Name: Referencyjna metoda mikrorozcieńczenia bulionu do badania wrażliwości in vitro dalbawancyny na bakterie rozwijające się tlenowo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Poznaj metodę mikrorozcieńczenia bulionu do oznaczania MIC dalbawancyny wobec bakterii Gram-dodatnich. Protokół obejmuje przygotowanie roztworów w DMSO i użycie pożywki Mueller-Hinton z polisorbaten 80.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wcześniejsze prace dotyczące badania wrażliwości dalbavancyny były cenne w rozwoju ustandaryzowanych metod i uznanie za tę pracę otrzymują JMI Laboratories, Robert Rennie i Beth Goldstein.

Uwaga: Zapoznaj się z dokumentami CLSI M7-A10 i M100-S25 i/lub ISO/FDIS 20776-1, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat referencyjnej metody mikrorozcieńczania bulionu dla wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe2, 3, 4. Metody referencyjne dopuszczają opcje w niektórych procedurach specyficznych dla przygotowania inokulum i produkcji paneli MIC w celu osiągnięcia tego samego wyniku końcowego. Opisana tutaj metoda odnosi się do jednego środka przeciwdrobnoustrojowego, dalbawancyny, a niektóre z etapów stanowią jeden z potencjalnie kilku sposobów, w jaki można przeprowadzić procedurę referencyjną. Należy stosować odpowiednie środki ostrożności (zgodne z poziomem bezpieczeństwa biologicznego 2)10. Format panelu MIC wykorzystany na potrzeby tej publikacji wideo przedstawiono w tabeli 1.
1. Przechowuj Dalbawancynę w proszku
<ol>
	<li>Po otrzymaniu diagnostycznego proszku dalbawancyny przechowywać w temperaturze -20 oC w suchym środowisku w zamrażarce bez rozmrażania. Przed użyciem proszek powinien zrównoważyć się, aby osiągnąć RT przed otwarciem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie rozcieńczeń panelu MIC
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy nie wyższy niż 1 600 μg/ml dalbawancyny w czystym (czystym) DMSO w sterylnych szklanych lub plastikowych probówkach i użyć tego samego dnia przygotowania lub przechowywać w temperaturze od -20 do -60 oC lub niższej do wykorzystania w przyszłości w zamrażarce bez rozmrażania. Podczas ważenia proszku należy wziąć pod uwagę siłę działania dalbawancyny podaną w dokumentacji otrzymanej wraz z proszkiem (patrz równanie 1, np. 800 μg/ml preparatu podstawowego).</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy w sposób podobny do schematu, jak pokazano w kolumnie 1 ("Stężenie źródła") w tabeli 2 za pomocą czystego DMSO w sterylnych probówkach szklanych lub plastikowych. Użyć jednej pipety do odmierzenia rozcieńczalnika, a drugiej pipety do dodania początkowego bulionu dalbavanciny do pierwszej probówki. Do każdego kolejnego stężenia wyjściowego dalbavancyny należy użyć nowej pipety.</li>
	<li>Przygotuj 100-krotne końcowe rozcieńczenia stężenia panelu MIC (stężenia pośrednie) za pomocą schludnego DMSO. Jak pokazano w kolumnach 2-4 tabeli 2, należy połączyć odpowiednie objętości źródła i DMSO, aby uzyskać pożądane stężenie pośrednie (objętości, które należy zastosować, będą zależeć od liczby paneli MIC, które mają zostać wykonane).</li>
	<li>Przygotować 0,004% P80: Przygotować świeży roboczy roztwór podstawowy 2% P80, dodając 0,1 ml P80 do 4,9 mldH2O. Sterylizować, przepuszczając przez filtr 0,22 mikrona i użyć roztworu w tym samym dniu przygotowania. Przygotować 0,004% rozcieńczalnik P80, sporządzając rozcieńczenie 2% P80 w stosunku 1:500 (np. 0,3 ml 2% P80 do 149,7 ml CAMHB).</li>
	<li>Dalsze rozcieńczanie stężeń pośrednich przygotowanych w kroku 2.2 1:100 w bulionie Muellera Hintona (CAMHB) dostosowanym do kationów uzupełnionym 0,004% (v/v) polisorbat-80 (P-80) P-80 i/lub LHB (dla paciorkowców) dodanych w stężeniu dwukrotnie wyższym niż końcowe, ponieważ dodanie inokulum (krok 4.3) spowoduje rozcieńczenie 1:2. Patrz: kolumny 6 i 7 w tabeli 2.</li>
</ol>
3. Przygotuj panele MIC
<ol>
	<li>Dozować 50 μl każdego roztworu dalbawancyny przygotowanego w kroku 2.3 do odpowiednich dołków panelu MIC i umieścić pożywkę tylko w jednym dołku (studzienka kontrolna wzrostu). Do tego etapu można użyć pipety wielokanałowej ze sterylnymi końcówkami.</li>
	<li>Panele należy natychmiast zużyć lub zamknąć folią z tworzywa sztucznego, umieścić w plastikowych torebkach i natychmiast umieścić w zamrażarce bez rozmrażania w temperaturze ≤-20 oC (najlepiej w temperaturze ≤-60 oC) do czasu, aż będzie potrzebna. Jeśli używane są zamrożone panele, usuń uszczelki i umieść poszczególne panele na stole laboratoryjnym na 15-30 minut (do momentu rozmrożenia zawartości) przed przystąpieniem do inokulacji panelu.</li>
</ol>
4. Zaszczepij panele mikrofonowe, wykonaj czystość i skonfiguruj liczenie kolonii
<ol>
	<li>Wybierz kilka dobrze wyizolowanych kolonii z 18-24-godzinnego agatora z krwią lub innej nieselektywnej płytki agarowej. Dotknij górnej części każdej kolonii sterylną pętlą lub wacikiem i przenieś do 1-5 ml CAMHB lub soli fizjologicznej, aż zmętnienie będzie równoważne 0,5 wzorca McFarlanda. Oceń zmętnienie przez wizualne porównanie z 0,5 McFarlanda lub za pomocą urządzenia fotometrycznego.</li>
	<li>W ciągu 15-30 minut od przygotowania rozcieńczyć inokulum w stosunku 1:100 w CAMHB (100 μl w 10 ml CAMHB). W przypadku większości bakterii badanych przeciwko dalbawancynie, z wyjątkiem S. pneumoniae, rozcieńczenie to zapewni końcowe stężenie studzienki 5 x 105 CFU/ml (dopuszczalny zakres to 2-8 x 105 CFU/ml). W przypadku S. pneumoniae stężenie bakterii oparte na porównaniu zmętnienia do 0,5 McFarlanda jest zwykle znacznie mniejsze, dlatego inokulum należy rozcieńczyć w stosunku 1:25 (400 μl w 10 ml CAMHB+10% +LHB).</li>
	<li>W ciągu 15 minut po przygotowaniu inokulum przenieść 50 μl końcowego inokulum do każdego dołka (z wyjątkiem studzienki kontrolnej sterylności) panelu MIC przygotowanego w kroku 3. Na tym etapie można użyć pipety wielokanałowej ze sterylnymi końcówkami.</li>
	<li>Przeprowadzić kontrolę czystości, przenosząc i rozprowadzając 1-10 μl podwielokrotności z dołka do dodatniej kontroli wzrostu za pomocą sterylnej pętli do nieselektywnego agaru (np. agar sojowy z tryptykazą z 5% krwią owczą).</li>
	<li>Ustawić liczbę kolonii, usuwając 10 μl z dołka kontrolnego wzrostu za pomocą pipety jednokanałowej i sterylnej końcówki, a następnie przenieść do 10 ml soli fizjologicznej (rozcieńczenie 1:1 000). Wymieszać i przenieść 100 μl za pomocą pipety jednokanałowej i sterylnej końcówki do odpowiedniego, nieselektywnego podłoża agarowego (np. agaru sojowego z tryptykazą z 5% krwią owczą) i rozprowadzić na całej powierzchni agaru za pomocą sterylnej pętli, powtarzając dwa razy w różnych kierunkach, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum (rozcieńczenie 1:10).</li>
</ol>
5. Inkubacja paneli mikrofonowych, tabliczek zliczania kolonii i czystości
<ol>
	<li>Przed inkubacją zamknąć każdy panel MIC lub stos nie więcej niż 4 paneli w plastikowej torbie, taśmą z tworzywa sztucznego lub ciasno przylegającą plastikową osłoną. Alternatywnie, umieść pusty panel MIC na wierzchu stosu nie więcej niż 4 paneli MIC, umieść wilgotny ręcznik papierowy w plastikowym pojemniku, umieść panele MIC w plastikowym pojemniku i bezpiecznie zamknij pojemnik pokrywką.</li>
	<li>Panele MIC należy inkubować w inkubatorze z otaczającym powietrzem w temperaturze 35 °C ± 2 °C przez 16–20 godzin (gronkowce i enterokoki) i 20–24 godziny (paciorkowce) w ciągu 30 minut od inokulacji. Inkubować płytki do liczenia kolonii i czystości w tych samych warunkach, z wyjątkiem inkubacji paciorkowców w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
</ol>
6. Przeczytaj tabliczki MIC i Colony Count; Sprawdź tabliczkę czystości
<ol>
	<li>Odczyt MIC jako najniższe stężenie, które całkowicie hamuje rozwój bakterii w studzienkach, wykryte gołym okiem.</li>
	<li>Policz kolonie na tabliczce do liczenia kolonii. Pomnóż każdą kolonię przez współczynnik rozcieńczenia (1:10 000) (np. 50 kolonii odpowiada 5 x 105 jtk/ml). Dopuszczalny zakres to 20-80 kolonii (2-8 x 105 CFU/ml) i jest stosowany jako przybliżona wytyczna.</li>
	<li>Sprawdź tabliczkę czystości. Jeśli wszystkie kolonie są podobne do kolonii użytych w kroku 4.1, wówczas inokulum można uznać za czyste. Jeśli obecne są jakiekolwiek inne kolonie, istnieje możliwość obecności zanieczyszczenia w panelu MIC i badanie należy powtórzyć.</li>
</ol>
7. Sprawdź wyniki kontroli jakości.
<ol>
	<li>Patrz Tabela 3, aby zapoznać się z oczekiwanymi zakresami szczepów kontroli jakości CLSI. Należy podać wyniki badań izolatów tylko wtedy, gdy wyniki MIC dalbawancyny dla organizmu(-ów) kontrolnego(-ych) jakości(-ych) mieszczą się w oczekiwanym zakresie.</li>
	<li>W przypadku uzyskania wartości MIC wynoszącej ≥0,25 μg/ml dla któregokolwiek klinicznego izolatu S. aureus, należy powtórzyć badanie MIC dalbawancyny i (lub) przesłać do laboratorium referencyjnego w celu weryfikacji.</li>
</ol>

<ol><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Once-weekly+dalbavancin+versus+daily+conventional+therapy+for+skin+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection.</a> The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22M07-A10.+Methods+for+Dilution+Antimicrobial+Tests+for+Bacteria+that+Grow+Aerobically.%3A+Approved+Standard%22">M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard</a>. , Tenth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22M100-S25.+Performance+Standards+for+Antimicrobial+Susceptibility+Testing%3B+Twenty-Fifth+Informational+Supplement%22">M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement</a>. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+laboratory+testing+and+in+vitro+diagnostic+test+systems+--+Susceptibility+testing+of+infectious+agents+and+evaluation+of+performance+of+antimicrobial+susceptibility+test+devices+--+Part+1%3A+Reference+method+for+testing+the+in+vitro+activity+of+antimicrobial+agents+against+rapidly+growing+aerobic+bacteria+involved+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22ISO%2FFDIS%22%5BJournal%5D)">Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases.</a> ISO/FDIS. 20776-1, International Organization for Standardization. (2006).</li>
<li>Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surrogate+analysis+of+vancomycin+to+predict+susceptible+categorization+of+dalbavancin%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).</li>
<li>Turnidge, J., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting+and+revising+antibacterial+susceptibility+breakpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints.</a> Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).</li>
<li>Rennie, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+broth+microdilution+antimicrobial+susceptibility+test+results+for+dalbavancin%2C+a+new+glycopeptide+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent.</a> Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).</li>
<li>Arhin, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polysorbate+80+on+oritavancin+binding+to+plastic+surfaces%3A+implications+for+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+agents+and+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).</li>
<li>Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+reference+broth+microdilution+method+for+testing+telavancin%3A+effect+on+MIC+results+and+correlation+with+other+testing+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+agents+and+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).</li>
<li>Ribbon Panel, B. lue <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Safe+Work+Practices+in+Human+and+Animal+Medical+Diagnostic+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Supplements%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories.</a> MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).</li>
<li>Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+quality+control+evaluations+for+susceptibility+testing+of+Dalbavancin+%28BI397%29%2C+an+investigational+glycopeptide+with+potent+gram-positive+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity.</a> Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).</li>
<li>Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Broth+Microdilution+and+Agar+Dilution+Dalbavancin+and+Vancomycin+MIC+Results+for+42+Aerobic+Gram-positive+Bacteria.+Poster+132%5BTitle%5D)+AND+%22ASM%22%5BJournal%5D)">Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132.</a> ASM. , San Francisco, CA. (2012).</li>
<li>Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+dalbavancin+MIC+values+determined+by+Etest+%28AB+BIODISK%29+and+reference+dilution+methods+using+gram-positive+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).</li>
<li>Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+dalbavancin+against+staphylococci+and+streptococci%2C+assessed+by+BSAC+and+NCCLS+agar+dilution+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antimicrobial+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).</li>
<li>Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+of+dalbavancin+potency+and+spectrum+in+the+United+States+%282012%29%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+microbiology+and+infectious+disease%22%5BJournal%5D)">Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012).</a> Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).</li>
</ol>

Sandra McCurdy jest pracownikiem Durata Therapeutics; Firma Laboratory Specialists, Inc., pracodawca Laury Koeth i Jeanny Fisher, została zakontraktowana przez Durata Therapeutics do przygotowania manuskryptu. Opłaty za publikację tego artykułu zostały opłacone przez Laboratory Specialists, Inc.

Przedstawiono następujące szczegóły metody w celu uwzględnienia w dodatkowych kwestiach podczas przygotowywania się do badania MIC dalbawancyny. Konstrukcja panelu MIC będzie zależała od liczby środków przeciwdrobnoustrojowych, które mają być testowane (tj. samej dalbawancyny lub wielu leków) oraz gatunku bakterii, które mają być testowane. Stężenia dalbawancyny powinny obejmować interpretacyjne wartości graniczne dla wszystkich badanych gatunków bakterii oraz cały zakres rozcieńczeń oczekiwanych dla co najmniej jednego szczepu QC. Serie rozcieńczeń przeciwdrobnoustrojowych mogą być zorganizowane w rzędy lub kolumny, w zależności od liczby środków przeciwdrobnoustrojowych i/lub izolatów/płytki oraz metody inokulacji. Objętość dalbavancyny w proszku i bulionu powinna być obliczona w taki sposób, aby zapewnić produkcję optymalnych ilości i minimalną ilość odpadów. Dla przykładu użytego w niniejszej publikacji tomy opierają się na przygotowaniu dwóch paneli MIC. Bulion Mueller Hinton regulowany kationami powinien być przygotowany i autoklawowany zgodnie z instrukcjami producenta i sprawdzoną sterylnością pożywki. Panele MIC mogą być wykonane i używane tego samego dnia przygotowania lub mogą być testowane przez odpowiednie organizmy kontroli jakości, a zwalidowane panele przechowywane w stanie zamrożonym do wykorzystania w przyszłości. Ważne jest, aby podczas całego zabiegu stosować sterylne techniki.
Nie ma ścisłych kryteriów weryfikacji stężenia inokulum z liczbą kolonii. Liczebność kolonii może być sprawdzana początkowo dla każdego badanego gatunku i/lub okresowo w celu potwierdzenia etapu rozcieńczania przeprowadzonego w kroku 4.2. Ważne jest, aby ważność wzorca 0,5 McFarlanda była również rutynowo sprawdzana za pomocą E. coli ATCC 25922 przy użyciu procedury podobnej do kroku 4.5. Jeśli wyniki nie są równoważne 1-2 x 108 jtk/ml, należy uzyskać nowy wzorzec 0,5 McFarlanda. Jeśli liczba kolonii w studzienkach MIC wykracza poza dopuszczalny zakres (2-8 x 105 jtk/ml i wyniki MIC dla klinicznego izolatu (izolatów) klinicznego różnią się od oczekiwanego rozkładu normalnego (np. 0,03-0,12 ug/ml dla S. aureus) i/lub wyniki MIC dla izolatu(-ów) kontroli jakości wykraczają poza oczekiwane zakresy, konieczne jest przeprowadzenie testów walidacyjnych i może być uzasadniona modyfikacja metody. Sugeruje się, że do powtórzenia liczenia kolonii stosuje się zwalidowany wzorzec McFarlanda 0,5, a jeśli wyniki ponownie odbiegają od oczekiwanych wyników, rozcieńczenie inokulum przeprowadzone w kroku 4.2 powinno być odpowiednio dostosowane i MIC powtórzone. Należy zauważyć, że kontrola czystości jest konieczna nawet wtedy, gdy przeprowadza się zliczanie kolonii, ponieważ procedura zliczania kolonii wykorzystuje rozcieńczoną objętość, która niekoniecznie musi wykrywać niższe stężenia organizmów skażających.
Aby badanie MIC zostało uznane za ważne, musi wystąpić akceptowalny wzrost w studzience kontrolnej wzrostu. W przypadku większości bakterii, które będą testowane przeciwko dalbawancynie (tj. gronkowce, paciorkowce i enterokoki, wzrost będzie widoczny jako guzik (zwykle >2 mm), a rzadziej wzrost może objawiać się zmętnieniem w studzience. W przeciwieństwie do niektórych środków przeciwdrobnoustrojowych, które mogą wykazywać efekt końcowy wraz ze wzrostem stężenia, punkty końcowe dalbawancyny są zazwyczaj dobrze zdefiniowane. Istnieją różne urządzenia kontrolne mające na celu ułatwienie odczytu testów mikrorozcieńczenia, które mogą być używane do odczytywania płytek zawierających dalbawancynę, o ile nie ma kompromisu w zdolności dostrzegania wzrostu w studzienkach.
Krytyczne etapy w protokole są związane z częściami procedury, które są związane z rozpuszczalnością dalbawancyny i dodatkiem P80. Ważne jest, aby maksymalne stężenie zastosowanej dalbawancyny nie przekraczało 1 600 μg/ml, aby DMSO było używane jako rozpuszczalnik i aby stężenia pośrednie były przygotowywane w DMSO przed rozcieńczeniem bulionu, tak aby końcowe stężenie DMSO w studzienkach panelowych MIC nie było większe niż 1%. DMSO jest higroskopijny i dlatego stosowanie starszych butelek DMSO było brane pod uwagę w odniesieniu do rozpuszczalności dalbawancyny. Jednakże, podczas gdy małe badanie BMD ze szczepami kontroli jakości wykazało, że nie jest to ważna zmienna (patrz sekcja wyników), dobrą praktyką jest używanie nowych lub niedawno otwartych butelek DMSO. Ważne jest również, aby P80 był dodawany do bulionu w końcowym etapie przygotowania rozcieńczalnika leku i miał końcowe stężenie 0,002% w studzience MIC.
Zawarta tutaj procedura BMD polega na przygotowaniu paneli MIC przy użyciu 50 μl/studzienkę przy stężeniach dalbavancyny i P-80 dwukrotności stężenia końcowego oraz dodaniu inokulum do 50 μl/studzienkę, tak aby końcowa objętość/studzienka wynosiła 100 μl. Metoda ta pozwala na wyprodukowanie jednego formatu panelu MIC do badania zarówno S. aureus, jak i S. pneumoniae , ponieważ lizowana krew końska może być dodana do inokulum. Alternatywne metody przygotowania paneli MIC przy użyciu 100 μl/studzienkę z dodatkiem do 10 μl/studzienkę opisano w procedurach CLSI i ISO.
Wartość graniczna dalbawancyny dla S. aureus wynosi ≤0,12 μg/ml (ulotka dołączona do opakowania FDA). Jak wykazano w niedawnym nadzorze, większość izolatów jest hamowana przez dalbawancynę na poziomie 0,06 μg/ml15. W przypadku podatnego punktu granicznego zbliżonego do modalnego MIC, wszelkie zmiany MIC wynikające z różnic w metodzie mogą wpływać na wskaźniki podatności. Ze względu na to, że procedura BMD dla dalbawancyny obejmuje kilka unikalnych etapów (w szczególności stosowanie DMSO do przygotowania podstawowych i pośrednich rozcieńczeń leków oraz 0,002% P80 w dołku MIC), konieczne jest dokładne przestrzeganie tej metody. Organizm QC S. aureus (ATCC 29213) z bardzo wyraźnym modalnym MIC dalbavancyny wynoszącym 0,06 μg/ml jest dobrym wskaźnikiem zmienności metody i powinien być rutynowo stosowany do walidacji metody BMD. Jeśli wyniki MIC mieszczą się w oczekiwanym zakresie 0,03-0,12 μg/ml, ale wykazują tendencję do niskiej lub górnej strony tego zakresu, uzasadniona jest dalsza walidacja metody.
Dodanie 0,002% P80 jest zalecane dla wszystkich istotnych organizmów Gram-dodatnich (gronkowców, enterokoków i paciorkowców). Warto jednak zauważyć, że wykazano, że lizowana krew końska działa podobnie do P-80 w odniesieniu do jej zdolności do wiązania i że dodanie P-80 do CAMHB+LHB nie ma dodatkowego wpływu na wyniki MIC paciorkowców dalbawancyny.
Obecnie nie ma metody dyfuzji krążkowej do badania dalbawancyny, a ze względu na słabą korelację wyników BMD i AD, nie zaleca się badania wrażliwości dalbawancyny metodą AD12, 14. Metoda BMD powinna być stosowana do przyszłej oceny wrażliwości na dalbawancynę oraz jako złoty standard przy opracowywaniu komercyjnych testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Dalbavancyna to półsyntetyczny lipoglikopeptyd, który został zatwierdzony przez FDA w maju 2014 roku do leczenia ostrych bakteryjnych infekcji skóry i struktury skóry wywołanych przez organizmy Gram-dodatnie1. Głównym celem szczegółowego przedstawienia tej metody w formie wideo jest dostarczenie jasnych wskazówek dla laboratoriów klinicznych i naukowców zajmujących się badaniami w zakresie testowania i raportowania dokładnych i powtarzalnych wyników wrażliwości na dalbawancynę.
Oznaczanie środka przeciwdrobnoustrojowego MIC metodami komercyjnymi jest rutynowo wykonywane w laboratoriach klinicznych w celu oceny aktywności środka in vitro przeciwko bakteriom chorobotwórczym. Opisana tutaj metoda to metoda mikrorozcieńczenia bulionu zalecana przez CLSI i ISO 2,3,4. Ze względu na to, że komercyjne metody wrażliwości dalbawancyny nie są obecnie dostępne (w momencie publikacji), a metody dyfuzji krążkowej i rozcieńczania agaru nie są obecnie zalecane dla dalbawancyny, obecnie dostępnymi opcjami są referencyjne metody rozcieńczania bulionu 12,14. Ponieważ ta metoda referencyjna nie jest komercyjną i zatwierdzoną przez FDA metodą diagnostyki in vitro, laboratoria kliniczne w USA, które stosują tę procedurę do testowania pacjentów, muszą przestrzegać wymogów regulacyjnych dotyczących testu opracowanego laboratoryjnie (LDT). Przewiduje się, że wraz ze wzrostem stosowania dalbawancyny, więcej laboratoriów będzie musiało przetestować ten związek. Zwalidowano badanie wankomycyny jako substytut do określania wrażliwości S. aureus na dalbawancynę5. Jednak dalbawancyna może być aktywna przeciwko pośredniemu S. aureus wankomycyny (VISA) i dlatego klinicyści mogą poprosić o wyniki MIC dalbawancyny. Ponadto mogą być wymagane wyniki MIC dla innych gatunków bakterii.
Granica podatności FDA dla dalbawancyny przeciwko S. aureus została ustalona na poziomie ≤0,12 μg/ml. FDA przypisała tylko kategorię podatności z powodu braku danych na temat opornych izolatów. Normalny rozkład MIC wśród izolatów S. aureus typu dzikiego wynosi od 0,03 do 0,12 μg/ml, przy czym wyraźny modalny MIC wynosi 0,06 μg/ml. Niewielkie różnice w wynikach MIC wynikające z różnicy w metodzie, w połączeniu z nieodłączną zmiennością BMD ± jednym rozcieńczeniu, mogą mieć potencjalnie znaczący wpływ na wskaźniki wrażliwości. 6 Podobnie jak w przypadku innych lipoglikopeptydów, badanie wrażliwości dalbawancyny może być trudne ze względu na rozpuszczalność i stosunkowo duży rozmiar cząsteczki oraz jej właściwości wiążące7,8,9. Opisana tutaj referencyjna metoda BMD obejmuje dwa specyficzne etapy, które są unikalne dla środków nierozpuszczalnych i/lub środków lipoglikopeptydowych: (1) zastosowanie DMSO do przygotowania roztworów podstawowych i (2) dodanie 0,002% P-80 do końcowych rozcieńczeń panelu MIC. Celem niniejszej publikacji wideo jest wyjaśnienie metody BMD dalbavanciny i skupienie się w szczególności na tych kluczowych etapach, aby zapewnić dokładne i powtarzalne wyniki MIC.

<table><tbody><tr><td>Dalbavancin</td><td>Metrics, Inc.</td><td>Greenville, NC</td><td>BI-397</td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>St. Louis, MO</td><td>C5793</td></tr><tr><td>Regulowany kationem bulion Mueller Hinton</td><td>Becton Dickinson</td><td>Sparks, MD</td><td>212322</td></tr><tr><td>Lizowana krew końska</td><td>Cleveland Scientific</td><td>Bath, OH</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna Dose-it</td><td>Integra Biosciences</td><td>Hudson, NH</td><td></td></tr><tr><td>Piper wielokanałowy (Viaflo II)</td><td>Integra</td><td>Hudson, NH</td><td>4164</td></tr><tr><td>Pipeta 12-kanałowa (Matrix)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Pipety jednokanałowe (Ovation 10 &micro; l - 100 i mikro; l)</td> <td>VistaLab</td><td>Brewster, NY</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka</td><td>Greiner Bio-one</td><td>Monroe, NC</td><td>650161</td></tr><tr><td>50 ml płaskie stożkowe dolne probówki wirówkowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>16x125 mm jednorazowe szklane rurki</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>12x17 mm zatrzask, rurki polistyrenowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>16 ml probówki wirówkowe</td><td>BioExpress</td><td>Kaysville, UT</td><td>C-3394-2</td></tr><tr><td>Zbiorniki na odczynniki</td><td>Integra Biosciences</td><td>Hudson, NH</td><td>4312</td></tr><tr><td>Jednorazowe sterylne pętle (1 i mikro; l & 10 &mikro; l)</td><td>Biologix</td><td>Lenexa, KA</td><td>65-0001,65-0010</td></tr><tr><td>Tryptyczny agar sojowy + 5% krwi owczej</td><td>Becton Dickinson</td><td>Sparks, MD</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator (otoczenie)</td>Inkubator <td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5% CO2)</td>Waga analityczna <td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Rękawice ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td>52817</td></tr><tr><td>Fartuchy laboratoryjne</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

referencyjna metoda mikrorozcieńczenia bulionu do badania wrażliwości in vitro dalbawancyny na bakterie rozwijające się tlenowo

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) jest przeprowadzany w celu oceny aktywności in vitro środków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko różnym bakteriom. Wyniki AspAT, które są wyrażone jako minimalne stężenia hamujące (MIC), są wykorzystywane w badaniach nad opracowywaniem środków przeciwdrobnoustrojowych i monitorowaniem rozwoju oporności oraz w warunkach klinicznych w wytycznych dotyczących leczenia przeciwdrobnoustrojowego. Dalbawancyna jest półsyntetycznym środkiem przeciwdrobnoustrojowym lipoglikopeptydowym, który został zatwierdzony w maju 2014 r. przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do leczenia ostrych bakteryjnych zakażeń skóry i struktury skóry wywołanych przez organizmy Gram-dodatnie. Przewagą dalbawancyny nad obecnymi terapiami przeciwgronkowcowymi jest jej długi okres półtrwania, co pozwala na dawkowanie raz w tygodniu. Dalbawancyna wykazuje działanie przeciwko Staphylococcus aureus (w tym zarówno S. aureus wrażliwy na metycylinę [MSSA], jak i oporny na metycylinę S. aureus [MRSA]), gronkowce koagulazo-ujemne, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus, paciorkowce β-hemolityczne i enterokoki wrażliwe na wankomycynę. Podobnie jak w przypadku innych najnowszych środków lipoglikopeptydowych, optymalizacja metod badania wrażliwości bulionu CLSI i ISO obejmuje zastosowanie dimetylosulfotlenku (DMSO) jako rozpuszczalnika podczas przygotowywania roztworów podstawowych i polisorbatu 80 (P80) w celu złagodzenia przylegania środka do tworzywa sztucznego. Przed rozpoczęciem badań klinicznych i w początkowym okresie opracowywania dalbawancyny nie prowadzono badań wrażliwości z użyciem P-80, a wyniki MIC były 2-4 krotnie wyższe, podobnie jak wyższe wyniki MIC uzyskiwano po zastosowaniu metody wrażliwości na rozcieńczenie agaru. Dalbawancyna została po raz pierwszy uwzględniona w tabelach metodologii mikrorozcieńczeń bulionu CLSI w 2005 r. i zmieniona w 2006 r. w celu wyjaśnienia stosowania DMSO i P-80. Przedstawiona tutaj procedura mikrorozcieńczania bulionu (BMD) jest specyficzna dla dalbawancyny i jest zgodna z metodami CLSI i ISO, z szczegółowymi szczegółami krok po kroku i skupieniem się na krytycznych etapach dodanych w celu uzyskania jasności.

Tutaj przedstawiamy protokół określania wrażliwości na dalbawancynę klinicznie istotnych bakterii Gram-dodatnich przy użyciu referencyjnej metodologii mikrorozcieńczenia bulionu.

Referencyjna metoda mikrorozcieńczenia bulionu do badania wrażliwości in vitro dalbawancyny na bakterie rozwijające się tlenowo

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

Ogólnym celem następującej procedury jest wyznaczenie minimalnego stężenia hamującego dla dalbawancyny. W tym celu zastosowano metodę mikrorozcieńczeń w bulionie, koncentrując się na kluczowych etapach specyficznych dla dalbawancyny. Roztwór zapasowy i rozcieńczenia pośrednie dalbawancyny przygotowano w DMSO, a rozcieczenia końcowe wykonano w bulionie Muellera-Hintona o dostosowanej zawartości kationów, uzupełnionym o polisorbat.Rozcieńczenia nanosi się na płytkę 96-dołkową i inokuluje standaryzowaną zawiesiną bakterii. Płytkę inkubuje się następnie przez 16 do 24 godzin i analizuje w celu określenia minimalnej ilości dalbawancyny wymaganej do zahamowania wzrostu bakterii. Przestrzeganie tej standaryzowanej metody zapewni spójne wyniki zarówno w przypadku izolatów klinicznych, jak i pokazanych tutaj izolatów kontrolnych. Dalbawancyna jest półsyntetycznym lipoglikopeptydowym środkiem przeciwdrobnowym, który został zatwierdzony w maju 2014 roku przez FDA do leczenia ostrych bakteryjnych zakażeń skóry i tkanek skóry wywołanych przez organizmy gram-dodatnie.Niniejsza metoda opisuje ustandaryzowaną metodę mikrorozcieńczeń w pożywce płynnej do oceny wrażliwości na daptomycynę, która obejmuje zastosowanie DMSO do przygotowania roztworów macierzystych w polisorbachacie 80 w celu ograniczenia przylegania środka do tworzywa sztucznego. Demonstracja wizualna tej metody jest pomocna, ponieważ etapy przygotowania roztworu macierzystego i roztworu na płytkę MIC nie są typowe w porównaniu z większością środków przeciwdrobnoustrojowych. Kroki te są charakterystyczne dla lipoglikopeptydów i ich przestrzeganie jest istotne dla uzyskania powtarzalnych i dokładnych wyników MIC.Procedurę zaprezentuje Gina Fisher, naukowiec z mojego laboratorium. Należy pamiętać, że podczas wykonywania poniższej procedury należy przestrzegać odpowiednich środków ostrożności zgodnych z poziomem bezpieczeństwa biologicznego drugiego stopnia. Należy rozpocząć od odważenia odpowiedniej ilości dalbawancyny w celu przygotowania roztworu zapasu o stężeniu 800 µg/mL.Do sterylnej probówki szklanej lub plastikowej dodaj odpowiednią ilość czystego DMSO, następnie przenieś proszek do probówki i wymieszaj go w wortexie. Następnie, korzystając z roztworu zapasu DALBAVANCIN o stężeniu 800 µg/mL, przygotuj stężenia 100 x końcowych stężeń na płytce MIC, zgodnie z kolumnami od pierwszej do czwartej. Są one określane jako stężenia pośrednie.Całkowita objętość preparatu będzie zależeć od liczby paneli MIC. Na koniec rozcień stężenia pośrednie 1:100 w pożywce Mueller-Hinton bez dostosowania kationowego, znanej również jako C-A-M-H-B, uzupełnionej o 0,004% P 80. Otrzymane stężenie robocze DALBAVANCIN i P 80 jest dwukrotnością stężenia końcowego.Ponieważ dodanie inokulum spowoduje rozcieńczenie jednego do dwóch, należy za pomocą pipety wielokanałowej ze sterylnymi końcówkami przenieść 50 µL każdego rozcieńczenia dalbawancyny do odpowiednich dołków sterylnego panelu do mikrorozcieńczeń o 96 dołkach. Format płytki MIC umożliwia przetestowanie ośmiu inokulum na jednej płytce. Jeśli panele nie zostaną użyte natychmiast, należy je zapieczętować folią plastikową, a następnie umieścić w plastikowych workach i przechowywać w zamrażarce bez systemu No Frost w temperaturze co najmniej -60 °C do momentu ich użycia.W tej demonstracji zaszczepiona zostanie jedna świeżo przygotowana płytka. Aby przygotować inokulum, należy wybrać kilka dobrze odizolowanych kolonii z 18- do 24-godzinnej płytki agarowej z krwią lub innej nie wybiórczej płytki agarowej. W tym przypadku zastosowano szczepy kontrolne jakości s aria oraz EPHI callous.Dotknij wierzchołka każdej kolonii sterylnym wymazem i przenieś jej część do probówki zawierającej od jednego do pięciu mililitrów C-A-M-H-B lub soli fizjologicznej. Kontynuuj przenoszenie, aż mętność będzie odpowiadać standardowi 0,5 McFarland w ciągu 15 do 30 minut od przygotowania; rozcieńcz inokulum w stosunku 1:100 w C-A-M-H-B, aby uzyskać końcowe stężenie 5 × 10⁵ CFU na mililitr. Akceptowalny zakres wynosi od 2 do 8 × 10⁵ CFU na mililitr.Natychmiast, używając pipety wielokanałowej ze sterylnymi końcówkami, przenieś 50 µL końcowego inokulum do każdego odpowiedniego dołka płytki panelu MIC. Cztery rzędy są szczepione każdym z dwóch izolatów, co daje łącznie cztery powtórzenia na izolat. Następnie, aby przeprowadzić kontrolę czystości, użyj pipety, aby przenieść od 1 do 10 µL roztworu z dodatniej kontroli wzrostu na agar nieselektywny, taki jak agar sojowy Tryptic Soy Agar z 5% krwią owczą.Użyj sterylnej pętli, aby rozprowadzić roztwór po powierzchni płytki. Obróć płytkę o 90 stopni i wykonaj kolejne posiewy, aby upewnić się, że inokulum zostało równomiernie rozłożone. Przykryj płytkę i odstaw ją na bok.W ramach przygotowania do liczenia kolonii, użyć pipety jednokanałowej, aby przenieść 10 µL roztworu z dołka kontrolnego wzrostu do 10 mL mieszaniny soli fizjologicznej, a następnie przenieść 100 µL na odpowiednie nie wybiórcze podłoże agarowe, takie jak agar sojowy-kazeinowy z 5% krwią owczą; za pomocą sterylnej pętlki rozprowadzić roztwór po całej powierzchni agaru. Powtórzyć ten proces dwukrotnie w różnych kierunkach, aby zapewnić równomierne rozprzestrzenienie inokulum. Następnie ułożyć do czterech paneli MIC w plastikowym pojemniku, upewniając się, że górny panel jest szczelnie zamknięty pokrywką.Następnie umieść wilgotny ręcznik papierowy w plastikowym pojemniku i szczelnie zamknij go pokrywką w ciągu 30 minut od inokulacji. Inkubuj panele MIC, płytkę do zliczania kolonii oraz płytkę do kontroli czystości w inkubatorze z powietrzem otoczenia w temperaturze 35 ± 2 °C przez 16 do 20 godzin. Następnego dnia odczytaj minimalne stężenie hamujące jako najniższe stężenie, które całkowicie hamuje wzrost bakterii w dołkach, stwierdzone gołym okiem.Określ liczbę kolonii na płytce do liczenia kolonii. Pomnóż policzoną liczbę przez czynnik rozcieńczenia. Na przykład 50 kolonii pomnożone przez czynnik rozcieńczenia 10 000 daje pięć razy 10 do potęgi piątej CFU na mililitr.Akceptowalny zakres wynosi od 20 do 80 kolonii, co odpowiada wartości od dwóch do ośmiu razy 10⁵ jednostek tworzących kolonie na ml. Stężenie inokulum jest ważną zmienną pozwalającą kontrolować badanie podatności w celu uzyskania dokładnych wyników. Na koniec należy sprawdzić płytkę kontrolną czystości.Jeśli wszystkie kolonie są podobne do kolonii użytych jako inokulum, można uznać kulturę za czystą. Jeśli obecne są jakiekolwiek inne kolonie, istnieje prawdopodobieństwo wystąpienia zanieczyszczenia w panelu MIC i test należy powtórzyć. Wyniki MIC DAL bevans porównano z wynikami uzyskanymi za pomocą metody rozcieńczeń agarowych, jak pokazano tutaj.Wyniki MIC metodą agarową dla Dal bevans są zazwyczaj od dwóch do ośmiokrotnie wyższe niż wyniki uzyskane metodą mikrorozcieńczeń w bulionie. Kontrastuje to z wynikami dla wankomycyny, które są zbieżne dla obu metod.W związku z tym metoda makrorozcień nie jest zalecana do testowania dalbawancyny w pożywce płynnej. Wyniki MIC w metodzie mikrorozcień dla kontroli jakości powinny mieścić się w oczekiwanych zakresach, zgodnie z przedstawionymi danymi. Organizm kontrolny SS, ATCC 29213, z bardzo wyraźnym modalnym MIC wynoszącym 0,06 µg/mL, stanowił dobry wskaźnik zmienności metody.Jeśli uzyskane wyniki znajdują się poza oczekiwanymi zakresami dla organizmów kontrolnych lub wykazują tendencję do wartości niskich bądź wysokich w obrębie tego zakresu, wskazana jest dalsza walidacja metody. Oprócz walidacji metody z wykorzystaniem organizmów kontrolnych dla dalbawancyny, dane MIC z regionalnych programów nadzoru nad antymikrobiotykami mogą stanowić podstawę do określenia spodziewanych wyników MIC w warunkach laboratoryjnych; jak pokazano tutaj, w przypadku Dal b Anson MIC, wyniki dla izolatów zebranych w Europie i USA w latach 2011–2013 były mniejsze niż 0,25 micrograms per milliliter dla 99,9% SIU i 100% paciorkowców. Na podstawie tych danych nadzorczych ewidentne jest, że wyniki MIC dalbawancyny dla gronkowców i paciorkowców przekraczające 0,12 micrograms per milliliter są rzadkie.W przypadku uzyskania wyższych wartości test należy powtórzyć i/lub przesłać próbkę do laboratorium referencyjnego w celu walidacji. Przygotowanie rozcieńczenia roztworu zapasu w DMSO oraz dodanie P 80 do rozcieńczenia w pożywce w stężeniu 0,002% w końcowej studzience MIC są krytycznymi etapami uzyskania dokładnych i powtarzalnych wyników MIC dla dalbawancyny. Jak zawsze, ale szczególnie w obszarze rozwoju oporności bakterii, dokładne wyniki podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe są kluczowe dla wyboru odpowiedniej terapii przez lekarza klinicystę.

a-reference-broth-microdilution-method-for-dalbavancin-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badanie wrażliwości Mycobacterium tuberculosis na środki przeciwdrobnoustrojowe jest trudne, lecz kluczowe dla opieki nad pacjentem. Ten format z użyciem płytek mikrotytrujących umożliwia przetestowanie 12 leków przeciwprątkowych i pozwala wyznaczyć wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC), co pomoże w doborze odpowiedniego leczenia.

Badanie wrażliwości kompleksu Mycobacterium tuberculosis na leki pierwszego i drugiego rzutu metodą rozcieńczeń w bulionie z wykorzystaniem płytek mikrotitracyjnych

Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Źródło: Koeth, L. M., et al., A Reference Bulion Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobical. J. Vis. Exp. (2015).Ten film przedstawia metodę mikrorozcieńczenia bulionu w celu określenia minimalnego stężenia hamującego (MIC) antybiotyku lipoglikopeptydowego przeciwko bakteriom Gram-dodatnim. Obejmuje izolację kolonii bakteryjnych, rozcieńczanie, inokulację studzienek mikropłytek o różnych stężeniach antybiotyków oraz weryfikację czystości...

Metoda mikrorozcieńczania bulionu do badania wrażliwości bakterii Gram-dodatnich na antybiotyki

Ten film demonstruje metodę opartą na płytkach mikromiareczkowych do określania minimalnego stężenia hamującego (MIC) testowych antybiotyków przeciwko bakteriom. Po dodaniu zawiesiny patogenu bakteryjnego Pseudomonas aeruginosa do płytki mikromiareczkowej zawierającej seryjne rozcieńczenia badanego antybiotyku i inhibitora wytwarzania pyomelaniny przez bakterie, mierzy się gęstość optyczną studzienek w celu obliczenia minimalnego stężenia hamującego antybiotyku oraz wpływu inhibitora produkcji...

Metoda mikromiareczkowania na płytkach do oceny minimalnego stężenia hamującego antybiotyku

Ten film demonstruje test in vitro do badania związków przeciwgrzybiczych za pomocą testu mikrorozcieńczenia bulionu. Badane związki rozcieńcza się seryjnie na płytce do mikromiareczkowania i inkubuje z inokulum grzybów. Po inkubacji płytkę bada się pod kątem studzienek, w których nie stwierdzono wzrostu grzybów, w celu oceny potencjału przeciwgrzybiczego badanych związków i ich minimalnego stężenia hamującego (MIC).

Test mikrorozcieńczenia bulionu in vitro do badań przesiewowych związków przeciwgrzybiczych

Próba CARA) to półilościowa, średnio przepustowa metoda oceny aktywności badanych agentów przeciwko prątkom, które się replikują, nie replikują, lub jedno i drugie.  CARA pozwala na szybką ocenę aktywności zależnej od czasu i stężenia oraz identyfikuje parametry, które należy realizować za pomocą testów jednostek tworzących kolonie (CFU).

Wizualizacja testu resazuryny agarowej z węglem drzewnym do półilościowego, średnioprzepustowego oznaczania liczby prątków

Łatwa i elastyczna metoda mikrorozcieńczania bulionu do badania związków przeciwgrzybiczych i ekstraktów.

Mikrorozcieńczenie bulionu Badania przesiewowe in vitro: łatwa i szybka metoda wykrywania nowych związków przeciwgrzybiczych

Ten protokół przedstawia szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) w ciągu 2,5 godziny poprzez stymulowane pojedynczymi komórkami obrazowanie metabolizmu D2O. Metoda ta ma zastosowanie do bakterii w moczu lub środowisku krwi pełnej, które są transformujące dla szybkiego jednokomórkowego fenotypowego AspAT w klinice.

Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

Przedstawiamy tutaj protokół do identyfikacji potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych poprzez badanie fenotypową, obejmujące syntezę chemiczną związku 4-aminochinolinowego, określenie jego minimalnego stężenia hamującego wobec Mycobacterium tuberculosis i ocenę jego cytotoksyczności w liniach komórek ssaczych.

Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Opisujemy prostą, szybką i niezawodną metodę tworzenia biofilmów Candida albicans z wykorzystaniem 96-dołkowych płytek mikrotytacyjnych oraz jej przydatność w badaniu wrażliwości komórek wewnątrz biofilmów na środki przeciwgrzybicze.

Metoda z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrującej do monitorowania tworzenia się i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans

Poznaj metodę mikrorozcieńczenia bulionu do oznaczania MIC dalbawancyny wobec bakterii Gram-dodatnich. Protokół obejmuje przygotowanie roztworów w DMSO i użycie pożywki Mueller-Hinton z polisorbaten 80.

Referencyjna metoda mikrorozcieńczenia bulionu do badania wrażliwości in vitro dalbawancyny na bakterie rozwijające się tlenowo

Przeglądaj więcej filmów