Fotowzorcowanie białek i komórek w środowisku wodnym za pomocą fotokatalizy TiO₂

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przeprowadzenie modyfikacji powierzchni rusztowania do hodowli komórek z wykorzystaniem aktywności fotokatalitycznej dwutlenku tytanu. Osiąga się to poprzez osadzenie cienkiej warstwy dwutlenku tytanu na szklanym szkiełku nakrywkowym, a następnie pokrycie go oktadecylochlorosilanem w celu nadania całej powierzchni właściwości hydrofobowych. W drugim kroku podłoże jest blokowane poprzez zanurzenie go w pożywce do hodowli komórek zawierającej albuminę surowiczą.

Albumin adsorbuje się na powierzchni, czyniąc ją nieprzepuszczalną dla adhezji komórek. Następnie próbkę przenosi się do roztworu wodnego zawierającego kolagen, a następnie powierzchnię naświetla się skupionym światłem UV. Pozwala to cząsteczkom kolagenu na selektywną adsorpcję w obszarze naświetlonym, co czyni ten region podatnym na adhezję komórek.

Proces ten można powtarzać w celu wzorowania wielu białek lub typów komórek. W tym filmie pokazujemy, jak region adhezyjny komórek PC 12 może zostać selektywnie zmodyfikowany za pomocą naświetlania UV. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, że fotokataliza dwutlenkiem tytanu znajduje zastosowanie komercyjne w samoczyszczących się oknach szklanych, które pod wpływem promieniowania świetlnego usuwają zanieczyszczenia organiczne z powierzchni, co dowodzi skuteczności tej procedury; obecnie poszukujemy studenta studiów doktoranckich z mojego laboratorium do wspólnego prowadzenia tych badań.

Zacznij od ponumerowania szkiełek nakrywkowych za pomocą rysika diamentowego w sposób, który pomoże upewnić się, że właściwa strona próbki jest skierowana do góry. Następnie oczyść szkiełka nakrywkowe, najpierw pod bieżącą wodą dwukrotnie destylowaną, a następnie poprzez zanurzenie ich w roztworze piranha na 10 minut. Po 10 minutach opłucz szkiełka nakrywkowe ośmiokrotnie w wodzie dwukrotnie destylowanej i wysusz je strumieniem azotu.

Następnie umieść tarczę z tlenku tytanu w systemie rozpylania wysokoczęstotliwościowego (RF), a następnie przymocuj czyste szkiełka nakrywkowe do uchwytu próbek za pomocą taśmy poliamidowej, umieść uchwyt w komorze rozpylania i odessaj powietrze z komory, aż ciśnienie osiągnie 2,0 × 10⁻⁴ Pa. Następnie wprowadź do komory argon i ustaw ciśnienie osadzania na 4,0 mTorr, utrzymując zamkniętą przysłonę. Stopniowo zwiększ moc RF do 70 W.

Następnie otwórz migawkę i prowadź napylanie przez 15 minut, aby uzyskać warstwę o grubości od 120 do 150 nanometrów. Rozpocznij od wysuszenia zlewki szklanej i pęsety w piekarniku w temperaturze 120 °C przez 30 minut. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe w reaktorze plazmowym i poddaj powierzchnię dwutlenku tytanu działaniu plazmy tlenowej przez pięć minut przy mocy 200 W i przepływie tlenu wynoszącym 100 standardowych centymetrów sześciennych na minutę, aby uzyskać powierzchnię bardziej hydrofilową.

Następnie wyjmij próbki i zanurz je w wodzie podwójnie destylowanej, aby potwierdzić, że powierzchnia jest superhydrofilowa, a następnie dokładnie osusz powierzchnię w strumieniu azotu. Dalej, przenieś próbki, wysuszony zlew i pincetę do worka rękawiczkowego wypełnionego azotem i przygotuj 1 mM roztwór oktadecylotrichloretylenu rozpuszczonego w toluenie. Zanurz próbkę w roztworze na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby utworzyć samozorganizowaną monowarstwę na powierzchni tlenku tytanu.

Następnie usuń wszelkie cząsteczki fazora, płucząc próbkę w toluenie, acetonie, etanolu, a na koniec w wodzie dwukrotnie destylowanej przez pięć minut w każdym z tych roztworów. Następnie przepłucz próbkę czterokrotnie w świeżej wodzie dwukrotnie destylowanej i wysusz powierzchnię w strumieniu azotu.

Sterylizuj pokrywki szkiełek obiektowych z powłoką, zanurzając próbki w 70% etanolu przez pięć minut. Następnie przepłucz próbki dwukrotnie w sterylnej wodzie dwukrotnie destylowanej. Dalej, umieść próbkę w szalce o średnicy 35 mm i dodaj dwa mililitry pożywki wzrostowej dla PC 12.

Inkubować próbki przez co najmniej trzy godziny w inkubatorze z buforowaniem CO2 w temperaturze 37°C, aby albuminy surowicy w medium zdążyły zaadsorbować się na powierzchni szkiełek zakrywek. Przygotować odwrócony mikroskop fluorescencyjny, włączając w pierwszej kolejności lampę łukową. Następnie włożyć kostkę filtra UV i przekręcić obiektyw na taki o powiększeniu 20x.

Zmierz natężenie światła za pomocą miernika natężenia UV i oblicz czas naświetlania dla dawki 200 joules per square centimeter. Następnie, używając mikrometru przedmiotowego, ustaw średnicę obszaru do naświetlania na 200 microns poprzez regulację przysłony pola widzenia. Po trzygodzinnej inkubacji uzupełnij pożywkę pokrywającą szkiełka podstawowe 200 microliters kolagenu typu czwartego o stężeniu 3.0 milligrams per milliliter.

Następnie przenieś szalkę 35 milimetrową na stolik mikroskopu i ustaw ostrość mikroskopu na powierzchni próbki, korzystając z nacięć pomocniczych. Naświetl obszar szkiełka podstawowego światłem UV z dawką 200 j/cm². Następnie wymień pożywkę na dwa mililitry świeżej pożywki wzrostowej z NGF i bez kolagenu typu IV, a próbkę umieść ponownie w inkubatorze.

Zebrać hodowlę zróżnicowanych pod wpływem NGF komórek PC 12 do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml i odwirować probówkę z prędkością 150 ×g przez cztery minuty. Następnie odessać nadsącz i dodać jeden mililitr pożywki wzrostowej. Resuspenderć komórki, delikatnie pipetując zawiesinę w górę i w dół, a następnie ocenić ich liczbę za pomocą cytometru hematologicznego.

Oznacz gęstość komórek i przenieś 3,0 × 10⁵ komórek do szalki 35 mm zawierającej zmodyfikowane szkiełka podstawowe. Inkubuj szalkę przez jeden do dwóch dni w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C po jednym do dwóch dniach hodowli na zmodyfikowanej powierzchni XC 2. Za pomocą mikroskopu potwierdź, że komórki przylegają i rosną wyłącznie w obszarze szkiełek podstawowych naświetlonym promieniowaniem UV.

Następnie do szalki z hodowanymi komórkami należy dodać 67 µL kolagenu typu IV, tak aby końcowe stężenie kolagenu wynosiło 100 µg/mL, przy mikroskopie skonfigurowanym do wzorowania powierzchni. Szalkę należy umieścić na stoliku mikroskopu i ustawić obszar naświetlania obok aktualnego położenia komórek. Następnie należy naświetlić szkiełko podstawowe światłem UV z dawką 200 J/cm².

Po napromieniowaniu należy zastąpić pożywkę taką, która nie zawiera kolagenu, a następnie umieścić próbkę z powrotem w inkubatorze, starając się zakończyć przetwarzanie pojedynczej próbki w ciągu 30 minut. Jest to obraz przekroju poprzecznego wykonany za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, przedstawiający warstwę dwutlenku tytanu naniesioną metodą rozpylania magnetronowego. Na podstawie obserwacji grubość warstwy oszacowano na około 150 nanometrów.

Zauważalna jest tutaj również płaskość naniesionej warstwy dwutlenku tytanu. Dalsza analiza z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych wykazała, że średniokwadratowa chropowatość powierzchni wynosiła zaledwie 0,2 nanometra. Kolagen typu IV oraz roztwór absorbują preferencyjnie w obszarze naświetlonym promieniowaniem UV, w którym albuminy zostały usunięte przez laser.

Aby zademonstrować wszechstronność tego podejścia, za pomocą tej samej techniki naniesiono wzory z innych białek, takich jak fibryna. Tutaj komórki rosną na obszarze z naniesionym wzorem XC dwa na szkiełku podstawowym oraz bezpośrednio obok nich, w obszarze wyznaczonym linią przerywaną. Szkiełko podstawowe zostało niedawno poddane naświetlaniu UV in situ dwa i pokryte kolagenem typu cztery.

Przez następne pięć dni komórki proliferują i migrują, aby pokryć nowo zakodowany obszar. Przedstawiona tutaj procedura może zostać wykorzystana do dowolnej manipulacji komórkami w hodowli i potencjalnie do wzorowania wielu typów komórek w celu stworzenia złożonych systemów współhodowli.