacja pełnego koła rąbka splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni

To badanie wykorzystuje cytometrię przepływową i dwie różne strategie bramkowania na izolowanych perfundowanych splotach naczyniówkowych mózgu myszy; ten protokół identyfikuje główne podzbiory komórek odpornościowych, które wypełniają tę strukturę mózgu.

Izolacja i charakterystyka komórek odpornościowych z mikropreparowanych splotów naczyniówkowych myszy

Splot naczyniówkowy (CP), niedostatecznie zbadana tkanka w neurobiologii, odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje technikę mikrodysekcji w celu wyizolowania CP i zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej w celu uzyskania ogólnego obrazu jego struktury komórkowej.

Mikrodysekcja i skaningowa mikroskopia elektronowa z całym mocowaniem Wizualizacja splotu naczyniówkowego myszy

Poznaj metodę obserwacji ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo u myszy przy użyciu mikroskopii DIC. Technika ta umożliwia analizę wzorców ruchu i częstotliwości rzęsek w czasie rzeczywistym.

Obserwacja ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo

Przeglądaj więcej filmów