Name: Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji mózgu u gryzoni w celu badania molekularnych substratów zachowania i zaburzeń psychiatrycznych. Technika ta umożliwia precyzyjne dostarczanie substancji do wybranych regionów mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MSB jest wspierane przez Alcohol Beverage Medical Research Foundation, Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537), oraz fundusze startowe zapewnione przez Virginia Higher Education Equipment Trust Fund i VCU School of Medicine.

<ol><li>Koob, G. F., Volkow, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurocircuitry+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Neurocircuitry of addiction.</a> Neuropsychopharmacology. 35 (1), 217-238 (2010).</li>
<li>Kalivas, P. W., Peters, J., Knackstedt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+and+brain+circuits+in+drug+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Interv%22%5BJournal%5D)">Animal models and brain circuits in drug addiction.</a> Mol Interv. 6 (6), 339-344 (2006).</li>
<li>Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reinstatement+model+of+drug+relapse%3A+recent+neurobiological+findings%2C+emerging+research+topics%2C+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research.</a> Psychopharmacology (Berl). 229 (3), 453-476 (2013).</li>
<li>Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+predictive+validity+of+the+rat+self-administration+model+for+abuse+liability%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability).</a> Neurosci Biobehav Rev. 35 (3), 912-938 (2011).</li>
<li>Watson, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockade+of+dopamine+D3+receptors+enhances+while+D2+receptor+antagonism+impairs+social+novelty+discrimination+and+novel+object+recognition+in+rats%3A+a+key+role+for+the+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex.</a> Neuropsychopharmacology. 37 (3), 770-786 (2012).</li>
<li>Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28B%29+receptor+modulation+of+serotonin+neurons+in+the+dorsal+raphe+nucleus+and+escalation+of+aggression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice.</a> J Neurosci. 30 (35), 11771-11780 (2010).</li>
<li>Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychostimulants+act+within+the+prefrontal+cortex+to+improve+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function.</a> Biol Psychiatry. 72 (3), 221-227 (2012).</li>
<li>Bowers, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activator+of+G+protein+signaling+3%3A+a+gatekeeper+of+cocaine+sensitization+and+drug+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking.</a> Neuron. 42 (2), 269-281 (2004).</li>
<li>Abudara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+connexin43+mimetic+peptide+Gap19+inhibits+hemichannels+without+altering+gap+junctional+communication+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes.</a> Front Cell Neurosci. 8, 306(2014).</li>
<li>Cahill, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1R%2FGluN1+complexes+in+the+striatum+integrate+dopamine+and+glutamate+signalling+to+control+synaptic+plasticity+and+cocaine-induced+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses.</a> Mol Psychiatry. 19 (12), 1295-1304 (2014).</li>
<li>McFarland, K., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+mediating+cocaine-induced+reinstatement+of+drug-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior.</a> J Neurosci. 21 (21), 8655-8663 (2001).</li>
<li>Fuchs, R. A., Branham, R. K., See, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+neural+substrates+mediate+cocaine+seeking+after+abstinence+versus+extinction+training%3A+a+critical+role+for+the+dorsolateral+caudate-putamen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different neural substrates mediate cocaine seeking after abstinence versus extinction training: a critical role for the dorsolateral caudate-putamen.</a> J Neurosci. 26 (13), 3584-3588 (2006).</li>
<li>Ebersberger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+meningeal+innervation%3A+aspects+and+consequences+of+chemosensitivity+of+meningeal+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Physiology of meningeal innervation: aspects and consequences of chemosensitivity of meningeal nociceptors.</a> Microsc Res Tech. 53 (2), 138-146 (2001).</li>
<li>Netter, F. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNetter%2C+FH+%22Musculoskeletal+System+Part+I%3A+Anatomy%3B+Physiology%2C+and+Metabolic+Disorders%22">Musculoskeletal System Part I: Anatomy; Physiology, and Metabolic Disorders</a>. 8, 1st ed, CIBA-Geigy. Summit, New Jersey. (1987).</li>
<li>Ferguson, S. M., Eskenazi, D., Ishikawa, M., Wanat, M. J., Phillips, P. E., Dong, Y., Roth, B. L., Neumaier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+neuronal+inhibition+reveals+opposing+roles+of+indirect+and+direct+pathways+in+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transient neuronal inhibition reveals opposing roles of indirect and direct pathways in sensitization.</a> Nat Neurosci. 14 (1), 22-24 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quinones-Hinojosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+deep+brain+structures+with+microinjections+for+delivery+of+drugs%2C+viral+vectors%2C+or+cell+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+injection+of+a+viral+vector+for+conditional+gene+manipulation+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li>
<li>Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdialysis+of+ethanol+during+operant+ethanol+self-administration+and+ethanol+determination+by+gas+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Fornari, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+stereotaxic+surgery+and+animal+welfare+outcome+improvements+for+behavioral+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience.</a> J Vis Exp. (59), e3528(2012).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> J Vis Exp. (20), e880(2008).</li>
<li>Richardson, N. R., Roberts, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+ratio+schedules+in+drug+self-administration+studies+in+rats%3A+a+method+to+evaluate+reinforcing+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy.</a> J Neurosci Methods. 66 (1), 1-11 (1996).</li>
<li>Cheeta, S., Brooks, S., Willner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reinforcer+sweetness+and+the+D2%2FD3+antagonist+raclopride+on+progressive+ratio+operant+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3 antagonist raclopride on progressive ratio operant performance.</a> Behav Pharmacol. 6 (2), 127-132 (1995).</li>
<li>Roberts, D. C., Morgan, D., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+rat+addicted+to+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neuropsychopharmacol+Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">How to make a rat addicted to cocaine.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 31 (8), 1614-1624 (2007).</li>
<li>Arnold, J. M., Roberts, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critique+of+fixed+and+progressive+ratio+schedules+used+to+examine+the+neural+substrates+of+drug+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">A critique of fixed and progressive ratio schedules used to examine the neural substrates of drug reinforcement.</a> Pharmacol Biochem Behav. 57, 441-447 (1997).</li>
<li>Hodos, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+ratio+as+a+measure+of+reward+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Progressive ratio as a measure of reward strength.</a> Science. 134 (3483), 943-944 (1961).</li>
<li>Depoortere, R. Y., Li, D. H., Lane, J. D., Emmett-Oglesby, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+of+self-administration+of+cocaine+in+rats+under+a+progressive-ratio+schedule%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Parameters of self-administration of cocaine in rats under a progressive-ratio schedule.</a> Pharmacol Biochem Behav. 45 (3), 539-548 (1993).</li>
<li>Bowers, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+accumbens+AGS3+expression+drives+ethanol+seeking+through+G+betagamma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nucleus accumbens AGS3 expression drives ethanol seeking through G betagamma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12533-12538 (2008).</li>
<li>Bull, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+Nucleus+Accumbens+Core+Astrocytes+Modulate+Reward+and+the+Motivation+to+Self-Administer+Ethanol+after+Abstinence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Rat Nucleus Accumbens Core Astrocytes Modulate Reward and the Motivation to Self-Administer Ethanol after Abstinence.</a> Neuropsychopharmacology. 39 (12), 2835-2845 (2014).</li>
<li>Hopf, F. W., Chang, S. J., Sparta, D. R., Bowers, M. S., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motivation+for+alcohol+becomes+resistant+to+quinine+adulteration+after+3+to+4+months+of+intermittent+alcohol+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Motivation for alcohol becomes resistant to quinine adulteration after 3 to 4 months of intermittent alcohol self-administration.</a> Alcohol Clin Exp Res. 34 (9), 1565-1573 (2010).</li>
<li>Hopf, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+nucleus+accumbens+SK+channel+activity+enhances+alcohol+seeking+during+abstinence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reduced nucleus accumbens SK channel activity enhances alcohol seeking during abstinence.</a> Neuron. 65 (5), 682-694 (2010).</li>
<li>Salerni, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSalerni%2C+CM+%22Engineering+Adhesives+for+Repeated+Sterilization%22">Engineering Adhesives for Repeated Sterilization</a>. , Henkel. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.henkelna.com/us/content_data/99736_Engineering_Adhesives_for_Repeated_Sterilization.pdf">http://www.henkelna.com/us/content_data/99736_Engineering_Adhesives_for_Repeated_Sterilization.pdf</a> (2015).</li>
<li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> J Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).</li>
<li>Mastakov, M. Y., Baer, K., Xu, R., Fitzsimons, H., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+injection+of+rAAV+with+mannitol+enhances+gene+expression+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain.</a> Mol Ther. 3 (2), 225-232 (2001).</li>
<li>Burger, C., Nguyen, F. N., Deng, J., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+mannitol-induced+hyperosmolality+amplifies+rAAV2-mediated+striatal+transduction+to+a+greater+extent+than+local+co-infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Systemic mannitol-induced hyperosmolality amplifies rAAV2-mediated striatal transduction to a greater extent than local co-infusion.</a> Mol Ther. 11 (2), 327-331 (2005).</li>
<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+autonomic+nervous+system+by+acute+glial+cell+Gq-GPCR+activation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of the autonomic nervous system by acute glial cell Gq-GPCR activation in vivo.</a> J Physiol. 591 (22), 5599-5609 (2013).</li>
<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> PNAS. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li>
<li>Cruikshank, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+block+of+Cx36+and+Cx50+gap+junction+channels+by+mefloquine%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Potent block of Cx36 and Cx50 gap junction channels by mefloquine.</a> PNAS. 101 (33), 12364-12369 (2004).</li>
<li>Miguel-Hidalgo, J., Shoyama, Y., Wanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+gliotoxins+or+a+gap+junction+blocker+in+the+prelimbic+cortex+increases+alcohol+preference+in+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Infusion of gliotoxins or a gap junction blocker in the prelimbic cortex increases alcohol preference in Wistar rats.</a> J Psychopharmacol. 23 (5), 550-557 (2008).</li>
<li>Bowers, M. S., Lake, R. W., Rubinchik, S., Dong, J. Y., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+Homer+1a+function+in+the+nucleus+accumbens+using+adenovirus+gene+transfer+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Elucidation of Homer 1a function in the nucleus accumbens using adenovirus gene transfer technology.</a> Ann N Y Acad Sci. 1003, 419-421 (2003).</li>
<li>Mackler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAC-1+is+a+brain+POZ%2FBTB+protein+that+can+prevent+cocaine-induced+sensitization+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NAC-1 is a brain POZ/BTB protein that can prevent cocaine-induced sensitization in the rat.</a> J Neurosci. 20 (16), 6210-6217 (2000).</li>
<li>Geyer, M. A., Swerdlow, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+startle+response%2C+prepulse+inhibition%2C+and+habituation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Measurement of startle response, prepulse inhibition, and habituation.</a> Curr Protoc Neurosci. 8, Unit 8.7(2001).</li>
<li>Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+reinforced+progressive+ratio+performance+in+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey.</a> Pharmacol Biochem Behav. 9 (5), 631-638 (1978).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma sprzecznych lub sprzecznych interesów.

Przedstawiona tutaj procedura jest skutecznym sposobem wytwarzania kaniul do mikroiniekcji i mikroiniektorów, które pomogą w wyjaśnieniu molekularnych substratów motywowanego zachowania. Ta metoda ma kilka zalet. Po pierwsze, dzięki produkcji własnych implantów i mikroiniektorów można szybko zoptymalizować nowe parametry eksperymentalne; Oznacza to, że nie trzeba czekać na przybycie komponentów wykonanych na zamówienie. Po drugie, ze względu na małą średnicę kaniuli, można jednocześnie wszczepić więcej kaniuli. Skraca to wymagany czas operacji, co może poprawić przeżywalność, a także pozwala na wszczepienie wielu implantów na zwierzę. Po trzecie, oprogramowanie używane do sterowania komorami operacyjnymi z łatwością dostosowuje się do progresywnych harmonogramów proporcji, ponieważ paradygmat stałego współczynnika można szybko przekształcić w paradygmat współczynnika progresywnego, po prostu stosując listę parametrów przejścia zdarzenia, która zawiera żądany harmonogram zbrojenia.
Aby zapewnić szerokie zastosowanie, przedstawiono ogólną procedurę mikroiniekcji, która powinna mieć szerokie zastosowanie w przypadku mikroiniekcji prawie każdego obecnie dostępnego odczynnika. W związku z tym przewidujemy, że technika ta będzie nadal miała podobnie wysoką użyteczność w przyszłości, z niewielkimi modyfikacjami. Zmieniając tylko kilka zmiennych, podejście to można zastosować do szerokiej liczby odczynników. Parametry, które najczęściej byłyby manipulowane, obejmują długość, na jaką mikroiniektor wystaje z kaniuli, objętość wstrzyknięcia i szybkość wstrzyknięcia. Na przykład można chcieć, aby wstrzykiwacz wystawał dalej od końcówki kaniuli, aby uniknąć blizny glejowej, która zwykle tworzy się wokół przewlekłych implantów. Dodatkowo można wstrzyknąć większą objętość. W przypadku mikroiniekcji wirusa prążkowia zwykle stosuje się objętość 1 μl, która jest zwykle wstrzykiwana przez dłuższy czas (często 7 – 10 minut plus 3 – 10 minut dodatkowy czas dyfuzji) w porównaniu z tą stosowaną w przypadku odczynników farmakologicznych (zwykle 0,3 – 0,5 μl w ciągu 2 – 3 minut plus 1 – 3 minuty dodatkowy czas dyfuzji). Użytkownik powinien zapoznać się z literaturą i/lub empirycznie określić parametry najlepiej dopasowane do swoich potrzeb. Niezależnie od tego, sukces tej procedury zależy krytycznie od 4 zmiennych: 1) długości kaniuli, 2) długości mikrowtryskiwacza, 3) jakości wzoru rozpylania mikroiniektora oraz 4) integralności systemu przed wstrzyknięciem. Ponieważ miejsce mikroiniekcji zależy od głębokości, na jaką mikroiniektor wystaje z kaniuli, konieczne jest, aby zarówno kaniule (krok 1.2.8), jak i długość mikroiniektora (po zgięciu, krok 2.2.1) były dokładnie znane i jednolite u wszystkich badanych. Można to łatwo kontrolować, łatwo odrzucając wszelkie narzędzia, które nie mają wymaganej długości podczas końcowego ponownego pomiaru. Co więcej, miejsce wstrzyknięcia można przewidzieć tylko wtedy, gdy występuje ono bezpośrednio pod kaniulą prowadzącą. W związku z tym każdy mikrowtryskiwacz, który nie rozpyla długiego, drobnego strumienia podczas badania (kroki 2.4.6), powinien zostać odrzucony. Wtrysk wysokiej jakości jest również związany z integralnością systemu przed wtryskiem. Jeśli po wylaniu całej wody z wtryskiwacza (przed napełnieniem odczynnikiem) na chusteczce laboratoryjnej zaobserwuje się wiele plam, należy usunąć wyciek (Uwaga dotycząca kroku 2.4.8). Ponadto, jeśli pęcherzyk (krok 2.4.9), który oddziela lek od wody w rurki PE20, nie jest jedną, pojedynczą pęcherzyką (po napełnieniu mikrowtryskiwacza odczynnikiem), oznacza to, że wtryskiwacz jest częściowo zatkany. To zatorowanie może uniemożliwić lub przekierować wstrzyknięcie. Temu również można łatwo zaradzić (uwaga dotycząca kroku 2.4.8).
Jeśli ktoś chce dokonać mikroiniekcji, gdy zwierzę znajduje się w ramie stereotaktycznej, istnieją trzy możliwości. Po pierwsze, można zwiększyć długość kołnierza mikrowtryskiwacza tak, aby mógł być mocno trzymany przez manipulator stereotaktyczny, a także rozciągał się wystarczająco daleko, aby umożliwić podłączenie do rurki PE20. Po drugie, można by tymczasowo wszczepić kaniulę i użyć prezentowanego tutaj standardowego mikroiniektora. Po trzecie, można użyć pipet z ciągnionego i polerowanego szkła. Pytania z dnia 16,17 na dzień
Istotnym ograniczeniem przedstawionej tutaj procedury jest to, że najlepiej przeprowadzić ją u dobrze traktowanych szczurów, które są zaznajomione z procedurą. Szczury wykorzystane do danych opisanych w sekcji wyników nie wymagały specjalnych procedur obchodzenia się ze szczurami, ponieważ ten sam badacz zajmował się szczurami codziennie przez ponad 2 miesiące. Obejmowało to codzienną obserwację i manipulację implantem chirurgicznym przez co najmniej 2 tygodnie. Jednak szczury mogą być szybko przyzwyczajone do wielu technik, które są używane przed testem hamowania impulsów, na który może mieć wpływ stres. Te specjalne techniki habituacji zostały już wcześniej szczegółowo opisane. 43 Poza tymi procedurami zaleca się, aby szczury były przyzwyczajone do procedury mikroiniekcji, w której podczas iniekcji "pozorowanych" stosuje się skrócone mikroiniekcje. Podczas tych pozorowanych iniekcji bardzo ważne jest, aby mikrowstrzykiwacz nie wystawał w tkankę, aby ograniczyć uszkodzenie tkanki. Innymi słowy, mikrowtryskiwacz powinien być wygięty nie dłużej niż 14 mm. W związku z tym dokładne przyzwyczajenie wymagane do optymalnego wdrożenia tej techniki może być postrzegane jako ograniczenie.
Chociaż istnieje kilka paradygmatów behawioralnych do pomiaru motywacji, współczynnik progresywny jest powszechnie używany do ilościowego określenia wysiłku, jaki podmiot jest skłonny włożyć, aby uzyskać wzmacniacz. Paradygmat stosunku progresywnego tworzy miarę znaną jako punkt przerwania, który jest często definiowany jako maksymalna liczba naciśnięć dźwigni w ostatnim zakończonym stosunku; tj. maksymalna reakcja, która wygenerowała wzmocnienie. 21 Współczynnik progresywny jest wrażliwy na wielkość wzmocnienia. Na przykład wyższe dawki kokainy (lub sacharozy) dają wyższy punkt graniczny, a niższe dawki kokainy (lub sacharozy) dają niższy punkt graniczny. 21,22 W związku z tym punkt przerwania jest rutynowo używanym wskaźnikiem zastępczym dla motywacji i/lub wzmacniania skuteczności. 21,23-26 Ponieważ intencją punktu przerwania jest określenie, kiedy zwierzę przestaje reagować, ważnym parametrem paradygmatu progresywnego współczynnika jest długość sesji. Skończone długości sesji mogą nakładać fałszywy limit na wartości punktów przerwania, a sytuacja ta może być nasilona przez zabiegi wstępne, które nienormalnie zmniejszają tempo samodzielnego podawania lub zwiększają pauzy po wzmocnieniu. To zamieszanie można przezwyciężyć na wiele sposobów; Np. sesje, które kończą się, gdy zwierzę wstrzymało odpowiedź o pewną wielokrotność średniego odstępu między infuzjami. 44 Częściej stosowanym wariantem tego podejścia jest przerywanie sesji po wstrzymaniu odpowiedzi przez pewną empirycznie określoną wartość, która jest niezmienna u wszystkich badanych. Metodę zastosowania tego podejścia przedstawiliśmy w kroku 4.4.9.11.

Gryzonie i ludzie reagują w niezwykle podobny sposób na bodźce behawioralne1-3. Sugeruje to, że gryzonie są odpowiednimi obiektami do wyjaśnienia molekularnych substratów zachowania izłożonych schorzeń psychicznych4. Zrozumienie molekularnych substratów złożonych procesów behawioralnych, takich jak motywacja, często wymaga mikroiniekcji do mózgu. Przedstawiona zostanie tu zarówno technika mikroiniekcji mózgu, jak i test motywacji pierwotnej. Szczury będą wykorzystywane jako obiekty, ale procedury te można łatwo dostosować do dobrze traktowanych myszy. Niniejszy dokument obejmuje procedury wytwarzania wymaganych kaniul, obturatorów (atrap kaniul lub styletów) oraz mikroiniektorów. Przedstawiona metoda jest znacznie bardziej elastyczna i bardziej opłacalna niż narzędzia prefabrykowane. Ta elastyczność okaże się cenna przy optymalizacji warunków. Co ważne, ponieważ procedura mikroiniekcji może być wykorzystana do przetestowania niezliczonej ilości hipotez; Przedstawione tu techniki powinny mieć szerokie zastosowanie. Na przykład ligandy receptorowe mogą być mikrowstrzykiwane, aby zrozumieć neurochemię3,5,6; Peptydy przepuszczalne dla komórek i małe cząsteczki mogą być mikrowstrzykiwane w celu zrozumienia wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych7-10; Toksyny, blokery kanałów jonowych lub koktajle antagonistów mogą być mikrowstrzykiwane, aby zrozumieć obwody1,11,12.
Podczas gdy przedstawiony tutaj ogólny protokół może być łatwo dostosowany przez użytkownika do jego konkretnych potrzeb, procedura ta jest szczególnie dobrze dostosowana do testów behawioralnych, ponieważ mikroiniekcja występuje u obudzonych gryzoni, które są tylko pod łagodnym ograniczeniem ręki. Nie jest wymagane znieczulenie ani specjalne ograniczenia. Jest to możliwe, ponieważ sam mózg nie odczuwa bólu. Jeśli jednak znieczulenie nie jest stosowane, mikroiniekcja musi odbywać się przez kaniule, które zostały wcześniej wszczepione stereotaktycznie. Dzieje się tak, ponieważ nocyceptory są obecne na skórze głowy, oponach mózgowych13, które są błonami otaczającymi mózg, oraz okostnej14, która jest błoną pokrywającą czaszkę. Należy zauważyć, że czasami pożądane jest mikroiniekcja w znieczuleniu. Jednym z przykładów jest sytuacja, w której wirus jest wstrzykiwany i można chcieć wstrzyknąć wirusa bezpośrednio za pomocą igieł ze stali nierdzewnej15 lub szklanych pipet, ponieważ może to zmniejszyć uszkodzenie tkanek i poprawić wydajność transdukcji. 16,17 Opisane poniżej mikroiostrzykacze mogą być w tym celu modyfikowane, a sugestie, jak to zrobić, można znaleźć w Dyskusji. Ponieważ inne artykuły JoVE wykazały stereotaktyczną implantację kaniuli mózgowej,18-20 procedury te nie zostaną tutaj omówione.
Prezentujemy te procedury mikroiniekcji razem z testem, który określa ilościowo motywację. Obecnie stosowanych jest kilka modeli umotywowanych zachowań u gryzoni, takich jak boks pasa startowego i skalowanie bariery. W tym miejscu opisujemy, jak używać harmonogramu wzmocnienia opartego na progresywnym współczynniku instrumentalnym do ilościowego określenia motywacji, w której reakcja instrumentalna jest utrzymywana przez wzmacniacz. Reakcja na współczynnik progresywny reaguje na wielkość wzmocnienia. 21,22 W związku z tym test ten jest rutynowo stosowany jako wskaźnik zastępczy dla motywacji i/lub wzmacniania skuteczności. 21,23-30 Ponieważ kilka doskonałych recenzji szczegółowo omówiło ten temat,21,24 skupimy się głównie na kwestiach praktycznych.

<table><tbody><tr><td>Rurka kaniuli</td><td>Amazon Supply / Małe części</td><td>HTXX-26T-60</td><td>26 G, Hypotube S / S 316-TW 26GA</td></tr><tr><td>Obturator</td><td>Amazon Supply / Małe części</td><td>GWXX-0080-30-05</td><td>33 gauge, drut S / S 316LVM 0,008 IN</td></tr><tr><td>Drut mikroiniektora</td><td>MicroGroup</td><td>33RW 304</td><td>33 gauge</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td>3924AC</td><td>Płyn, nieżelowy, może być sterylizowany</td></tr> <tr><td>w autoklawiePlastikowa rurka do mikrowtryskiwaczy</td><td>Becton Dickson</td><td>427406</td><td>PE20</td></tr><tr><td>Średnia waga Hemostats</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241-G</td><td></td></tr><tr><td>Linijka</td><td>Fisher</td><td>09-016</td><td>150 mm</td></tr><tr><td>#7 Kleszcze</td><td>Stoelting</td><td>52100-77</td><td>Dumont, Dumostar</td></tr><tr><td>Narzędzie obrotowe</td><td>Dremmel</td><td>285</td><td>Dwubiegowa</td></tr><tr><td>tarcza tnąca</td><td>McMaster Carr</td><td>3602</td><td>15/16 "x 0,025"</td></tr> <tr><td>Pompa mikroiniekcyjna</td><td>Aparat Harvard</td><td>PhD 2000</td><td></td></tr><tr><td>1 ul Szklana strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>7001KH</td><td>Styl igły: 25s / 2,75 "/ 3</td></tr><tr><td>aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki laboratoryjne</td><td>Kimwipes</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie operacyjne</td><td>Coulbourn</td><td>Graficzne Państwowe</td><td></td></tr><tr><td>Izby Operacyjne</td><td>Coulborun</td><td>Habitest</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Mikroiniekcja mózgu może pomóc w wyjaśnieniu molekularnych substratów złożonych zachowań, takich jak motywacja. W tym celu gryzonie mogą służyć jako odpowiednie modele, częściowo dlatego, że reakcja na bodźce istotne behawioralnie i obwody analizujące wyniki działania bodźca są zadziwiająco podobne między ludźmi a gryzoniami. W badaniu molekularnych substratów złożonych zachowań, mikroiniekcja odczynników, które modyfikują, rozszerzają lub wyciszają określone systemy, jest nieocenioną techniką. Bardzo ważne jest jednak, aby miejsce mikroiniekcji było precyzyjnie ukierunkowane, aby ułatwić interpretację wyników. Przedstawiamy metodę produkcji narzędzi chirurgicznych i igieł do mikroiniekcji, która umożliwia dokładne mikroiniekcje i nieograniczone możliwości dostosowywania przy minimalnych kosztach. Co ważne, technika ta może być z powodzeniem wykonywana u obudzonych gryzoni, jeśli jest przeprowadzana w połączeniu z innymi artykułami JoVE, które obejmowały wymagane zabiegi chirurgiczne. Ponadto istnieje wiele paradygmatów behawioralnych, które dobrze nadają się do pomiaru motywacji. Współczynnik progresywny jest powszechnie stosowaną metodą, która określa ilościowo skuteczność wzmacniacza w utrzymaniu reakcji pomimo (często wykładniczo) rosnącego zapotrzebowania na pracę. Test ten jest wrażliwy na wielkość wzmacniacza i manipulacje farmakologiczne, co pozwala na określenie skuteczności wzmocnienia i / lub motywacji. Przedstawiamy również proste podejście do programowania oprogramowania operacyjnego w celu dostosowania do harmonogramu zbrojenia o progresywnym współczynniku.

W tej części przedstawiamy przykłady wyników, które można uzyskać za pomocą opisanej powyżej procedury. W pierwszej kolejności pokazano typowy obszar poddany transfekcji wektorami wirusowymi (Rysunek 3). Zazwyczaj w tkance prążkowia uzyskuje się objętość transfekcji wynoszącą ~1 mm3. Objętość regionu poddanego transfekcji można ilościowo określić wycinając seryjne przekroje z zastosowaniem metody Cavalieriego.32 Należy zaznaczyć, że objętość transfekcji zależy od wielu czynników, takich jak rodzaj transfekowanej tkanki, serotyp wirusa, promotor, szybkość i objętość iniekcji, liczba wstrzykniętych cząstek, pH wstrzykiwanego preparatu oraz to, czy zastosowano odczynniki hiperosmolane, takie jak mannitol.33,34 Typowo mikroiniekujemy 1012 cząstek/ml, 1 µl na stronę w ciągu 10 min, a następnie odczekujemy dodatkowe 7 min przed zastąpieniem obturatorów. Dodatkowo, pH preparatu wynosi zazwyczaj około 8. Następnie wykazujemy, że motywację można manipulować poprzez ekspresję transgenu (Rysunek 4) lub mikroiniekcję odczynników farmakologicznych (Rysunek 5).
Na Rysunku 4 przedstawiono ekspresję projektowanego receptora aktywowanego wyłącznie przez projektowane leki (DREADDs). Za regionem kodującym receptor DREADD następowały wewnętrzna sekwencja wejścia rybosomu (IRES) oraz kaseta mCitrine. mCitrine umożliwia wygodną wizualizację transfekowanych komórek. Receptor DREADD został sprzężony z heterotrymericznym białkiem G Gαq. Aktywacja sprzężonego z Gαq receptoru DREADD może stymulować astrocyty,28,35 a sam DREADD może być aktywowany poprzez systemiczne podanie klozapiny-N-tlenku (CNO, 3 mg/kg, i.p).14,22,36 Szczury zostały przeszkolone w naciskaniu dźwigni w celu otrzymania wzmocnienia w postaci etanolu, gdzie 3 naciśnięcia dźwigni dawały 1 szansę na picie podczas codziennych, 1-godzinnych sesji przez 60 kolejnych dni. Następnie szczury zostały poddane wymuszonej abstynencji, a w astrocytach jądra półleżącego (nucleus accumbens core) wyekspresowano receptory DREADD sprzężone z Gαq. Po 3 tygodniach abstynencji zmierzono motywację do samopodawania etanolu, określając punkt krytyczny (breakpoint).21,27-30 Aktywacja astrocytów jądra półleżącego za pomocą systemicznego podania CNO zmniejszyła motywację szczurów do powrotu do samopodawania etanolu po abstynencji w porównaniu z grupą otrzymującą nośnik. Co istotne, CNO nie wywarło żadnego wpływu w analogicznie przeszkolonej grupie, w której zamiast DREADD wyekspresowano zielone białko fluorescencyjne (GFP).
<img alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej regionu przedniej spoistki po transfekcji; dołączony schemat atlasu mózgu." src="/files/ftp_upload/53018/53018fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywny region brzusznego prążkowia po transfekcji mikroiniekcyjnym wirusem.Obraz ten ilustruje region astrocytów jądra półleżącego, które zostały poddane transfekcji zgodnie z powyższą metodą. Dane zostały przedrukowane z pracy Bull et al.13 za zgodą właściciela praw autorskich. Szczegóły znajdują się w tej publikacji oraz w dołączonych materiałach uzupełniających. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53018/53018fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy punktu krytycznego dla etanolu; DREADD, GFP, CNO; analiza porównawcza wyników eksperymentalnych." src="/files/ftp_upload/53018/53018fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Motywacja szczurów do samopodawania etanolu została zmniejszona poprzez aktywację transgenu nadmiernie ekspresowanego w astrocytach rdzenia jądra półleżącego. Wirus został wstrzyknięty za pomocą mikroiniekcji, a motywację zmierzono poprzez wyznaczenie punktu krytycznego po upływie jednego tygodnia na ekspresję wirusa. Ekspresowany transgen stanowił projektowany receptor aktywowany wyłącznie przez projektowane leki (DREADDs). Jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA (F(2,30)=3,29, p=0,04), a następnie test post-hoc Scheffé wykazały, że aktywacja DREADD poprzez systemiczne podanie klozapiny-N-tlenku (CNO, 3 mg/kg, ip) znacząco zmniejszyła motywację szczurów do samopodawania etanolu po okresie abstynencji w porównaniu z grupą kontrolną. CNO nie wywarło żadnego wpływu w równie dobrze wytrenowanej kohorcie, w której zamiast DREADD ekspresowane było zielone białko fluorescencyjne (GFP). Dane zostały przedrukowane z Bull et al.13 za zgodą właściciela praw autorskich. Szczegóły znajdują się w tej publikacji oraz w towarzyszących jej materiałach uzupełniających.
<img alt="wykres słupkowy analizy punktu krytycznego dla etanolu; traktowanie placebo i lekiem; zaznaczono istotność statystyczną" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Mikroiniekcja blokerów połączeń szczelinowych zwiększyła motywację szczurów do samopodawania etanolu po okresie abstynencji. Oceniono wpływ dwóch blokerów połączeń szczelinowych na motywację (mierzoną za pomocą punktu krytycznego) szczurów do samopodawania etanolu: meflokiny oraz kwasu 18-α-glcyrrhizynowego (18-α). Dwuway ANOVA wykazała, że mikroiniekcja blokerów połączeń szczelinowych do jądra półleżącego (core) zwiększyła motywację szczurów do samopodawania etanolu po abstynencji (F(3,40)=5.56, p=0.003). Dane zostały przedrukowane z pracy Bull et al.13 za zgodą właściciela praw autorskich. Szczegóły znajdują się w tej publikacji oraz w towarzyszących jej materiałach uzupełniających.

Gryzonie są odpowiednim modelem do badania molekularnych substratów zachowania i złożonych zaburzeń psychicznych. Mikroiniekcja mózgu u obudzonych gryzoni może być wykorzystana do wyjaśnienia substratów chorobowych. Przedstawiono skuteczną i konfigurowalną metodę mikroiniekcji mózgu, a także wykonanie paradygmatu instrumentalnego, który określa ilościowo motywację.

Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest precyzyjne wykonanie kaniuli oraz mikroinjektorów, a także prawidłowe przeprowadzenie mikroiniekcji. W pierwszej kolejności wykonuje się kaniulę o odpowiedniej długości. Drugim krokiem jest przycięcie i montaż mikroinjektorów.Następnie należy przygotować mikroinjektory, cewki oraz pompę do mikroiniekcji. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie mikroiniekcji i odczekanie czasu wymaganego na dyfuzję. W ostatecznym rozrachunku mikroiniekcja jest stosowana w celu precyzyjnego wprowadzenia odczynników do pożądanego obszaru mózgu, co demonstruje prawidłową technikę manipulacji.W mikroiniekcjach uczestniczyć będzie Ryan Poland, student z mojego laboratorium. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ wymagana jest szczególna ostrożność, a każdy etap wymaga ogromnej uwagi, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie kaniuli oraz właściwe miejsce mikroiniekcji. Aby przygotować kaniulę, najpierw narysuj na taśmie linię referencyjną o długości 15 millimeter za pomocą cienkopisu.Następnie należy posłużyć się nim jako wzorem do sekwencyjnego zaznaczenia 15 milimetrowych odcinków na rurce za pomocą ostrego markera permanentnego. Następnie należy naciąć rurkę kaniuli, przykładając ją do powoli obracającej się tarczy odcinającej narzędzia rotacyjnego. W zaznaczonych punktach należy obrócić kaniulę o 180 stopni i naciąć przeciwległą stronę rurki.Nie przecinaj rurki całkowicie, ponieważ może to doprowadzić do niedrożności. Następnie gwałtownie zegnij rurkę, aby połamać ją na sekcje o długości 15 milimetrów. Potem przytrzymaj każdy koniec kaniuli prostopadle do tarczy odcinającej między kciukiem a palcem wskazującym.Obracaj kaniulą, dotykając jej końcówki powierzchni tarczy odcinającej, aby uformować tępy koniec. Następnie rozwierć oba końce kaniuli za pomocą igły skośnej o rozmiarze 26 G, aby upewnić się, że wszystkie zadziory zostały usunięte, a kaniula jest drożna. Aby przygotować zacisk obturatora, zaciśnij kaniulę w połowie jej długości za pomocą prostych kleszczyków hemostatycznych o średniej wadze; połóż zablokowane kleszczyki na blacie w taki sposób, aby kaniula znajdowała się prostopadle do powierzchni blatu.Następnie wprowadź jeden koniec drutu ator do kaniuli, aż dotrze on do stołu. Zginaj drut, ściskając go palcami, aż do uzyskania kąta 30 stopni, utrzymując jednocześnie kontakt między obturatorem a stołem. Następnie wyjmij drut z kaniuli i odetnij nadmiar w odległości 2,5 mm od miejsca zgięcia za pomocą małych cążek bocznych.W tej procedurze należy utrzymać jeden koniec rurki mikroinjektora prostopadle za pomocą zablokowanego prostego kleszczyka hemostatycznego. Obracając kleszczyk przy jednoczesnym napinaniu rurki, należy ciasno owinąć ją wokół kleszczyka co najmniej jeden raz. Następnie należy odmierzyć 32 mm od przeciwległego, wolnego końca rurki mikroinjektora i chwycić ten punkt prostopadle drugim kleszczykiem hemostatycznym.Zginaj rurkę w przód i w tył, utrzymując napięcie, aż pęknie. Następnie sprawdź rurkę mikroinkjektora, aby upewnić się, że oba końce są proste, a średnica wewnętrzna jest drożna. Narysuj linię referencyjną o długości 5 mm na miarce i sekwencyjnie zaznacz 5 mm odcinki rurki kaniuli za pomocą markera permanentnego.Następnie dotknij rurki kaniuli powoli obracającej się tarczy tnącej w zaznaczonych punktach, aby naciąć rurkę. Następnie gwałtownie zgnij rurkę kołnierza mikroinjektora, aby połamać ją na pięciomilimetrowe odcinki. Nasuń jeden kołnierz na każdą rurkę mikroinjektora w odległości około dwóch centymetrów od końca.Nanieś niewielką ilość kleju błyskawicznego na rurkę mikroinkjektora w odległości pięciu milimetrów od jednego z jej końców. Następnie nasuń pierścień na kropelkę kleju tak, aby znajdował się jeden milimetr od końca rurki do mikroiniekcji. Po tym czasie pokryj klejem oba końce pierścienia.Następnie do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej sterylną wodą przymocuj igłę o rozmiarze 26 G. Nasuń ośmiocentymetrowy odcinek plastikowej rurki do mikroinjektora na igłę, uważając, aby nie przebić rurki, a następnie nasuń drugi koniec plastikowej rurki na koniec kołnierza wysuszonego mikroinjektora. Naciśnij tłok strzykawki wypełnionej wodą, aby sprawdzić drożność. W tym kroku zegnij gotowy mikroinjektor pod kątem 95 stopni w odległości 15 mm od końca przeciwległego do kołnierza.Następnie należy uciąć plastikową rurkę na długość 70 centymetrów i nasunąć ją na kołnierz mikroinjektora. Aby przygotować pompę do mikroiniekcji, należy ustawić średnicę igły do mikroiniekcji, pożądane tempo infuzji oraz docelową objętość iniekcji na rurce. Następnie należy ustawić tryb pompy na objętość, aby precyzyjna ilość cieczy była podawana automatycznie.Następnie dostosuj ogranicznik pompy tak, aby strzykawka mogła zostać napełniona objętością wtrysku plus dodatkowe 0,2 µL. Teraz umieść końcówkę szczelnej strzykawki gazowej w sterylnej wodzie znajdującej się w małej łódce do prób i delikatnie poruszaj tłokiem w przód i w tył, aby równomiernie nasmarować wewnętrzny drut. Cofnij tłok do ogranicznika pompy, aby napełnić igłę do mikroiniekcji wodą.Następny slajd. Przewód PE 20 połączony z mikroinjektorem poprzez igłę o rozmiarze 26 G przymocowaną do jednofiltrowej strzykawki wypełnionej sterylną wodą. Należy rozpylić sterylną wodę przez mikroinjektor i sprawdzić wzór oraz zasięg rozpylania.Następnie umieść wysterylizowany mikroinżektor na sterylnym polu. Zsunie rurkę z igły, a następnie odetnij rurkę poniżej miejsca uszkodzonego przez igłę, trzymając ją w pozycji pionowej, aby zapobiec wyciekaniu wody. Następnie lekko wysuń tłok strzykawki mikroinżektora, aby utworzyć kroplę na końcówce igły, i nasuń wypełnioną wodą rurkę PE 20 na igłę.Następnie całkowicie wysuń tłok, aby przygotować się do załadunku próbki i upewnić się, że w mikroinjektorze nie pozostały żadne ślady etanolu. Sprawdź szczelność układu, dotykając kilka razy czystą chusteczką laboratoryjną kropli wody tworzącej się na końcówce mikroinjektora. Następnie cofnij tłok strzykawki o 0,2 µL, aby stworzyć pęcherzyk powietrza między wodą sterylną a cewką PE 20 oraz roztworem przeznaczonym do wstrzyknięcia.Następnie umieść mikroinżektor w odczynniku przeznaczonym do wstrzyknięcia i powoli odciągnij tłok strzykawki do oporu. Aby przygotować zwierzę do iniekcji, przyciśnij klatkę piersiową szczura do klatki piersiowej eksperymentatora. Oczyść obszar wokół kaniuli aplikatorem watnym nasączonym Betadyną.Przetrzyj nasadkę głowicy trzy razy Betadine, a następnie dwa razy etanolem. Następnie umieść napełniony mikroinjektor w kaniuli. Naciśnij przycisk start w pompie do mikroiniekcji i monitoruj ruch pęcherzyka powietrza.Po zakończeniu iniekcji należy wyjąć mikroinżektor z kaniuli i zastąpić go obturatorem. Ten rysunek przedstawia transfekcję regionu astrocytów jądra półleżącego za pomocą mikroiniekcji wirusa, a ten rysunek pokazuje zmniejszenie motywacji szczurów do samopodawania etanolu poprzez aktywację transgenu, który był nadeksperymowany w jądrze półleżącym. Aktywacja DREAD w miejscach występowania astrocytów rdzeniowych poprzez systemowe podanie CNO znacząco zmniejszyła motywację szczurów do samopodawania etanolu po okresie abstynencji w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą CNO w nośniku, co nie wywarło żadnego wpływu na równie wytrenowaną kohortę wykazującą ekspresję GFP zamiast DREAD.Technika ta umożliwia dostosowanie narzędzi do mikrowstrzykiwania do mózgu, co zapewnia większą elastyczność procedur eksperymentalnych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że precyzyjna lokalizacja mikrowstrzyknięcia jest niezbędna do osiągnięcia pożądanego efektu.

rodent-brain-microinjection-to-study-molecular-substrates-motivated

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Monitorowanie poziomów neurotransmiterów pozakomórkowych w określonych obszarach mózgu swobodnie poruszających się zwierząt dostarcza wiedzy na temat związku między uwalnianiem neurotransmiterów a zachowaniem. Mikrodializa in vivo w połączeniu z detekcją elektrochemiczną zapewnia doskonałą rozdzielczość anatomiczną i chemiczną, a także informacje o tym, w jaki sposób podstawowa neurotransmisja ulega zmianom pod wpływem manipulacji farmakologicznych lub fizjologicznych.

Przeżywalna operacja stereotaktyczna u gryzoni

Źródło: Poland, R. i wsp. Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania. J. Vis. Exp. (2015)W tym filmie zestaw do mikroiniekcji wypełniony wodą, składający się ze strzykawki i rurki do mikrowstrzykiwaczy, służy do precyzyjnego dostarczania leku. Szczur z wszczepioną kaniulą prowadzącą jest poddawany celowanej mikroiniekcji mózgu, umożliwiającej dokładne podawanie środków terapeutycznych obudzonym zwierzętom przy minimalnym uszkodzeniu tkanek.

Oparte na mikroiniekcjach dostarczanie środka terapeutycznego do obudzonego mózgu gryzonia

Ten protokół opisuje montaż i użycie iniekcji do precyzyjnego dostarczania leku do wybranych obszarów mózgu znieczulonego szczura, a następnie monitorowanie aktywności neuronalnej za pomocą zarejestrowanych sygnałów elektrycznych.

Mikroiniekcja leku z zapisem elektrofizjologicznym w mózgu szczura

Źródło: Paolone, G., et al. Spersonalizowane igły do mikroiniekcji w mózg gryzoni. J. Vis. Exp. (2018).Ten film przedstawia wstrzyknięcie mikroigłowe do mózgu gryzonia za pomocą mikroigły kwarcowej z otworami. Mikroigła jest podłączona do strzykawki i mikropompy w celu kontrolowania szybkości podawania. Igła z roztworem do wstrzykiwań jest wprowadzana do mózgu z prędkością podawania ustawioną na niską. Po ustawieniu zwiększa się szybkość dostawy. Igła jest wycofywana po krótkiej przerwie.

Mikroiniekcja mózgu gryzoni za pomocą mikroigły kwarcowej

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

Ten artykuł opisuje, jak mikrowstrzykiwać wektory wirusowe do mózgu myszy, a następnie testować w warunkowym paradygmacie preferencji miejsca, który obejmuje fazę przejęcia, wyginięcia i przywrócenia.

Stereotaktyczne mikroiniekcja wektorów wirusowych eksprymujących rekombinazę Cre w celu zbadania roli genów docelowych w preferencjach miejsca uwarunkowanego kokainą

Tutaj tworzymy szklaną pipetę o podwójnej funkcji: hamowaniu głębokich struktur mózgu za pomocą mikroiniekcji leków i monitorowaniu ich efektów w czasie rzeczywistym poprzez jednoczesne zapisy elektrofizjologiczne.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia

Stereotaktyczne wstrzykiwanie lentiwirusów wyrażających cDNA lub shRNA może modulować ekspresję genów w określonych obszarach mózgu myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół łączący zastrzyki stereotaktyczne z zadaniami behawioralnymi, takimi jak Test Otwartego Pola (OFT) i Test Wymuszonego Pływania (FST).

Zastosowanie techniki iniekcji stereotaktycznej do badania wpływu genetycznego na zachowania zwierząt

Wykazaliśmy, że wszczepienie mikroelektrody w korze ruchowej szczurów powoduje natychmiastowe i trwałe deficyty motoryczne. Proponowane tutaj metody obejmują operację wszczepienia mikroelektrod i trzy zadania behawioralne gryzoni w celu wyjaśnienia potencjalnych zmian w funkcji motorycznej małej lub dużej spowodowanej uszkodzeniem kory ruchowej spowodowanym implantacją.

Testy behawioralne gryzoni w celu oceny deficytów funkcjonalnych spowodowanych implantacją mikroelektrod w korze ruchowej szczura

Opisana tutaj jest procedura stereotaktyczna, która może celować w trudne i trudno dostępne obszary mózgu (ze względu na ograniczenia przestrzenne) przy użyciu kątowego podejścia koronalnego. Protokół ten można dostosować zarówno do modeli mysich, jak i szczurzych i może być stosowany do różnych zastosowań neuronaukowych, w tym implantacji kaniuli i mikroiniekcji konstruktów wirusowych.

Adaptacyjne kątowe podejście stereotaktyczne dla wszechstronnych technik neurobiologicznych

Poznaj metodę mikroiniekcji mózgu u gryzoni w celu badania molekularnych substratów zachowania i zaburzeń psychiatrycznych. Technika ta umożliwia precyzyjne dostarczanie substancji do wybranych regionów mózgu.

Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania

Przeglądaj więcej filmów