Name: Fotowzorcowanie białek i komórek w środowisku wodnym za pomocą fotokatalizy TiO2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę modyfikacji powierzchni rusztowań komórkowych za pomocą fotokatalizy dwutlenku tytanu. Technika umożliwia tworzenie mikrodomen kolagenowych dla selektywnej adhezji komórek in situ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Panu Kotaro Okubo za życzliwą pomoc przy obrazowaniu SEM. Prace te były wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021) oraz przez granty badawcze z Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation i Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.

1. Przygotowanie szkiełka podstawowego pokrytego TiO2
<ol>
	<li>Ponumeruj szkiełka nakrywkowe za pomocą rylca diamentowego. Ułatwia to nie tylko śledzenie poszczególnych szkiełek, ale także zapewnia, że prawidłowa strona próbki jest skierowana do góry. Oczyść szkiełka, najpierw pod bieżącą wodą ddH2O, a następnie poprzez zanurzenie ich w roztworze piranha (H2SO4:H2O2 = 4:1). Po 10 min dokładnie wypłucz szkiełka, 8 razy w ddH2O. Wysusz szkiełka w strumieniu N2.</li>
	<li>Umieść tarczę TiO2 w systemie rozpylania wysokoczęstotliwościowego (RF). Przymocuj szkiełka do uchwytu próbek urządzenia do rozpylania za pomocą taśmy polimidowej. Umieść uchwyt z próbkami w komorze rozpylania. Odsysaj powietrze z komory, aż ciśnienie osiągnie 2.0×10-4 Pa.</li>
	<li>Wprowadź gaz Ar do komory i ustaw ciśnienie nanoszenia na 4.0 mTorr. Przy zamkniętej przesłonie stopniowo zwiększ moc RF do 70 W.</li>
	<li>Otwórz przesłonę i rozpylaj przez 15 min, aby uzyskać warstwę o grubości 120-150 nm (Rycina 1: Krok A). Szybkość wzrostu warstwy musi zostać wyznaczona dla każdego urządzenia.</li>
</ol>
2. Powlekanie powierzchni warstwą odpychającą komórki
<ol>
	<li>Zhydrofilizuj powierzchnię TiO2, poddając próbkę działaniu plazmy O2 zgodnie z instrukcją producenta reaktora plazmowego. Próbkę traktujemy przez 5 min przy mocy 200 W i przepływie O2 wynoszącym 100 sccm. Zanurz próbkę w ddH2O i potwierdź, że powierzchnia jest superhydrofilowa. Dokładnie wysusz powierzchnię w strumieniu N2.</li>
	<li>Przygotuj 1 mM roztwór oktadecyltrichlorosilanu (OTS), dodając 39,6 μl OTS do 100 ml toluenu. Zanurz próbkę w roztworze na 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Krok ten należy przeprowadzić wewnątrz worka rękawiczkowego wypełnionego N2 (Ryc. 1: Krok B).</li>
	<li>Aby usunąć cząsteczki fizysorbowane, poddaj próbkę sonikacji w toluenie, acetonie, etanolu i ddH2O przez 5 min w każdym z tych mediów, w podanej kolejności. Przepłucz próbkę czterokrotnie w świeżej ddH2O i wysusz powierzchnię w strumieniu N2. Powierzchnia powinna być hydrofobowa, z kątem zwilżania wynoszącym 100-110°.</li>
</ol>
3. Wzorowanie powierzchni ex-situ
<ol>
	<li>Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, narysuj na powierzchni kilka linii pomocniczych za pomocą rysika diamentowego. Znaczniki te pomagają w śledzeniu przetworzonych obszarów oraz w ustawianiu ostrości mikroskopu. Sterylizuj TiO2 powleczony OTS poprzez zanurzenie próbki w 70% etanolu na 5 min. Następnie przemyj próbkę dwukrotnie w sterylnej ddH2O.</li>
	<li>Umieść próbkę w szalce 35-mm i dodaj 2 ml pożywki wzrostowej dla linii PC12 (patrz Krok 4.2). Inkubuj przez ponad 3 hr w inkubatorze CO2 (37 °C). Procedura ta ma na celu umożliwienie adsorpcji albumin surowiczych na powierzchni. Zaadsorbowane albuminy hamują późniejszą adsorpcję innych białek i komórek (Rysunek 1: Krok C).</li>
	<li>W czasie oczekiwania przygotuj odwrócony mikroskop fluorescencyjny.
	<ol>
		<li>Włącz lampę łukową, włóż kostkę z filtrem UV i ustaw obiektyw na 20X.</li>
		<li>Zmierz natężenie światła I (W cm-2) za pomocą miernika natężenia UV i oblicz czas naświetlania t (w sekundach) dla dawki d (w J cm-2) według wzoru: t = d/I. 
		Na przykład, aby naświetlić próbkę dawką 200 J cm-2 przy użyciu źródła światła o mocy 600 mW cm-2, wymagane jest 333 sec naświetlania.</li>
		<li>Użyj mikrometru przedmiotowego i przymknij przysłonę pola widzenia, aby ustawić rozmiar obszaru do naświetlania, np. 200 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 3 hr inkubacji uzupełnij pożywkę o 200 μl kolagenu typu IV o stężeniu 3,0 mg ml-1 (Col-IV; stężenie końcowe 300 μg ml-1).</li>
	<li>Przenieś szalkę 35-mm na stolik mikroskopu. Znajdź linię pomocniczą, ustaw ostrość mikroskopu na powierzchni próbki i naświetl światłem UV dawką 200 J cm-2 (Rysunek 1: Krok D). Obszar naświetlania UV można zmieniać, regulując otwór przysłony pola widzenia lub zastępując przysłonę maską metalową o dowolnej geometrii.</li>
	<li>Wymień pożywkę na świeżą pożywkę wzrostową (bez Col-IV) i umieść próbkę z powrotem w inkubatorze.</li>
</ol>
4. Hodowla komórek
<ol>
	<li>Rutynowa hodowla komórek PC12 jest prowadzona na plastikowych szalkach pokrytych kolagenem.
	<ol>
		<li>Aby pokryć 60-mm szalkę do hodowli tkankowej Col-IV, najpierw zwilżyć powierzchnię ddH2O, a następnie odessać całą ddH2O.</li>
		<li>Przygotować roztwór Col-IV o stężeniu 300 μg ml-1, rozcieńczając roztwór wyjściowy (3 mg ml-1) 10-krotnie w ddH2O.</li>
		<li>Dodać 200 μl Col-IV (300 μg ml-1) na jedną 60-mm szalkę. Pozostawić roztwór do rozprowadzenia się po całej powierzchni.</li>
		<li>Osuszyć szalkę w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza przez około 1 hr.</li>
		<li>Przepłukać powierzchnię dwukrotnie 4 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (D-PBS). W przypadku braku natychmiastowego użycia pokrytej szalki, przepłukać ją raz 4 ml ddH2O. Po odessaniu ddH2O przechowywać szalkę w inkubatorze. Należy starać się nie przechowywać jej dłużej niż dwa tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki PC12 hoduje się w pożywce wzrostowej składającej się z: pożywki Eagle'a modyfikowanej przez Dulbecco (niska zawartość glukozy) + 10% płodowej surowicy bydlęcej + 5% surowicy końskiej + 1% roztworu penicyliny-streptomycyny. Inkubować komórki w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2) i wymieniać połowę pożywki co drugi dzień. Przesiewać komórki przed osiągnięciem konfluencji.
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę wzrostową i dodać 2 ml PBS+ (D-PBS + 10 mg ml-1 albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 10 mM EDTA) podgrzanego do 37 °C. Inkubować przez 5 min w 37 °C. Delikatnie opukać szalkę, aby odczepić wszystkie komórki.</li>
		<li>Zebrać komórki do 15 ml probówki stożkowej. Przepłukać szalkę 3 ml świeżego D-PBS podgrzanego do 37 °C.</li>
		<li>Wirować probówkę przy 150 × g przez 4 min.</li>
		<li>Odessać nadsącz i dodać 1 ml pożywki wzrostowej.</li>
		<li>W hodowli rutynowej rozdzielać komórki w stosunku od 1:3 do 1:5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wysiać komórki na próbkę OTS/TiO2 modyfikowaną promieniowaniem UV, należy ocenić gęstość komórek i dodać 3,0×105 komórek na 35-mm szalkę (Figure 1: Krok E). Inkubować szalkę w inkubatorze z nawilżaczem (37 °C, 5% CO2) przez 1-2 dni. Do eksperymentów z wzorcowaniem można wykorzystać zarówno naiwne, jak i zróżnicowane czynnikiem wzrostu nerwów (NGF) komórki PC12. W celu indukcji różnicowania NGF, kilka dni przed wysianiem komórek na próbkę, do pożywki wzrostowej dodaje się 100 ng ml-1 7S-NGF. Różnicowanie NGF wydaje się zwiększać adhezyjność komórek PC12 i ułatwia ich manipulację, zwłaszcza w eksperymentach z wzorcowaniem in-situ.</li>
</ol>
5. Wzorowanie powierzchni in situ
<ol>
	<li>Po 1-2 dniach hodowli na powierzchni zmodyfikowanej ex-situ, potwierdź, że komórki przywierają i rosną wyłącznie w obszarze naświetlanym promieniowaniem UV. Przygotuj mikroskop zgodnie z opisem w kroku 3.4.</li>
	<li>Przenieś próbkę do nowej 35-milimetrowej szalki do hodowli tkanek zawierającej pożywkę wzrostową, 100 ng ml-1 NGF (w przypadku użycia komórek zróżnicowanych za pomocą NGF) oraz 100 μg ml-1 Col-IV.</li>
	<li>Umieść szalkę na stoliku mikroskopu. Znajdź odpowiednią pozycję i naświetl próbkę promieniowaniem UV z dawką 200 J cm-2 (Rysunek 1: Krok F, G). Nowo utworzony obszar dopuszczający jest oznaczony gwiazdką na Rysunku 1: Krok G.</li>
	<li>Postaraj się zakończyć obróbkę pojedynczej próbki w ciągu 30 min. Po naświetlaniu przenieś próbkę z powrotem do pożywki bez Col-IV.</li>
	<li>Zachowaj szczególną ostrożność podczas przenoszenia szalki z hodowlą komórek oraz podczas transferu próbki między szalkami, aby zapobiec odklejeniu się ukształtowanych struktur komórkowych.</li>
</ol>
<img alt="Schemat wiązania białek indukowanego promieniowaniem UV; szkło TiO2, SAM OTS, albumina, kolagen, proces z komórkami PC12." src="/files/ftp_upload/53045/53045fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczny opis całego procesu. Szczegóły znajdują się w tekście. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53045/53045fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Patterning+on+Photolithographically+Defined+Parylene-C%3A+SiO2+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates.</a> J. Vis. Exp. (85), e50929(2014).</li>
<li>Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Outgrowth+of+Dissociated+Neurons+on+Patterned+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates.</a> J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).</li>
<li>Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Beam+Patterning+of+Fibronectin+Nanodots+that+Support+Focal+Adhesion+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation.</a> Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).</li>
<li>Tanii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Organosilane+Monolayer+Template+to+Quantitative+Evaluation+of+Cancer+Cell+Adhesive+Ability%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability.</a> Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01(2011).</li>
<li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Situ+Guidance+of+Individual+Neuronal+Processes+by+Wet+Femtosecond+Laser+Processing+of+Self-Assembled+Monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers.</a> Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).</li>
<li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Neurite+Outgrowth+is+Required+for+Axon+Specification+by+Cultured+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons.</a> J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).</li>
<li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+Proteins+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (22), e1065(2008).</li>
<li>Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Two-Dimensional+Patterned+Substrates+for+Protein+and+Cell+Confinement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement.</a> J. Vis. Exp. (55), e3164(2011).</li>
<li>Singhvi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Cell+Shape+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering Cell Shape and Function.</a> Science. 264, 696-698 (1126).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li>
<li>Degot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Visualization+and+Quantitative+Analysis+of+Drug+Effects+using+Micropatterned+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells.</a> J. Vis. Exp. (46), e2514(2010).</li>
<li>Nakanishi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+of+a+Substrate+for+Cell+Adhesion+under+Standard+Fluorescence+Microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressable+Micropatterning+of+Multiple+Proteins+and+Cells+by+Microscope+Projection+Photolithography+Based+on+a+Protein+Friendly+Photoresist%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist.</a> Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).</li>
<li>Deka, G., Okano, K., Kao, F. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Photopatterning+of+Cells+In+Situ+by+Q-Switched+Neodymium-Doped+Yttrium+Ortho-Vanadate%5BTitle%5D)+AND+%22Laser.+J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate.</a> Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012(2014).</li>
<li>Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Control+over+Cell+Adhesive+Properties+using+Molecular-Based+Surface+Engineering+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).</li>
<li>Choi, I., Yeo, W. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Monolayers+with+Dynamicity+Stemming+from+%28Bio%29chemical+Conversions%3A+From+Construction+to+Application%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application.</a> ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).</li>
<li>Nakanishi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switchable+Substrates+for+Analyzing+and+Engineering+Cellular+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Asian+J%22%5BJournal%5D)">Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions.</a> Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).</li>
<li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Modification+of+Cell-Culture+Scaffolds+by+Photocatalytic+Decomposition+of+Organosilane+Monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers.</a> Biofabrication. 6, 035021(2014).</li>
<li>Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Modification+of+Cell+Scaffold+in+Aqueous+Solution+using+TiO2+Photocatalysis+and+Linker+Protein+L2+for+Patterning+Primary+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22e-J.+Surf.+Sci.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons.</a> e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).</li>
<li>Arima, Y., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Surface+Functional+Groups+on+Protein+Adsorption+and+Subsequent+Cell+Adhesion+using+Self-Assembled+Monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers.</a> J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).</li>
<li>Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiO2+Photocatalysis+and+Related+Surface+Phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena.</a> Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).</li>
<li>Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Surface+Wettability+on+the+Adsorption+of+Proteins+and+Detergents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents.</a> J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+and+Photo-Patternable+Superhydrophobic+Film%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film.</a> Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing Hippocampal Neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W naszym obecnym protokole folia TiO2 została utworzona przez rozpylanie magnetronowe RF. Preferujemy tę metodę osadzania, ponieważ pozwala nam ona na powtarzalne przygotowanie fotokatalitycznego filmu TiO2 o chropowatości sub-nm. Chociaż procesy osadzania napylania są znane materiałoznawcom i inżynierom elektronikom, mogą nie być do końca dostępne dla biologów. W takim przypadku folia TiO2 z powłoką wirową byłaby alternatywnym wyborem23. W tej metodzie nanocząstki TiO2</s...

Procesy litografii półprzewodnikowej i jej pochodne - takie jak fotolitografia1,2, litografia wiązką elektronów3-6 i druk mikrokontaktowy7-10 - stały się teraz uznanym narzędziem w biologii komórki do hodowli żywych komórek w określonej pozycji i geometrii. Metoda modelowania opiera się na wykorzystaniu mikroprefabrykowanych podłoży, składających się z mikrowyspy permisywnej powłoki komórkowej na nieprzepuszczalnym tle. Takie podłoże służy jako szablon do modelowania komórek. Technologie te dostarczyły nam nowatorskich metod inżynierii komórek i ich funkcji na poziomie jedno- i wielokomórkowym, ekstrakcji wewnętrznych właściwości komórek oraz zwiększenia przepustowości komórkowych badań przesiewowych leków11.
Stopień swobody w tworzeniu wzorów komórkowych znacznie by wzrósł, gdyby geometria wzorca szablonu mogła być zmieniana in situ, tj. podczas hodowli komórek na powierzchni. Konwencjonalne metody tworzenia wzorów nie mogą być tutaj bezpośrednio stosowane, ponieważ przetwarzają próbki w atmosferze lub w próżni. W związku z tym zaproponowano różne nowe techniki modyfikacji powierzchni, które opierają się m.in. na związkach fotoreaktywnych12,13 czy ablacji laserowej5,14. Proponowane metody zostały ładnie zrecenzowane przez Robertusa i wsp.15, a ostatnio przez Choi i wsp.16 i przez Nakanishiego17.
Tutaj w tym artykule opisujemy nowy protokół modyfikacji powierzchni in-situ, który wykorzystuje fotokatalityczny rozkład cząsteczek organicznych na powierzchni dwutlenku tytanu (TiO2)18,19. W tej metodzie folia TiO2 jest umieszczana między szklanym podłożem a folią organiczną, która łączy komórki, a folia organiczna jest rozkładana in situ przez miejscowe naświetlanie światłem ultrafioletowym (UV) do obszaru zainteresowania (λ < 388 nm). Pokazujemy, że nowy protokół może być wykorzystany do tworzenia mikrowzorców białek macierzy zewnątrzkomórkowej i żywych komórek zarówno ex situ, jak i in situ. TiO2 jest biokompatybilny, stabilny chemicznie i optycznie przezroczysty, co sprawia, że jest przyjazny do wprowadzenia w eksperymentach z hodowlami komórkowymi. Protokół ten stanowi opartą na materiałoznawstwie alternatywę dla modyfikacji rusztowań kultur komórkowych w środowisku hodowli komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>szklane Warner Instruments</td><td>CS-15R15</td><td>średnica 15 mm, grubość #1,5</td></tr><tr><td>Rysik diamentowy</td><td>Ogura Jewel Industry</td><td>D-Point Pen</td><td></td></tr><tr><td>System napylania RF</td><td>ANELVA</td><td>SPC350</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 cel rozpylania</td><td>Kojundo Chemical Lab</td><td>Tlenek tytanu (IV), cel</td><td>Czystość, 99,9%</td></tr><tr><td>Reaktor plazmowy</td><td>Yamato</td><td>PR301</td><td></td></tr><tr><td>n-oktadecylotrichlorosilan (OTS)</td><td>Aldrich</td><td>104817</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Wako</td><td>204-01866</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych (35&#160; mm)</td><td>Greiner</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych (60&#160; mm)</td> <td>BD Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu IV</td><td>Nitta Gelatin</td><td>Cellmatrix Typ IV</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Gibco</td><td>12483-020</td><td>Inaktywacja termiczna i przejście przez 0,22&#160; &#956; m filtr przed użyciem</td></tr><tr><td>Serum dla koni</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td>Przepuścić przez 0,22 i # 160; &#956; m filtr przed użyciem</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (100x)</td><td>Nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>7S czynnik wzrostu nerwów (NGF)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-130</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo</td><td>N001</td><td>Roztwór podstawowy w 0,5 M</td></tr><tr><td>nanocząsteczce TiO2</td><td>Tayca</td><td>TKD-701</td><td></td></tr></tbody></table>

fotowzorcowanie białek i komórek w środowisku wodnym za pomocą fotokatalizy tio2

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

Zanieczyszczenia organiczne zaadsorbowane na powierzchni dwutlenku tytanu (TiO2) mogą być rozkładane przez fotokatalizę pod wpływem światła ultrafioletowego (UV). W tym miejscu opisujemy nowatorski protokół wykorzystujący fotokatalizę TiO2 do lokalnej zmiany powinowactwa komórek na powierzchni substratu. W tym eksperymencie cienka warstwa TiO2 została pokryta napylaniem na szklane szkiełko nakrywkowe, a powierzchnia TiO2 została następnie zmodyfikowana monowarstwą organosilanu pochodzącą z oktadecylotrichlorosilanu (OTS), który hamuje adhezję komórek. Próbkę zanurzono w pożywce do hodowli komórkowej, a skupione światło UV napromieniowano na obszar ośmiokątny. Kiedy komórki PC12 linii komórek neuronalnych zostały posiane na próbce, komórki przylegały tylko do obszaru naświetlanego promieniowaniem UV. Dalej pokazujemy, że ta modyfikacja powierzchni może być również przeprowadzana in situ, tj. nawet wtedy, gdy komórki rosną na podłożu. Właściwa modyfikacja powierzchni wymagała, aby białko kolagenu macierzy zewnątrzkomórkowej było obecne w pożywce w momencie naświetlania promieniami UV. Przedstawiona tutaj technika może być potencjalnie wykorzystana do modelowania wielu typów komórek w celu konstruowania systemów kokultury lub do arbitralnego manipulowania komórkami w hodowli.

Rysunek 2A przedstawia obraz z przekroju wykonany za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) filmu TiO2 osadzonego metodą rozpylania katodowego. Na podstawie obserwacji oszacowano, że grubość filmu wynosi około 150 nm. Zauważalna jest tutaj płaskość osadzonego filmu TiO2. Dalsza analiza za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) wykazała, że chropowatość powierzchni mierzona jako wartość średnia kwadratowa (rms) wynosiła 0,2 nm (Rysunek 2B).
<p class="j...

Opisujemy protokół modyfikacji powinowactwa komórek powierzchni rusztowania w środowisku wodnym. Metoda wykorzystuje fotokatalizę dwutlenku tytanu do rozkładu filmu organicznego w obszarze napromieniowanym światłem. Pokazujemy, że można go wykorzystać do tworzenia mikrodomen białek rusztowań, zarówno ex situ, jak i in situ.

Fotowzorcowanie białek i komórek w środowisku wodnym za pomocą fotokatalizy TiO2

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przeprowadzenie modyfikacji powierzchni rusztowania do hodowli komórek z wykorzystaniem aktywności fotokatalitycznej dwutlenku tytanu. Osiąga się to poprzez osadzenie cienkiej warstwy dwutlenku tytanu na szklanym szkiełku nakrywkowym, a następnie pokrycie go oktadecylochlorosilanem w celu nadania całej powierzchni właściwości hydrofobowych. W drugim kroku podłoże jest blokowane poprzez zanurzenie go w pożywce do hodowli komórek zawierającej albuminę surowiczą.Albumin adsorbuje się na powierzchni, czyniąc ją nieprzepuszczalną dla adhezji komórek. Następnie próbkę przenosi się do roztworu wodnego zawierającego kolagen, a następnie powierzchnię naświetla się skupionym światłem UV. Pozwala to cząsteczkom kolagenu na selektywną adsorpcję w obszarze naświetlonym, co czyni ten region podatnym na adhezję komórek.Proces ten można powtarzać w celu wzorowania wielu białek lub typów komórek. W tym filmie pokazujemy, jak region adhezyjny komórek PC 12 może zostać selektywnie zmodyfikowany za pomocą naświetlania UV. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy, że fotokataliza dwutlenkiem tytanu znajduje zastosowanie komercyjne w samoczyszczących się oknach szklanych, które pod wpływem promieniowania świetlnego usuwają zanieczyszczenia organiczne z powierzchni, co dowodzi skuteczności tej procedury; obecnie poszukujemy studenta studiów doktoranckich z mojego laboratorium do wspólnego prowadzenia tych badań.Zacznij od ponumerowania szkiełek nakrywkowych za pomocą rysika diamentowego w sposób, który pomoże upewnić się, że właściwa strona próbki jest skierowana do góry. Następnie oczyść szkiełka nakrywkowe, najpierw pod bieżącą wodą dwukrotnie destylowaną, a następnie poprzez zanurzenie ich w roztworze piranha na 10 minut. Po 10 minutach opłucz szkiełka nakrywkowe ośmiokrotnie w wodzie dwukrotnie destylowanej i wysusz je strumieniem azotu.Następnie umieść tarczę z tlenku tytanu w systemie rozpylania wysokoczęstotliwościowego (RF), a następnie przymocuj czyste szkiełka nakrywkowe do uchwytu próbek za pomocą taśmy poliamidowej, umieść uchwyt w komorze rozpylania i odessaj powietrze z komory, aż ciśnienie osiągnie 2,0 × 10⁻⁴ Pa. Następnie wprowadź do komory argon i ustaw ciśnienie osadzania na 4,0 mTorr, utrzymując zamkniętą przysłonę. Stopniowo zwiększ moc RF do 70 W.Następnie otwórz migawkę i prowadź napylanie przez 15 minut, aby uzyskać warstwę o grubości od 120 do 150 nanometrów. Rozpocznij od wysuszenia zlewki szklanej i pęsety w piekarniku w temperaturze 120 °C przez 30 minut. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe w reaktorze plazmowym i poddaj powierzchnię dwutlenku tytanu działaniu plazmy tlenowej przez pięć minut przy mocy 200 W i przepływie tlenu wynoszącym 100 standardowych centymetrów sześciennych na minutę, aby uzyskać powierzchnię bardziej hydrofilową.Następnie wyjmij próbki i zanurz je w wodzie podwójnie destylowanej, aby potwierdzić, że powierzchnia jest superhydrofilowa, a następnie dokładnie osusz powierzchnię w strumieniu azotu. Dalej, przenieś próbki, wysuszony zlew i pincetę do worka rękawiczkowego wypełnionego azotem i przygotuj 1 mM roztwór oktadecylotrichloretylenu rozpuszczonego w toluenie. Zanurz próbkę w roztworze na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby utworzyć samozorganizowaną monowarstwę na powierzchni tlenku tytanu.Następnie usuń wszelkie cząsteczki fazora, płucząc próbkę w toluenie, acetonie, etanolu, a na koniec w wodzie dwukrotnie destylowanej przez pięć minut w każdym z tych roztworów. Następnie przepłucz próbkę czterokrotnie w świeżej wodzie dwukrotnie destylowanej i wysusz powierzchnię w strumieniu azotu.Sterylizuj pokrywki szkiełek obiektowych z powłoką, zanurzając próbki w 70% etanolu przez pięć minut. Następnie przepłucz próbki dwukrotnie w sterylnej wodzie dwukrotnie destylowanej. Dalej, umieść próbkę w szalce o średnicy 35 mm i dodaj dwa mililitry pożywki wzrostowej dla PC 12.Inkubować próbki przez co najmniej trzy godziny w inkubatorze z buforowaniem CO2 w temperaturze 37°C, aby albuminy surowicy w medium zdążyły zaadsorbować się na powierzchni szkiełek zakrywek. Przygotować odwrócony mikroskop fluorescencyjny, włączając w pierwszej kolejności lampę łukową. Następnie włożyć kostkę filtra UV i przekręcić obiektyw na taki o powiększeniu 20x.Zmierz natężenie światła za pomocą miernika natężenia UV i oblicz czas naświetlania dla dawki 200 joules per square centimeter. Następnie, używając mikrometru przedmiotowego, ustaw średnicę obszaru do naświetlania na 200 microns poprzez regulację przysłony pola widzenia. Po trzygodzinnej inkubacji uzupełnij pożywkę pokrywającą szkiełka podstawowe 200 microliters kolagenu typu czwartego o stężeniu 3.0 milligrams per milliliter.Następnie przenieś szalkę 35 milimetrową na stolik mikroskopu i ustaw ostrość mikroskopu na powierzchni próbki, korzystając z nacięć pomocniczych. Naświetl obszar szkiełka podstawowego światłem UV z dawką 200 j/cm². Następnie wymień pożywkę na dwa mililitry świeżej pożywki wzrostowej z NGF i bez kolagenu typu IV, a próbkę umieść ponownie w inkubatorze.Zebrać hodowlę zróżnicowanych pod wpływem NGF komórek PC 12 do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml i odwirować probówkę z prędkością 150 ×g przez cztery minuty. Następnie odessać nadsącz i dodać jeden mililitr pożywki wzrostowej. Resuspenderć komórki, delikatnie pipetując zawiesinę w górę i w dół, a następnie ocenić ich liczbę za pomocą cytometru hematologicznego.Oznacz gęstość komórek i przenieś 3,0 × 10⁵ komórek do szalki 35 mm zawierającej zmodyfikowane szkiełka podstawowe. Inkubuj szalkę przez jeden do dwóch dni w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C po jednym do dwóch dniach hodowli na zmodyfikowanej powierzchni XC 2. Za pomocą mikroskopu potwierdź, że komórki przylegają i rosną wyłącznie w obszarze szkiełek podstawowych naświetlonym promieniowaniem UV.Następnie do szalki z hodowanymi komórkami należy dodać 67 µL kolagenu typu IV, tak aby końcowe stężenie kolagenu wynosiło 100 µg/mL, przy mikroskopie skonfigurowanym do wzorowania powierzchni. Szalkę należy umieścić na stoliku mikroskopu i ustawić obszar naświetlania obok aktualnego położenia komórek. Następnie należy naświetlić szkiełko podstawowe światłem UV z dawką 200 J/cm².Po napromieniowaniu należy zastąpić pożywkę taką, która nie zawiera kolagenu, a następnie umieścić próbkę z powrotem w inkubatorze, starając się zakończyć przetwarzanie pojedynczej próbki w ciągu 30 minut. Jest to obraz przekroju poprzecznego wykonany za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, przedstawiający warstwę dwutlenku tytanu naniesioną metodą rozpylania magnetronowego. Na podstawie obserwacji grubość warstwy oszacowano na około 150 nanometrów.Zauważalna jest tutaj również płaskość naniesionej warstwy dwutlenku tytanu. Dalsza analiza z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych wykazała, że średniokwadratowa chropowatość powierzchni wynosiła zaledwie 0,2 nanometra. Kolagen typu IV oraz roztwór absorbują preferencyjnie w obszarze naświetlonym promieniowaniem UV, w którym albuminy zostały usunięte przez laser.Aby zademonstrować wszechstronność tego podejścia, za pomocą tej samej techniki naniesiono wzory z innych białek, takich jak fibryna. Tutaj komórki rosną na obszarze z naniesionym wzorem XC dwa na szkiełku podstawowym oraz bezpośrednio obok nich, w obszarze wyznaczonym linią przerywaną. Szkiełko podstawowe zostało niedawno poddane naświetlaniu UV in situ dwa i pokryte kolagenem typu cztery.Przez następne pięć dni komórki proliferują i migrują, aby pokryć nowo zakodowany obszar. Przedstawiona tutaj procedura może zostać wykorzystana do dowolnej manipulacji komórkami w hodowli i potencjalnie do wzorowania wielu typów komórek w celu stworzenia złożonych systemów współhodowli.

photopatterning-proteins-cells-aqueous-environment-using-tio2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niebędąca podatna na fouling monowarstwa silanu PEG została desorbowana z indywidualnie adresowalnych elektrod ITO na szkle poprzez przyłożenie potencjału redukcyjnego. Elektrochemiczne usuwanie warstwy silanu PEG z mikroelektrod ITO umożliwiło adhezję komórek w sposób przestrzennie zdefiniowany, przy czym wzory komórkowe ściśle odpowiadały rozmieszczeniu elektrod.

Wzorcowanie komórek na optycznie przezroczystych elektrodach z tlenku indu i cyny

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorów komórkowych na SiO2 kompatybilną z mikrofabrykacją. Predefiniowany wzór parylenu-C jest drukowany fotolitograficznie na płytkach SiO2. Po inkubacji z surowicą (lub innym roztworem aktywacyjnym) komórki przylegają specyficznie (i rosną zgodnie z zgodnością) leżącego poniżej parylenu-C, będąc jednocześnie odpychane przez regiony SiO2.

Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie 
Parylene-C: Substraty SiO2

Przedstawiono procedury przygotowania segmentowanych i współosiowych nanoprzewodów za pomocą elektroosadzania szablonowego w nanoporach. Jako przykłady wykonano segmentowane nanodruty składające się z segmentów Ag i ZnO oraz współosiowe nanodruty składające się z powłoki TiO2 i rdzenia Ag. Nanodruty wykorzystano w eksperymentach z fotokatalitycznym tworzeniem wodoru.

Przygotowanie i stosowanie fotokatalitycznie aktywnego segmentowego Ag|ZnO i koncentryczne nanodruty TiO2-Ag wykonane metodą elektroosadzania szablonowego

Przedstawiono protokół fotochemicznego wzrostu oksydacyjnego małych krystalicznych nanocząstek tlenku irydu na powierzchni CdSe@CdS zasianych nanocząstek pręcików.

Fotochemiczny wzrost oksydacyjny nanocząstek tlenku irydu na CdSe@CdS nanoprętach

Ten artykuł bada przydatność druku atramentowego do produkcji barwnikowych ogniw słonecznych. Opracowano niezawierający spoiwa atrament nanocząsteczkowy TiO2 i wydrukowano go na podłożu szklanym FTO. Zadrukowana warstwa została wyprodukowana w komórce o powierzchni czynnej 0,25cm2 i wydajności 3,5%.

Druk cyfrowy dwutlenku tytanu do ogniw słonecznych uczulonych na barwnik

Metoda dla w pełni drukowalnych, wolnych od fulerenów, wysoce stabilnych, masowo-heterozłączowych ogniw słonecznych opartych na alkoholanach Ti jako akceptorze elektronów i produkcji polimeru oddając elektrony jest opisana tutaj. Ponadto opisano metodę kontrolowania morfologii warstwy fotoaktywnej poprzez masowość molekularną jednostek Ti-alkoxidian.

Kontrola morfologii dla w pełni drukowalnych organiczno-nieorganicznych ogniw słonecznych z heterozłączami masowymi na bazie tytanowo-alkoksydowego i polimeru półprzewodnikowego

Ogólnym celem tego projektu było wykorzystanie elektroprzędzenia do wytworzenia fotoanody o ulepszonej wydajności dla barwnikowych ogniw słonecznych.

Elektroprzędzenie elektrod fotokatalitycznych do barwnikowych ogniw słonecznych

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania chromoforów do przenoszenia ładunku na bazie membrany kompozytowej z polioksometalunu/polimeru.

Przygotowanie membran fotoczułych na bazie polioksometalanu do fotoaktywacji katalizatorów tlenku manganu

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły dla przetwarzanych w roztworze cienkich warstw półprzewodnikowych srebra, bizmutu i jodu (Ag-Bi-I) wytwarzanych na przezroczystych elektrodach pokrytych TiO2 oraz ich potencjalnego zastosowania jako stabilnych i bezołowiowych urządzeń optoelektronicznych.

Trójskładnikowe cienkie warstwy "srebrowo-bizmutowo-jodowe" przetworzone w roztworze do bezołowiowych absorberów fotowoltaicznych

Bezpośrednio włączyliśmy organiczny barwnik na bazie stylbenu do rdzenia kobaloksymu, aby wygenerować diadę fotosensybilizatora-katalizatora do fotokatalitycznej produkcji H2. Opracowaliśmy również prosty układ eksperymentalny do oceny produkcjiH2 sterowanej światłem przez montaże fotokatalityczne.

Opracowanie hybryd fotouczulacza i kobaloksymu do produkcjiH2 napędzanej energią słoneczną w wodnych warunkach tlenowych

Prezentowany tutaj jest protokół do zbadania uniwersalnego zestawu procedur eksperymentalnych do kompleksowej oceny laboratoryjnej fotokatalizatorów w dziedzinie oczyszczania środowiska, na przykładzie fotokatalitycznego usuwania antybiotykowych cząsteczek zanieczyszczeń organicznych z wody za pomocą uczulonych ftalocyjaniną kompozytów fosforanu srebra.

Kompletna metoda oceny wydajności fotokatalizatorów w degradacji antybiotyków w remediacji środowiska

Poznaj metodę modyfikacji powierzchni rusztowań komórkowych za pomocą fotokatalizy dwutlenku tytanu. Technika umożliwia tworzenie mikrodomen kolagenowych dla selektywnej adhezji komórek in situ.

Fotowzorcowanie białek i komórek w środowisku wodnym za pomocą fotokatalizy TiO₂

Przeglądaj więcej filmów