Referencyjna metoda mikrorozcieńczenia bulionu do badania wrażliwości in vitro dalbawancyny na bakterie rozwijające się tlenowo

Ogólnym celem poniższej procedury jest określenie minimalnego stężenia hamującego dalbawancyny. Stosując metodę mikrorozcieńczania bulionu, koncentrując się na kluczowych krokach, które są unikalne dla Dalbavancin, aby to zrobić. Rozcieńczenie podstawowe i pośrednie dalbawancyny wykonuje się w DMSO, a końcowe rozcieńczenie wykonuje się w kationie na dostosowanym bulionie Muellera Hintona uzupełnionym polisorbatem.

Rozcieńczenie dozuje się do 96-dołkowej płytki i zaszczepia standaryzowaną zawiesiną bakterii. Płytka jest następnie inkubowana przez 16 do 24 godzin i badana w celu określenia minimalnej ilości dalbawancyny wymaganej do zahamowania wzrostu bakterii. Przestrzeganie tej znormalizowanej metody zapewni spójne wyniki zarówno w przypadku izolatów klinicznych, jak i, jak pokazano tutaj, izolatów kontroli jakości Dalbawancyna jest półsyntetycznym środkiem przeciwdrobnoustrojowym lipo glikopeptydowym, który został zatwierdzony w maju 2014 r. przez FDA do leczenia ostrych bakteryjnych zakażeń skóry i struktury skóry wywołanych przez organizmy Gram-dodatnie.

Niniejsza metoda opisuje znormalizowaną metodę bulionu, mikrorozcieńczenia wrażliwości na dassin, która obejmuje zastosowanie DMSO do przygotowania roztworów podstawowych w polisorbacie 80 w celu złagodzenia przylegania środka do tworzywa sztucznego Pomocne jest wizualne zademonstrowanie tej metody. Ze względu na to, że etapy przygotowania roztworu podstawowego i płytki MIC nie są typowe w porównaniu z większością środków przeciwdrobnoustrojowych. Kroki te są unikalne dla lipo glikopeptydów i są ważne, aby postępować zgodnie z nimi w celu uzyskania powtarzalnych i dokładnych wyników MIC.

Procedurę zademonstruje Gina Fisher, naukowiec z mojego laboratorium. Należy pamiętać, że podczas wykonywania poniższej procedury należy zastosować odpowiednie środki ostrożności zgodne z drugim poziomem bezpieczeństwa biologicznego. Rozpocząć od odważenia odpowiedniej ilości dalbawancyny, aby przygotować roztwór podstawowy 800 mikrogramów na mililitr.

Dodaj odpowiednią ilość NEAT DMSO do sterylnej szklanej lub plastikowej probówki, a następnie przenieś proszek do probówki i zwiruj ją. Następny. Używając roztworu podstawowego DALBAVANCIN o stężeniu 800 mikrogramów na mililitr, przygotować 100 końcowych stężeń MIC na płytce, jak pokazano w kolumnach od pierwszej do czwartej. Są one określane jako stężenia pośrednie.

Całkowita przygotowana objętość będzie zależała od liczby paneli MIC. Na koniec rozcieńczyć pośrednie stężenia w stosunku jeden do 100 w nieskorygowanym kationowo bulionie Mueller Hinten, znanym również jako C-A-M-H-B, uzupełnionym 0,004% P 80. Uzyskane stężenie robocze DALBAVANCINY i P 80 jest dwukrotnie większe od stężenia końcowego.

Ponieważ dodanie inokulum spowoduje rozcieńczenie od jednego do dwóch przy użyciu wielokanałowej pipety ze sterylnymi końcówkami, należy dozować 50 mikrolitrów każdego rozcieńczenia dalbavancyny do odpowiednich studzienek 96-dołkowego sterylnego panelu mikrorozcieńczeń. Format płytki MIC pozwala na przetestowanie ośmiu lornetek na płytkę. Jeśli panele nie zostaną natychmiast użyte, nałóż folię z tworzywa sztucznego, aby je uszczelnić, a następnie umieść je w plastikowych torebkach i przechowuj w zamrażarce bez rozmrażania w temperaturze co najmniej minus 60 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne.

W tej demonstracji zostanie zaszczepiona jedna świeżo przygotowana płytka. Aby przygotować inokulum, wybierz kilka dobrze odizolowanych kolonii z 18-24-godzinnego ślimaka do krwi lub innej nieselektywnej płytki ślimakowej. Tutaj stosuje się kontrolę jakości s aria i zrogowaciałe szczepy EPHI.

Dotknij górnej części każdej kolonii sterylnym wacikiem i przenieś jej część do probówki zawierającej od jednego do pięciu mililitrów C-A-M-H-B lub soli fizjologicznej. Kontynuuj przenoszenie, aż zmętnienie zrówna się z 0,5 wzorca McFarlanda w ciągu 15 do 30 minut przygotowania, rozcieńczyć inokulum jeden do 100 w C-A-M-H-B, aby uzyskać końcowe stężenie pięć razy 10 do piątej CFU na mililitr. Dopuszczalny zakres wynosi od dwóch do ośmiu razy od 10 do piątej CFU na mililitr.

Natychmiast za pomocą pipety wielokanałowej ze sterylnymi końcówkami przenieś 50 mikrolitrów końcowego inokulum do każdej odpowiedniej studzienki na płycie panelowej MIC tutaj. Cztery rzędy są inokulowane każdym z dwóch izolatów, co daje w sumie cztery kontrpróby na izolat. Następnie, aby przeprowadzić kontrolę czystości, użyj pipety, aby przenieść od jednego do 10 mikrolitrów roztworu w pozytywnej kontroli wzrostu do nieselektywnego agaru, takiego jak agar sojowy Try Decay z 5% krwią owczą.

Za pomocą sterylnej pętli rozprowadzić roztwór na powierzchni płytki. Obróć płytkę o 90 stopni i ponownie rozprowadź smugi, aby upewnić się, że inokulum jest równomiernie rozprowadzone. Przykryj talerz i odłóż go na bok.

Przygotowując się do liczenia kolonii, użyj pipety jednokanałowej, aby przenieść 10 mikrolitrów roztworu w studzience kontrolnej wzrostu do 10 mililitrów mieszanki soli fizjologicznej, a następnie przenieś 100 mikrolitrów do odpowiedniego nieselektywnego podłoża rolniczego, takiego jak wypróbuj agar sojowy Toay z 5% krwią owczą za pomocą sterylnej pętli, rozprowadź roztwór na całej powierzchni agri. Powtórz ten proces dwa razy w różnych kierunkach, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum. Następnie ułóż do czterech paneli MIC w plastikowym pojemniku, upewniając się, że górny panel jest szczelnie zamknięty pokrywą.

Następnie umieść wilgotny ręcznik papierowy w plastikowym pojemniku i zamknij go szczelnie pokrywką w ciągu 30 minut od zaszczepienia. Panele MIC należy inkubować, płytkę do liczenia kolonii i płytkę kontrolną czystości w inkubatorze z otaczającym powietrzem w temperaturze 35 stopni Celsjusza plus minus dwa stopnie Celsjusza przez 16 do 20 godzin. Następnego dnia odczytaj minimalne stężenie hamujące jako najniższe stężenie, które całkowicie hamuje rozwój bakterii w studzienkach, wykryte gołym okiem.

Określ liczbę kolonii na tabliczce do liczenia kolonii. Pomnóż liczbę policzoną przez współczynnik rozcieńczenia. Na przykład 50 kolonii razy współczynnik rozcieńczenia 10 000 równa się pięć razy 10 piątej CFU na mililitr.

Dopuszczalny zakres wynosi od 20 do 80 kolonii, co odpowiada dwóm do ośmiu razy 10 do piątej kolonii tworzącej jednostki na ml. Stężenie inokulum jest ważną zmienną do kontrolowania badania wrażliwości w celu uzyskania dokładnych wyników. Na koniec sprawdź tabliczkę czystości.

Jeśli wszystkie kolonie są podobne do kolonii używanych jako inokulum, można je uznać za czyste. Jeśli obecne są jakiekolwiek inne kolonie, istnieje możliwość obecności zanieczyszczenia w panelu MIC i badanie należy powtórzyć. Wyniki DAL bevans, MIC porównano z wynikami uzyskanymi przy użyciu metody rozcieńczania rolniczego, jak pokazano tutaj.

Wyniki Agri MIC dla Dal bevans są zwykle od dwóch do ośmiu razy wyższe niż w przypadku bulionu. Mikrorozcieńczenie, wyniki MIC. To kontrast wankomycyna wyniki, które są metodami bulionowymi i rolniczymi.

Z tego względu nie zaleca się rozcieńczania dalbavancin do badania bulionu dalbavancyny. Mikrorozcieńczenie MIC, wyniki kontroli jakości powinny mieścić się w oczekiwanych zakresach, jak pokazano tutaj. Organizm kontroli jakości SS, A TCC 2 9 2 1 3 z bardzo wyraźnym modalnym MIC wynoszącym 0,06 mikrograma na mililitr, był dobrym wskaźnikiem zmienności metody.

Jeżeli uzyskane wyniki wykraczają poza oczekiwane zakresy dla organizmów objętych kontrolą jakości lub wykazują tendencję do dolnej lub górnej granicy zakresu, uzasadniona jest dalsza walidacja metody. Oprócz walidacji metody przy użyciu organizmów kontrolnych jakości, dalbawancyny, dane MIC z regionalnych programów nadzoru przeciwdrobnoustrojowego mogą stanowić podstawę dla wyników MIC, których można oczekiwać w klinicznych warunkach laboratoryjnych, jak pokazano tutaj, Dal b Anson MIC, wyniki dla izolatów zebranych w Europie i USA w latach 2011-2013 były mniejsze niż 0,25 mikrograma na mililitr dla 99,9% SIU i 100% paciorkowców. Na podstawie tych danych z nadzoru oczywiste jest, że wyniki MIC dalbawancyny dla gronkowców i paciorkowców większych niż 0,12 mikrograma na mililitr są rzadkie.

W przypadku zaobserwowania wyższych liczb badanie należy powtórzyć i/lub przesłać do laboratorium referencyjnego w celu walidacji. Przygotowanie rozcieńczenia wyjściowego w DMSO i dodanie P 80 do rozcieńczenia bulionu w stężeniu 0,002% do końcowego dołka MIC są krytycznymi krokami do uzyskania dokładnych i powtarzalnych wyników MIC dalbawancyny Jak zawsze, ale szczególnie w tym obszarze rozwoju oporności bakterii, dokładne wyniki wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe mają kluczowe znaczenie dla wyboru odpowiedniej terapii przez lekarza.