Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) za pomocą cytometrii przepływowej
29 stycznia 2016
Populacje mikroorganizmów zawierają znaczną heterogeniczność komórek, która może dyktować ogólne zachowanie. Analiza sondy molekularnej za pomocą cytometrii przepływowej może określić stany fizjologiczne komórek, jednak jej zastosowanie różni się w zależności od gatunku. Badanie to zapewnia protokół do dokładnego określenia śmiertelności komórek w populacji cyjanobakterii, bez niedoceniania lub rejestrowania wyników fałszywie dodatnich.
Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób stworzyć protokół, który może skutecznie analizować stan fizjologiczny sinic przy użyciu cytometrii przepływowej i sond molekularnych. Protokół ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące fizjologii komórek w społecznościach drobnoustrojów. Główną zaletą tej procedury jest to, że zoptymalizowany protokół sondy fluorescencyjnej może rozróżniać stany fizjologiczne cyjanobakterii na poziomie poszczególnych komórek w czasie rzeczywistym.
Procedurę tę zademonstruje David Hartnell, doktorant pracujący w laboratorium cytometrii na Uniwersytecie w Bournemouth. Przed rozpoczęciem eksperymentu umieść pustą probówkę hemolityczną na sondzie do wstrzykiwania próbki. Kliknij odblokuj.
A następnie płukać z powrotem, aby rozpocząć proces czyszczenia cytometrii przepływowej. Pod koniec płukania wstecznego załaduj nową rurkę do hemolizy zawierającą dwa mililitry ultra czystej przefiltrowanej wody na sondę do wstrzykiwania próbki lub SIP i ustaw limit czasu na 10 do 15 minut, a prędkość płynu na prędką. Następnie wybierz nową komórkę danych i ustaw odpowiednie progi fluorescencji i rozproszenia światła, aby zredukować szum tła.
Następnie kliknij uruchom. Jeśli łączna liczba zdarzeń na sekundę jest nie mniejsza niż zalecana przez producenta, uruchom szybko dwa mililitry roztworu odkażającego przez dwie minuty. I powtórz kroki spłukiwania wstecznego i spłukiwania ultra czystą wodą.
Aby przygotować pierwotną monokulturę M.aeruginosa, należy zalać w autoklawie 98 mililitrów ultra czystej przefiltrowanej wody, zmieszanej z dwoma mililitrami pożywki z glonów, w 250-mililitrowej zlewce przez 20 minut w temperaturze 120 stopni Celsjusza. Gdy kultura znajduje się w wysokiej gęstości w stanie ustalonym, zdezagreguj dwa mililitry komórek przez wirowanie. A następnie przenieś komórki pod sondę do wstrzykiwania próbki.
Upewnij się, że komórki są równomiernie rozproszone za pomocą mikroskopii świetlnej. Następnie wybierz wykres histogramu w oprogramowaniu cytometru przepływowego, aby zarejestrować dane dotyczące rozproszenia światła do przodu. I kliknij log, aby wyświetlić dane w skali logarytmicznej na osi x.
W osobnym wyjściu ustaw inny histogram osi logarytmicznej, aby zarejestrować naturalną fluorescencję komórek M.aeruginosa. Następnie wybierz źródło światła, które może wzbudzić fikocyjaninę, oraz detektor, który może filtrować emisje z powstałej fluorescencji. Aby nagrywać w najwyższej rozdzielczości, wybierz ustawienia najbardziej zbliżone do wielkości rdzenia organizmu docelowego.
I ustaw stosunkowo wolne natężenie przepływu. Przed uzyskaniem danych należy ustawić próg, aby wykluczyć wszelkie sygnały rozpraszania światła i fluorescencji spowodowane elektronicznym szumem tła lub resztkami próbki komórki. Następnie wybierz nową komórkę danych.
Utwórz wykres zagęszczenia z parametrami rozproszenia do przodu i z boku na skali logarytmicznej, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Teraz zastosuj rozproszenie światła do przodu i naturalną bramkę fluorescencji do danych rozpraszania do przodu po boku, aby wykluczyć wszelkie sygnały rozproszenia niskiego poziomu i uwzględnić tylko sygnały fikocyjaniny o wyższej względnej fluorescencji. Następnie zbieraj zdarzenia, aż próbka zostanie zakończona, i użyj danych do określenia początkowej liczby komórek.
Aby zoptymalizować wychwyt komórek sondy molekularnej, należy wystawić połowę wcześniej przygotowanej monokultury na działanie odpowiednich warunków do wygenerowania martwej kontroli. Sprawdź zmiany w mikrośrodowisku próbki, aby potwierdzić śmierć kultury. A następnie zdezagreguj formację kolonii, jak właśnie pokazano.
Następnie wybierz laser o długości 488 nm wraz z detektorem, który może rejestrować fluorescencję z zielonych i pomarańczowych sond kwasów nukleinowych. I 640-nanometrowy laser do rejestrowania sygnałów fikocyjaniny przez odpowiednie detektory. W nowym arkuszu danych skonfiguruj wykres gęstości z parametrami rozproszenia do przodu i z boku.
Następnie utwórz jeden histogram, używając odpowiedniego kanału detektora optycznego sondy molekularnej. Jeden histogram do wykrywania emisji fikocyjaniny i jeden histogram do zdarzeń rozproszenia do przodu, wszystko w skali logarytmicznej. Uruchom próbki sinic przy użyciu różnych stężeń i czasów inkubacji.
Utwórz bramkę w histogramie rozproszenia do przodu, aby uwzględnić zdarzenia tylko z rozmiarem komórki organizmu docelowego. I zastosuj go do odpowiedniego kanału sondy fluorescencyjnej. Następnie w kanale sondy fluorescencyjnej utwórz kolejną inkluzywną bramkę programową względem najwyższego piku na histogramie.
A następnie przesunąć odpowiednią dodatnią fluorescencję sondy na wykres gęstości. Porównaj liczbę sygnałów fluorescencyjnych z liczbą martwych komórek kontrolnych, gdzie najwyższy procent wychwytu sondy jądrowej komórki, który nie powoduje niespecyficznego barwienia. Do testowania nakładania się interferencji fluorescencji z wewnętrznego lub niespecyficznego barwienia komórek, wybierz 50 procent żywych i 50 procent martwych danych z kultur mieszanych.
I usuń bramki fluorescencyjne. Zastosuj bramki, aby uwzględnić tylko histogram rozproszenia do przodu dla wielkości komórki organizmu docelowego na histogramie kanału fikocyjaniny. Bramkowanie najwyższych i najniższych pików fikocyjaniny i oznaczanie ich odpowiednio żywymi i martwymi.
Następnie oddzielnie zastosuj bramki do sygnałów żywej i martwej fikocyjaniny. I nagraj obie średnie długości fal. Aby określić czułość protokołu, należy zastosować średnie długości fal dodatniej fluorescencji martwej sondy molekularnej do wewnętrznego niespecyficznego sygnału na żywo.
Na koniec wybierz zoptymalizowany protokół, w którym największa ilość martwych komórek została wybarwiona bez wystąpienia barwienia niespecyficznego. Na tych wykresach pokazano reprezentatywne wyjścia rozpraszania światła do przodu i z boku, dla wielkości komórki i wewnętrznej złożoności hodowli wsadowej M.aeruginosa w fazie wykładniczej. Bramkowanie można przeprowadzić poprzez uściślanie danych między określonymi punktami wyjścia rozpraszania światła do przodu.
Fikocyjanina wytwarza silny sygnał podczas badania przez źródło czerwonego światła, które może być wykorzystane do dalszego bramkowania interesujących populacji. Z sygnału rozpraszania światła do przodu i sygnałów fluorescencyjnych, dane mogą być następnie bramkowane od oryginalnego wyjścia do określonych danych w próbce M.aeruginosa w celu końcowego zliczenia komórek. Kiedy żywe grupy kontrolne o wyższej pigmentacji i martwe o niższej pigmentacji są mieszane, malejąca zmiana w automatycznej fluorescencji staje się wyraźna.
W komórkach z naruszoną błoną sondy kwasów nukleinowych wytwarzają dodatkowy sygnał, który można zaobserwować za pomocą cytometrii przepływowej i dodatkowo potwierdzić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Dyskryminacja fluorescencyjna między żywymi i martwymi komórkami zwiększa się z czasem między stężeniami 0,05 a 0,5 mikromola, ale maleje między stężeniami od jednego do 100 mikromolowych dla obu sond. Rzeczywiście, optymalne stężenie dla zielonej sondy kwasu nukleinowego wydaje się wynosić 0,5 mikromola przy czasie inkubacji wynoszącym 30 minut.
W przypadku pomarańczowej sondy kwasu nukleinowego optymalne stężenie to jeden mikromol na 10-minutową inkubację. Po opanowaniu, dla każdej sondy molekularnej, optymalizacja może zostać zakończona w ciągu jednego dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu sond w stabilnym środowisku, w odpowiedniej temperaturze, pH i warunkach oświetleniowych.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrobiologią do zbadania niejednorodności zbiorowisk fitoplanktonu. Po obejrzeniu filmu powinieneś teraz dobrze zrozumieć, jak opracować optymalny protokół oceny fizjologii komórkowej za pomocą cytometrii przepływowej i sond molekularnych. Nie zapominaj, że praca z sondami molekularnymi i organizmami toksycznymi może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego PPE i pełne zrozumienie materiałów COSHH.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia protokół do analizy stanów fizjologicznych cyjanobakterii za pomocą cytometrii przepływowej i sond molekularnych. Metoda ma na celu dokładne określenie śmiertelności komórek w populacjach mikroorganizmów, rozwiązując problemy związane z niejednorodnością komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia komórki
- Cytometria przepływowa
Tło
- Populacje mikroorganizmów wykazują znaczną niejednorodność komórek.
- Cytometria przepływowa może oceniać stany fizjologiczne, ale różni się w zależności od gatunku.
- Dokładne pomiary śmiertelności komórek są kluczowe dla zrozumienia społeczności mikroorganizmów.
- Optymalizacja sond fluorescencyjnych może poprawić analizę na poziomie pojedynczych komórek.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu do oceny fizjologii cyjanobakterii.
- Poprawa dokładności oznaczania śmiertelności komórek.
- Ułatwienie analizy w czasie rzeczywistym stanów fizjologicznych cyjanobakterii.
Stosowane metody
- Cytometria przepływowa do analizy komórek.
- Sondy molekularne do rozróżniania stanów fizjologicznych.
- Optymalizacja protokołu dla dokładnych wyników.
- Demonstracja przez studenta doktoranta w laboratorium cytometrii.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie rozróżnia stany fizjologiczne w cyjanobakteriach.
- Udało się dokładnie określić śmiertelność komórek.
- Analiza w czasie rzeczywistym dostarczyła wglądu w zachowanie mikroorganizmów.
- Wyniki wspierają zrozumienie populacji cyjanobakterii.
Wnioski
- Opracowany protokół poprawia analizę fizjologii cyjanobakterii.
- Rozwiązuje poprzednie ograniczenia w pomiarze śmiertelności komórek.
- Ta metoda może być zastosowana do różnych badań mikroorganizmów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of cellular viability in microbial systems supports early-stage target validation by enabling reliable phenotypic screening and mechanistic de-risking. Flow cytometry with optimized molecular probes provides quantitative, single-cell resolution data that improves predictive confidence in lead identification campaigns. This approach addresses heterogeneity challenges in discovery biology, facilitating data-driven go/no-go decisions and reducing late-stage biological risk in antimicrobial or anti-infective pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing viable from non-viable cells in microbial populations.
- Operational Value: Supports functional target validation through membrane integrity assessment using SYTOX Green and SYTOX Orange probes.
- Predictive Value: Optimized probe concentrations (0.5 µM green, 1.0 µM orange) minimize false negatives and non-specific staining, enhancing assay reliability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible fluorescence readouts for high-throughput compound screening in antimicrobial discovery.
- Quantitative Output: Enables precise measurement of probe uptake as a dependent variable for dose-response modeling.
- Scalability: Protocol optimization in Microcystis aeruginosa provides a transferable framework for other cyanobacterial or microbial systems.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports preclinical modeling of antimicrobial efficacy by quantifying compound-induced mortality in target pathogens.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase viability screening to preclinical validation through consistent, flow cytometry-based endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in lead optimization by providing real-time, single-cell physiological data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by correlating compound treatment with changes in cellular viability.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducibility through optimized probe incubation and concentration parameters.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence measurements enabling statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking membrane integrity readouts to compound mechanism of action.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cytometry platform applicable across microbial targets in anti-infective programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false viability readings through probe optimization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories via defined probe concentrations and incubation times.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of compounds lacking target-specific activity.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds with genuine antimicrobial effects versus assay artifacts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry operation and fluorescence compensation for multi-parameter detection.
- Dependent on access to flow cytometers with 488 nm laser compatibility and appropriate detection channels for SYTOX dyes.
- Necessitates cross-team protocol standardization to ensure consistent probe handling, storage, and application.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to Gram-positive or Gram-negative bacterial models.
- Includes practical limitations such as probe toxicity and the need for biosafety containment when working with toxic organisms like Microcystis aeruginosa.
