Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) za pomocą cytometrii przepływowej
29 stycznia 2016
Populacje mikroorganizmów zawierają znaczną heterogeniczność komórek, która może dyktować ogólne zachowanie. Analiza sondy molekularnej za pomocą cytometrii przepływowej może określić stany fizjologiczne komórek, jednak jej zastosowanie różni się w zależności od gatunku. Badanie to zapewnia protokół do dokładnego określenia śmiertelności komórek w populacji cyjanobakterii, bez niedoceniania lub rejestrowania wyników fałszywie dodatnich.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu opracowania protokołu umożliwiającego efektywną analizę stanu fizjologicznego cyjanobakterii przy użyciu cytometrii przepływowej i sond molekularnych. Protokół ten może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące fizjologii komórkowej społeczności drobnoustrojów. Główną zaletą tej procedury jest to, że zoptymalizowany protokół z użyciem sond fluorescencyjnych pozwala w czasie rzeczywistym rozróżnić stany fizjologiczne cyjanobakterii na poziomie pojedynczych komórek.
Procedurę tę zademonstruje David Hartnell, doktorant pracujący w laboratorium cytometrii na Uniwersytecie w Bournemouth. Przed rozpoczęciem eksperymentu umieść pustą probówkę do hemolizy pod sondą wtryskową próbek. Kliknij unclog.
Następnie wykonaj płukanie wsteczne, aby rozpocząć proces czyszczenia cytometru przepływowego. Po zakończeniu płukania wstecznego nałóż na sondę wtryskową próbek (SIP) nową probówkę do hemolizy zawierającą 2 mL ultra czystej filtrowanej wody, ustaw limit czasu na 10 do 15 minut, a prędkość przepływu na szybką (fast). Następnie wybierz nową komórkę danych i ustaw odpowiednie progi fluorescencji oraz rozproszenia światła, aby zredukować szum tła.
Następnie kliknij run. Jeśli całkowita liczba zdarzeń na sekundę nie jest niższa od zalecenia producenta, przepuść 2 mL roztworu dekontaminacyjnego przez dwie minuty w trybie fast. Powtórz kroki płukania wstecznego i płukania wodą ultraczystą.
Aby przygotować pierwotną monokulturę M.aeruginosa, wysterylizować w autoklawie 98 mililitrów filtrowanej wody ultrapurej zmieszanej z dwoma mililitrami pożywki dla glonów, w zlewce o pojemności 250 mililitrów przez 20 minut w temperaturze 120 °C. Gdy kultura osiągnie wysoką stacjonarną gęstość, rozbić aglomeraty dwóch mililitrów komórek poprzez wstrząsanie na vortexie. Następnie przenieść komórki pod sondę wtryskową do próbek.
Potwierdzić pod mikroskopem świetlnym, czy komórki są równomiernie rozproszone. Następnie wybrać w oprogramowaniu cytometru przepływowego wykres histogramu, aby zarejestrować dane dotyczące rozproszenia światła w przód (forward scatter). Kliknąć przycisk log, aby wyświetlić dane w skali logarytmicznej na osi x.
W osobnym oknie wyjściowym ustaw kolejny histogram z osią logarytmiczną, aby zarejestrować naturalną fluorescencję komórek M.aeruginosa. Następnie wybierz źródło światła zdolne do wzbudzenia fikocyjaniny oraz detektor, który może filtrować emisje wynikające z powstałej fluorescencji. Aby uzyskać najwyższą rozdzielczość pomiaru, wybierz ustawienia najbliższe rozmiarowi rdzenia organizmu docelowego.
Następnie ustaw stosunkowo wolną prędkość przepływu. Przed rozpoczęciem akwizycji danych ustaw próg odcięcia (gate), aby wyeliminować sygnały rozproszenia światła i fluorescencji spowodowane elektronicznym szumem tła lub zanieczyszczeniami w próbce komórkowej. Następnie wybierz nową komórkę danych.
Utwórz wykres gęstości z parametrami forward scatter i side scatter w skali logarytmicznej, a następnie kliknij run. Teraz zastosuj bramkę forward light scatter i natural fluorescence do danych forward scatter względem side scatter, aby wykluczyć sygnały rozproszenia o niskim poziomie i uwzględnić jedynie sygnały fikocyjaniny o wyższej fluorescencji względnej. Następnie zbieraj zdarzenia do czasu zakończenia analizy próbki i wykorzystaj uzyskane dane do wyznaczenia początkowej liczby komórek.
Aby zoptymalizować pobieranie sondy molekularnej przez komórki, połowę wcześniej przygotowanej monokultury należy poddać odpowiednim warunkom w celu wytworzenia kontroli negatywnej (martwej). Należy sprawdzić zmiany w mikrośrodowisku próbki, aby potwierdzić obumarcie hodowli, a następnie rozbić kolonie w sposób przedstawiony powyżej.
Następnie należy wybrać laser o długości fali 488 nm wraz z detektorem zdolnym do rejestracji fluorescencji z zielonych i pomarańczowych sond kwasów nukleinowych oraz laser o długości fali 640 nm do rejestracji sygnałów fikocyjaniny poprzez odpowiednie detektory. W nowym arkuszu danych należy ustawić wykres gęstości z parametrami rozproszenia przedniego i bocznego.
Następnie utwórz jeden histogram, korzystając z odpowiedniego kanału detektora optycznego sondy molekularnej. Jeden histogram do wykrywania emisji fikocyjaniny oraz jeden histogram dla zdarzeń rozproszenia przedniego, wszystkie w skali logarytmicznej. Przebadaj próbki cyjanobakterii, stosując różne stężenia i czasy inkubacji.
Utwórz bramkę na histogramie rozproszenia przedniego (forward scatter), aby uwzględnić zdarzenia odpowiadające wyłącznie wielkości komórek organizmu docelowego, a następnie zastosuj ją do odpowiedniego kanału sondy fluorescencyjnej. Następnie, w kanale sondy fluorescencyjnej, utwórz kolejną inkluzywną bramkę programową obejmującą najwyższy piki na histogramie.
Następnie należy nanieść odpowiadającą im fluorescencję dodatniej sondy na wykres gęstości. Porównaj liczbę sygnałów fluorescencyjnych z liczbą martwych komórek kontrolnych, aby wyznaczyć najwyższy procent pobrania sondy kwasów nukleinowych przez komórki, który nie powoduje barwienia niespecyficznego. W celu przetestowania nakładania się interferencji fluorescencji wynikającej z wewnętrznego lub niespecyficznego barwienia komórek, wybierz dane z mieszanej hodowli składającej się w 50% z komórek żywych i w 50% z komórek martwych.
Następnie usuń bramki fluorescencyjne. Zastosuj bramki tak, aby w histogramie kanału fikocyjaniny uwzględnić jedynie histogram rozproszonego światła przedniego (forward scatter) odpowiadający wielkości komórek organizmu docelowego. Wyznacz bramki dla najwyższych i najniższych pików fikocyjaniny, odpowiednio z etykietami „żywe” i „martwe”.
Następnie oddzielnie zastosuj bramkowanie dla sygnałów żywej i martwej fikocyjaniny. Zapisz obie średnie długości fal. Aby określić czułość protokołu, oblicz stosunek średnich długości fal fluorescencji dodatniej martwej sondy molekularnej do wewnętrznego niespecyficznego sygnału żywych komórek.
Na koniec wybierz zoptymalizowany protokół, w którym zabarwiono największą liczbę martwych komórek, bez wystąpienia barwienia niespecyficznego. Na tych wykresach przedstawiono reprezentatywne wyniki rozproszenia światła w przód (forward scatter) i w boku (side scatter), odpowiadające wielkości komórek oraz ich złożoności wewnętrznej dla hodowli seryjnej M.aeruginosa w fazie wykładniczej. Gating można przeprowadzić poprzez doprecyzowanie danych pomiędzy określonymi punktami wyniku rozproszenia światła w przód.
Fikocyjanina generuje silny sygnał po wzbudzeniu czerwonym źródłem światła, co może posłużyć do dalszego bramowania populacji badanych. Na podstawie sygnałów rozproszonego światła w przód (FSC) oraz sygnałów fluorescencyjnych można następnie wyodrębnić z pierwotnego wyniku dane specyficzne dla próbki M.aeruginosa w celu końcowego przeliczenia komórek. Po zmieszaniu żywych kontroli o wysokim stopniu pigmentacji oraz martwych kontroli o niskim stopniu pigmentacji staje się widoczny spadek przesunięcia autofluorescencji.
W komórkach z uszkodzoną błoną sondy kwasów nukleinowych generują dodatkowy sygnał, który można zaobserwować za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie potwierdzić w mikroskopii epifluorescencyjnej. Dyskryminacja fluorescencyjna między komórkami żywymi a martwymi wzrasta wraz z czasem w zakresie stężeń od 0,05 do 0,5 µM, natomiast spada w zakresie stężeń od 1 do 100 µM dla obu sond. Rzeczywiście, optymalne stężenie dla zielonej sondy kwasów nukleinowych wydaje się wynosić 0,5 µM przy czasie inkubacji 30 minut.
W przypadku pomarańczowej sondy kwasu nukwinowego optymalne stężenie wynosi 1 µM przy 10-minutowej inkubacji. Po opanowaniu tej metody optymalizacja każdej sondy molekularnej może zostać przeprowadzona w ciągu jednego dnia, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu sond w stabilnym środowisku, w odpowiedniej temperaturze, pH i warunkach oświetleniowych.
Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom z zakresu mikrobiologii do zgłębiania heterogeniczności wspólnot fitoplanktonu. Po obejrzeniu filmu powinni Państwo mieć teraz dobre wyobrażenie o tym, jak opracować optymalny protokół oceny fizjologii komórkowej z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i sond molekularnych. Należy pamiętać, że praca z sondami molekularnymi i organizmami toksycznymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odpowiednich środków ochrony indywidualnej (P.P.E.) oraz pełne zapoznanie się z materiałami COSHH.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół analizy stanów fizjologicznych cyjanobakterii z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i sond molekularnych. Metoda ta ma na celu dokładne określenie śmiertelności komórek w populacjach mikroorganizmów, rozwiązując problemy związane z heterogenicznością komórkową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia komórki
- Cytometria przepływowa
Wstęp
- Populacje mikrobów wykazują znaczną heterogeniczność komórkową.
- Cytometria przepływowa pozwala ocenić stany fizjologiczne, jednak jej skuteczność różni się w zależności od gatunku.
- Dokładny pomiar śmiertelności komórek jest kluczowy dla zrozumienia społeczności mikrobiologicznych.
- Zoptymalizowane sondy fluorescencyjne mogą usprawnić analizę na poziomie pojedynczej komórki.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu oceny fizjologii cyjanobakterii.
- Poprawa dokładności oznaczania śmiertelności komórek.
- Umożliwienie analizy stanów fizjologicznych cyjanobakterii w czasie rzeczywistym.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa w analizie komórek.
- Sondy molekularne do rozróżniania stanów fizjologicznych.
- Optymalizacja protokołu dla uzyskania dokładnych wyników.
- Prezentacja przeprowadzona przez doktoranta w laboratorium cytometrii.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie różnicuje stany fizjologiczne sinic.
- Osiągnięto dokładne oznaczenie śmiertelności komórek.
- Analiza w czasie rzeczywistym dostarczyła informacji na temat zachowania drobnoustrojów.
- Wyniki wspierają zrozumienie populacji sinic.
Wnioski
- Opracowany protokół usprawnia analizę fizjologii cyjanobakterii.
- Rozwiązuje on wcześniejsze ograniczenia w pomiarze śmiertelności komórek.
- Metoda ta może zostać zastosowana w różnych badaniach mikrobiologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna ocena żywotności komórkowej w systemach mikrobiologicznych wspiera wczesny etap walidacji celu, umożliwiając wiarygodny screening fenotypowy oraz redukcję ryzyka mechanistycznego. Cytometria przepływowa z wykorzystaniem zoptymalizowanych sond molekularnych dostarcza ilościowych danych w rozdzielczości pojedynczych komórek, co zwiększa pewność prognostyczną w kampaniach identyfikacji związków wiodących. Podejście to rozwiązuje problemy związane z heterogenicznością w biologii odkryć, ułatwiając podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o dane oraz zmniejszając ryzyko biologiczne na późnych etapach rozwoju przeciwbakteryjnych lub przeciwinfekcyjnych linii produktów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez odróżnianie komórek żywotnych od nieżywotnych w populacjach drobnoustrojów.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację punktów uchwytu poprzez ocenę integralności błony z wykorzystaniem sond SYTOX Green i SYTOX Orange.
- Wartość prognostyczna: Zoptymalizowane stężenia sond (0,5 µM dla zielonej, 1,0 µM dla pomarańczowej) minimalizują liczbę wyników fałszywie ujemnych oraz nieswoiste barwienie, zwiększając wiarygodność analizy.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość analizy: Generuje zestandaryzowane, powtarzalne odczyty fluorescencji do wysokoprzepustowego przesiewu związków w badaniach nad nowymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi.
- Wynik ilościowy: Umożliwia precyzyjny pomiar poboru sondy jako zmiennej zależnej w modelowaniu zależności dawka-odpowiedź.
- Skalowalność: Optymalizacja protokołu dla Microcystis aeruginosa zapewnia przenaszalny model dla innych systemów sinicowych lub mikrobiologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Wspiera modelowanie przedkliniczne skuteczności przeciwdrobnoustrojowej poprzez ilościowe określanie śmiertelności wywołanej związkiem w patogenach docelowych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy badania żywotności w fazie odkrycia z walidacją przedkliniczną dzięki spójnym punktom końcowym opartym na cytometrii przepływowej.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w optymalizacji wiodących związków poprzez dostarczanie w czasie rzeczywistym fizjologicznych danych na poziomie pojedynczych komórek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, dostarczając wglądu w mechanizmy, który pomaga w podejmowaniu decyzji dotyczących dalszego rozwoju związków.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez korelację traktowania związkami ze zmianami żywotności komórkowej.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzację i powtarzalność analizy dzięki zoptymalizowanym parametrom inkubacji i stężenia sond.
- Analityka: Pozwala na uzyskanie ilościowych pomiarów fluorescencji, umożliwiając statystyczne porównanie warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów poprzez powiązanie odczytów integralności błon z mechanizmem działania związku.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę cytometryczną, którą można zastosować w odniesieniu do różnych celów mikrobiologicznych w programach przeciwzakaźnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję fałszywych odczytów żywotności dzięki optymalizacji sondy.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację pomiędzy laboratoriami poprzez zdefiniowanie stężeń sond oraz czasów inkubacji.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w przypadku związków wykazujących brak aktywności specyficznej dla celu.
- Wpływ na portfolio: Pozwala na priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację związków o rzeczywistym działaniu przeciwdrobnoustrojowym w odróżnieniu od artefaktów analizy.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze cytometrii przepływowej oraz kompensacji fluorescencji w detekcji wieloparametrycznej.
- Zależne od dostępu do cytometrów przepływowych kompatybilnych z laserem 488 nm oraz odpowiednich kanałów detekcji dla barwników SYTOX.
- Wymaga standaryzacji protokołów między zespołami w celu zapewnienia spójnego obchodzenia się z sondami, ich przechowywania i aplikacji.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody podczas przenoszenia jej na modele bakterii Gram-dodatnich lub Gram-ujemnych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak toksyczność sond oraz potrzeba zachowania zasad bezpieczeństwa biologicznego podczas pracy z toksycznymi organizmami, takimi jak Microcystis aeruginosa.
