Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania

Ogólnym celem tej procedury jest dokładne wykonanie kaniuli i mikroiniektorów oraz prawidłowe wykonanie mikroiniekcji. Osiąga się to poprzez uprzednie wyprodukowanie kaniuli o odpowiedniej długości. Drugim krokiem jest wycięcie i zmontowanie mikrowtryskiwaczy.

Następnie należy przygotować mikrowtryskiwacze, rurkę i pompę do mikroiniekcji. Ostatnim krokiem jest zakończenie mikroiniekcji i pozostawienie okresu dyfuzji. Ostatecznie mikroiniekcja służy do dokładnego wstrzykiwania odczynników do pożądanego obszaru mózgu, wykazując prawidłową obsługę.

Podczas mikroiniekcji będzie Ryan Poland, student w moim laboratorium. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ należy zachować szczególną ostrożność, a wszystkie kroki wymagają dużej uwagi, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie kaniuli i miejsce mikroiniekcji. Aby przygotować kaniulę, najpierw narysuj 15-milimetrową linię odniesienia na taśmie za pomocą pisaka z cienką końcówką.

Następnie użyj go jako przewodnika do sekwencyjnego oznaczania 15-milimetrowych odcinków na rurce ostrym markerem permanentnym. Następnie naciąć rurkę kaniuli, dotykając jej wolno obracającej się tarczy odcinającej narzędzia obrotowego. W zaznaczonych punktach obróć kaniulę o 180 stopni i naciąć przeciwną stronę rurki.

Nie przecinaj całkowicie rurki, ponieważ może to prowadzić do niedrożności. Następnie ostro zegnij rurkę, aby podzielić ją na 15-milimetrowe odcinki. Następnie przytrzymaj każdy koniec kaniuli prostopadle do odciętego dysku między kciukiem a palcem wskazującym.

Obróć rurkę kaniuli, dotykając jej końcówką powierzchni tarczy odcinającej, aby uzyskać końcówkę. Następnie rozwiercić oba końce kaniuli za pomocą igły ze skosem o rozmiarze 26, aby upewnić się, że wszystkie zadziory zostały usunięte i że kaniula jest drożna. Aby przygotować zacisk zasłonowy jedną kaniulę w przybliżeniu w połowie długości z prostymi hemostatykami o średniej wadze, połóż zablokowany hemostat na ławce tak, aby kaniula była prostopadła do ławki.

Następnie wprowadź jeden koniec drutu atora do kaniuli, aż dotrze do stołu. Zegnij drut, ściskając palcami, aż do uzyskania kąta 30 stopni, zachowując kontakt między zasłoną a ławką. Następnie usuń drut z kaniuli i odetnij nadmiar części w odległości 2,5 milimetra od zagięcia za pomocą małych ukośnych nożyków.

W tej procedurze trzymaj jeden koniec rurki mikrowtryskiwacza prostopadle z zablokowanym prostym hemostatem. Przekręć hemostat, utrzymując napięcie na rurce i zwiń go ciasno wokół hemostatu przynajmniej jeden raz. Następnie zmierz 32 milimetry od przeciwległego luźnego końca rurki mikrowtryskiwacza i chwyć ten punkt prostopadle drugim hemostatem.

Zegnij rurkę w przód iw tył, utrzymując napięcie, aż pęknie. Następnie sprawdź rurkę mikrowtryskiwacza, aby upewnić się, że oba końce są proste, a średnica wewnętrzna nie jest drożna. Narysuj pięciomilimetrową linię odniesienia na taśmie mierniczej i zaznacz kolejno pięć milimetrowych odcinków rurki kaniuli za pomocą trwałego markera.

Następnie przyłóż rurkę kaniuli do wolno obracającej się tarczy odcinającej w zaznaczonych punktach, aby naciąć rurkę. Następnie ostro zegnij rurkę kołnierza mikrowtryskiwacza, aby podzielić ją na pięciomilimetrowe odcinki. Wsuń jeden kołnierz na każdą rurkę mikrowtryskiwacza w odległości około dwóch centymetrów od końca.

Nałóż niewielką ilość super kleju na rurkę mikrowtryskiwacza w odległości pięciu milimetrów od jednego końca. Następnie nasuń kołnierz na super kulkę kleju tak, aby znajdowała się jeden milimetr od końca rurki do mikroiniekcji. Następnie przykryj oba końce kołnierza klejem.

Następnie przymocuj igłę o rozmiarze 26 do jednomililitrowej strzykawki wypełnionej sterylną wodą. I wsuń ośmiocentymetrowy kawałek plastikowej rurki mikrowtryskiwacza na igłę, uważając, aby nie przebić rurki, po czym nasuń drugi koniec plastikowej rurki na kołnierz wysuszonego mikrowtryskiwacza. Popchnij tłok strzykawki wypełnionej wodą, aby sprawdzić patent C.In tym kroku zegnij gotowy mikrowtryskiwacz na 15 milimetrów od końca przeciwnego do kołnierza o 95 stopni.

Następnie przytnij plastikową rurkę do 70 centymetrów i nasuń ją na kołnierz mikrowtryskiwacza. Aby przygotować pompę do mikroiniekcji, należy ustawić średnicę igły do mikroiniekcji, żądaną szybkość infuzji oraz docelową objętość wstrzyknięcia na probówce. Następnie ustaw tryb pompy na objętość, aby precyzyjna objętość była dostarczana automatycznie.

Następnie wyreguluj ogranicznik pompy, aby umożliwić napełnienie strzykawki do objętości wstrzyknięcia plus dodatkowe 0,2 mikrolitra. Teraz umieść końcówkę szczelnej strzykawki w sterylnej wodzie zawartej w małej łódeczce serwatkowej i delikatnie trzepocz tłokiem, aby równomiernie nasmarować drut wewnętrzny. Pociągnąć tłok do ogranicznika na pompie, aby napełnić igłę do mikroiniekcji wodą.

Następny slajd. Rurka PE 20, która jest podłączona do mikrowtryskiwacza na igłę o rozmiarze 26 przymocowaną do jednomililitrowej strzykawki wypełnionej sterylną wodą. Rozpyl sterylną wodę przez mikrowtryskiwacz i sprawdź wzór natryskiwania oraz odległość.

Następnie umieść wysterylizowany mikrowstrzykiwacz na sterylnym polu. Zsuń rurkę z igły, odetnij rurkę poniżej obszaru uszkodzonego przez igłę, trzymając ją w pozycji pionowej, aby zapobiec kapaniu wody. Następnie popchnij tłok strzykawki z mikrowtryskiwaczem lekko do przodu, aby utworzyć kroplę na końcu igły i wsuń rurkę PE 20 wypełnioną wodą na igłę.

Następnie popchnij tłok całkowicie do przodu, aby przygotować się do załadowania próbki i upewnić się, że w mikrowtryskiwaczu nie pozostał śladowy ilość etanolu. Sprawdź ustawienie pod kątem wycieków, dotykając kilkakrotnie kropli wody, która tworzy się na końcówce mikrowtryskiwacza, czystą chusteczką laboratoryjną. Następnie odciągnąć tłok strzykawki o 0,2 mikrolitra, aby utworzyć pęcherzyk między sterylną wodą a rurką PE 20 a roztworem, który ma być wstrzyknięty.

Następnie umieścić mikrowstrzykiwacz w odczynniku, który ma być wstrzyknięty i powoli pociągnąć tłok strzykawki do blokady. Aby przygotować zwierzę do wstrzyknięcia, przyłóż klatkę piersiową szczura do klatki piersiowej eksperymentatora. Oczyść obszar wokół kaniuli bawełnianym aplikatorem nasączonym Betadine.

Przetrzyj nasadkę głowy trzy razy Betadine, a następnie dwukrotnie przetrzyj ją etanolem. Następnie umieść napełniony mikrowtryskiwacz w kaniuli. Naciśnij start na pompie mikrowtryskowej i monitoruj ruch pęcherzyków.

Po zakończeniu wstrzykiwania wyjmij mikrowstrzykiwacz z kaniuli i zastąp go obturatorem. Rysunek ten przedstawia transfekcję regionu astrocytów jądra półleżącego przez mikrowstrzyknięty wirus, a rysunek ten pokazuje zmniejszenie motywacji szczurów do samodzielnego podawania etanolu poprzez aktywację transgenu, który uległ nadmiernej ekspresji w jądrze półleżącym. Aktywacja lęku w astrocytach przez ogólnoustrojowe podawanie CNO znacznie zmniejszyła motywację szczurów do samodzielnego podawania etanolu po abstynencji w porównaniu z CNO na nośniku, co nie miało wpływu na równie wyszkoloną kohortę, która wyrażała GFP zamiast strachu, który kiedyś opanowała.

Technika ta może pozwolić na niestandardowe narzędzia do mikroiniekcji mózgu i dalszą elastyczność procedur eksperymentalnych. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać, że do osiągnięcia pożądanego efektu niezbędne jest precyzyjne miejsce mikroiniekcji.