Name: Procedura decelularyzacji wątroby szczura w urządzeniu do perfuzji o oscylacyjnym ciśnieniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę decelularyzacji wątroby szczura przy użyciu perfuzji tętniczej z oscylacyjnym ciśnieniem. Technika ta zapewnia bardziej jednorodne i szybsze usuwanie komórek w porównaniu do tradycyjnych metod.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby serdecznie podziękować Steffenowi Lippertowi, Khalidowi Aliyevowi, Korinnej Jöhrens i Katharinie Struecker za ich pomoc podczas tego projektu.

Zwierzęta były utrzymywane w Instytucie Medycyny Eksperymentalnej (Facility for Experimental Medicine, FEM, Charité, Berlin, Niemcy), a wszystkie protokoły doświadczalne zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Państwowy Urząd Zdrowia i Spraw Lokalnych (LAGeSo, Berlin, Niemcy; nr rej. O 0365/11).
1. Pobieranie wątroby
<ol>
	<li>Przygotowanie przedoperacyjne
	<ol>
		<li>Do unieruchomienia należy użyć płyty korkowej. Na płytę położyć obrus medyczny. Za pomocą czterech igieł przymocować do płyty korkowej maskę inhalacyjną do znarkomializacji wewnątrzoperacyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kaniuli do żyły wrotnej
	<ol>
		<li>Podłączyć kaniulę dożylną obwodową (G 20) do kurka trójdrożnego. Kaniulę dożylną należy odciąć pod skosem, tak aby jej długość wynosiła ok. 1,5 cm.</li>
		<li>Odpowietrzyć układ za pomocą strzykawki 10 ml wypełnionej roztworem Ringera. Bardzo ważne jest dokładne odpowietrzenie, ponieważ zator gazowy może negatywnie wpłynąć na perfuzyjną decelularyzację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kaniuli tętniczej
	<ol>
		<li>Użyć kaniuli typu motylek i przyciąć igłę do długości 5 mm. Do 5-milimetrowej igły dopasować rurkę o długości 5 cm (ID 0,58 mm; OD 0,96 mm) i przymocować ją superglue. Do większej rurki wsunąć rurkę o długości 2 cm (ID 0,28 mm; OD 0,61 mm) i przymocować ją superglue.</li>
		<li>Na tak przygotowaną konstrukcję nasunąć kolejną rurkę jako łącznik i przymocować ją superglue. Odpowietrzyć kaniulę tętniczą za pomocą strzykawki 5 ml wypełnionej roztworem Ringera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie i analgezja
	<ol>
		<li>Indukować narkozę szczura w komorze indukcyjnej za pomocą 3,5% izofluranu w tlenie przy przepływie 1,5 L/min.</li>
		<li>Aby zapewnić bezpieczną analgezję podczas operacji, wstrzyknąć doprzewrotnie metamizol (100 mg/kg masy ciała) oraz niską dawkę ketaminy/medetomidyny (10 mg/0,1 mg na kg masy ciała).</li>
		<li>Dostarczać 1,5% izofluranu w 1 L/min tlenu przez maskę inhalacyjną w celu podtrzymania znieczulenia chirurgicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowania przedoperacyjne
	<ol>
		<li>Starannie ogolić brzuch za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia. Zdezynfekować miejsce nacięcia na brzuchu, zwilżając je 70% etanolem.</li>
		<li>Umieścić zwierzę w pozycji na plecach na przygotowanej płycie, włożyć głowę do maski inhalacyjnej i unieruchomić kończyny za pomocą taśmy medycznej i pinów. Usunąć nadmiar etanolu i sierść za pomocą kompresu gazowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena znieczulenia
	<ol>
		<li>Ocenić głębokość znieczulenia, obserwując częstotliwość oddechów. Gdy znieczulenie wyda się wystarczająco głębokie (40-60 oddechów/min), sprawdzić skuteczność analgezji, próbując wywołać odruch uciskania palców, ściskając kleszczykami chirurgicznymi skórę między palcami obu kończyn tylnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostęp do jamy brzusznej
	<ol>
		<li>Wykonać nacięcie pośrodkowe tylnej ściany brzucha powyżej pęcherza. Od tego punktu wyciąć w kształcie litery V w stronę obu bocznych łuków żebrowych. Należy uważać, aby nie przeciąć przepony. Odciągnąć rozciętą ścianę brzucha w stronę klatki piersiowej.</li>
		<li>Wyrostek mieczowaty przymocować zaciskiem Overholta, odciągnąć go w stronę głowy i utrwalić gumką receptorką. Wyewakuować jelita za pomocą mokrych tamponów watowych. Owinąć jelita mokim opatrunkiem gazowym. Ponadto przykryć wszystkie brzegi rany brzusznej mokrymi opatrunkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparacja wątroby
	<ol>
		<li>Przeprowadzić dyssekcję więzadła obojczykowatego. Za pomocą mokrego opatrunku gazowego odsunąć płat przyśrodkowy i lewy płat wątroby ku górze, pod kopułę przepony. Obnażyć więzadło wątrobo-dwunastnicze oraz górny płat sieciowy wątroby.</li>
		<li>Za pomocą dwóch mikrokleszczyków i nożyczek sprężynowych ostrożnie rozciąć więzadło przytwierdzone do górnego płatu sieciowego, aż płat stanie się ruchomy. Przesunąć płat za pomocą mokrych tamponów watowych pod kompresem gazowym, utrzymując płat przyśrodkowy i lewy na miejscu.</li>
		<li>Po mobilizacji górnego płatu sieciowego wątroby przesunąć żołądek w lewo. Utrzymać żołądek zaciskiem i rozciąć małą sieciówkę za pomocą mikrokleszczyków i nożyczek sprężynowych.</li>
		<li>Zmobilizować dolny płat sieciowy wątroby aż do uzyskania ruchomości, a następnie przesunąć płat z powrotem do jego jamistej przestrzeni. Użyć zacisku Backhausa do unieruchomienia dwunastnicy. Przesunąć dwunastnicę w lewo, aby rozciągnąć i obnażyć więzadło wątrobo-dwunastnicze. Obrysować wspólny przewód żółciowy w rozciągniętym więzadle wątrobo-dwunastniczym.</li>
		<li>Oddzielić przewód żółciowy od tkanki tłuszczowej i trzustkowej. Przeciąć przewód żółciowy 1,5 cm od jego rozwidlenia. Oddzielić żyłę wrotną od otaczającej tkanki tłuszczowej. Obnażyć żyłę żołądkowo-dwunastniczą.</li>
		<li>Podwiązać żyłę żołądkowo-dwunastniczą dwukrotnie jedwabiem 6-0 i przeciąć żyłę między dwoma podwiązaniami. Rozciąć pień trzewny i wspólną tętnicę wątrobową z otaczających tkanek, aż zostaną odsłonięte wszystkie odgałęzienia tętnicze.</li>
		<li>Uwolnić tętnicę żołądkowo-dwunastniczą z otaczających tkanek. Podwiązać tętnicę żołądkowo-dwunastniczą dwukrotnie jedwabiem 6-0, zachowując dystans między podwiązaniami. Przeciąć tętnicę żołądkowo-dwunastniczą między dwoma podwiązaniami.</li>
		<li>Uwolnić tętnicę śledzionową z otaczających tkanek. Podwiązać tętnicę śledzionową dwukrotnie jedwabiem 6-0, zachowując dystans między podwiązaniami. Przeciąć tętnicę śledzionową między dwoma podwiązaniami.</li>
		<li>Uwolnić lewą tętnicę żołądkową z otaczających tkanek. Podwiązać lewą tętnicę żołądkową dwukrotnie jedwabiem 6-0, zachowując dystans między podwiązaniami. Przeciąć tętnicę między dwoma podwiązaniami.</li>
		<li>Obrysować żyłę główną dolną między prawą nerką a prawym bocznym płatem wątroby. Oddzielić żyłę od przestrzeni zaotrzewnowej. Obnażyć aortę, prowadząc wzdłuż pnia trzewnego.</li>
		<li>Rozciąć tkankę tłuszczową zaotrzewnową. Wstrzyknąć 1 000 I.E. heparyny w 1 ml soli fizjologicznej do żyły głównej dolnej. Wycofać kaniulę i zamknąć nacięcie tamponem watowym. Odczekać 1-2 min na wystąpienie systemowego działania heparyny.</li>
		<li>Obrysować aortę kleszczykami. Rozciąć aortę i wypuścić krew ze szczura. Ponadto rozciąć żyłę główną dolną dystalnie od nerki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kaniulacja żyły wrotnej (użyć kaniuli przygotowanej w sekcji 1.2)
	<ol>
		<li>Wyciąć nacięcie w kształcie „rybiej paszczy” w dystalnej części żyły wrotnej. Rozszerzyć nacięcie kleszczykami i wprowadzić kaniulę do żyły wrotnej. Przepłukać wątrobę 20 ml roztworem Ringera, aż odbarwi się, a następnie przymocować kaniulę podwiązaniami (jedwab 6-0).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kaniulacja tętnicza (użyć kaniuli przygotowanej w sekcji 1.3)
	<ol>
		<li>Rozciąć aortę powyżej pnia trzewnego. Uwolnić segment aorty z przestrzeni zaotrzewnowej. Przeciąć segment aorty podłużnie, aby utworzyć łatę aortalną. Wprowadzić wykonaną kaniulę do statywowego uchwytu.</li>
		<li>Za pomocą dwóch kleszczyków nasunąć łatę aortalną na kaniulę. Podwiązać tętnicę wątrobową jedwabiem 6-0 nad kaniulą i przymocować łatę na łączniku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksplantacja wątroby
	<ol>
		<li>Otworzyć przeponę, wykonać nacięcie okrężne i oddzielić wątrobę od struktur otaczających.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywanie
	<ol>
		<li>Przechowywać wątrobę w sterylnym zbiorniku 500 ml wypełnionym 350 ml roztworem Ringera do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Roztwory detergentów
<ol>
	<li>10% roztwór stokowy Triton X-100
	<ol>
		<li>Napełnij butelkę o pojemności 1 000 ml 900 ml aqua dest. i dodaj 100 ml Triton X-100 (99,9%). Użyj mieszadła, aby rozpuścić Triton X-100. Dopełnij butelkę aqua dest. do uzyskania całkowitej objętości 1 000 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1% Triton X-100
	<ol>
		<li>Dodaj 100 ml roztworu stokowego (10%) do butelki o pojemności 1 000 ml. Dodaj 900 ml aqua dest. i wstrząśnij butelką dwukrotnie. Przefiltruj 1% roztwór Triton X-100 przez filtr sterylny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10% roztwór stokowy SDS
	<ol>
		<li>Napełnij butelkę o pojemności 1 000 ml 900 ml aqua dest. i dodaj 66,99 g SDS (99,9%, gęstość 0,67). Użyj mieszadła, aby rozpuścić SDS. Dopełnij butelkę aqua dest. do uzyskania całkowitej objętości 1 000 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1% SDS
	<ol>
		<li>Dodaj 100 ml roztworu stokowego (10%) do butelki o pojemności 1 000 ml. Dodaj 900 ml aqua dest. i wstrząśnij butelką dwukrotnie. Przefiltruj 1% roztwór SDS przez filtr sterylny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Decelularyzacja
<ol>
	<li>Konfiguracja urządzenia do perfuzji<img alt="Perfuzja wątroby szczura w bioreaktorze; podpisany schemat pokazuje dopływ/odpływ; rozkład ciśnienia." src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"></li>
</ol>
Rysunek 1: Schemat urządzenia perfuzyjnego do selektywnej perfuzji tętniczej i żylnej wrotnej czterech wątrób szczura w warunkach oscylującego ciśnienia.(zmodyfikowany na podstawie Struecker et al. 14)
<ol>
	<li>Podłącz odpływ do trójdrożnego kurka i przedłużki Heidelberger, aby regulować poziom napełnienia, a następnie napełnij reaktor 500 ml 0,9% NaCl. 
	<img alt="Schemat ekstrakcji Soxhleta z systemem refluksu rozpuszczalnika, układem ekstrakcyjnym i kolbą do odzyskiwania rozpuszczalnika." src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"></li>
</ol>
Rysunek 2: Schemat układu perfuzyjnego. Połącz komorę perfuzyjną (1 400 cm3)(1) z końcem dystalnym (4) pułapki pęcherzykowej (5) poprzez dostęp żylny wrotny (2) lub dostęp tętniczy (3). Pułapka pęcherzykowa (5) powinna być wyposażona w zatyczkę (4) na końcu dystalnym oraz odpowietrznik (6). Podłącz pułapkę pęcherzykową (5) do przedłużki Heidelbergera (7). Połącz przedłużkę Heidelbergera z segmentem pompy (8). Następnie podłącz segment pompy (8) do kolejnej przedłużki Heidelbergera (9). Włóż ostatnią przedłużkę Heidelbergera (9) do butelki z roztworem detergentu (10). Podłącz respirator (11) do komory perfuzyjnej (lub do rozdzielacza ciśnienia w przypadku perfuzji wielokrotnych). Aby odprowadzić płyny z reaktora, podłącz odpływ do butelki na odpady (12).
<ol>
	<li>Włóż segment pompy do pompy. Uruchom pompę, aby wypełnić obwód PBS, zamknij dalszy koniec pułapki na pęcherzyki powietrza i otwórz odpowietrznik. Gdy dół pułapki zostanie całkowicie wypełniony PBS (2-3 cm), zamknij odpowietrznik i otwórz dalszy koniec pułapki na pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Instalacja wątroby
	<ol>
		<li>Połącz kran trójdrożny kaniuli żyły wrotnej z odpowiednim dostępem do reaktora. Podłącz kaniulę tętniczą do dostępu tętniczego. Należy zachować szczególną ostrożność, aby do układów nie dostało się powietrze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosowanie warunków ciśnienia oscylacyjnego
	<ol>
		<li>Użyj respiratora o częstotliwości 15 bpm i amplitudzie 26 mbar (min. 4 mbar, max. 30 mbar). Podłącz respirator do komory rozdzielczej ciśnienia, a komorę do reaktora. Rozpocznij aplikację ciśnienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół decelularyzacji
	<ol>
		<li>Wykonaj etapy perfuzji przy szybkości przepływu 5 ml/min. Rozpocznij decelularyzację poprzez perfuzję wątroby 1% Triton X-100 przez 90 min. Pozwól na odpływ ścieków przez wylot urządzenia do perfuzji, aby utrzymać stały poziom cieczy w komorze perfuzyjnej powyżej perfundowanej wątroby. Po 90 min zmień detergent na 1% SDS. 
		<img alt="Schemat harmonogramu perfuzji z PBS, 1% Triton X-100, 1% SDS przy szybkości przepływu 5 ml/min." src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
		<img alt="Tabela dróg perfuzji, przedstawiająca żyłę wrotną i tętnicę wątrobową wraz z danymi dotyczącymi ciśnienia oscylacyjnego." src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
 Rysunek 3: Protokół perfuzji dla wszystkich grup eksperymentalnych.

<ol><li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+support+strategies%3A+cutting-edge+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+scaffolds+effectively+support+the+proliferation+and+differentiation+of+mouse+fetal+hepatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li>
<li>Bao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+portal+implantable+functional+tissue-engineered+liver+using+perfusion-decellularized+matrix+and+hepatocytes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats.</a> Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+whole-organ+assembly%3A+moving+toward+transplantation+on+demand%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).</li>
<li>De Kock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+quick+method+for+whole-liver+decellularization%3A+a+novel+in+vitro+three-dimensional+bioengineering+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+toxicology%22%5BJournal%5D)">Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool.</a> Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).</li>
<li>Park, K. M., Woo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+decellularization+for+multi-organ+scaffolds+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+proceedings%22%5BJournal%5D)">Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats.</a> Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).</li>
<li>Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+as+a+practical+scaffold+with+a+vascular+network+template+for+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering.</a> J Biosci Bioeng. , (2012).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver Int. 33, 448-458 (2013).</li>
<li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+rat+liver+decellularization+by+arterial+perfusion+under+oscillating+pressure+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2014).</li>
<li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+Liver+Decellularization+Under+Oscillating+Pressure+Conditions%3A+A+Technical+Refinement+to+Improve+the+Homogeneity+of+the+Decellularization+Process%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż przedstawiona technika pobierania i decelularyzacji wątroby szczura jest łatwa do odtworzenia, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków:
Podczas przygotowań do pobrania wątroby ważne jest, aby unikać ciężkiego krwawienia, ponieważ aktywuje ono krzepnięcie krwi i może prowadzić do tworzenia się skrzepów krwi w wątrobie. Naszym zdaniem korzystne jest nacięcie aorty brzusznej bezpośrednio przed kaniulacją żyły wrotnej, aby uniknąć napływu krwi przez tętnicę wątrobową podczas perfuz...

Decelularyzacja i recelularyzacja mogą umożliwić generowanie funkcjonalnych, nadających się do przeszczepu organów in vitro 1. Usuwając komórki i materiał antygenowy (np. DNA, epitopy alfa-Gal) z narządu, można uzyskać nie- lub mniej immunogenną macierz zewnątrzkomórkową (ECM). Macierz ta zachowuje trójwymiarową mikroanatomię narządu i może służyć jako idealna biomatryca do ponownego zasiedlenia komórkami o innym, prawdopodobnie ksenogenicznym pochodzeniu 2. W ten sposób zdecelularyzowana matryca wątroby szczura może zostać ponownie zasiedlona ludzkimi komórkami wątroby. Ta humanizowana mikrowątroba może służyć jako model ex vivo do badań nad chorobami (np. wrodzonymi chorobami metabolicznymi, chorobami wirusowymi lub nowotworami złośliwymi) lub do przedklinicznych testów farmaceutycznych 3.
Kilka różnych protokołów decelularyzacji perfuzji wątroby szczurów zostało już opublikowanych 4-13. We wszystkich protokołach decelularyzacja została osiągnięta przez perfuzję alkalicznych detergentów jonowych lub niejonowych przez kaniulowaną żyłę wrotną. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, byliśmy pierwszą grupą, która zgłosiła decelularyzację wątroby szczura przez selektywną perfuzję przez żyłę wrotną i / lub tętnicę wątrobową szczura 14. Umożliwienie selektywnej perfuzji różnych układów naczyniowych w wątrobie może umożliwić lepsze wyniki decelularyzacji, a ponadto może odgrywać ważną rolę w ponownym zasiedlaniu komórek.
W opisanym tutaj badaniu, wątroby były perfundowane w specjalnie zaprojektowanym urządzeniu do perfuzji, umożliwiającym perfuzję w warunkach oscylacji ciśnienia. Te warunki ciśnienia naśladują fizjologiczną zależną od układu oddechowego perfuzję wątroby: in situ wątroba wisi pod kopułą przepony, której ruch podczas oddychania ma bezpośredni wpływ na perfuzję wątroby. Wdech w szczególności prowadzi do obniżenia przepony i ściśnięcia wątroby, optymalizując odpływ wątrobowo-żylny, podczas gdy wydech prowadzi do uniesienia wątroby i obniżenia ciśnienia wewnątrzbrzusznego w celu optymalizacji dopływu wrotno-żylnego 15.
Naszym celem było ocenienie, czy warunki oscylacji ciśnienia mają wpływ na jednorodność decelularyzacji perfuzji wątroby szczura poprzez naśladowanie warunków wewnątrzbrzusznych ex vivo. Jednorodność procesu decelularyzacji może być niedocenianym czynnikiem w decelularyzacji perfuzyjnej. Wszystkie znane środki stosowane do decelularyzacji wątroby powodują zmiany w ECM. Komórki w słabo perfuzjowanych obszarach pozostają w ECM, podczas gdy inne obszary są już całkowicie pozbawione komórek. Aby rozpuścić pozostałe komórki, czas trwania perfuzji lub ciśnienie muszą zostać podwyższone, powodując więcej zmian w dobrze ukrwionych obszarach. Dlatego detergenty do decelularyzacji powinny być rozprowadzane jednorodnie w narządzie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Samodzielnie zbudowana kaniula tętnicza</td></tr><tr><td>&nbsp; Portex Niesterylne rurki polietylenowe</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0,28 mm ID 0,61 mm OD</td></tr><tr><td>&nbsp; Portex Niesterylne rurki polietylenowe</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0,58 mm ID 0,96 mm OD</td></tr><tr><td>Venodrop Bezpieczny cewnik motylkowy</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4">kaniula żyły wrotnej</td></tr><tr><td>Cewnik żył obwodowych</td><td>BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>Zawór trójdrożny</td><td>smiths medical</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><<tr>td colspan="4"></td></tr><tr><td>Patyczki bawełniane</td> chirurgiczne <td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>Płatki kosmetyczne&nbsp;</td><td>Opatrunek chirurgiczny Shaoxing Zhengde</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>Bandaż z gazy</td><td>Hubei Haige&nbsp; Instrumenty medyczne</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ringer Solution</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 ml Strzykawka</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 ml/ Luer Solo</td></tr><tr><td>5 ml Strzykawka</td><td>Braun</td><td>4606061V</td><td>5 ml /Luer Solo</td></tr><tr><td>Szew (Jedwab 6/0)</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>serweta medyczna</td><td>Shaoxing Zhengde Opatrunek chirurgiczny</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">chirurgiczny uchwyt na igły do narzędzi</td></tr><tr><td></td><td>Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>mikrokleszczyki</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>mikronożyczki</td><td>Martin</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>mikrokleszczyki</td><td>S& T &nbsp;</td><td></td><td></td>112314</tr><tr><td>Zacisk</td><td>Nożyczki Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>F S T&nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze chirurgiczne</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Maska decelularyzacyjna</td></tr><tr><td></td><td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td> Urządzenie do perfuzji <td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>Charite, laboratorium inżynierii medycznej</td> wykonane <td>na zamówienie urządzenie</td> do <td>decelularyzacji</td><td></td></tr><tr><td>pompa perystaltyczna ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&nbsp;</td><td>4-kanałowy</td></tr><tr><td>Przedłużenie Heidelberger 75 cm&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA segment</td><td>pompy IDEX</td><td>IS 3510&nbsp;</td><td>MS/CA/click'n'go/POM-C</td></tr><tr><td>Rurka CA 2-korkowa</td><td>Pharmed</td><td>BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>pułapka bąbelkowa&nbsp;</td><td></td><td>Produkt</td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>Luer Lock złącze węża</td><td>Neolab</td><td>nr 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detergenty</td></tr><tr><td>SDS granulki</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>CN30.4&nbsp;</td><td>2,5 kg</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>3051.1&nbsp;</td><td>10 L</td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">barwienie</td></tr><tr><td>Eozyna 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoksylina</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>barwienie gomori</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>barwienie AlcainBlue-PAS</td><td>Morphisto</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień bezpośrednia 80&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

procedura decelularyzacji wątroby szczura w urządzeniu do perfuzji o oscylacyjnym ciśnieniu

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decelularyzacja i recelularyzacja narządów miąższowych może umożliwić wytwarzanie funkcjonalnych organów in vitro, a kilka protokołów decelularyzacji wątroby gryzoni zostało już opublikowanych. Naszym celem było usprawnienie procesu decelularyzacji poprzez budowę autorskiego urządzenia perfuzyjnego umożliwiającego selektywną perfuzję przez żyłę wrotną i/lub tętnicę wątrobową. Ponadto staraliśmy się przeprowadzić perfuzję w warunkach oscylacji ciśnienia otoczenia, aby poprawić jednorodność decelularyzacji. Jednorodność decelularyzacji perfuzyjnej była do tej pory niedocenianym czynnikiem. Podczas decelularyzacji obszary w obrębie narządu, które są słabo ukrwione, mogą nadal zawierać komórki, podczas gdy macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) w obszarach dobrze ukrwionych może być już dotknięta alkalicznymi detergentami. Oscylacyjne zmiany ciśnienia mogą naśladować zmiany ciśnienia w jamie brzusznej, które zachodzą podczas oddychania, aby zoptymalizować mikroperfuzję w wątrobie. W przedstawionym tutaj badaniu bezkomórkowe matryce wątroby szczura analizowano za pomocą barwienia histologicznego, analizy zawartości DNA i odlewania korozyjnego. Perfuzja przez tętnicę wątrobową wykazała bardziej jednorodne wyniki niż perfuzja żyły wrotnej. Zastosowanie warunków ciśnienia oscylacyjnego poprawiło skuteczność decelularyzacji perfuzyjnej. Najlepsze wyniki uzyskano u wątroby perfundowanej przez tętnicę wątrobową i w warunkach oscylacji ciśnienia. Zaprezentowane techniki pobierania wątroby, kaniulacji i perfuzji przy użyciu naszego autorskiego urządzenia umożliwiają zaawansowane konfiguracje perfuzji w celu usprawnienia eksperymentów z decelularyzacją i recelularyzacją w wątrobach szczurów.

Jednorodność, a tym samym skuteczność różnych protokołów decelularyzacji, oceniono za pomocą obserwacji makroskopowej, analizy histologicznej oraz analizy zawartości pozostałego DNA w decelularyzowanych macierzach wątroby. Ponadto wykonano odlew korozyjny w celu wizualizacji nienaruszonej mikroanatomii wątrób po decelularyzacji.
Makroskopia
Podczas decelularyzacji wątroby stają się prześwitujące, co wskazuje na usunięcie zawartości komórkowej. Wątroby perfundowane p...

Przedstawione techniki pobierania wątroby, kaniulacji i perfuzji przy użyciu naszego zastrzeżonego urządzenia umożliwiają zaawansowane ustawienia perfuzji w celu usprawnienia eksperymentów z decelularyzacją i recelularyzacją w wątrobach szczurów.

Procedura decelularyzacji wątroby szczura w urządzeniu do perfuzji o oscylacyjnym ciśnieniu

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ocena roli korzenia perfuzyjnego w optymalizacji jednorodności decelularyzacji perfuzyjnej wątroby szczura. Osiąga się to poprzez uprzednie kaniulowanie żył wrotnych i tętnic wątrobowych świeżo izolowanych wątrób szczura. W drugim kroku wątroby są podłączone do urządzenia do perfuzji w celu selektywnej perfuzji żył wrotnych lub tętnic wątrobowych.Następnie do komory perfuzyjnej przyłożone są oscylujące zmiany ciśnienia, aby naśladować zmiany ciśnienia wewnątrzbrzusznego występujące podczas oddychania. Optymalizacja mikroperfuzji wątroby sprawia, że wątroby perfundowane przez tętnicę wątrobową w warunkach ciśnienia oscylacyjnego wykazują bardziej jednorodną i szybszą decelularyzację, co oceniono poprzez obserwację makroskopową oraz analizy histologiczne i biochemiczne. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak decelularyzacja poprzez perfuzję żylną wrotną, jest fakt, że perfuzja tętnicza z zastosowaniem warunków ciśnienia oscylacyjnego prowadzi do bardziej homogenicznego rezultatu decelularyzacji.Niemniej jednak, metoda ta w krótszym czasie może dostarczyć wiedzy na temat technik spowolnienia procesów. Można

procedure-for-decellularization-rat-livers-an-oscillating-pressure

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Decelularyzacja perfuzyjna jest nowoczesną techniką wytwarzania rusztowań całej wątroby, która zachowuje skład macierzy zewnątrzkomórkowej oraz mikroarchitekturę narządu. W niniejszym opracowaniu opisano metodę przygotowania rusztowań całego narządu z wykorzystaniem decelularyzacji perfuzyjnej i późniejszej repopulacji hepatocytami. Dzięki tej technice możliwe jest wytworzenie funkcjonalnych i możliwych do przeszczepienia graftów wątroby.

Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób

Opisano technikę izolacji fibroblastów wrotnych z wątroby szczura. Wątroby poddano perfuzji oraz trawieniu in situ kolagenazą, a następnie trawieniu ex vivo zawiesiny wątrobowej i selekcji komórek pod względem wielkości. Metoda ta pozwala na uzyskanie czystej populacji fibroblastów wrotnych bez konieczności pasażowania w hodowli.

Izolacja fibroblastów wrotnych szczura poprzez perfuzję wątroby in situ

Pierwotne hepatocyty stanowią cenne narzędzie do oceny funkcji biochemicznych, molekularnych i metabolicznych w fizjologicznie istotnym systemie eksperymentalnym. Opisujemy niezawodny protokół perfuzji wątroby szczura in situ, który pozwala na konsekwentne uzyskiwanie żywotnych hepatocytów w ilości do 1,0 × 108 komórek na preparat, przy żywotności komórek w zakresie 88 ~ 96%.

Izolacja i hodowla pierwotna komórek wątroby szczura

Przeszczepy marginalne, takie jak stłuszczone wątroby, przeszczepy od starszych dawców lub wątroby pobrane po śmierci sercowej (DCD) źle znoszą tradycyjne, zimne przechowywanie statyczne. Opracowaliśmy nowatorski model subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo w celu zachowania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby przed przeszczepem.

Technika subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo do przechowywania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby

Istnieje znaczny niedobór dawców wątroby, a kryteria dla dawców wątroby zostały rozszerzone. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) został opracowany w celu oceny i modyfikacji funkcji narządów. Badanie to demonstruje szczurzy model NEVLP i testuje zdolność pegylowanej katalazy do łagodzenia uszkodzeń wątroby.

Mały zwierzęcy model normacyjnej perfuzji wątroby ex vivo

Ustanawiamy nowatorską technikę chirurgiczną dla modelu perfuzji pojedynczego płata wątroby in vivo u szczurów jako warunek wstępny do dalszych badań in vivo częściowej inżynierii wątroby w przyszłości.

Nowatorska technika chirurgiczna jako podstawa częściowej inżynierii wątroby in vivo u szczurów

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie specjalnego cewnika dożylnego, standaryzowanego sterylnego jednorazowego wężyka, kontroli temperatury uzupełnionej monitorowaniem w czasie rzeczywistym, oraz systemu alarmowego dla dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w celu poprawy spójności żywotności, wydajności i funkcjonalności izolowanych pierwotnych hepatocytów szczurów.

Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji

Protokół opisuje chirurgiczne pobieranie i późniejszą decelularyzację unaczynionych płatów świńskich poprzez perfuzję detergentu z dodecylosiarczanu sodu przez unaczynienie płata w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym.

Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym

Opisujemy technikę chirurgiczną i proces decelularyzacji kompozytowych kończyn tylnych szczurów. Decelularyzacja odbywa się przy użyciu dodecylosiarczanu sodu o niskim stężeniu przez system perfuzji maszynowej ex vivo.

Pobieranie i decelularyzacja kończyn tylnych szczura przy użyciu bioreaktora opartego na perfuzji ex vivo do unaczynionej allotransplantacji kompozytowej

Dla mysich wątrob stworzono normotermiczny system perfuzji wątroby ex vivo (NEVLP). System ten wymaga doświadczenia w mikrochirurgii, ale pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników perfuzji. Możliwość wykorzystania wątroby myszy ułatwia badanie szlaków molekularnych w celu identyfikacji nowych dodatków perfuzatu i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów skoncentrowanych na naprawie narządów.

Normothermiczna perfuzja płuc ex vivo w wątrobie u myszy

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.

Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D

Poznaj metodę decelularyzacji wątroby szczura przy użyciu perfuzji tętniczej z oscylacyjnym ciśnieniem. Technika ta zapewnia bardziej jednorodne i szybsze usuwanie komórek w porównaniu do tradycyjnych metod.

Procedura decelularyzacji wątroby szczura w urządzeniu do perfuzji o oscylacyjnym ciśnieniu

Przeglądaj więcej filmów