Procedura decelularyzacji wątroby szczura w urządzeniu do perfuzji o oscylacyjnym ciśnieniu

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena roli korzenia perfuzyjnego w optymalizacji jednorodności decelularyzacji perfuzji wątroby szczura. Osiąga się to poprzez pierwsze kaniulowanie żył wrotnych i tętnic wątrobowych świeżo izolowanych wątrob szczurów. W drugim etapie wątroby są podłączane do urządzenia perfuzyjnego w celu selektywnej perfuzji żył wrotnych lub tętnic wątrobowych.

Następnie do komory perfuzyjnej przykładane są oscylacyjne zmiany ciśnienia, aby naśladować zmiany ciśnienia w jamie brzusznej, które zachodzą podczas oddychania. Optymalizując mikroperfuzję wątroby, ostatecznie wątroby perfundowane przez tętnicę wątrobową w warunkach oscylującego ciśnienia wykazują bardziej jednorodną i szybszą decelularyzację, co oceniano za pomocą obserwacji makroskopowej oraz analizy histologicznej i biochemicznej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak decelularyzacja perfuzji żyły wrotnej, jest to, że perfuzja tętnicza przy użyciu warunków oscylującego ciśnienia prowadzi do bardziej jednorodnego wyniku decelularyzacji.

Jednak w krótszym czasie ta metoda może zapewnić wgląd w techniki zwalniania. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak eksperymenty solaryzacji rez, zestawy perfuzji zewnątrzustnej i modele narządów. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą walczyć, ponieważ pobieranie i kaniulacja tętnicza czerwonych wątrob może być skomplikowane.

Przed pobraniem wątroby wykonaj ukośne cięcie do końca 1,5-centymetrowego kawałka obwodowego cewnika żylnego G 20. Podłącz cewnik do trójdrożnego kurka zatrzymującego i użyj 10-mililitrowej strzykawki wypełnionej roztworem dzwonka, aby przewietrzyć system. Następnie przytnij igłę kaniuli motylkowej na długość pięciu milimetrów i użyj super kleju, aby przymocować pięciocentymetrową rurkę do igły.

Włóż rurkę o długości dwóch centymetrów do większej rurki i przymocuj ją również za pomocą super kleju. Wsuń kolejną rurkę na tę konstrukcję i przyklej ją na miejscu, aby utworzyć łącznik. Następnie użyj pięciomililitrowej strzykawki wypełnionej roztworem dzwonka, aby usunąć nowo skonstruowaną kaniulę tętniczą Aby naprawić wątrobę do zbioru.

Zacznij od użycia mokrego bandaża, aby przytrzymać przyśrodkowy i lewy płat wątroby znieczulonego dorosłego szczura pod kopułą przepony. W tym czasie należy również odsłonić więzadło wątroby i dwunastnicy oraz górny płat wątroby. Następnie użyj dwóch mikrokleszczyków i nożyczek sprężynowych, aby ostrożnie wypreparować więzadło przyczepione do górnego płata omentalnego, aż płat będzie ruchomy.

Następnie przytrzymując przyśrodkowy i lewy płat na miejscu. Użyj mokrych bawełnianych wacików, aby przesunąć płat pod kompresem GRE i brzuch na lewo od zwierzęcia. Zamocuj żołądek za pomocą zacisku i wypreparuj niewielki pęd

Następnie wypreparuj dolny lub mentalny płat wątroby, aż będzie ruchomy, i przenieś płat z powrotem do jego jamy za pomocą zacisku tylnego, aby zatrzymać dwunastnicę, przesuń dwunastnicę w lewo, aby odsłonić więzadło dwunastnicy herpy. Opisując wspólny przewód żółciowy. Następnie wyciąć przewód żółciowy z tkanki tłuszczowej i trzustkowej, przecinając przewód 1,5 centymetra od rozwidlenia dróg żółciowych.

Wypreparuj żyłę słoniową z otaczającej tkanki tłuszczowej, odsłaniając żyłę żołądka i dwunastnicy. Następnie podwiąż żyłę żołądkowo-dwunastniczą dwukrotnie za pomocą sześciu szwów zerowych i podziel żyłę między dwa węzły. Wypreparuj pień trzewny i wspólną tętnicę wątrobową z otaczającej tkanki, aż ujawni się cała ramia tętnicza.

Po wycięciu wszystkich tętnic należy oznaczyć dolną żyłę główną między prawą nerką a prawym bocznym płatem wątroby i wyciąć żyłę z przestrzeni zaotrzewnowej. Podążaj za pniem trzewnym, aby odsłonić aortę. Następnie wypreparuj tkankę tłuszczową zaotrzewnową i oznacz aortę powyżej pnia trzewnego.

Teraz wstrzyknij 1000 jednostek heparyny w jednym mililitrze soli fizjologicznej do katoryny żyły dolnej. Przykryj nacięcie wacikiem i odczekaj od jednej do dwóch minut, aż heparyna zacznie działać. Następnie obrysuj aortę kleszczami i wypreparuj aortę i katołaza żyły dolnej dystalnie od nerki.

Aby umieścić kaniulę żylną wrotną, wykonaj nacięcie w jamie ustnej ryby w dystalnej żyle wrotnej i otwórz nacięcie kleszczami. Następnie kanuluj żyłę wrotną i przepłucz wątrobę 20 mililitrami roztworu dzwonka, aż wątroba odczłowieczy się Używając jedwabnych sześciu ligatur zerowych, aby zamocować kaniulę na miejscu. Aby umieścić kaniulę tętniczą, należy wyciąć aortę powyżej pnia trzewnej, aż segment aorty będzie mógł zostać uwolniony z przestrzeni zaotrzewnowej.

Przetnij segment aorty wzdłużnie, aby wygenerować łatkę aorty i włóż samodzielnie zbudowaną kaniulę do statycznego uchwytu. Następnie użyj dwóch kleszczy, aby wsunąć plaster aorty na kaniulę i podwiązać tętnicę wątrobową jedwabnym szewem zerowym nad kaniulą. Mocowanie łatki na łączniku w celu przeprowadzenia decelularyzacji Połącz trójdrożny kran na kaniuli żyły wrotnej z odpowiednim dostępem do reaktora i podłącz kaniulę tętniczą do dostępu tętniczego, uważając, aby powietrze nie dostało się do systemów.

Następnie podłącz respirator do komory dystrybucji ciśnienia i podłącz komorę do reaktora. Uruchom aplikację ciśnieniową. Następnie, aby rozpocząć decelularyzację.

Połączyć wątrobę z 1% tritton X 100 w tempie pięciu mililitrów na minutę. Pozwól, aby ścieki wyciekały przez odpływ urządzenia perfuzyjnego, aby utrzymać stały poziom płynu w komorze perfuzyjnej i powyżej perfundowanej wątroby. Po 90 minutach zmień detergent na 1% SDS Wątroby perfundowane przez żyłę siłową wykazują jednorodne wyjaśnienie wskazujące na decelularyzację z makroskopowo widocznymi pozostałymi komórkami w trakcie i po procesie, podczas gdy wątroby perfundowane przez tętnicę wątrobową wykazują bardziej jednorodny przebieg decelularyzacji z mniej widocznymi pozostałymi komórkami.

Jeśli wątroby były perfundowane pod wpływem warunków oscylującego ciśnienia, nie było widać żadnych pozostałych komórek. Niezależnie od perfuzji. Ocena histologiczna korzeni zdecelularnych matryc wątroby potwierdza makroskopowe wyniki w wątrobach perfundowanych przez tętnicę wątrobową.

Nie obserwuje się pozostałych komórek, niezależnie od tego, czy były perfuzjowane w warunkach ciśnienia oscylacyjnego, czy nie, wątroby perfundowane przez żyłę wrotną, jednak wykazują strefy pozostałych komórek, nawet jeśli są perfundowane w warunkach ciśnienia oscylacyjnego, chociaż warunki te zmniejszają pozostałą masę komórkową w tych wątrobach, należy zauważyć, zachowanie zewnątrzkomórkowych matryc wątroby niezależnie od warunków decelularyzacji. Zawartość DNA w suchej masie macierzy wątroby również zmniejszyła się we wszystkich grupach eksperymentalnych w porównaniu z rodzimymi wątrobami. Chociaż różnice były tylko statystycznie istotne w grupie perfuzji w warunkach ciśnienia oscylacyjnego.

Ponadto odlewanie korozyjne zdecelularnych matryc wątroby potwierdziło zachowanie mikroanatomii wątroby podczas procesu perfuzji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać kannalety i perfuzjować czerwone wątroby w celu powtarzalnego jednorodnego spowolnienia. Nie zapominaj, że praca z Triton X 100 i SDS może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy również podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.