Name: Przygotowanie i charakterystyka pojedynczych i wielolekowych, fizycznie uwięzionych miceli polimerowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metodę odlewu z rozpuszczalnika do przygotowania i charakteryzacji miceli polimerowych z załadowanymi lekami. Technika ta umożliwia szybkie i powtarzalne tworzenie stabilnych systemów dostarczania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant z AACP New Pharmacy Faculty Research Award Program, Medical Research Foundation of Oregon New Investigator Grant, Oregon State University-Startup fund, oraz Pacific University, School of Pharmacy Start-up fund.

1. Przygotowanie indywidualnych i wielolekowych miceli metodą odlewania rozpuszczalnikowego
<ol>
	<li>Odważyć DTX 1 mg lub EVR 1 mg lub oba leki w dawce 1 mg każdy dla miceli dwulekowych (DDM).</li>
	<li>Odważyć 15 mg PEG2000-b-PLA 1800 lub PEG 4000-b-PLA 2200 dla osób lub DDM.</li>
	<li>Rozpuścić lek/leki i polimer w 0,5 ml acetonitrylu i umieścić w kolbie okrągłodennej o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Utworzyć cienką warstwę polimerową rozprowadzaną przez odparowanie roztworu acetonitrylu polimeru leku (leków) pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej. Ustawić parownik obrotowy na 100 obr./min, temperaturę łaźni wodnej na 40 oC i podciśnienie 260 mbar na 5 min, a następnie redukcję do 100 mbar na kolejne 3 min.</li>
	<li>Ponownie uwodnić film polimerowy za pomocą 0,5 ml wody dejonizowanej o temperaturze 50 oC i delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby utworzyć micele.</li>
	<li>Przefiltruj otrzymany roztwór micelarny przez nylonowy filtr 0,2 μm, aby usunąć wszelkie nierozpuszczone leki lub zanieczyszczenia do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
</ol>
2. Ocena obciążenia i stabilności leku w micelach za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC)
<ol>
	<li>Przeprowadzić analizę RP-HPLC przy użyciu kolumny C8 o temperaturze 40 °C w trybie izokratycznym z fazą ruchomą acetonitryl/woda (62/38) zawierającą 0,1% kwasu fosforowego i 1% metanolu przy natężeniu przepływu 1 ml/min i objętości wtrysku 10 μl.</li>
	<li>Rozcieńczyć świeżo przygotowane micele (sekcja 1) w stosunku 1:100 w fazie ruchomej przed analizą za pomocą RP-HPLC w celu określenia początkowego obciążenia lekiem. Przechowywać nierozcieńczone pojedyncze micele i DDM w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 48 godzin i przygotować świeże próbki rozcieńczone w skali 1:100 w fazie ruchomej w celu ponownej oceny za pomocą RP-HPLC i określenia stabilności leku (leków) w micelach przez 24 godziny.</li>
	<li>Monitoruj szczyty DTX i EVR odpowiednio przy 227 i 279 nm z czasami retencji odpowiednio 1,7 i 5,7 min. Wykonaj wszystkie pomiary w trzech egzemplarzach. Przedstaw dane jako średnie obciążenie ± SD leków.</li>
</ol>
3. Ocena wielkości cząstek miceli za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
<ol>
	<li>Rozcieńczyć świeżo przygotowane micele (zgodnie z opisem w sekcji 1) w wodzie dejonizowanej w stosunku 1:20, aby uzyskać końcowe stężenie polimeru 1,5 mg/ml.</li>
	<li>Zmierz intensywność lasera He-Ne (633 nm) pod kątem 173°, aby określić rozpraszanie. Wszystkie pomiary należy wykonać w temperaturze 25 °C po osiągnięciu równowagi wstępnej przez 2 minuty.</li>
	<li>Wykonaj wszystkie pomiary w trzech egzemplarzach. Przedstaw dane jako średnią wielkość Z ± SD wraz ze wskaźnikiem polidyspersyjności (PDI) rozkładu.</li>
</ol>
4. Ocena uwalniania leków in vitro z poszczególnych miceli i DDM
<ol>
	<li>Przygotuj poszczególne micele i DDM zgodnie z opisem w punkcie 1. Załadować 2,5 ml miceli do kasety dializacyjnej o pojemności 3 ml z punktem odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącym 7 000 g/mol. 
	UWAGA: To MWCO zostało wybrane, aby umożliwić swobodną dyfuzję wolnych leków wraz z niepowiązanymi cząsteczkami polimeru z kasety, a tym samym zapewnić warunki zlewu.</li>
	<li>Umieść kasety w 2,5 l 10 mM buforu fosforanowego o pH 7,4 (przygotowanym przez rozcieńczenie roztworu podstawowego 200 mM) i zmieniaj bufor co 3 godziny, aby zapewnić warunki zlewu. Utrzymywać temperaturę buforu na poziomie 37 °C przez cały czas trwania doświadczenia.</li>
	<li>Po 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 i 48 godzinach pobrać 150 μl roztworu z kaset i zastąpić 150 μl świeżego buforu.</li>
	<li>Analizować próbki za pomocą RP-HPLC, jak ustalono w sekcji 2, w celu określenia stężenia leku. Dopasuj krzywą dane o uwalnianiu leku (leków) w oparciu o prosty model dyfuzji z jednofazowym asocjacją wykładniczą za pomocą oprogramowania statycznego.</li>
	<li>Oblicz czas potrzebny do osiągnięcia 50% uwalniania leku (t1/2) każdego leku w poszczególnych micelach lub DDM na podstawie dopasowania krzywej. Wszystkie pomiary wykonuj w kwadransu.</li>
</ol>

<ol><li>Yokoyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles+as+a+new+drug+carrier+system+and+their+required+considerations+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials.</a> Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).</li>
<li>Shin, H. C., Alani, A. W., Rao, D. A., Rockich, N. C., Kwon, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-drug+loaded+polymeric+micelles+for+simultaneous+delivery+of+poorly+soluble+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorly soluble anticancer drugs.</a> J Control Release. 140, 294-300 (2009).</li>
<li>Adams, M. L., Lavasanifar, A., Kwon, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+block+copolymers+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic block copolymers for drug delivery.</a> J Pharm Sci. 92, 1343-1355 (2003).</li>
<li>Oerlemans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles+in+anticancer+therapy%3A+targeting%2C+imaging+and+triggered+release%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release.</a> Pharm Res. 27, 2569-2589 (2010).</li>
<li>Shin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3-in-1+polymeric+micelle+nanocontainer+for+poorly+water-soluble+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs.</a> Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).</li>
<li>Hasenstein, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+Triolimus%3A+a+novel+multidrug-loaded+micelle+containing+Paclitaxel+Rapamycin%2C+and+17-AAG%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG.</a> Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).</li>
<li>Mazzaferro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bivalent+sequential+binding+of+docetaxel+to+methyl-beta-cyclodextrin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin.</a> Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).</li>
<li>Iwase, Y., Maitani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+in+vivo+evaluation+of+liposomal+everolimus+for+lung+carcinoma+and+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma.</a> Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).</li>
<li>Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+effect+of+docetaxel+and+everolimus+as+individual+and+dual-drug-loaded+micellar+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers.</a> Pharm Res. 31, 660-669 (2014).</li>
<li>Xu, W., Ling, P., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles%2C+a+promising+drug+delivery+system+to+enhance+bioavailability+of+poorly+water-soluble+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs.</a> J Drug Deliv. 2013, 340315(2013).</li>
<li>Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29-block-poly%28L-amino+acid%29+micelles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowanie miceli polimerowych do dostarczania leków stale się rozwija ze względu na ich wszechstronność i zdolność do dostarczania leków hydrofobowych w różnych stanach chorobowych. Dlatego techniki potrzebne do przygotowania i scharakteryzowania tych preparatów przed zastosowaniem w hodowlach komórkowych lub u zwierząt są krytycznym pierwszym krokiem do określenia najlepszego parowania między lekiem a polimerem. PEG-b-PLA są doskonałymi amfifilowymi kopolimerami blokowymi do celów dostarczania leków. Jedn...

Amfifilowe kopolimery blokowe o powtarzalnej strukturze złożonej z hydrofilowych i hydrofobowych domen mogą spontanicznie samoorganizować się, tworząc trójwymiarowe zespoły makromolekularne znane jako micele polimerowe. Struktury te mają wewnętrzny hydrofobowy rdzeń otoczony hydrofilową powłoką. Rdzeń hydrofobowy ma zdolność włączania leków hydrofobowych albo poprzez fizyczne uwięzienie poprzez interakcje hydrofobowe, albo przez sprzężenie chemiczne ze szkieletem polimerowym. 1 Istnieje wiele zalet stosowania tych kopolimerów blokowych do tworzenia miceli do dostarczania leków. Obejmują one włączenie słabo rozpuszczalnych leków, poprawę farmakokinetyki włączonych leków, a biokompatybilność i/lub biodegradowalność polimerów sprawia, że są one bezpieczną alternatywą dla konwencjonalnych solubilizatorów. 2 Kolejną zaletą stosowania miceli polimerowych jest ich koloidalna wielkość cząstek, wynosząca od 15 do 150nm3, co czyni je atrakcyjnymi do podawania pozajelitowego. Dlatego w ciągu ostatnich 20 lat micele polimerowe stały się realnymi systemami dostarczania leków słabo rozpuszczalnych w wodzie, zwłaszcza w terapii raka. 3,4
Obecnie istnieje pięć polimerowych preparatów micelarnych do terapii nowotworów w trakcie badań klinicznych. 4 Cztery micele w badaniach klinicznych to kopolimery diblokowe na bazie PEG, podczas gdy ostatni to kopolimer triblokowy zawierający tlenek etylenu. Wielkość tych miceli wahała się od 20 nm do 85 nm. Zaletą stosowania polimerów na bazie PEG jest ich biokompatybilność i w zależności od drugiego bloku mogą być również biodegradowalne. Ostatnio opracowano nowe systemy dostarczania leków oparte na micelach polimerowych glikolu polietylenowego i kwasu polimlekowego (PEG-b-PLA) do jednoczesnego dostarczania wielu leków przeciwnowotworowych. Micele PEG-b-PLA są zarówno biokompatybilne, jak i biodegradowalne. Te wielolekowe micele wykazały synergiczne hamowanie różnych modeli nowotworów in vitro i in vivo2,5,6 i wpisują się w obecny paradygmat stosowania wielu leków w chemioterapii w celu zapobiegania oporności i obniżania toksyczności. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie przygotowaniem i scharakteryzowaniem tych systemów dostarczania leków micelarnych do stosowania w nowotworach i innych stanach chorobowych.
W poniższej pracy opisaliśmy krok po kroku proces, dzięki któremu takie micele mogą być przygotowane i scharakteryzowane przed oceną ich w interesujących stanach chorobowych. Do celów niniejszej pracy wybrano dwa słabo rozpuszczalne leki przeciwnowotworowe: docetaksel (DTX) i ewerolimus (EVR). Zarówno DTX, jak i EVR są związkami słabo rozpuszczalnymi w wodzie o wewnętrznej rozpuszczalności w wodzie odpowiednio 1,9 i 9,6 μg/ml. 7,8 W tym protokole zastosowano dwa polimery PEG-b-PLA o różnych masach cząsteczkowych jako elementy budulcowe dla sformułowanych miceli polimerowych, polimery te to PEG2000-b-PLA 1800 (3,800 Da) i PEG 4000-b-PLA 2200 (6,200 Da). Micele PEG-b-PLA mogą zatem stanowić unikalną platformę jako nanonośnik dla DTX i EVR pojedynczo lub w połączeniu. Wymagane odczynniki/materiały i sprzęt potrzebne do przygotowania i scharakteryzowania tych miceli są wymienione w Tabeli 1.

<table><tbody><tr><td>PEG2000-b-PLA1800</td><td>Advanced Polymer Materials, Inc</td><td>6-01- PLA/2000</td><td>PLA MW można określić przy zamówieniu</td></tr><tr><td>PEG4000-b-PLA2200</td><td>Advanced Polymer Materials, Inc</td><td>6-01- PLA/4000</td><td>PLA MW można określić przy zamówieniu</td></tr><tr><td>Docetaxel</td><td>LC Laboratories</td><td>D-1000</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Everolimus</td><td>LC Laboratories</td><td>E-4040</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>EMD/VWR</td><td>EM-AX0145-1</td><td>Klasa HPLC; 4 L</td></tr><tr><td>Kolba okrągłodenna&nbsp;</td><td>Glassco/VWR</td><td>89426-496</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>RV 10 Sterujące parowniki obrotowe</td><td>IKA Works</td><td>8025001</td><td>Parownik rotacyjny</td></tr><tr><td>Shimadzhu HPLC z detektorem DAD</td> Kaseta dializacyjna <td>Shimadzhu</td><td></td><td>RP-HPLC</td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer MWCO 7000</td><td>Thermo Scientific, Inc</td><td>66370</td><td>3 ml</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy pH 7,4, 200 mM</td><td>VWR</td><td>100190-870</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Malvern NanoZS</td><td>Malvern Instruments, Wielka Brytania</td><td></td><td>DLS</td></tr><tr><td>Filtr nylonowy</td><td>Acrodisc/VWR</td><td>28143-242</td><td>13 mm; 0,2&mikro; M</td></tr><tr><td>Kwas fosforowy, NF</td><td>Spectrum Chemical/VWR</td><td>700000-626</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td><a href="http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com</a></td><td></td><td>Oprogramowanie analityczne</td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 Rapid Resolution&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>866953-906</td><td>4,6 i razy; 75 mm, 3.5 &#956; mln</td></tr></tbody></table>

przygotowanie i charakterystyka pojedynczych i wielolekowych, fizycznie uwięzionych miceli polimerowych

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Amfifilowe kopolimery blokowe, takie jak kwas polimlekowy (PEG-b-PLA) mogą samoorganizować się w micele powyżej ich krytycznego stężenia micelarnego, tworząc hydrofobowe rdzenie otoczone hydrofilowymi powłokami w środowisku wodnym. Rdzeń tych miceli może być wykorzystany do ładowania hydrofobowych, słabo rozpuszczalnych w wodzie leków, takich jak docetaksel (DTX) i ewerolimus (EVR). Systematyczna charakterystyka struktury miceli i możliwości ładowania leku jest ważna przed przeprowadzeniem badań in vitro i in vivo. Celem opisanego w niniejszym dokumencie protokołu jest zapewnienie niezbędnych etapów charakterystyki w celu uzyskania standaryzowanych produktów micelarnych. DTX i EVR mają rozpuszczalność wewnętrzną odpowiednio 1,9 i 9,6 μg/ml Przygotowanie tych miceli można osiągnąć poprzez odlewanie rozpuszczalnikiem, które zwiększa rozpuszczalność wodną DTX i EVR odpowiednio do 1,86 i 1,85 mg/ml. Stabilność leku w micelach oceniana w temperaturze pokojowej przez 48 godzin wskazuje, że 97% lub więcej leków jest zatrzymywanych w roztworze. Wielkość miceli oceniono za pomocą dynamicznego rozpraszania światła i wskazano, że wielkość tych miceli wynosiła poniżej 50 nm i zależała od masy cząsteczkowej polimeru. Uwalnianie leku z miceli oceniano za pomocą dializy w warunkach zlewu przy pH 7,4 w temperaturze 37 oC przez 48 godzin. Wyniki dopasowania krzywej wskazują, że uwalnianie leku jest napędzane przez proces pierwszego rzędu, co wskazuje, że jest ono napędzane dyfuzją.

Indywidualne micele DTX lub EVR oraz DDM DTX i EVR w micelach PEG-b-PLA zostały pomyślnie sformułowane z użyciem PEG4000-b-PLA2200 lub PEG2000-b-PLA1800 (Rysunek 1).
DTX, EVR oraz DDM wykazały podobną stabilność w PEG4000-b-PLA2200 lub PEG2000-b-PLA1800 w ciągu 48 hr (Rysunek 2). Początkowe obciążenie lekiem EVR w PEG4000</s...

Celem tego protokołu jest opisanie przygotowania i charakterystyki fizycznie uwięzionych, słabo rozpuszczalnych w wodzie leków w systemach dostarczania leków micelarnych składających się z amfifilowych kopolimerów blokowych.

Przygotowanie i charakterystyka pojedynczych i wielolekowych, fizycznie uwięzionych miceli polimerowych

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przedstawienie szczegółowego procesu przygotowania i charakterystyki komórek obciążonych lekiem przed ich oceną w wybranych stanach chorobowych. Zostaje to osiągnięte poprzez przygotowanie komórek metodą odlewania rozpuszczalnika, aby uzyskać powtarzalne komórki do badania. W drugim kroku ocenia się stabilność obciążenia oraz rozmiar komórek, co pozwala określić zdolność komórek do przyjmowania i zatrzymywania klinicznie istotnych stężeń.Następnie określa się szybkość uwalniania leku z komórek mięśniowych, aby upewnić się, że posiadają one odpowiednie charakterystyki uwalniania in vitro przed oceną stabilności in vivo. Wyniki pokazują, że powtarzalnie generowane stabilne komórki mięśniowe mogą stanowić platformę do dostarczania leków w różnych stanach chorobowych w oparciu o zaprezentowane tutaj techniki oceny. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak ładowanie równowagowe czy metody dializy, jest możliwość znacznie szybszego przygotowania miozyn przy powtarzalnym ładowaniu leku i rozmiarze.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę różnych stanów chorobowych, ponieważ leki w skali nano oferują możliwości wykraczające poza konwencjonalne formy. Zazwyczaj osoby początkujące mogą mieć trudności z tymi technikami, mimo że są one proste, ponieważ wciąż należy przeprowadzić badania uwalniania, bez których nie można rzetelnie ocenić efektu gwałtownego uwalniania (burst effect). Procedury te zaprezentują Shaman Duke, mój student studiów doktoranckich, oraz Deepa, moja współpracowniczka. Najpierw odważ 1 mg DTX, 1 mg EVR oraz 15 mg Peg 4,000 block PLA 2200 dla mikrocząstek z dwoma lekami (DDM). Po odważeniu rozpuść leki i polimer w 0,5 ml acetonitrylu, a następnie przenieś roztwór do okrągłodennej kolby o pojemności 5 ml. Utwórz cienką, rozłożoną warstwę leku i polimeru poprzez odparowanie roztworu leku, polimeru i acetonitrylu pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wirówki rotacyjnej.Następnie rehydratyzuj film polimerowy z lekiem, dodając 0,5 ml wody dejonizowanej wstępnie podgrzanej do 50 °C, i delikatnie wstrząsaj kolbą w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C w celu utworzenia miceli. Przenieś roztwór do probówki do wirowania i wiruj przy 7 200 ×g przez trzy minuty. Pobierz roztwór za pomocą igły i przefiltruj otrzymany roztwór miceli do nowej probówki do wirowania o pojemności 1,5 ml, używając nylonowego filtra o rozmiarze porów 0,2 µm, aby usunąć nierozpuszczony lek lub zanieczyszczenia. Na tym etapie przeprowadź analizę HPLC w fazie odwróconej z użyciem kolumny C8 równoważonej w temperaturze 40 °C w trybie izokratycznym z fazą ruchomą składającą się z acetonitrylu i wody; przed analizą metodą HPLC w fazie odwróconej w celu określenia początkowego załadunku leku, rozcieńcz świeżo przygotowane micele w acetonitrylu w stosunku 1:100.Po przechowywaniu nierozcieńczonych komórek w temperaturze pokojowej przez 48 godzin, należy przygotować świeże rozcieńczone próbki do ponownej oceny metodą HPLC w fazie odwróconej i określić stabilność leku w komórkach w ciągu 48 godzin. Monitoruj piki DTX i DVR przy 227 i 279 nanometrach z czasami retencji odpowiednio 1,7 i 5,7 minuty. Przedstaw dane jako średnią plus lub minus odchylenie standardowe załadunku leku.Następnie rozcieńczyć świeżo przygotowane komórki i wodę dejonizowaną w stosunku 1:20 do końcowego stężenia polimeru 1,5 mg/ml. Przenieść roztwór do kuwety do pomiaru dynamicznego rozpraszania światła. Zmierzyć intensywność laseru helowo-neonowego pod kątem 173 stopni w celu wyznaczenia rozpraszania.Dane należy przedstawić jako średnią średnicę Z wraz z odchyleniem standardowym oraz indeksem polidyspersyjności (PDI) rozkładu. Po przygotowaniu DDM zgodnie z wcześniejszym opisem, należy wprowadzić 2,5 ml komórek do kasety dializacyjnej o pojemności 3 ml i progu odcięcia masy cząsteczkowej 7 000 g/mol. Kasetę należy umieścić w 2,5 l 10 mM buforu fosforanowego o pH 7,4 w następujących odstępach czasu.Odbierz 150 µL roztworu i zastąp go 150 µL świeżego buforu. Wymieniaj bufor co trzy godziny, aby zapewnić warunki synchronizacji. Przeanalizuj próbki za pomocą HPLC w fazie odwróconej, aby wyznaczyć krzywą stężenia leku.Dopasowano dane dotyczące uwalniania leku w oparciu o prosty model dyfuzyjny z jednofazową asocjacją wykładniczą przy użyciu oprogramowania statystycznego D-T-X-E-V-R, a DDM wykazał podobną stabilność w PEG 2000 block PLA 1800 lub PEG 2000 block PLA 2200 w ciągu 48 godzin. Wszystkie moje komórki zachowały 97% lub więcej początkowego ładunku po 48 godzinach w temperaturze pokojowej. Na podstawie wyników dynamicznego rozpraszania światła wszystkie moje komórki wykazały rozkład unimodalny z wartościami PDI mniejszymi niż 0,2.Na podstawie danych, uwalnianie DTX z pojedynczych komórek mięśniowych oraz z DDM wyniosło około 60% w ciągu 48 godzin. Uwalnianie EVR z pojedynczych komórek mięśniowych i z DDM wyniosło odpowiednio 60% oraz 50%. Czas potrzebny do uwolnienia 50% leku z pojedynczych komórek mięśniowych oraz z DDM, a także dane dotyczące jakości dopasowania, są tutaj przedstawione.Jakość dopasowania krzywej dla wszystkich moich komórek, z wyjątkiem pojedynczych EVR, wynosi powyżej 0,950, co oznacza, że założenie o uwalnianiu pierwszego rzędu jest dobrym przybliżeniem wyjaśniającym uwalnianie leku z pojedynczych moich komórek oraz DDM. Po opanowaniu techniki te mogą być rutynowo stosowane dla biblioteki leków i polimerów w moich komórkach w czasie od kilku godzin do tygodnia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pełnej charakterystyce moich komórek przed przejściem do kultur komórkowych lub modeli zwierzęcych po zastosowaniu tych procedur. Można również oceniać lub charakteryzować inne systemy dostarczania, takie jak liposomalne systemy dostarczania, aby odpowiedzieć na pytanie o rolę systemu dostarczania leku w skuteczności leczenia.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przygotować i scharakteryzować obciążenie komórek lekiem przed ich oceną w interesującym nas stanie chorobowym.

preparation-characterization-individual-multi-drug-loaded-physically

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Niniejszy artykuł opisuje metodę nanoprecypitacji do syntezy nanocząsteczek polimerowych z wykorzystaniem kopolimerów diblokowych. Omówimy syntezę kopolimerów diblokowych, technikę nanoprecypitacji oraz potencjalne zastosowania.

Formułowanie diblokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji

Opisano protokół przygotowania i charakterystyki lipofilowych miceli 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG).

Przygotowanie i charakterystyka lipofilowych miceli prolekowych doksorubicyny

Kluczowe etapy żywej anionowej polimeryzacji eteru fenyloglicydylowego (PheGE) na glikolu metoksy-polietylenowym (mPEG-b-PPheGE) są opisane. Otrzymane micele kopolimeru blokowego (BCM) obciążono doksorubicyną w 14% (wag.) i uzyskano trwałe uwalnianie leku przez 4 dni w fizjologicznie istotnych warunkach.

Polimeryzacja anionowa kopolimeru amfifilowego do otrzymywania miceli kopolimeru blokowego stabilizowanego oddziaływaniami π-π stacking

Aby dostarczyć leki przeciwnowotworowe do miejsc nowotworowych o wysokiej swoistości i zmniejszonych skutkach ubocznych, potrzebne są nowe metody oparte na nanocząsteczkach. Tutaj opisujemy usieciowane micele dwusiarczkowe, które można łatwo przygotować przez utlenianie za pośrednictwem nadtlenku wodoru i są w stanie skutecznie dysocjować w środowisku redukującym guza, aby uwolnić ładunki.

Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Dostarczamy protokoły i reprezentatywne dane do projektowania, montażu i charakteryzowania miceli kompleksu polielektrolitowego, nanocząstek typu rdzeń-powłoka tworzonych przez polielektrolity i hydrofilowe naładowane-nienaładowane kopolimery blokowe.

Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu

Synteza i charakterystyka trzeciorzędowej biblioteki amidów peptydów

Synteza, aktywacja i charakterystyka celowo zaprojektowanych metaloorganicznych materiałów szkieletowych jest wyzwaniem, zwłaszcza gdy bloki budulcowe są niekompatybilne lub niechciane polimorfy są termodynamicznie faworyzowane nad pożądanymi formami. Opisujemy, w jaki sposób zastosowania wspomaganej rozpuszczalnikiem wymiany łączników, dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego proszku w kapilarnach i aktywacji poprzez suszenie nadkrytycznym CO2 mogą rozwiązać niektóre z tych wyzwań.

Synteza i charakterystyka funkcjonalizowanych struktur metaloorganicznych

Celem tego protokołu jest włączenie SDF-1α, czynnika naprowadzającego komórki macierzyste, do nanocząsteczek siarczanu dekstranu i chitozanu.  Powstałe cząstki są mierzone pod kątem ich wielkości i potencjału zeta, a także zawartości, aktywności i szybkości uwalniania in vitro SDF-1α z nanocząstek.

Przygotowanie i charakterystyka nanocząstek siarczanu SDF-1α-chitozan-dekstranu

Opisano protokół syntezy i charakterystyki koloidów pokrytych cząstkami supramolekularnymi. Te supramolekularne koloidy ulegają samoorganizacji po aktywacji wiązań wodorowych między cząsteczkami zakotwiczonymi na powierzchni przez światło UV.

Synteza i charakterystyka koloidów supramolekularnych

Poznaj metodę odlewu z rozpuszczalnika do przygotowania i charakteryzacji miceli polimerowych z załadowanymi lekami. Technika ta umożliwia szybkie i powtarzalne tworzenie stabilnych systemów dostarczania leków.

Przygotowanie i charakterystyka pojedynczych i wielolekowych, fizycznie uwięzionych miceli polimerowych

Przeglądaj więcej filmów