Stymulacja nerwu błędnego jako narzędzie do indukowania plastyczności w szlakach istotnych dla uczenia się wymierania

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ułatwienie wygaszania warunkowego lęku poprzez stymulację nerwu błędnego. Jest to osiągane najpierw poprzez wykonanie elektrod służących do doprowadzania prądu do nerwu błędnego. Kolejne kroki polegają na implantacji tych elektrod wokół środkowej części szyjnej nerwu błędnego wraz z czepkiem na głowę po okresie rekonwalescencji; następnie zwierzęta przechodzą warunkowanie lękowe bodźcem słuchowym oraz trening wygaszania ze stymulacją nerwu błędnego lub stymulacją pozorowaną.

Ostatnim krokiem jest przetestowanie ekspresji uwarunkowanego strachu oraz ocena redukcji uwarunkowanej reakcji zamrożenia. W ostateczności stymulacja nerwu błędnego jest wykorzystywana do wzmocnienia uczenia się wygaszania poprzez indukowanie plastyczności w sieciach wygaszania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak systemowe leczenie farmakologiczne, jest możliwość precyzyjnej regulacji czasu trwania zabiegu w celu osiągnięcia specyficznego dla danej sieci uwalniania neuroprzekaźników, które mogą być powiązane z bieżącym zachowaniem.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu uczenia się emocjonalnego i pamięci, w szczególności w kwestii tego, jak uwalnianie hormonów stresu, takich jak epinefryna i glikokortykoidy, może wpływać na konsolidację pamięci długotrwałej. Zastosowania tej techniki obejmują terapie ekspozycyjne wykorzystywane w leczeniu zaburzeń lękowych i związanych z traumą, a także rehabilitację w przypadku uzależnień. Ponadto stymulacja nerwu błędnego może być stosowana w innych modelach uczenia się w plastyczności synaptycznej, takich jak uczenie się motoryczne po udarze mózgu lub urazowym uszkodzeniu mózgu.

W ramach przygotowań należy wykonać narzędzie wiertnicze z igły. Aby rozpocząć tworzenie mankietu, nasuń cztery centymetry rurki micro renaine na trzpień wiertła. Następnie za pomocą wiertła z igły wywierć cztery otwory w odstępach dwóch milimetrów, tworząc narożniki kwadratu. Otwory powinny być gładkie, bez poszarpanych krawędzi.

Następnie przetnij rurkę wzdłuż, pomiędzy otworami. Teraz, używając nici chirurgicznej, przygotuj system mocowań, aby przymocować mankiet do nerwu błędnego po obu stronach. Zawiąż nici razem około dwóch centymetrów od tworzywa, tak aby rurka i nici tworzyły trójkąt; pozostaw końce każdej nici o długości około ośmiu centymetrów poza węzłem.

Następnie przetnij izolowany siedmiostrzałowy drut platynowo-irydowy na odcinki o długości 70 milimetrów. Teraz, używając palnika jubilerskiego, usuń około jednego centymetra izolacji z jednego końca drutu.

Następnie użyj płomienia, aby stopić platynowy meridium w miejscu, w którym jest on odsłonięty. Stosując tę technikę, złącz siedem odsłoniętych pasm drutu z platynowego meridium w jeden mocniejszy drut, a koniec drutu stop w kulkę na przeciwległym końcu stopionego segmentu drutu. Stop drut z platynowego meridium w małą kulkę przy minimalnym usunięciu izolacji.

Teraz przyklej taśmą gwintowaną plastikową opaskę, tak aby krawędź cięcia znajdowała się w płaszczyźnie poziomej, z mocno naciągniętymi gwintami i rozprostowaną opaską. Używając pęsety, przeciągnij odsłonięty koniec przygotowanego drutu przez prawy dolny otwór i przesuń go do środka opaski. Następnie przełóż drut przez prawy górny otwór i zawiąż go pętlą z powrotem nad opaską.

Następnie przełóż drut ponownie przez prawą górną dziurkę, a następnie szarpnij go, aby go napiąć i upewnić się, że jest stabilnie zamocowany. Kluczowe jest, aby drut znajdujący się w zagłębieniu mankietu był nieizolowany, podczas gdy drut na zewnętrznym dolnym końcu mankietu pozostawał izolowany, tak aby dostarczony prąd trafiał wyłącznie do nerwu błędnego. Następnie przełóż nieizolowany koniec przez prawą dolną dziurkę od strony wnętrza mankietu.

Aby domknąć pętlę, umieść przewód po lewej stronie mankietu w dokładnie taki sam sposób, końcówkę przewodu pozostawiając wolną, bez mocowania do mankietu. Przylutuj odsłonięty koniec przewodu do złotego pinu. Pozostaw luty do ostygnięcia, a następnie ponownie je rozgrzej, aby zapewnić trwałe połączenie.

W razie potrzeby dodać więcej lutu. Teraz należy przygotować konektory dla końcówki głowicy miejsca wejścia VNS dla każdego miejsca wejścia. Zdjąć izolację z końców dwóch 30 milimetrowych odcinków miedzianego drutu 26 AWG oraz odciąć wąski koniec luźnego złotego pinu, a następnie przylutować każdą parę przewodów do pinu zgodnie z opisem.

Przyłutuj wolne końce przewodów do dwóch zębów z topnikiem w konektorze. W ten sposób powstają konektory. Po przygotowaniu zwierzęcia do operacji w ramie stereotaktycznej, użyj skalpela, aby naciąć skórę nad czaszką i odsłonić lambda oraz bregma.

Używając kleszczyków tępych, wykonaj tunel podskórnie od nacięcia w dół lewej strony przed uchem i w stronę lewej strony szyi. Tunel ten będzie służył do przeprowadzenia mankietu. Następnie, za pomocą skalpela, wykonaj dwa małe otwory startowe dla śrub kotwiczących.

Nie należy umieszczać tych otworów bezpośrednio na linii środkowej. Następnie za pomocą pęsety i śrubokręta wkręć dwie śruby kostne, pozostawiając miejsce na wypełnienie akrylem pod śrubami. Następnie wypełnij przestrzeń pod okrągłym elementem oraz pomiędzy śrubami akrylem; unikaj kontaktu akrylu z otaczającymi tkankami i nałóż dodatkowy akryl pomiędzy śrubami.

Następnie chwyć implant w taki sposób, aby zaznaczony drut znajdował się rostralnie względem drutu niezaznaczonego. Szybko umieść implant w akrylu. Należy dopilnować, aby akryl nie dostał się na złote piny, w obszar zacisku ani w miejsce wprowadzenia.

Pozostaw do wyschnięcia na pięć minut i przygotuj się do dalszej pracy pod stereomikroskopem. Wykonaj małe nacięcie nad lewą żyłą szyjną wewnętrzną, bezpośrednio pomiędzy żuchwą a obojczykiem. Poszerz nacięcie za pomocą tępej dyssekcji aż do poziomu mięśni.

Odsłoń mięsień mostkowo-kłykciowy, mostkowo-językowy oraz mięsień łopatkowo-mostkowy. Następnie kontynuuj tępe rozcinanie wzdłuż bruzd między mięśniami, aby odnaleźć tętnicę szyjną wspólną. Pochwa otaczająca tętnicę szyjną zawiera również nerw błędny.

Używając nożyczek, ostrożnie rozetnij osłonkę, aby odsłonić odcinek nerwu błędnego o długości pięciu milimetrów. Następnie, korzystając z nacięcia w okolicy głowy, użyj nici znajdujących się po stronie mankietu przeciwległej do elektrod, aby przeciągnąć mankiet przez tunel podskórny do miejsca nacięcia na szyi. Delikatnie unieś nerw za pomocą narzędzi szklanych i przesuń nici mankietu pod nerw.

Należy uważać, aby nie trzeć o nerw. Górna strona mankietu powinna być skierowana ku stronie górnej zwierzęcia. Teraz należy włożyć nerw do środka mankietu i zamknąć mankiet na nakładce głowicy.

Podłącz piny połączone z mankietem do pinów w miejscu wejściowym stymulacji, aby potwierdzić, że mankiet jest odpowiednio rozmieszczony. Wywołaj bezdech. Oddychanie testowe powinno na krótko ustać, a częstość akcji serca również powinna spaść.

Po potwierdzeniu położenia mankietu, należy przymocować piny do miejsca wprowadzenia stymulacji za pomocą akrylu. Następnie zamyka się miejsce operacyjne i podaje zwierzęciu Marcaine oraz antybiotyki miejscowe. Należy pozwolić zwierzęciu na rekonwalescencję przez pięć dni w izolacji od innych osobników.

Przed przeprowadzeniem testów należy przygotować komorę do warunkowania operacyjnego pod nadzorem kamery wideo. Pierwszego dnia treningu behawioralnego należy emitować sygnał dźwiękowy pięć razy po 30 sekund, aby wykazać brak wrodzonego lęku przed tym sygnałem. Po wstępnej prezentacji sygnału, w pierwszym i drugim dniu, należy przeprowadzić warunkowanie lękowe szczurów.

Odtwórz ton o częstotliwości 32 Hz wraz z losowo rozmieszczonym jednym sekundowym wstrząsem elektrycznym stóp o natężeniu 0,5 mA. Przez każdy dzień wykonaj osiem par ton-wstrząs, zachowując od trzech do pięciu minut przerwy między prezentacjami tonu. Trzeciego dnia sprawdź siłę powiązania między tonem a wstrząsem.

Podawaj sygnał dźwiękowy pojedynczo cztery razy, w odstępach od trzech do pięciu minut. Zarejestruj zachowanie zamierania zwierzęcia w czwartym i piątym dniu. Przeprowadź trening wygaszania z jednoczesną stymulacją nerwu błędnego lub stymulacją pozorną.

Podłącz szczura do stymulatora i umieść go w komorze warunkowania instrumentalnego. 150 milisekund. Przed każdym sygnałem dźwiękowym stymuluj nerw błędny przez 30 sekund.

Przeprowadzić cztery pary sygnałów stymulujących z przerwami od trzech do pięciu minut. Okresowo sprawdzać integralność elektryczną mankietu VNS oraz miejsca wprowadzenia za pomocą oscyloskopu, stosując opisany protokół. Szczury zostały przeszkolone w zadaniu warunkowania lękowego słuchowego ze stymulacją nerwu błędnego podczas wygaszania.

Zwierzęta, które podczas fazy wygaszania zostały poddane ograniczonej liczbie niearomatyzowanych ekspozycji na sygnał warunkowy, nie wykazały redukcji lęku uwarunkowanego. W przeciwieństwie do nich, szczury traktowane BNS wykazują znaczną redukcję zamrożenia, podobną do tej obserwowanej u zwierząt z grupy sham, które przeszły rozszerzony trening wygaszania. Zwierzęta traktowane BNS wykazały również zmniejszenie zachowania zamrożenia poza czasem prezentacji sygnału warunkowego, co sugeruje, że ich trening wygaszania uogólnił się na kontekst.

Dalsze badania wykazały, że połączenie VNS z treningiem wygaszania zmienia metaplastyczność w szlaku pomiędzy korą infralimbiczną a boczno-podstawną częścią ciała migdałowatego. U znieczulonych zwierząt w grupie pozorowanej, które nie wygasiły reakcji strachu, stymulacja seryjna kory infralimbicznej wywołała długotrwałe depresję wywołanego potencjału pola lokalnego w boczno-podstawnej części ciała migdałowatego.

Depresja synaptyczna ta została odwrócona u zwierząt, u których wystąpiło znaczące wygaszenie reakcji lękowej uwarunkowanej. Co więcej, zastosowanie VNS podczas pojedynczej sesji wygaszania sprzyjało indukcji długotrwałego wzmocnienia synaptycznego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat stosowania VNS w połączeniu z treningiem behawioralnym.

Po opanowaniu techniki, wykonanie komponentów VNS oraz operacja mogą zająć około trzech godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podczas wykonywania tego zabiegu należy pamiętać o zachowaniu ciągłości połączeń elektrycznych.