Name: Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę oznaczania śmiertelności komórek sinic Microcystis aeruginosa za pomocą cytometrii przepływowej i sond molekularnych. Protokół umożliwia analizę fizjologicznych stanów komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować doktorantowi Dave'owi Hartnellowi oraz Uniwersytetowi w Bournemouth za wsparcie i finansowanie badań i obiektów.

1. Przygotowanie sondy molekularnej i cytometru przepływowego
<ol>
	<li>Rozcieńczone roztwory podstawowe sond kwasów nukleinowych, które są dostarczane w postaci 5 mM roztworu dimetylosulfotlenku (DMSO) do podwielokrotności wymaganych stężeń w ultraczystym przefiltrowanymH2O.</li>
	<li>Przechowuj sondy kwasów nukleinowych w ciemnych warunkach w temperaturze od -5 oC do -25 oC do czasu użycia.</li>
	<li>Włącz cytometr przepływowy i załaduj pakiet oprogramowania (patrz tabela materiałów/sprzętu, aby zapoznać się ze specyfikacjami FCM).</li>
	<li>Umieść pustą probówkę do hemolizy (12 x 75 mm) na sondzie iniekcyjnej próbki (SIP), kliknij przycisk odblokuj, a następnie przepłucz z powrotem, aby rozpocząć proces czyszczenia FCM. 
	UWAGA: Niektóre stopnie próbek dla SIP mogą pomieścić kilka typów probówek, w tym probówki do mikrowirówek. Rozcieńczalnik sondy molekularnej i płyn osłonowy stosowane w aparacie FCM pochodzą z analitycznego źródła filtrowanego membranowo 0,22 μm "typu 1".</li>
	<li>Umieścić świeżą probówkę do hemolizy z 2 ml ultraczystego przefiltrowanegoH2Ona SIP, ustawić limit czasu na 10 - 15 minut i prędkość przepływu na szybką (lub natężenie przepływu >66 μl/min).</li>
	<li>Wybierz nową komórkę danych, ustaw odpowiednie progi dla kanałów fluorescencji i rozpraszania światła, aby zredukować szumy tła i kliknij "uruchom".</li>
	<li>Jeśli łączna liczba zdarzeń na sekundę nie jest niższa niż zalecana przez producenta, należy szybko uruchomić 2 ml próbki roztworu do odkażania przez 2 minuty, a następnie powtórzyć kroki 1.4 i 1.5. 
	UWAGA: Należy zapoznać się z zaleceniami producentów dotyczącymi protokołów czyszczenia FCM podczas rozruchu, ponieważ mogą się one różnić w zależności od modelu. Testowanie określonych progów również musi być zgodne z modelem FCM, ponieważ niektóre urządzenia pozwalają użytkownikowi na zastosowanie wzmocnień napięcia do lamp fotopowielacza (PMT), zwiększając lub zmniejszając sygnał elektryczny rejestrowany z detektorów optycznych. Model FCM użyty w tym eksperymencie ma stałe napięcie PMT i wykorzystuje próg Rozproszenie światła do przodu 80 000 (FSC-H) w celu wykluczenia cząstek mniejszych niż 2,0 μm i szumu elektronicznego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kultur i wstępne liczenie komórek
<ol>
	<li>Autoklaw 98 ml ultraczystego przefiltrowanegoH2Oi 2 ml pożywki z glonów (stężenie x50) w zlewce o pojemności 250 ml przez 20 minut w temperaturze 120 oC.</li>
	<li>Z początkowej monokultury M.aeruginosa (PCC 7806) w stanie wysokiej gęstości w stanie ustalonym umieścić 2 ml próbki w probówce pod SIP. Zdezagreguj wszelkie formacje kolonii za pomocą wirowania lub sonikacji20 i potwierdź równomiernie rozproszone komórki za pomocą mikroskopii świetlnej. 
	UWAGA: Nadmierna ekspozycja na fale ultradźwiękowe może prowadzić do lizy komórek i powinna być stosowana z ostrożnością. Ponieważ sonikacja może zapaść pęcherzyki gazowe (jak u gatunków takich jak M.aeruginosa), dane wyjściowe, takie jak intensywność bocznego rozpraszania światła (SSC-H), mogą stać się bardziej wrażliwe.</li>
	<li>W oprogramowaniu FCM wybierz wykres histogramu, aby zarejestrować dane z rozpraszania światła do przodu (FSC-H) i skonfiguruj specyfikacje wykresu, klikając "log", aby wyświetlić w skali logarytmicznej na osi.</li>
	<li>W osobnym wyjściu wybierz inny histogram (oś logarytmiczna), aby zarejestrować naturalną fluorescencję, taką jak dodatkowy pigment fotosyntetyczny fikocyjanina (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), znajdujący się w M.aeruginosa.</li>
	<li>Użyj źródła światła, które może wzbudzić fikocyjaninę i detektora, który może filtrować emisje z powstałej fluorescencji. 
	UWAGA: Pigment fotosyntetyczny, taki jak chlorofil, może być wzbudzany za pomocą powszechnie stosowanego niebieskiego lasera 488 nm, podczas gdy fikocyjanina jest wzbudzana ponad 600 nm i zostanie wykryta tylko przy czerwonym źródle światła21. Skontaktuj się z producentem cytometrów przepływowych w celu uzyskania źródeł światła wzbudzenia i widm detektorów emisji, tutaj zastosowano zarówno laser 488 nm, jak i 640 nm wraz z laserem optycznym 675 ± 12,5 nm filtr.</li>
	<li>W celu nagrania o najwyższej rozdzielczości należy wybrać ustawienia najbardziej zbliżone do wielkości rdzenia organizmu docelowego (10 μm) i stosunkowo wolnego przepływu (14 μl/min). 
	UWAGA: Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość, próbki należy uruchamiać zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi zdarzeń na sekundę.</li>
	<li>Przed uzyskaniem danych należy użyć progu, aby wyeliminować sygnały rozpraszania światła i / lub fluorescencji, które są spowodowane elektronicznym szumem tła lub resztkami próbki komórki.</li>
	<li>Wybierz nową komórkę danych, utwórz wykres gęstości z parametrami FSC-H i SSC-H na skali logarytmicznej i kliknij przycisk Uruchom.</li>
	<li>Jeśli gęstość próbki prowadzi do nadmiernej częstości zdarzeń, można podjąć kroki rozcieńczania w celu zwiększenia dokładności i precyzji.</li>
	<li>Na wykresie gęstości zastosuj bramki programowe z poprzedniego histogramu, aby wykluczyć sygnały rozproszone niskiego poziomu, wytwarzane przez szum tła lub zanieczyszczenia (FSC <320 000). I odwrotnie, bramkują sygnały fikocyjaniny o wyższej względnej fluorescencji z komórek i obejmują tylko te zdarzenia (FL4, 56 000 - 1 950 000).</li>
	<li>Użyj liczby komórek zarejestrowanych w obszarach bramkowanych i podziel ją przez całkowitą objętość próbki, która przeszła przez FCM, aby obliczyć, ile komórek na ml. 
	UWAGA: Zastosowany tutaj model FCM jest wyposażony w sterowany mikroprocesorem system pomp perystaltycznych umożliwiający określenie objętości próbki. Inne urządzenia FCM mogą wymagać skalibrowanego zawieszenia stopki lub obliczenia różnic masy/objętościH2Ow celu sprawdzenia całkowitej objętości próbki.</li>
	<li>Dodać wymaganą objętość komórek do świeżo przygotowanej pożywki, aby rozpocząć cykl wzrostu partii (250 000 komórek/ml) M.aeruginosa. 
	UWAGA: Gatunki będą różnić się tempem wzrostu w zależności od parametrów środowiska in situ i dostępności składników odżywczych, dlatego cykl partii powinien być wcześniej zarejestrowany w celu określenia faz cyklu życia.</li>
</ol>
3. Optymalizacja wychwytu komórek sondy molekularnej
<ol>
	<li>Zbierz połowę kultury M.aeruginosa przygotowanej w kroku 2 z fazy wykładniczej i użyj jako "żywej" kontroli. 
	UWAGA: Próbki rozcieńczone z hodowli o wysokiej gęstości bezpośrednio do fazy wykładniczej mogą wpływać na wyniki optymalizacji poprzez obrót martwych komórek, w porównaniu z kulturami zaszczepionymi z początkowej fazy opóźnienia / indukcji.</li>
	<li>Przygotuj drugą połowę jako "martwą" kontrolę, stosując metody takie jak 70% etanol, podgrzewanie próbek w temperaturze 60 oC przez 1 godzinę, paraformaldehyd lub 4% formaldehyd przez 30 minut6,11,22. Sprawdź zmiany w mikrośrodowisku próbek (np. pH). 
	UWAGA: Dodatnia, zabita termicznie, "martwa" kontrola w M.aeruginosa różni się od "żywej" próbki poprzez spadek sygnałów fikocyjaniny. Indukowanie śmiertelności innymi metodami może nie powodować takiej samej wydajności i będzie się różnić w zależności od gatunku.</li>
	<li>Skonfiguruj próbki mieszane, używając różnych proporcji próbek "żywych" i "martwych" (np. 0%, 25%, 50%, 100%).</li>
	<li>Zdezagreguj tworzenie kolonii przez wirowanie lub sonikację i sprawdź pH.</li>
	<li>Wybierz laser 488 nm wraz z detektorami, które mogą rejestrować fluorescencję z zielonych (FL1, 530 ± 15 nm) i pomarańczowych (FL2, 585 ± 20 nm) sond kwasów nukleinowych oraz laser 640 nm, aby rejestrować sygnały fikocyjaniny przez odpowiedni detektor. 
	UWAGA: Po związaniu z DNA, zielona sonda kwasu nukleinowego ma przybliżoną długość fali wzbudzenia fluorescencji 504 nm i maksima emisji 523 nm, podczas gdy pomarańczowa sonda kwasu nukleinowego ma długość fali wzbudzenia 547 nm i maksima emisji 570 nm. Laser półprzewodnikowy z jonami argonu o długości 488 nm może być użyty do wzbudzenia obu sond molekularnych, Jednak zielony laser (do 547 nm) będzie wytwarzał wyższą pomarańczową fluorescencję.</li>
	<li>Jako punkt wyjścia wprowadź sondę molekularną o stężeniu zalecanym przez producentów do 50% "żywych" i 50% "martwych" kultur i inkubuj w ciemności.</li>
	<li>Wybierz nową komórkę danych, umieść próbkę pod SIP z progami i wyzwalaczami, które zredukują szum tła (FSC-H 80 000).</li>
	<li>Utwórz wykres gęstości z parametrami FSC-H i SSC-H oraz trzema histogramami. Jeden histogram wykorzystujący odpowiedni kanał detektora optycznego sondy molekularnej (FL1 lub 2), jeden do wykrywania emisji fikocyjaniny (FL4-H), a drugi FSC-H, wszystkie w skali logarytmicznej.</li>
	<li>Próbki M.aeruginosa należy inkubować z sondami kwasów nukleinowych w ciemności przez okres do 60 minut, rejestrując w oddzielnych komórkach danych, w kilku punktach czasowych (1, 5, 10, 15, 30 i 60 minut). 
	UWAGA: Podczas dostosowywania parametrów, takich jak pH, sprawdź z producentami potencjalne reakcje z niektórymi chemikaliami (w przypadku badanych sond kwasów nukleinowych bufor nie może zawierać fosforanów ani wysokich poziomów kationów jednowartościowych lub dwuwartościowych, ponieważ wiązanie z DNA zostanie zmniejszone).</li>
	<li>Zastosuj bramkę programową, aby uwzględnić tylko histogram FSC-H (320 000 - 1 500 000) dla wielkości komórek organizmu docelowego, do odpowiedniego histogramu kanału sondy fluorescencyjnej. 
	UWAGA: Stężenia użyte w tym protokole wynosiły 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 i 100 μM, które można zmienić poprzez zwiększenie lub zmniejszenie objętości próbki M.aeruginosa lub początkowego roztworu podstawowego sond nukleinowych.</li>
	<li>W kanale sondy fluorescencyjnej zastosuj kolejną włączoną bramkę programową do najwyższego piku na histogramie (zielony FL1-H, 240 000 - 1 650 000, pomarańczowy FL2-H, 30 000 - 165 000), a następnie zabramuj tę dodatnią fluorescencję sondy na wykresie gęstości.</li>
	<li>Uruchom kroki 3.1 - 3.11 ze 100% "żywymi", 100% "martwymi" i wszystkimi mieszanymi próbkami hodowli, dostosowując stężenia sondy molekularnej (np. x 0,1 do x 10) i/lub temperaturę i poziomy pH, jeśli to konieczne.</li>
	<li>Porównaj liczbę dodatnich sygnałów fluorescencyjnych sondy molekularnej z pierwotną gęstością komórek "martwych" komórek (pobranych z połowy całkowitego FSC-H lub 100% "martwej" hodowli), aby znaleźć całkowity procent komórek wybarwionych sondami kwasów nukleinowych.</li>
	<li>Zrób to dla każdego okresu w każdym stężeniu, aby znaleźć optymalny protokół dla najwyższego procentu wychwytu sondy jądrowej komórki bez wytwarzania niespecyficznego barwienia (użyj średnich w jednoczynnikowej analizie wariancji ANOVA lub Kruskala-Wallisa, jeśli dane są nieparametryczne).</li>
</ol>
4. Dyskryminacja fluorescencji sondy molekularnej
<ol>
	<li>Do testowania interferencji / nakładania się fluorescencji z wewnętrznego lub niespecyficznego barwienia komórek, należy wybrać 50% "żywych" i 50% "martwych" danych z kultur mieszanych i zdjąć wszystkie bramki.</li>
	<li>Zastosuj bramkę programową, aby uwzględnić w histogramie kanału fikocyjaniny tylko histogram FSC-H (320 000 - 1 500 000) dla wielkości komórek organizmu docelowego.</li>
	<li>Bramkować najwyższy pik fikocyjaniny i oznaczać jako "żywy", z dodaniem najniższego piku oznaczonego jako "martwy".</li>
	<li>Wykonaj kolejny krok bramki do odpowiedniego kanału histogramu fluorescencji sondy molekularnej, używając pojedynczo sygnałów "żywych", a następnie "martwych" sygnałów fikocyjaniny (FL4), rejestrując obie średnie długości fal. 
	UWAGA: Sposób indukowania śmiertelności w tym eksperymencie został wykonany przez obróbkę cieplną, która zgodnie z tym protokołem wyraźnie zmniejsza sygnały fikocyjaniny. Inne metody wytwarzania populacji "martwych" komórek mogą dawać różne wyniki w nabytych seriach.</li>
	<li>Stosunek średnich długości fal dodatniej fluorescencji sondy molekularnej ("martwej") do sygnału wewnętrznego/niespecyficznego ("na żywo") w celu określenia czułości protokołu. 
	UWAGA: Aby poprawić dyskryminację fluorescencyjną "żywych" i "martwych" populacji, należy zwiększyć źródło węgla do aktywnego wychwytywania barwnika w komórkach zubożonych w składniki odżywcze lub kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w celu poprawy przepuszczalności ściany komórkowej i wynikających sygnałów fluorescencyjnych6. Ograniczona kompensacja nakładania się widma w niektórych modelach FCM może być wykonywana przez manipulowaną przez użytkownika korekcję parami podczas pobierania próbki (zmiany napięcia PMT) lub z specjalistycznego oprogramowania poanalitycznego.</li>
	<li>Wybierz zoptymalizowany protokół, w którym największa ilość "martwych" komórek została wybarwiona bez występowania barwienia niespecyficznego. Jeśli wiele testów ma podobne wyniki, zaakceptuj protokół o najniższym stężeniu i czasie inkubacji, wraz z dobrą dyskryminacją sygnału fluorescencji. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi procedury wyłączania cytometru.</li>
</ol>

<ol><li>Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+Activity+in+Readily+Culturable+Bacteria%3A+A+Review+and+Discussion+of+the+Practical+Issues%5BTitle%5D)+AND+%22Anton.+Leeuw.+Int.+J.+G%22%5BJournal%5D)">Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues.</a> Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).</li>
<li>Adams, D. G., Duggan, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tansley+Review+No.+107.+Heterocyst+and+Akinete+Differentiation+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria.</a> New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).</li>
<li>Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Physiological+Heterogeneity+in+Microbial+Population+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior.</a> Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).</li>
<li>Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Nutrient-Replete+Microcystis.+PCC+7806+Cultures+is+Inhibited+by+an+Extracellular+Signal+Produced+by+Chlorotic+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures.</a> Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).</li>
<li>Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+Microbial+Viability+Using+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).</li>
<li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life%2C+Death%2C+and+In-Between%3A+Meanings+and+Methods+in+Microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microb%22%5BJournal%5D)">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li>
<li>Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+Flow+Cytometry%22">Practical Flow Cytometry</a>. , 273-410 (2003).</li>
<li>Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-Cytometric+Total+Bacterial+Cell+Counts+as+a+Descriptive+Microbiological+Parameter+for+Drinking+Water+Treatment+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes.</a> Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past%2C+Present+and+Future+Applications+of+Flow+Cytometry+in+Aquatic+Microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology.</a> Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).</li>
<li>Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Flow+Cytometry+of+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria.</a> Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).</li>
<li>Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Applicability+of+Fluorescent+Vitality+Probes+on+Phytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton.</a> J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).</li>
<li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Viability+and+Antibiotic+Susceptibility+Testing+with+SYTOX+Green+Nucleic+Acid+Stain%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).</li>
<li>Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Senescence+and+Death+in+Emiliania+huxleyi.+and+Thalassiosira+pseudonana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Staining%2C+Chlorophyll+Alterations%2C+and+Dimethylsulfoniopropionate+%28DMSP%29+Metabolism.+Limnol.+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana.</a> Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).</li>
<li>Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+SYTOX+Green+Stain+for+Bacterial+Viability+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).</li>
<li>Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Activity+and+Membrane+Integrity+Changes+in+Microcystis+aeruginosa.-+New+Findings+on+Hydrogen+Peroxide+Toxicity+in+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria.</a> Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).</li>
<li>Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Experimentally+Generated+Turbulence+on+the+Mash01+Unicellular+Microcystis+aeruginosa+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain.</a> Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).</li>
<li>Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Microcystin+production+in+the+Cell+Cycle+of+Microcystis+viridis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+toxicol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis.</a> Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).</li>
<li>Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Control+of+HAB+Species+using+Low+Biosurfactant+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+Algae%22%5BJournal%5D)">On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations.</a> Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).</li>
<li>Bouchard, J. N., Purdie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Elevated+Temperature%2C+Darkness%2C+and+Hydrogen+Peroxide+Treatment+on+Oxidative+Stress+and+Cell+Death+in+the+Bloom-Forming+Toxic+Cyanobacterium+Microcystis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis.</a> J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).</li>
<li>Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+Natural+Microcystis+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Phycol.+J%22%5BJournal%5D)">Enumeration of Natural Microcystis Populations.</a> Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).</li>
<li>Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarie%2C+D+%22Algal+culturing+techniques%22">Algal culturing techniques</a>. Andersen, R. A. , Academic press. 253-268 (2005).</li>
<li>Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+method+for+the+assessment+of+the+minimal+inhibitory+concentrations+of+antibacterial+agents+to+Mycoplasma+agalactiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae.</a> Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).</li>
<li>Davey, H. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting+of+Heterogeneous+Microbial+Populations%3A+The+Importance+of+Single-Cell+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+rev%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses.</a> Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).</li>
<li>Franklin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explaining+the+Causes+of+Cell+Death+in+Cyanobacteria%3A+What+Role+for+Asymmetric+Division%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plankton+Res%22%5BJournal%5D)">Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division?</a> J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).</li>
<li>Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+Physiological+Heterogeneity+within+Starved+Cultures+of+Micrococcus+luteus.+by+Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).</li>
<li>Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaggoner%2C+A+%22Flow+cytometry+and+sorting%22">Flow cytometry and sorting</a>. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. , 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).</li>
<li>Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Sleeping+Beauty%22%3A+Quiescence+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">"Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).</li>
<li>Keer, J. T., Birch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+for+the+Assessment+of+Bacterial+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability.</a> J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zwiększona liczba publikacji z wykorzystaniem sond molekularnych wskazuje, że można uzyskać wiarygodne i pouczające dane 5,6,8-15,19,22,23. Jak dotąd nie ma idealnego barwienia dla żywotności komórek, które mogłoby być skuteczne u wszystkich gatunków przy tym samym stężeniu i czasie inkubacji6,10. Nawet ten sam typ sondy ze zmienioną emisją fluorescencji wykazuje potrzebę ustalenia prawidłowego stężenia i czasu inkubacji (tabele 1 i 3). Jak widać przy użyciu te...

Komórka jest złożonym systemem, który nieustannie reaguje na środowisko, modyfikując parametry fizjologiczne i zmieniając swoją funkcję. Na dynamikę populacji drobnoustrojów izogenicznych zarówno w przyrodzie, jak i w laboratorium wpływa rozwój subpopulacji, zachodzących nawet w względnie stałych warunkach środowiskowych 1-3. Zmienność naturalnych zbiorowisk mikroorganizmów wynika z bardzo zmiennego charakteru warunków środowiskowych. Te czasami stochastyczne procesy prowadzą następnie do powstania subpopulacji, które bardzo różnią się od średniej populacji. Ostatnie dowody wykazały, że te fizjologiczne subpopulacje reagują inaczej na warunki środowiskowe i mogą wytwarzać związki sygnałowe lub inhibitory, które dramatycznie wpływają i wpływają na całą populację3,4.
Ustalenie metody definiowania heterogeniczności w obrębie populacji jest kluczem do zrozumienia ekologii mikrobów w różnych środowiskach i jest niezbędne przy budowaniu wiedzy na temat uciążliwych cyjanobakterii, takich jak toksyczny Microcystis, który ma duży wpływ na bezpieczeństwo wodne ludzi. Gatunki takie jak Anabaena wykazują niejednorodność morfologiczną w odpowiedzi na fluktuacje środowiskowe, rozwijając wyspecjalizowane komórki, takie jak heterocysty i akinety2. W przeciwieństwie do tego, komórki Microcystis nie wykazują oczywistej heterogeniczności morfologicznej podczas reakcji na stres. Rozróżnienie między komórkami żywotnymi i nieżywotnymi jest najważniejszym aspektem różnicowania fizjologicznego i pozwala lepiej zrozumieć dynamikę populacji drobnoustrojów. Jednak pojęciowy problem żywotności samych bakterii pozostaje trudny i słabo scharakteryzowany1,5,6.
Cytometria przepływowa (FCM) to niezawodna i szybka metoda analizy pojedynczych komórek. Aby lepiej zrozumieć fizjologię pojedynczej komórki za pomocą FCM, wykorzystano sondy molekularne do rozróżnienia szeregu procesów metabolicznych i biochemicznych7. Doprowadziło to do poszerzenia wiedzy o gatunkach na poziomie komórkowym i populacyjnym, a to z kolei pomogło w zarządzaniu zasobami wodnymi8,9. Jednak organizmy różnią się pod względem wychwytu i wypływu sondy molekularnej ze względu na pory i pompy w ścianach komórkowych i błonach, co doprowadziło do wielu projektów sond molekularnych i wdrożenia protokołów6,10,11. Sondy molekularne dostępne do celów komercyjnych i badawczych są często dostarczane z ogólnym protokołem, który może mieć zastosowanie do bardzo różnych typów komórek. Należy być bardzo ostrożnym przy przenoszeniu protokołów opracowanych dla jednego typu komórek na inny6, dlatego tak ważne jest, aby skutecznie zoptymalizować sondy molekularne przed użyciem.
Zielone i pomarańczowe sondy kwasów nukleinowych wiążą się zarówno z dwu- jak i jednoniciowymi kwasami nukleinowymi z minimalną selektywnością zasad i są używane do oceny integralności błony komórkowej komórek. Zielona sonda kwasu nukleinowego ma znacznie lepszy sygnał fluorescencyjny znakowania komórek w porównaniu z innymi sondami molekularnymi, takimi jak związki na bazie jodku propidyny12, które mogą również działać jako wskaźnik żywotności komórek. Termin "żywotność komórki" zakłada tutaj, że degradacja DNA następuje po utracie integralności błony plazmatycznej. Sondy kwasu nukleinowego są niesymetrycznymi barwnikami cyjaninowymi o trzech ładunkach dodatnich i nie mogą dostać się do komórek z nienaruszonymi błonami w scharakteryzowanych stężeniach, zarówno w organizmach eukariotycznych11,13, jak i prokariotycznych14,15. Wiązanie sondy kwasu nukleinowego z kwasami nukleinowymi może spowodować nawet >500-krotny wzrost emisji fluorescencji z sygnałów endogennych w komórkach, których integralność błony jest naruszona. Chociaż sondy molekularne, takie jak zielona sonda kwasu nukleinowego, mogą być dobrym wskaźnikiem fizjologii pojedynczej komórki, istnieje potrzeba optymalizacji każdej sondy z zamierzonym organizmem docelowym, ponieważ czas inkubacji wahał się od 7 min do 30 min, a stężenie wahało się od 0,1 μM do 0,5 μM w samych eksperymentach Microcystis 15-19.
Tutaj prezentujemy protokół optymalizacji testów cytometrycznych zielonych i stosunkowo nowych pomarańczowych sond kwasów nukleinowych (które do tej pory nie były testowane na gatunku sinic M.aeruginosa). Opracowana metodologia może być następnie przeniesiona na inne gatunki i wykorzystana jako platforma do optymalizacji protokołów w innych sondach molekularnych, zwiększając w ten sposób zrozumienie mikroorganizmów i ich zachowań ekologicznych.

<table><tbody><tr><td>Pożywka cyjanobakterii</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3061-500ML</td><td>BG-11 Skoncentrowany roztwór słodkowodny (rozcieńczenie x50)</td></tr> <tr><td>Płyn odkażający</td><td>BD Biosciences</td><td>653155</td><td>Uruchom przez 2 minuty, gdy wydajność jest większa niż 12 zdarzeń na sekundę na szybko lub przy natężeniu przepływu 66 &mikro; l/min.&nbsp; Następnie 2 min osłony H2O.</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>na żądanie</td><td>BD Accuri C6</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>Barwienie kwasem nukleinowym &ndash; 5 mM roztwór w DMSO</td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S11368</td><td>Barwienie kwasem nukleinowym &ndash; 5 mM roztwór w DMSO</td></tr></tbody></table>

optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (microcystis aeruginosa) za pomocą cytometrii przepływowej

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Subpopulacje mikrobiologiczne w badaniach terenowych i laboratoryjnych wykazały wysoką niejednorodność parametrów morfologicznych i fizjologicznych. Określenie stanu komórki drobnoustrojów w czasie rzeczywistym wykracza poza kategorie żywe lub martwe, ponieważ drobnoustroje mogą istnieć w stanie uśpienia, w którym podział komórek i aktywność metaboliczna są zmniejszone. Biorąc pod uwagę potrzebę wykrywania i kwantyfikacji drobnoustrojów, cytometria przepływowa (FCM) z sondami molekularnymi zapewnia szybką i dokładną metodę pomagającą określić ogólną żywotność populacji. Stosując SYTOX Green i SYTOX Orange w modelowym mikrocyjanobakterii Microcystis aeruginosa do wykrywania integralności błony, opracowujemy przenośną metodę szybkiego wskazywania śmiertelności pojedynczych komórek. Sondy molekularne używane w tym czasopiśmie będą określane odpowiednio jako zielone lub pomarańczowe sondy kwasów nukleinowych (chociaż istnieją inne produkty o podobnych długościach fal wzbudzenia i emisji, które mają porównywalne sposoby działania, w szczególności odnosimy się do wyżej wymienionych sond). Protokoły wykorzystujące sondy molekularne różnią się w zależności od gatunku, różniąc się głównie stężeniem i czasem inkubacji. Zgodnie z tym protokołem określonym na M.aeruginosa, zielona sonda kwasu nukleinowego została zoptymalizowana do stężeń 0,5 μM po 30 minutach inkubacji, a pomarańczowa sonda kwasu nukleinowego do 1 μM po 10 minutach. W obu sondach stężenia mniejsze od deklarowanego optymalnego prowadziły do niedostatecznego zgłaszania komórek z uszkodzeniem błony. I odwrotnie, stężenia 5 μM i wyższe w obu sondach wykazywały rodzaj niespecyficznego barwienia, w którym "żywe" komórki wytwarzały docelową fluorescencję, co prowadziło do nadreprezentacji "niezdolnych do życia" liczb komórek. Kontrole dodatnie (zabite termicznie) dostarczyły możliwej do przetestowania martwej biomasy, chociaż adekwatność wytwarzania kontroli pozostaje przedmiotem dyskusji. Demonstrując logiczną sekwencję kroków do optymalizacji zielonych i pomarańczowych sond kwasów nukleinowych, pokazujemy, jak stworzyć protokół, który można wykorzystać do skutecznej analizy stanu fizjologicznego sinic.

Wyjścia dla rozproszenia światła w przód (FSC) i rozproszenia światła pod kątem (SSC) z hodowli okresowej M.aeruginosa w fazie wykładniczej dostarczają odpowiednio informacji o rozmiarze komórek (średnicy) oraz ich ziarnistości wewnętrznej (Rysunek 1A). FSC pozwala odróżnić komórki, które są zbyt duże i/lub zbyt małe, aby być M.aeruginosa. Takie odróżnianie, czyli bramkowanie (gating), można przeprowadzić poprzez zawężenie danych pomiędzy określonymi pun...

Populacje mikroorganizmów zawierają znaczną heterogeniczność komórek, która może dyktować ogólne zachowanie. Analiza sondy molekularnej za pomocą cytometrii przepływowej może określić stany fizjologiczne komórek, jednak jej zastosowanie różni się w zależności od gatunku. Badanie to zapewnia protokół do dokładnego określenia śmiertelności komórek w populacji cyjanobakterii, bez niedoceniania lub rejestrowania wyników fałszywie dodatnich.

Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) za pomocą cytometrii przepływowej

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu opracowania protokołu umożliwiającego efektywną analizę stanu fizjologicznego cyjanobakterii przy użyciu cytometrii przepływowej i sond molekularnych. Protokół ten może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące fizjologii komórkowej społeczności drobnoustrojów. Główną zaletą tej procedury jest to, że zoptymalizowany protokół z użyciem sond fluorescencyjnych pozwala w czasie rzeczywistym rozróżnić stany fizjologiczne cyjanobakterii na poziomie pojedynczych komórek.Procedurę tę zademonstruje David Hartnell, doktorant pracujący w laboratorium cytometrii na Uniwersytecie w Bournemouth. Przed rozpoczęciem eksperymentu umieść pustą probówkę do hemolizy pod sondą wtryskową próbek. Kliknij unclog.Następnie wykonaj płukanie wsteczne, aby rozpocząć proces czyszczenia cytometru przepływowego. Po zakończeniu płukania wstecznego nałóż na sondę wtryskową próbek (SIP) nową probówkę do hemolizy zawierającą 2 mL ultra czystej filtrowanej wody, ustaw limit czasu na 10 do 15 minut, a prędkość przepływu na szybką (fast). Następnie wybierz nową komórkę danych i ustaw odpowiednie progi fluorescencji oraz rozproszenia światła, aby zredukować szum tła.Następnie kliknij run. Jeśli całkowita liczba zdarzeń na sekundę nie jest niższa od zalecenia producenta, przepuść 2 mL roztworu dekontaminacyjnego przez dwie minuty w trybie fast. Powtórz kroki płukania wstecznego i płukania wodą ultraczystą.Aby przygotować pierwotną monokulturę M.aeruginosa, wysterylizować w autoklawie 98 mililitrów filtrowanej wody ultrapurej zmieszanej z dwoma mililitrami pożywki dla glonów, w zlewce o pojemności 250 mililitrów przez 20 minut w temperaturze 120 °C. Gdy kultura osiągnie wysoką stacjonarną gęstość, rozbić aglomeraty dwóch mililitrów komórek poprzez wstrząsanie na vortexie. Następnie przenieść komórki pod sondę wtryskową do próbek.Potwierdzić pod mikroskopem świetlnym, czy komórki są równomiernie rozproszone. Następnie wybrać w oprogramowaniu cytometru przepływowego wykres histogramu, aby zarejestrować dane dotyczące rozproszenia światła w przód (forward scatter). Kliknąć przycisk log, aby wyświetlić dane w skali logarytmicznej na osi x.W osobnym oknie wyjściowym ustaw kolejny histogram z osią logarytmiczną, aby zarejestrować naturalną fluorescencję komórek M.aeruginosa. Następnie wybierz źródło światła zdolne do wzbudzenia fikocyjaniny oraz detektor, który może filtrować emisje wynikające z powstałej fluorescencji. Aby uzyskać najwyższą rozdzielczość pomiaru, wybierz ustawienia najbliższe rozmiarowi rdzenia organizmu docelowego.Następnie ustaw stosunkowo wolną prędkość przepływu. Przed rozpoczęciem akwizycji danych ustaw próg odcięcia (gate), aby wyeliminować sygnały rozproszenia światła i fluorescencji spowodowane elektronicznym szumem tła lub zanieczyszczeniami w próbce komórkowej. Następnie wybierz nową komórkę danych.Utwórz wykres gęstości z parametrami forward scatter i side scatter w skali logarytmicznej, a następnie kliknij run. Teraz zastosuj bramkę forward light scatter i natural fluorescence do danych forward scatter względem side scatter, aby wykluczyć sygnały rozproszenia o niskim poziomie i uwzględnić jedynie sygnały fikocyjaniny o wyższej fluorescencji względnej. Następnie zbieraj zdarzenia do czasu zakończenia analizy próbki i wykorzystaj uzyskane dane do wyznaczenia początkowej liczby komórek.Aby zoptymalizować pobieranie sondy molekularnej przez komórki, połowę wcześniej przygotowanej monokultury należy poddać odpowiednim warunkom w celu wytworzenia kontroli negatywnej (martwej). Należy sprawdzić zmiany w mikrośrodowisku próbki, aby potwierdzić obumarcie hodowli, a następnie rozbić kolonie w sposób przedstawiony powyżej.Następnie należy wybrać laser o długości fali 488 nm wraz z detektorem zdolnym do rejestracji fluorescencji z zielonych i pomarańczowych sond kwasów nukleinowych oraz laser o długości fali 640 nm do rejestracji sygnałów fikocyjaniny poprzez odpowiednie detektory. W nowym arkuszu danych należy ustawić wykres gęstości z parametrami rozproszenia przedniego i bocznego.Następnie utwórz jeden histogram, korzystając z odpowiedniego kanału detektora optycznego sondy molekularnej. Jeden histogram do wykrywania emisji fikocyjaniny oraz jeden histogram dla zdarzeń rozproszenia przedniego, wszystkie w skali logarytmicznej. Przebadaj próbki cyjanobakterii, stosując różne stężenia i czasy inkubacji.Utwórz bramkę na histogramie rozproszenia przedniego (forward scatter), aby uwzględnić zdarzenia odpowiadające wyłącznie wielkości komórek organizmu docelowego, a następnie zastosuj ją do odpowiedniego kanału sondy fluorescencyjnej. Następnie, w kanale sondy fluorescencyjnej, utwórz kolejną inkluzywną bramkę programową obejmującą najwyższy piki na histogramie.Następnie należy nanieść odpowiadającą im fluorescencję dodatniej sondy na wykres gęstości. Porównaj liczbę sygnałów fluorescencyjnych z liczbą martwych komórek kontrolnych, aby wyznaczyć najwyższy procent pobrania sondy kwasów nukleinowych przez komórki, który nie powoduje barwienia niespecyficznego. W celu przetestowania nakładania się interferencji fluorescencji wynikającej z wewnętrznego lub niespecyficznego barwienia komórek, wybierz dane z mieszanej hodowli składającej się w 50% z komórek żywych i w 50% z komórek martwych.Następnie usuń bramki fluorescencyjne. Zastosuj bramki tak, aby w histogramie kanału fikocyjaniny uwzględnić jedynie histogram rozproszonego światła przedniego (forward scatter) odpowiadający wielkości komórek organizmu docelowego. Wyznacz bramki dla najwyższych i najniższych pików fikocyjaniny, odpowiednio z etykietami „żywe” i „martwe”.Następnie oddzielnie zastosuj bramkowanie dla sygnałów żywej i martwej fikocyjaniny. Zapisz obie średnie długości fal. Aby określić czułość protokołu, oblicz stosunek średnich długości fal fluorescencji dodatniej martwej sondy molekularnej do wewnętrznego niespecyficznego sygnału żywych komórek.Na koniec wybierz zoptymalizowany protokół, w którym zabarwiono największą liczbę martwych komórek, bez wystąpienia barwienia niespecyficznego. Na tych wykresach przedstawiono reprezentatywne wyniki rozproszenia światła w przód (forward scatter) i w boku (side scatter), odpowiadające wielkości komórek oraz ich złożoności wewnętrznej dla hodowli seryjnej M.aeruginosa w fazie wykładniczej. Gating można przeprowadzić poprzez doprecyzowanie danych pomiędzy określonymi punktami wyniku rozproszenia światła w przód.Fikocyjanina generuje silny sygnał po wzbudzeniu czerwonym źródłem światła, co może posłużyć do dalszego bramowania populacji badanych. Na podstawie sygnałów rozproszonego światła w przód (FSC) oraz sygnałów fluorescencyjnych można następnie wyodrębnić z pierwotnego wyniku dane specyficzne dla próbki M.aeruginosa w celu końcowego przeliczenia komórek. Po zmieszaniu żywych kontroli o wysokim stopniu pigmentacji oraz martwych kontroli o niskim stopniu pigmentacji staje się widoczny spadek przesunięcia autofluorescencji.W komórkach z uszkodzoną błoną sondy kwasów nukleinowych generują dodatkowy sygnał, który można zaobserwować za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie potwierdzić w mikroskopii epifluorescencyjnej. Dyskryminacja fluorescencyjna między komórkami żywymi a martwymi wzrasta wraz z czasem w zakresie stężeń od 0,05 do 0,5 µM, natomiast spada w zakresie stężeń od 1 do 100 µM dla obu sond. Rzeczywiście, optymalne stężenie dla zielonej sondy kwasów nukleinowych wydaje się wynosić 0,5 µM przy czasie inkubacji 30 minut.W przypadku pomarańczowej sondy kwasu nukwinowego optymalne stężenie wynosi 1 µM przy 10-minutowej inkubacji. Po opanowaniu tej metody optymalizacja każdej sondy molekularnej może zostać przeprowadzona w ciągu jednego dnia, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu sond w stabilnym środowisku, w odpowiedniej temperaturze, pH i warunkach oświetleniowych.Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom z zakresu mikrobiologii do zgłębiania heterogeniczności wspólnot fitoplanktonu. Po obejrzeniu filmu powinni Państwo mieć teraz dobre wyobrażenie o tym, jak opracować optymalny protokół oceny fizjologii komórkowej z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i sond molekularnych. Należy pamiętać, że praca z sondami molekularnymi i organizmami toksycznymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odpowiednich środków ochrony indywidualnej (P.P.E.) oraz pełne zapoznanie się z materiałami COSHH.

molecular-probe-optimization-to-determine-cell-mortality

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Śledzenie subtelnych zmian w progresji i kinetyce etapów cyklu komórkowego można przeprowadzić, stosując połączenie metabolicznego znakowania kwasów nukleinowych BrdU oraz barwienia całkowitej genomowej DNA jodeczkiem propidyny. Metoda ta eliminuje konieczność chemicznej synchronizacji dzielących się komórek, zapobiegając tym samym wprowadzaniu nieswoistych uszkodzeń DNA, które z kolei wpływają na przebieg cyklu komórkowego.

Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego z wykorzystaniem znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Źródło: Chapman, I. J. i wsp., Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) przy użyciu cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia metodę rozróżniania żywych i martwych komórek Microcystis aeruginosa poprzez połączenie znakowania sondą fluorescencyjną z analizą autofluorescencji fikocyjaniny i sygnałem sondy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza żywotności Microcystis aeruginosa za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje test cytometrii przepływowej do ilościowego określenia poziomów ROS w organoidach jelitowych 3D uzyskanych od transgenicznych myszy wykazujących ekspresję GFP. Metoda ta zapewnia eksperymentalny model in vitro do zbadania skuteczności badanych związków w produkcji ROS.

Test cytometrii przepływowej do ilościowego określania stresu oksydacyjnego: Test do ilościowego określania reaktywnych form tlenu w organoidach jelitowych za pomocą sond fluorogennych

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Optycznie kontrolowane substancje są potężnymi narzędziami do badania szlaków sygnałowych. Aby poszerzyć spektrum możliwych eksperymentów, opracowaliśmy urządzenie do badania substancji kontrolowanych optycznie w czasie rzeczywistym za pomocą cytometrii przepływowej: LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow — połączenie optogenetyki z cytometrią przepływową

Analiza cytometryczna przepływu okazała się przydatna do badania czystych kultur i monitorowania dynamiki społeczności mikroorganizmów. Przedstawiamy trzy kompleksowe przepływy pracy, od próbkowania po analizę danych, dla czystych kultur i złożonych społeczności, odpowiednio w przezroczystym podłożu, jak i w trudnych matrycach.

Charakterystyka dynamiki mikrobiomu – przepływy pracy oparte na cytometrii przepływowej od czystych kultur do naturalnych społeczności

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Przedstawiono protokół fluorescencyjnej, cytometrycznej cytometrii przepływowej starzejących się komórek nowotworowych indukowanych przez chemioterapię w hodowli komórkowej lub w mysich modelach nowotworów. Opcjonalne procedury obejmują współbarwienie immunologiczne, utrwalanie próbki w celu ułatwienia analizy dużych partii lub punktów czasowych oraz wzbogacanie żywotnych komórek starczych przez sortowanie metodą cytometrii przepływowej.

Sonda β-galaktozydazy związana ze starzeniem się w kolorze dalekiej czerwieni do identyfikacji i wzbogacania starzejących się komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół skupia się na wykorzystaniu cytometrii przepływowej i liczenia koralików do ilościowego oznaczania zarodników bakterii znakowanych bromkiem etydyny. Metoda ta jest również skuteczna w analizie kowalencyjnego sprzężenia białek na powierzchni nienaruszonych zarodników.

Poprawa liczenia zarodników Bacillus subtilis i analizy znaczników w cytometrii przepływowej

Przedstawiamy tutaj protokół mającycy mierzenie przeżycia po stresie w próbkach drożdży. Test wykorzystuje dwa barwniki fluorescencyjne, SYTO 9 i jodek propidiu (PI), do ilościowego określenia integralności błony plazmatycznej. Wykorzystuje cytometrię przepływową do dostarczania ilościowych i powtarzalnych szacunków ułamków żywych, martwych i uszkodzonych komórek dla próbek po stresie utlencyjnym.

Zoptymalizowany test ŻYWY/MARTWY połączony z cytometrią przepływową do ilościowego przeżycia po stresie w komórkach drożdży

Poznaj zoptymalizowaną metodę oznaczania śmiertelności komórek sinic Microcystis aeruginosa za pomocą cytometrii przepływowej i sond molekularnych. Protokół umożliwia analizę fizjologicznych stanów komórek w czasie rzeczywistym.

Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów