Przygotowanie i charakterystyka pojedynczych i wielolekowych, fizycznie uwięzionych miceli polimerowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest nakreślenie krok po kroku procesu przygotowania i scharakteryzowania komórek obciążonych lekiem przed oceną ich w stanach chorobowych będących przedmiotem zainteresowania. Osiąga się to poprzez przygotowanie moich komórek metodą odlewania rozpuszczalnikiem w celu wygenerowania odtwarzalnych moich komórek do badania. W drugim kroku ocenia się stabilność i rozmiar moich komórek, co określa zdolność moich komórek do ładowania i utrzymywania klinicznie istotnych stężeń.

Następnie określa się szybkość uwalniania leku z komórek My w celu upewnienia się, że moje komórki mają odpowiednią charakterystykę uwalniania in vitro przed oceną stabilności in vivo. Wyniki pokazują, że odtwarzalnie generowane, stabilne komórki mogą stanowić platformę do dostarczania leków w różnych stanach chorobowych w oparciu o przedstawione tutaj techniki oceny. Główną zaletą tej techniki lub istniejących metod, takich jak ładowanie równowagowe lub metody dializy, jest to, że miozyny mogą być wytwarzane znacznie szybciej dzięki powtarzalnemu obciążeniu i wielkości leku.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę różnych stanów chorobowych, ponieważ leki w nanoskali oferują możliwości wykraczające poza konwencjonalne formy, Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają, mogą zmagać się z tymi technikami, mimo że są one proste, ponieważ nadal możesz przeprowadzić badania uwalniania, nie możesz tak naprawdę ocenić efektu pęknięcia. Zademonstrują tę procedurę Shaman Duke, mój doktorant, i Deepa, mój współpracownik, którzy najpierw odważą jeden miligram DTX, jeden miligram EVR i 15 miligramów Peg 4, 000 block PLA 2200 dla podwójnego leku my cells lub DDM. Po odważeniu rozpuść leki i polimer w 0,5 mililitra acetonitrylu, a następnie przenieś roztwór do pięciomililitrowej kolby okrągłodennej, tworząc cienką warstwę polimerową rozprowadzaną przez odparowanie roztworu aceto polimeru leku pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.

Następnie należy ponownie uwodnić film polimerowy leku za pomocą 0,5 mililitra wody dejonizowanej podgrzanej do 50 stopni Celsjusza i delikatnie wstrząsnąć kolbą w łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza, aby utworzyć komórki myszy. Dodać roztwór do probówki wirówkowej i wirować z prędkością 7 200 razy G przez trzy minuty. Pobrać roztwór za pomocą igły i przefiltrować powstały roztwór Micella do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej za pomocą nylonowego filtra 0,2 mikrona, aby usunąć wszelkie nierozpuszczone leki lub zanieczyszczenia W tym momencie przeprowadzić analizę HPLC w odwrotnej fazie z ośmiokolumnową C zrównoważoną w temperaturze 40 stopni Celsjusza w trybie sokratejskim z ruchomą fazą próby acetylu I i rozcieńczyć wodą świeżo przygotowane komórki mycells w próbie ace eye w stosunek jeden do 100 przed analizą za pomocą HPLC z odwróconą fazą w celu określenia początkowego obciążenia lekiem.

Po przechowywaniu nierozcieńczonych komórek w temperaturze pokojowej przez 48 godzin, przygotuj świeże rozcieńczone próbki do ponownej oceny za pomocą HPLC z odwróconymi fazami i określ stabilność leku w moich komórkach w ciągu 48 godzin. Monitoruj szczyty DTX i DVR przy 227 i 279 nanometrach z czasami retencji odpowiednio 1,7 i 5,7 minuty. Przedstaw dane jako średnią plus lub minus odchylenie standardowe obciążenia lekiem.

Następnie rozcieńczyć świeżo przygotowane komórki i dejonizowaną wodę w stosunku od 1 do 20, aby uzyskać końcowe stężenie polimeru 1,5 miligrama na mililitr. Przenieś roztwór do weterynarza w celu dynamicznego pomiaru rozpraszania światła. Zmierz intensywność lasera helowo-neonowego pod kątem 173 stopni, aby określić rozpraszanie.

Przedstaw dane jako średnią wielkość Z plus minus odchylenie standardowe wraz ze wskaźnikiem polidyspersyjności lub PDI rozkładu. Po przygotowaniu DDM zgodnie z wcześniejszym opisem, załaduj 2,5 mililitra moich komórek do trzymililitrowej kasety dializacyjnej z odciętą masą cząsteczkową 7 000 gramów na mol. Umieść kasetę w 2.5 litrze 10-milimolowego buforu fosforanowego o pH 7,4 w następujących odstępach czasu.

Pobrać 150 mikrolitrów roztworu i zastąpić 150 mikrolitrami świeżego buforu. Zmieniaj bufor co trzy godziny, aby zapewnić warunki synchronizacji. Analizować próbki za pomocą HPLC z odwróconą fazą w celu wyznaczenia krzywej stężenia leku.

Dopasuj dane dotyczące uwalniania leku w oparciu o prosty model dyfuzji z jednofazowym asocjacją wykładniczą za pomocą oprogramowania statystycznego D-T-X-E-V-R, a DDM wykazał podobną stabilność w PEG 2000 bloku PLA 1800 lub PEG 2000 bloku PLA 2200 w ciągu 48 godzin. Wszystkie moje komórki zachowały 97% lub więcej początkowego obciążenia po 48 godzinach w temperaturze pokojowej. Opierając się na wynikach dynamicznego rozpraszania światła, wszystkie moje komórki wykazały rozkład jednomodalny z wartościami PDI mniejszymi niż 0,2.

Na podstawie danych uwolnienie DTX z poszczególnych komórek mycells i DDM wyniosło około 60% w ciągu 48 godzin. Uwalnianie EVR z poszczególnych moich komórek i DDM wynosiło odpowiednio 60% i 50%. Przedstawiono tutaj czas potrzebny na uwolnienie 50% leku z poszczególnych komórek i DDM oraz dane dotyczące dobroci dopasowania.

Dobroć dopasowania krzywej dla wszystkich moich komórek z wyjątkiem EVR indywidualnych, moje komórki wynosi powyżej 0,950, co oznacza, że założenie uwolnienia pierwszego rzędu jest dobrym przybliżeniem do wyjaśnienia uwalniania leku z poszczególnych moich komórek i DDM Po opanowaniu techniki te można rutynowo wykonywać na bibliotece leków i polimerów jako moje komórki w ciągu kilku godzin do tygodnia. Podczas tej procedury ważne jest, aby pamiętać o całkowitym scharakteryzowaniu moich komórek przed uzyskaniem dostępu do hodowli komórkowej lub modeli zwierzęcych zgodnie z tymi procedurami. Inne systemy dostarczania, takie jak liposomalny system dostarczania, mogą być również oceniane lub charakteryzowane, aby odpowiedzieć na pytanie o rolę systemu dostarczania leków w skuteczności leczenia.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i scharakteryzować ładowanie moich komórek lekiem przed oceną ich w chorobie. Stan zainteresowania.