Name: Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Poznaj technikę podsiatkówkowego wstrzyknięcia wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy. Ta metoda umożliwia skuteczną terapię genową w badaniach nad chorobami siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Seoul National University Research Grant (800-20140542), Pioneer Research Program of NRF/MEST (2012-0009544), oraz Bio-Signal Analysis Technology Innovation Program NRF/MEST (2009-0090895), oraz Grant NRF/MEST (2015M3A9E6028949).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z oświadczeniem Association for Research in Vision and Ophthalmology dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzroku oraz wytycznymi i przepisami ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Narodowego w Seulu oraz Komitet ds. Biochemicznego Bezpieczeństwa Szpitala Uniwersytetu Narodowego w Seulu.
1. Przygotowanie zestawu do iniekcji i wektorów wirusowych
<ol>
	<li>Przygotować strzykawkę mikrolitrową wyposażoną w tępą igłę 33 G, wysterylizowaną tlenkiem etylenu. Rozcieńczyć wektory wirusowe w PBS do odpowiedniego miana w mikroprobowce (np. 1 x 106 TU/µl). Kilkukrotnie przepłukać strzykawkę wektorami wirusowymi, aby usunąć powietrze z przestrzeni martwej strzykawki.</li>
</ol>
2. Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych
<ol>
	<li>Zanurzyć dorosłe myszy (tj. w wieku 6–8 tygodni) w narkozie poprzez dostrzykłonowe podanie mieszaniny tiletaminy i zolazepamu (1:1, 2,25 mg/kg masy ciała) oraz hydrochlorku ksylazyny (0,7 mg/kg masy ciała) lub zastosować alternatywny, odpowiedni schemat znieczulenia.</li>
	<li>Rozszerzyć źrenice za pomocą kropli do oczu z fenylefryną 0,5% i tropikamidem 0,5%.</li>
	<li>Przygotować strzykawkę mikrolitrową, nabierając 1,5–2 µl wektorów wirusowych.</li>
	<li>Odsunąć powiekę i wysunąć gałkę oczną, aby odsłonić równik dla wygodnego wstrzyknięcia i ustawić ostrość pod mikroskopem operacyjnym. Utrzymać wysuniętą pozycję oka aż do zakończenia iniekcji, w przeciwnym razie podczas wstrzykiwania może dojść do przemieszczenia igły. Aby stabilnie przytrzymać gałkę oczną, należy umieścić palce na zewnątrz obrąbka oczodołu.</li>
	<li>Nanieść kroplę okulistycznego roztworu wiskoelastycznego na powierzchnię rogówki.</li>
	<li>Umieścić małe okrągłe szkiełko nakrywkowe na górnej części rogówki, aby umożliwić wizualizację siatkówki.</li>
	<li>Wykon PTA mały otwór nieco za limbusm, używając sterylnej igły 30 G 1/2, w celu późniejszej iniekcji podsiatkówkowej. Dla wygody otwór należy wykonać w części dolnej dla prawego oka i w części górnej dla lewego oka. 
	UWAGA: Jeśli otwór zostanie wykonany w części skroniowej lub nosowej, trudno będzie go przykryć powieką po iniekcji. Pierwsze nakłucie powinno zostać wykonane nieco za limbusm, aby uniknąć naczyń limbalnych, które biegną wzdłuż limbusa i są łatwo rozpoznawalne. Należy uważać, aby podczas pierwszego nakłucia nie uderzyć igłą w soczewkę. Nie należy wprowadzać całej ściętej części igły, aby uniknąć przebicia soczewki.</li>
	<li>Wprowadzić tępe igłę 33 G strzykawki mikrolitrowej przez wcześniej wykonany otwór i posuwać igłę w przestrzeń podsiatkówkową do momentu wyczucia lekkiego oporu. 
	UWAGA: W przypadku iniekcji podsiatkówkowej optymalny kąt prowadzenia igły wynosi około 45 stopni względem płaszczyzny tęczówki, a tępą igłę należy pchać tylnie w kierunku obszaru okołobrodawkowego. Przerywana linia kwadratu na Rysunku 1 wskazuje sugerowaną drogę igły przez jamę ciała szklistego dla iniekcji podsiatkówkowej. 
	UWAGA: Podczas przebijania (lub przechodzenia przez) warstwy siatkówki nie będzie wyczuwalnego oporu, ponieważ są one bardzo miękkie. Zatem pierwsze odczucie lekkiego oporu wskazuje, że igła dotknęła już warstwy RPE i należy przerwać wprowadzanie igły. Należy uważać, aby nie przebić tkanki twardówki nadmiernym naciskiem, ponieważ igła powinna zostać umieszczona w potencjalnej przestrzeni podsiatkówkowej. Jeśli igła przebije tkankę twardówki zbyt dużą siłą, wejdzie ona bez oporu w okołogałkowe przestrzenie oczodołu. (Ten krok jest krytyczny)</li>
</ol>
<img alt="Schemat przekroju ludzkiego oka z zaznaczonymi rogówką, soczewką, siatkówką, nerwem wzrokowym oraz drogą wprowadzenia igły." src="/files/ftp_upload/53030/53030fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematiczny schemat wstrzyknięcia podsiatkówkowego.Przekrój oka myszy barwiony H&amp;E, przedstawiający struktury z zaznaczoną drogą wprowadzenia igły do wstrzyknięcia podsiatkówkowego (punktowy kwadrat). Powiększenie: 40X, pasek skali: 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53030/53030fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="9">
	<li>Delikatnie wstrzyknij wektory wirusowe (t.j. 1 x 106 TU/µl) do przestrzeni podsiatkówkowej, unikając drżeń, aby zapobiec niepożądanym uszkodzeniom tkanki, a następnie powoli wycofaj igłę. Podczas wstrzykiwania mocno przytrzymaj gałkę oczną, zgodnie z opisem w punkcie 2.4.</li>
	<li>Pod mikroskopem operacyjnym obserwuj powstanie pęcherza podsiatkówkowego po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że nie wystąpiło krwawienie z siatkówki.</li>
</ol>
<img alt="Zbliżenie oka ryby, tworzenie się zaćmy, obraz mikroskopowy, analiza zmętnienia soczewki." src="/files/ftp_upload/53030/53030fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Powstanie pęcherza podsiatkówkowego bez krwotoku do siatkówki.Widok mikroskopowy pęcherza podsiatkówkowego po wstrzyknięciu podsiatkówkowym pod mikroskopem operacyjnym wykazuje prawidłowe powstanie pęcherza bez wystąpienia krwotoku do siatkówki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53030/53030fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="11">
	<li>Delikatnie zamknij powiekę, aby przykryć miejsce wstrzyknięcia w celu zapewnienia samouszczelnienia. Zwróć myszy do klatki macierzystej i utrzymuj je przy życiu aż do momentu oceny. 
	UWAGA: Po zapoznaniu się badaczy z procedurami, mogą oni uzyskać powtarzalne wyniki przy użyciu szybkich procedur, pomijając te etapy (2.5, 6 i 10)</li>
</ol>
3. Ocena skuteczności dostarczania genów do nabłonka pigmentowego siatkówki
<ol start="1">
	<li>Uśmierć myszy w komorze z CO2. Wyłuskaj gałki oczne za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Utrwal gałki oczne w 4% roztworze paraformaldehydu w temperaturze 4 °C przez minimum 1 h lub do kilku dni.</li>
	<li>Chwyć rogówkę precyzyjną pęsetą i nakłuj ją mikro-nożyczkami. Usuń rogówkę, rozcinając ją wzdłuż limbusa. Usuń soczewkę za pomocą pęsety.</li>
	<li>Przytnij ciało rzęskowe mikro-nożyczkami, aby umożliwić odwarstwienie siatkówki. Delikatnie oddziel całą siatkówkę od kompleksu nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE)/naczyniówki/twardówki. Przetnij kompleks RPE/naczyniówki/twardówki promieniście od obwodu do centrum, w pobliżu nerwu wzrokowego, kilka razy, aby uzyskać od 4 do 8 płatów do montażu na płasko.</li>
	<li>Odwróć kompleks RPE/naczyniówki/twardówki stroną RPE do dołu i usuń wszystkie pozostałe tkanki po stronie twardówki, w tym mięśnie, spojówkę i nerw wzrokowy. Krok ten jest istotny dla uzyskania płaskiego kompleksu RPE/naczyniówki/twardówki, ponieważ każda pozostała tkanka powoduje nierówność preparatu.</li>
	<li>Inkubuj kompleks z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi zgodnie z celami badawczymi (opcjonalnie, szczegółowe metody znajdują się w literaturze). Zamontuj kompleksy RPE/naczyniówki/twardówki na płasko na szkiełku przedmiotowym i odsącz PBS za pomocą gąbki absorpcyjnej.</li>
	<li>Dodaj 30 µl medium montażowego i nałóż szkiełko nakrywkowe. Zaobserwuj próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu oceny skuteczności dostarczenia wektora. Przechowuj próbki w lodówce do dalszych obserwacji.</li>
</ol>

<ol><li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber%27s+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li>
<li>Jacobson, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations%3A+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).</li>
<li>Conlon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+potency+and+safety+studies+of+an+AAV2-mediated+gene+therapy+vector+for+the+treatment+of+MERTK+associated+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+gene+therapy+in+patients+with+choroideremia%3A+initial+findings+from+a+phase+1%2F2+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial.</a> Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).</li>
<li>Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+platforms+for+gene+therapy+of+inherited+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies.</a> Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).</li>
<li>Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+delivery+of+recombinant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Intraocular delivery of recombinant virus.</a> Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).</li>
<li>Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of therapeutic agents.</a> Retina. 29 (7), 875-912 (2009).</li>
<li>Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+detachment+model+in+rodents+by+subretinal+injection+of+sodium+hyaluronate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li>
<li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+transplantation+of+MACS+purified+photoreceptor+precursor+cells+into+the+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina.</a> J Vis Exp. (84), e50932(2014).</li>
<li>Sahel, J. A., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for blindness.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).</li>
<li>Allocca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adeno-associated+virus+serotypes+efficiently+transduce+murine+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors.</a> J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+transduction+of+ocular+cells+with+a+bovine+immunodeficiency+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector.</a> Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).</li>
<li>Rolling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapeutic+prospects+in+early+onset+of+severe+retinal+dystrophy%3A+restoration+of+vision+in+RPE65+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Mem+Acad+R+Med+Belg%22%5BJournal%5D)">Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).</li>
<li>Le Meur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+in+RPE65-deficient+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).</li>
<li>Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+and+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors and the retina.</a> Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).</li>
<li>Puche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+factors+associated+with+reticular+pseudodrusen+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration.</a> Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).</li>
<li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+for+neovascular+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration.</a> Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+amyloid+beta+alters+the+tight+junction+of+retinal+pigment+epithelium+in+5XFAD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice.</a> Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).</li>
<li>Shin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+cleavage+of+amyloid+beta+by+a+viral+protease+NIa+prevents+amyloid+beta-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity.</a> PLoS One. 9 (6), e98650(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule wideo szczegółowo opisaliśmy technikę iniekcji podsiatkówkowej z dostępu rąbkowego wraz z reprezentatywnymi wynikami płaskiego montażu RPE/naczyniówki/twardówki. Jest to łatwa i wygodna technika podsiatkówkowego wstrzykiwania wektorów wirusowych do RPE. Bezpośrednia wizualizacja powstawania pęcherzyków podczas iniekcji jest ważnym krokiem dla dokładnego podania dla początkujących. Istnieje kilka technik wstrzykiwań podsiatkówkowych przedstawionych w Journal of Visualized Experiments8-10. Przestr...

W okulistyce terapia genowa pojawiła się jako metoda leczenia monogenowych dziedzicznych retinopatii. Istnieją dziedziczne retinopatie związane z genami w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE), w tym wrodzona amuroza Lebera1,2, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki3 i choroideremia4. Dziedzina badawcza terapii genowej rozwija się zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych z wykorzystaniem wektorów wirusowych, takich jak wirus związany z adenowirusem (AAV), lentiwirus (LV) i adenowirus (Ad)5. Różne wektory wirusowe mają różny tropizm w siatkówce. Aby terapia genowa była bezpieczna i skuteczna, wektory wirusowe powinny być starannie dobrane zgodnie z komórkami docelowymi i genami docelowymi.
Droga dostarczania genów jest również ważna dla skutecznego dostarczania genów do komórek docelowych, dlatego powinna być również starannie wybrana. Dwie najczęstsze metody dostarczania wektorów wirusowych do wnętrza gałki ocznej to iniekcja podsiatkówkowa i iniekcja doszklistkowa6. Ta ostatnia, iniekcja doszklistkowa, jest szeroko stosowana do dostarczania leków w leczeniu neowaskularyzacji naczyniówki w mokrym zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD) i obrzęku plamki żółtej w retinopatii cukrzycowej7. Droga doszklistkowa zapewnia ekspozycję wektorów wirusowych na siatkówkę szklistą i wewnętrzną, ale dyfuzja wektorów do siatkówki zewnętrznej jest ograniczona. Z drugiej strony, droga podsiatkówkowa zapewnia bezpośrednie dostarczanie wektorów wirusowych do potencjalnej przestrzeni między siatkówką a RPE, wywołując zlokalizowany pęcherzyk. Dlatego wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest obecnie uważane za bardziej efektywną drogę celowania w komórki fotoreceptorowe i RPE. Jeśli chodzi o podejście chirurgiczne, pars plana jest wybierany jako bezpieczny obszar do iniekcji doszklistkowej, aby uniknąć uszkodzenia siatkówki u ludzi. Po prostu modyfikując to podejście do myszy, mogliśmy wstrzykiwać wektory wirusowe podsiatkówkowo lub dożylnie za pomocą dostępu rąbkowego.
W tym artykule wideo pokazujemy łatwą i wygodną metodę podsiatkówkowego wstrzykiwania wektorów wirusowych myszom RPE. Po pojedynczym nakłuciu z tyłu rąbka igłą 30 G 1/2, do przestrzeni podsiatkówkowej wprowadza się strzykawkę mikrolitrową wyposażoną w igłę o pojemności 33 G przez miejsce nakłucia rąbka. Wektory wirusowe o objętości 1,5 - 2 μl są wstrzykiwane do potencjalnej przestrzeni między siatkówką a RPE, wywołując pęcherzyki podsiatkówkowe. Zabieg ten może być wykonywany pod bezpośrednią wizualizacją przy użyciu mikroskopu operacyjnego. Powtarzana praktyka zagwarantuje powtarzalne wyniki nawet bez bezpośredniej wizualizacji powstawania pęcherzyków. Pomoże to naukowcom w przeprowadzaniu dokładnych i oszczędzających czas eksperymentów dotyczących dostarczania genów do siatkówki u myszy RPE.

<table><tbody><tr><td>PĘSETA DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0,1 x 0,06 mm KOŃCÓWKI</td><td>WPI</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>VANNAS Nożyczki S/S, 105 mm</td><td>WPI</td><td>555583S</td><td></td></tr><tr><td>33 G igła</td><td>WPI</td><td>NF33BL-2</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka NanoFil, 10 mikrolitrów&nbsp;</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>RPE-KIT</td><td>WPI</td><td>RPE-KIT</td><td>Do łatwego wstrzykiwania jedną ręką</td></tr><tr><td>30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm) BD Igła PrecisionGlideTM</td><td>BD</td><td>305107</td><td>Wstępne nakłucie do iniekcji podsiatkówkowej</td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe mikroskopu (nr 1 o średnicy 3 mm)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720&nbsp; (CS-3R)</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop operacyjny Leica</td><td></td><td>Leica LM M80</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluoresceneinowy</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>Thermo scientific</td><td>TMO. LV-Ctr</td><td>Służy do rozcieńczania wektorów</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Służy do rozcieńczania wektorów</td></tr><tr><td>Troperin (Fenylefryna 0,5% - Tropikamid 0,5%)</td><td>Hanmi</td><td></td><td>Do rozszerzania</td></tr><tr><td>Chlorowodorek proparakainy Roztwór okulistyczny USP, 0,5% (sterylny)</td><td>Bausch& Lomb</td><td></td><td>Do znieczulenia miejscowego</td></tr><tr><td>Healon GV OVD</td><td>Abbott Medical Optics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoletil 50 (hipochloryn tiletaminy i hipochlorek zolazepamu)</td><td>Virbac</td><td></td><td>Do znieczulenia ogólnego</td></tr><tr><td>Rompun do wstrzykiwań (Ksylazyna HCl)</td><td>Bayer</td><td></td><td>Do znieczulenia ogólnego</td></tr></tbody></table>

podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy nabłonek barwnikowy siatkówki

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Oko jest małym i zamkniętym organem, co czyni je idealnym celem terapii genowej. Ostatnio w terapii genowej w retinopatiach zastosowano różne strategie wykorzystujące niewirusowe i wirusowe dostarczanie genów do siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest najlepszym podejściem do dostarczania wektorów wirusowych bezpośrednio do komórek RPE. Przed rozpoczęciem badania klinicznego terapii genowej konieczne jest zweryfikowanie skuteczności terapii w modelach zwierzęcych różnych retinopatii. W ten sposób wstrzyknięcie podsiatkówkowe u myszy staje się podstawową techniką ocznej terapii genowej. W tym protokole zapewniamy łatwą i powtarzalną technikę wstrzykiwania wektorów wirusowych do siatkówki myszom eksperymentalnym. Technika ta jest modyfikowana z iniekcji doszklistkowej, która jest szeroko stosowaną techniką w klinikach okulistycznych. Reprezentatywne wyniki badania płaskiego montażu RPE/naczyniówki/twardówki pomogą zrozumieć skuteczność tej techniki oraz dostosować objętość i miano wektorów wirusowych do zakresu transdukcji genu.

Aby ocenić skuteczność wstrzyknięcia podsiatkówkowego w zakresie transdukcji genów wirusowych zgodnie z niniejszym protokołem, zastosowano komercyjnie dostępne wektory LV z promotorem CMV wykazującymi ekspresję zarówno GFP, jak i RFP w charakterze wskaźnika. Gałki oczne wyłuszczono po odpowiednim czasie, zależnie od celu badania. W celu uzyskania reprezentatywnych wyników, oczy wyłuszczono 10 i 20 tygodni po wstrzyknięciu podsiatkówkowym. Po całkowitym usunięciu siatkówki metodą opisaną powyżej, preparat płaski kompleksu...

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe to technika chirurgiczna służąca skutecznemu dostarczaniu genów do nabłonka barwnikowego siatkówki w oku myszy. Tutaj opisujemy łatwą i powtarzalną metodę subretinalnego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy eksperymentalnych.

Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest dostarczenie genu docelowego do nabłonka barwnikowego siatkówki u żywej myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie otwarcie powieki i wysunięcie gałki ocznej w celu odsłonięcia równika. Kolejnym krokiem jest wykonanie niewielkiego otworu za limbusm.Wstrzyknij wektory wirusowe do przestrzeni podsiatkówkowej za pomocą stępionej igły i zaobserwuj powstanie pęcherza podsiatkówkowego. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię immunofluorescencyjną, aby wykazać ekspresję markerów fluorescencyjnych dostarczonych przez wstrzykniętego wirusa w nabłonku pigmentowym siatkówki. Jest to efektywna i wygodna technika wstrzykiwania wektora wirusowego podsiatkówkowo do nabłonka pigmentowego.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ testy z iniekcją podsiatkówkową są trudne do przeprowadzenia dla osób początkujących. Po pierwsze, należy przygotować strzykawkę mikrolitrową z tępą igłą o rozmiarze 33 G, wysterylizowaną za pomocą tlenku etylenu.Następnie w probówce do mikrowirówki przygotować rozcieńczenie wektorów wirusowych w PBS o mianie około 1 miliona jednostek na mikrolitr. Podczas napełniania strzykawki należy kilkukrotnie przepłukać ją roztworem, aby usunąć powietrze z martwej przestrzeni strzykawki. Przygotować od 1,5 do 2 mikrolitrów wektora wirusowego do wstrzyknięcia.Przygotowaną dorosłą mysz znieczulono poprzez dostrychanialne wstrzyknięcie diazepamu i soli fizjologicznej; potwierdzono znieczulenie zwierzęcia poprzez brak odruchów. Po potwierdzeniu znieczulenia rozszerzono źrenice za pomocą kropli 0,5% fenylefryny i 0,5% idropiryny. Następnie, pod mikroskopem operacyjnym, odchylono powiekę i wysunięto gałkę oczną, aby odsłonić równik oka.Utrzymaj oko w tej pozycji, kładąc palce na zewnętrznej krawędzi obrąbka oczodołu. Następnie nanieś okulistyczny roztwór wiskoelastyczny na powierzchnię rogówki i umieść małe okrągłe szkiełko nakrywkowe nad rogówką. Dzięki temu siatkówka może być teraz oglądana nieco za limbusiem, w części dolnej w prawym oku lub w części górnej w lewym oku.Użyj sterylnej igły o rozmiarze 30 G (połowa igły), aby wykonać mały otwór w położeniu skroniowym lub nosowym. Otwory nie są dobrym rozwiązaniem, ponieważ trudno je zakryć. Podczas nakłuwania nie należy uszkodzić naczyń limbalnych ani soczewki i nie należy wprowadzać całej długości igły podczas iniekcji podsiatkówkowych.Wprowadź igłę do iniekcji wektora przez otwór pod kątem 45 stopni względem płaszczyzny tęczówki. Pchnij igłę w kierunku tylnym, ku obszarowi oko-tarczowemu, podążając wyznaczonym torem przez jamę ciała szklistego.Wprowadź igłę do przestrzeni podsiatkówkowej, aż poczujesz lekki opór, co wskazuje na dotarcie do warstwy RPE. Należy unikać przebijania tkanki twardówki nadmiernym naciskiem, ponieważ igła powinna zostać umieszczona w potencjalnej przestrzeni podsiatkówkowej. Jeśli igła przebije tkankę twardówki zbyt dużą siłą, bez oporu przedostanie się do okołogałkowej przestrzeni orbitalnej. Teraz delikatnie wstrzyknij wektor wirusowy do przestrzeni podsiatkówkowej.Należy trzymać igłę w całkowitym bezruchu, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek, co jest niezwykle istotne. Następnie należy równie delikatnie wycofać igłę. Teraz można zwolnić gałkę oczną.Powinna być widoczna pęcherzowatość podsiatkówkowa, wskazująca na akumulację wektora. Na koniec delikatnie zamknij powiekę, aby zakryć miejsce wstrzyknięcia. Otwór zamknie się samoistnie.Aby ocenić dostarczenie genu, uśmierć myszy poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla, a następnie potwierdź eutanazję. Wyjątkuj gałki oczne za pomocą nożyczek. Utrwal oczy w 4% PFA w temperaturze 4°C przez co najmniej godzinę, lecz najlepiej przez kilka dni.Chwyć i przebij rogówkę za pomocą pęsety i mikronożyczek. Następnie przetnij wzdłuż limbusa, aby usunąć rogówkę. Używając pęsety, usuń soczewkę.Następnie przytnij ciało rzęskowe. Potem odseparuj całą siatkówkę od kompleksu nabłonka pigmentowego siatkówki, naczyniówki i twardówki po usunięciu siatkówki. Przetnij kompleks promieniście od peryferii do centrum w pobliżu nerwu wzrokowego, tworząc od czterech do ośmiu kształtów przypominających płatki, aby spłaszczyć strukturę przed montażem.Następnie odwróć kompleks, kładąc stronę RPE do dołu, i odetnij wszelkie pozostałe tkanki po stronie twardówki, w tym mięśnie, spojówkę oraz nerw wzrokowy. Pozwala to na uzyskanie bardziej płaskiego preparatu kompleksu RPE-siatkówka-twardówka na szkiełku przedmiotowym. Nadmiar PBS usuń za pomocą gąbki chłonnej.Nanieś około 30 µL medium montażowego i przykryj kompleks szkiełkiem nakrywnym. Przechowuj preparat w temperaturze 4 °C, gdy nie jest on oglądany. Z zastosowaniem opisanego protokołu wstrzyknięto komercyjnie dostępne wektory LV z promotorami CMV wykazującymi ekspresję zarówno GFP, jak i RFP.Gałki oczne zostały enukleowane po 10 tygodniach, a następnie przygotowano preparaty z płaskich preparatów RPE. Intensywność sygnałów GFP i RFP różniła się pomiędzy komórkami RPE w miejscu iniekcji, a transdukcja była ograniczona do obszaru, w którym utworzył się krwiak po wstrzyknięciu. Zwiększenie powiększenia z 4x do 400x pozwoliło na ocenę patologii I z jeszcze większą rozdzielczością.Choć nie pokazano tego tutaj, transdukowane komórki wykazywały ekspresję wektora nawet 36 tygodni po iniekcji. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w pięć minut, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby igłę wprowadzić precyzyjnie i ostrożnie do przestrzeni podsiatkówkowej po jej rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie okulistyki do eksploracji terapii genowej w leczeniu wrodzonych, monogenowych chorób dziedzicznych oraz związanej z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej.

limbal-approach-subretinal-injection-viral-vectors-for-gene-therapy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejsza technika chirurgiczna przedstawia wstrzykiwanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy.

Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym

Źródło: Park, S. W., et al. Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy nabłonek barwnikowy siatkówki. J. Vis. Exp. (2015)Film opisuje metodę podsiatkówkowego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) w modelu mysim. Szczegółowo opisano w nim procedurę, od znieczulenia i przygotowania oka po precyzyjne dostarczenie wektora lentiwirusowego, zapewniając integrację i ekspresję genów w RPE.

Podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu mysim

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Zastrzyki podsiatkówkowe są najczęstszą techniką dostarczania dużych środków terapeutycznych, takich jak białka i wektory wirusowe, do fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki. Alternatywna metoda u myszy, która z powodzeniem celuje w przestrzeń podsiatkówkową z minimalnymi uszkodzeniami ubocznymi i krótkim czasem rekonwalescencji, jest opisana tutaj.

Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny

Tutaj demonstrujemy nowatorskie podejście do wykorzystania wysokiej rozdzielczości optycznej koherentnej tomografii spektralnej (HR-SD-OCT) do wspomagania dostarczania środków terapii genowej do przestrzeni podsiatkówkowej, oceny jej zasięgu powierzchniowego i charakteryzowania żywotności fotoreceptorów.

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

W tym manuskrypcie, iniekcja podspojówkowa jest demonstrowana jako prawidłowa metoda dostarczania wektora do tkanek oka u myszy za pomocą systemu iniekcyjnego składającego się z pompy strzykawkowej do infuzji/pobrania i gazoszczelnej wyjmowanej strzykawki połączonej z igłami do mikroiniekcji. Ten system iniekcji można również dostosować do innych dróg podawania wewnątrzgałkowego.

Podspojówkowe podawanie wektorów wirusa związanych z adenowirusem w małych modelach zwierzęcych

Wykonano iniekcje doszklistkowe w oku owcy w celu dostarczenia wirusowej terapii genowej do siatkówki.

Iniekcje doszklistkowe do oka owcy

Ten protokół przedstawia przezźrenicowe, sterowane widzeniem podejście przeztwardówkowe do bezpiecznego i precyzyjnego dostarczania przeszczepów komórkowych podsiatkówkowych, z niskim wskaźnikiem powikłań chirurgicznych, u myszy, biorców ze zwyrodnieniem siatkówki lub bez.

Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki

Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Iniekcje podsiatkówkowe są nieodzowną techniką w przedklinicznym rozwoju terapii chorób fotoreceptorowych i RPE. Opisujemy zoptymalizowaną technikę przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy, która poprawia wskaźniki powodzenia śródoperacyjnego i minimalizuje uszkodzenie siatkówki.

Zoptymalizowana minimalnie inwazyjna technika przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy

Poznaj technikę podsiatkówkowego wstrzyknięcia wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy. Ta metoda umożliwia skuteczną terapię genową w badaniach nad chorobami siatkówki.

Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki

Przeglądaj więcej filmów