Name: Badanie funkcji białek i roli zmienionej ekspresji białek przez interferencję przeciwciał i rekonstrukcje trójwymiarowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Poznaj metodę interferencji przeciwciał i rekonstrukcji 3D do badania funkcji białek w neuronach hipokampu. Technika Chariot umożliwia natychmiastową i kontrolowaną zmianę ekspresji białek w komórkach ssaków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prezentowana praca była częściowo wspierana przez fundusze z programu partnerskiego Canadian Institutes of Health Research / Fragile X Research Foundation of Canada dla RD, Fundacji Jerome'a Lejeune'a dla RD, Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung Uniwersytetu Erlangen-Norymberga dla RD oraz z Deutsche Forschungsgemeinschaft dla RD i RE. Autorzy pragną podziękować Ingrid Zenger za pomoc techniczną w utrzymaniu hodowli komórkowych, a także prof. M. Wegner za udostępnienie wektora pCMV5-FLAG. Autorzy pragną również szczególnie podziękować Nadji Schroeder za pomocne wsparcie podczas kręcenia filmu.

1. Roztwory magazynowe
<ol>
	<li>Zawiesić liofilizowany proszek z motywem aktywnym w sterylnymH2Odo końcowego stężenia 2 μg/μl. Ostrożnie postukać w celu wymieszania.</li>
	<li>Przygotować małe porcje (np. po 12 μl każdy, wymagane są 2 μl na reakcję) i przechowywać je w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Komórki nasienne ssaków, takie jak komórki HEK293 lub neurony pierwotne na 24-dołkowej płytce w pożywce wzrostowej o pojemności 500 μl, w tym antybiotyki. 
	UWAGA: Używając neuronów, wysiewaj komórki o niskiej gęstości i używaj tylko dwóch środkowych rzędów płytki 24-dołkowej. Każda studzienka będzie zatem miała pusty odpowiednik, w którym będzie przechowywana pożywka podczas inkubacji (krok 4.2). Podczas pracy z neuronami należy zawsze upewnić się, że komórki nie są trzymane poza inkubatorem dłużej niż kilka minut.</li>
	<li>Hodować komórki w odpowiednich warunkach (nawilżone, 5%CO2 i 37 °C), aż komórki zlewają się w około 50%. 
	UWAGA: W przypadku korzystania z neuronów należy hodować komórki aż do osiągnięcia pożądanego etapu rozwoju i zmieniać ok. 25-50% pożywki dwa razy w tygodniu. Podłoże: Pożywka neuropodstawowa (zawierająca 1x B27, 5 mM L-glutaminy i 1x penicylinę i streptomycynę; porównaj z odnośnikiem 16).</li>
</ol>
3. Formacja kompleksu rydwanów
<ol>
	<li>Na reakcję rozcieńczyć 0,1-2 μg POI lub odpowiadającego mu przeciwciała, a także odpowiednio białka kontrolnego lub przeciwciała kontrolnego w 50 μl PBS. 
	UWAGA: Technika ta działa również w przypadku kompleksów makromolekularnych składających się z wstępnie związanych przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych (por. "Reprezentatywne wyniki", ryc. 1). Wymieszaj i odwiruj.</li>
	<li>Dla każdej próbki rozcieńczyć 2 μl roztworu podstawowego Chariot w 50 μl PBS za pomocą oddzielnych probówek, aby uniknąć samoasocjacji Chariot. Wymieszaj i odwiruj.</li>
	<li>Przenieść rozcieńczony punkt POI lub przeciwciało (krok 3.1) do rozcieńczenia rydwanu za pomocą pipetowania. Wymieszaj i odwiruj.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej (utworzą się kompleksy Chariot-POI).</li>
</ol>
4. Transfekcja komórek
<ol>
	<li>Rozcieńczyć kompleksy rydwanu (krok 3.4) w 100 μl wstępnie ogrzanej pożywki wzrostowej (37 °C, bez dodatków). Usuń pożywkę i umyj komórki za pomocą wstępnie podgrzanego 1x PBS. 
	UWAGA: Podczas korzystania z neuronów nie wyrzucaj pożywki, zostanie ona ponownie użyta. Przechowywać w temperaturze 37 °C. Do prania użyj PBS zawierającego 0,5 mM MgCl2 i CaCl2, 
	Sugestia: trzymaj pożywkę w pustych studzienkach podczas inkubacji płytki (krok 4.5).</li>
	<li>Nanieść złożony roztwór Chariot (krok 4.1) na komórki i delikatnie wstrząsnąć komórkami, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie roztworu. Hoduj komórki w standardowych warunkach (krok 2.2) przez 1 godzinę. Dodaj serum do końcowego stężenia 10%. W przypadku korzystania z neuronów dodaj pożywkę z kroku 4.1. Hoduj komórki jeszcze przez 1 do 2 godzin. 
	UWAGA: Optymalny czas inkubacji zależy od wielkości i właściwości ładunku i może wymagać empirycznego dostosowania. Następujące sugestie mogą służyć jako wskazówka: W przypadku peptydów zwykle wystarcza 1 godzina, w przypadku białek zaleca się 1-2 godziny, w przypadku przeciwciał 2 godziny, a w przypadku transfekcji neuronów przeciwciałami 4 godziny.</li>
	<li>Przetwarzaj komórki do analizy jak zwykle. Uwaga: technika jest kompatybilna z eksperymentami z wykorzystaniem protokołów fiksacji, a także obrazowania na żywo.</li>
</ol>
5. Obrazowanie
<ol>
	<li>Za pomocą laserowego mikroskopu skaningowego wykonaj stosy z komórek i/lub przedziałów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania, korzystając z odległości około 0,25-0,5 μm. Dokładny rozstaw warstw zależy od wielkości konstrukcji, która ma być zrekonstruowana i należy ją określić indywidualnie.</li>
</ol>
6. Rekonstrukcja
<ol>
	<li>W kolejnych krokach użyj Esc na dole, aby przełączać się między Select i Navigate, Cntr aby wybrać wiele obiektów, klikając je i Shift, aby wyciąć obiekty (por. krok 6.10).</li>
	<li>Otwórz plik lsm w Imaris.</li>
	<li>Korzystając z dopasowania wyświetlania dla każdego kanału, skontrastuj obraz, aż najjaśniejsze struktury osiągną nasycenie. Należy pamiętać, że ta regulacja nie wpłynie na konstrukcję powierzchni, służy jedynie do pomocy eksperymentatorowi w progowaniu obrazu.</li>
	<li>Kliknij ikonę Dodaj nowe powierzchnie. Otworzy się kreator.</li>
	<li>Wybierz: Podziel na segmenty tylko obszar zainteresowania. Przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Dostosuj marginesy pola wyboru, aby dopasować je do interesującego Cię obiektu. Należy pamiętać, że obraz ma 3 wymiary i że zaznaczenie należy dostosować również w płaszczyźnie z. Jeśli prostokątny kształt pola wyboru nie powinien prawidłowo pasować do interesującego go obiektu, obróć obiekt i/lub powiększ pole, aż zostaną osadzone wszystkie wymagane struktury. Niepożądane obiekty mogą zostać usunięte później (por. krok 6.10). Postąpić.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni kanał. Poziom szczegółowości powierzchni lub średnica kuli powinny być ustawione tak, aby odpowiadały rekonstruowanym strukturom. W zależności od charakterystyki sygnału można użyć intensywności bezwzględnej lub kontrastu lokalnego. Ogólnie rzecz biorąc, kontrast lokalny działa lepiej w przypadku sygnałów rozproszonych. W każdym przypadku ustawienia należy dostosować osobno dla każdego sygnału lub struktury będącej przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia Thresholding (Progowanie) zrekonstruuj interesującą Cię strukturę.</li>
	<li>Zakończ rekonstrukcję, klikając zieloną strzałkę na dole.</li>
	<li>Dostosuj obiekt dalej za pomocą narzędzia ołówka, aby wyciąć i usunąć powierzchnie zgodnie z wymaganiami. Możliwe jest cięcie tylko w kierunku północ-południe, dlatego należy przechylić obraz, aby przyciąć żądany obiekt.</li>
	<li>Uzyskaj pomiary objętości, powierzchni i intensywności dla każdej powierzchni, wybierając Statystyki, Statystyki szczegółowe i Wartości średnie.</li>
	<li>(Krok opcjonalny) Aby obserwować statystyki oznaczone kolorami (por. Rysunek 2E i F), wybierz zakładkę koloru odpowiedniej powierzchni i zaznacz "Kod statystyczny" zamiast "Podstawa". Zostanie wyświetlonych kilka opcji.</li>
</ol>

<ol><li>Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSantoro%2C+MR+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22">Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease</a>. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).</li>
<li>Jiang, T. F., Chen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+two+lysosome+degradation+pathways+of+alpha-synuclein+in+Parkinson%27s+disease%3A+potential+therapeutic+targets%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets?</a> Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).</li>
<li>Howlett, D. R., Richardson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+APP+transgenic+mice%3A+a+model+of+Alzheimer%27s+disease+or+simply+overexpression+of+APP%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP?</a> Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).</li>
<li>Carlson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Modification+of+the+Phenotypes+Produced+by+Amyloid+Precursor+Protein+Overexpression+in+Transgenic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice.</a> Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).</li>
<li>Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+mRNA-secapping+regulator+implicated+in+X-linked+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation.</a> Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).</li>
<li>Fukami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+member+of+a+gene+family+on+Xp22.3%2C+VCX-A%2C+is+deleted+in+patients+with+X-linked+nonspecific+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation.</a> Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).</li>
<li>Van Esch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+VCX-A+due+to+NAHR+plays+a+major+role+in+the+occurrence+of+mental+retardation+in+patients+with+X-linked+ichthyosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis.</a> Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).</li>
<li>Sebat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+association+of+de+novo+copy+number+mutations+with+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Strong association of de novo copy number mutations with autism.</a> Science. 316, 445-449 (2007).</li>
<li>Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+edge%3A+a+link+between+gene+expression+levels+and+aggregation+rates+of+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins.</a> Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li>
<li>Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+therapeutics+and+applications+of+microRNAs+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment.</a> Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).</li>
<li>Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+RNA+interference-based+therapeutics+and+application+of+multi-target+small+interfering+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs.</a> Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).</li>
<li>DeVincenzo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise%2C+pitfalls+and+progress+of+RNA-interference-based+antiviral+therapy+for+respiratory+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses.</a> Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).</li>
<li>Fellmann, C., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+RNA+interference+rules+for+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable RNA interference rules for silencing.</a> Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).</li>
<li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).</li>
<li>Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Characterisation+of+Simiate%2C+a+Novel+Protein+Linked+to+the+Fragile+X+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome.</a> PLoS One. 8, e83007(2013).</li>
<li>Derlig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simiate+is+an+Actin+binding+protein+involved+in+filopodia+dynamics+and+arborisation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).</li>
<li>Loudet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-covalent+delivery+of+proteins+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells.</a> Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).</li>
<li>Nagel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+microspheres+as+protein+transduction+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Polymeric microspheres as protein transduction reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).</li>
<li>Selim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-osteoactivin+antibody+inhibits+osteoblast+differentiation+and+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Eukaryot+Gene+Expr%22%5BJournal%5D)">Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro.</a> Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).</li>
<li>Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Rho+GTPase+activity+alleviates+chondroitin+sulfate+proteoglycan-dependent+inhibition+of+neurite+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension.</a> J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).</li>
<li>Watanabe, S., Wakasugi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+function+of+human+neuroglobin+is+correlated+with+its+guanine+nucleotide+dissociation+inhibitor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).</li>
<li>Eguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+nuclear+localization+signal+for+nuclear+transport+of+DNA-encapsulating+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles.</a> J Control Release. 104, 507-519 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy protokół do badania znaczenia poziomów ekspresji białek w kontrolowaniu funkcji komórkowych w sposób zależny od dawki. Opisany protokół pozwala na precyzyjną manipulację ekspresją białek w różnych typach komórek ssaków, w tym w neuronach hipokampa, ułatwiając w ten sposób szczegółowe badania funkcji białek na poziomie komórkowym.
Chociaż interferencja RNA stanowi dobrze znaną strategię obniżania poziomu punktów POI, ma ona swoje wady (por. 14). Nie tylko ...

Ścisła kontrola ekspresji białek jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, aby mógł kierować swoim własnym rozwojem, jak również reagować na sygnały środowiskowe. W związku z tym w trakcie ewolucji wynaleziono wiele mechanizmów, które precyzyjnie regulują poziom ekspresji każdego białka kodowanego przez ok. 20 000 genów istniejących w dowolnej komórce eukariotycznej w danym momencie jej życia. Mechanizmy regulacyjne, zachodzące na różnych etapach produkcji białek, obejmują zarządzanie strukturą chromatyny, transkrypcję i obsługę RNA, a także kierunek potranslacyjnych modyfikacji białek, transportu i degradacji.
Nie jest więc zaskakujące, że nieprawidłowe działanie podstawowych mechanizmów molekularnych i zmienione poziomy ekspresji białek były związane z różnymi chorobami, takimi jak rak czy niepełnosprawność intelektualna. Rzeczywiście, patrząc na wyjątkową złożoność rozwoju neuronów i funkcji mózgu ssaków, wrażliwość tych wyrafinowanych systemów na zmiany w ekspresji białek przejawia się w kilku dobrze znanych deficytach intelektualnych, w tym chorobie Alzheimera i Parkinsona (AD i PD), a także zaburzeniach ze spektrum autyzmu (ASD), takich jak zespół łamliwego chromosomu X (FXS). Ta ostatnia choroba charakteryzuje się rozległą nieprawidłową ekspresją różnych białek, co jest spowodowane utratą pojedynczego białka regulującego translację, FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein)1-4. Co więcej, rearanżacje chromosomów wpływające na białko A sprzężone ze zmiennym ładunkiem x (VCXA), białko, które zarządza stabilnością i translacją mRNA poprzez modyfikację limitumRNA 5, były ostatnio związane z deficytami intelektualnymi, podczas gdy mutacje punktowe nie zostały zidentyfikowane u pacjentów z niepełnosprawnością poznawczą 6,7, co sugeruje, że obserwowane upośledzenie umysłowe wynika ze zmienionej ekspresji VCXA i rozregulowanej ekspresji jego docelowych białek. Zgodnie z tymi odkryciami, badanie badające, czy zmiany liczby kopii de novo genów są związane z ASD, ustaliło, że duplikacje i delecje nowych genów są znaczącym czynnikiem ryzyka ASD8, wspierając w ten sposób ideę, że podwyższony lub zmniejszony poziom ekspresji białek może powodować deficyty intelektualne.
Co ciekawe, ostatnie badania dostarczyły dalszych dowodów na to, że poziom ekspresji danego białka jest precyzyjnie dostosowany, aby zapobiec jego agregacji w wyniku dużej ilości białka przy prawie zerowym marginesie bezpieczeństwa9. W związku z tym zaproponowano, że nawet małe przyrosty są wystarczające do wywołania chorób takich jak AD i PD9. Chociaż różnorodność mechanizmów molekularnych przyczyniających się do kontroli ekspresji białek sugeruje złożony schemat regulacji w świetle tych ustaleń, badanie badające poziom ekspresji ponad 5000 genów ssaków10 wykazało, że natura preferowała bardziej oszczędny schemat: wykazano, że obfitość białek w komórkach jest głównie regulowana na poziomie translacji10, co ilustruje, że zarządzanie dostępnością RNA służy głównie precyzyjnemu dostrojeniu ekspresji białek.
Badanie dawki interesujących białek (POI) jest zatem nie tylko ważne dla zrozumienia endogennych funkcji białka, ale także dla badania wielu chorób i rozwoju terapii. W związku z tym w ostatnich dziesięcioleciach nastąpił postęp w kilku strategiach wykorzystujących interferencję RNA do manipulowania dawką POI. Chociaż interferencja RNA jest szeroko stosowana do badania funkcji białek, a nawet jest stosowana w badaniach klinicznych w leczeniu raka lub chorób oczu, a także w leczeniu przeciwwirusowym u pacjentóww wieku 11-13 lat, mogą pojawić się pewne trudności, które mogą uniemożliwić realizację tej strategii. Na przykład sekwencja zalążkowa, która napędza knockdown przez homologię, jest porównywalnie krótka, co sprzyja efektom off-target. Ponieważ wysoce wydajne sekwencje są rzadkie i muszą być znalezione spośród tysięcy opcji (omówionych w 14), zidentyfikowanie właściwej sekwencji może być czasochłonne i kosztowne, ale wyniki mogą być nadal rozczarowujące.
Alternatywną strategią jest bezpośrednie celowanie przeciwciałami w POI. W tym miejscu ilustrujemy zastosowanie nośnika białkowego Chariot (produkowanego przez Active Motif) w celu zmniejszenia dostępności białek komórkowych oraz zastosowanie trójwymiarowych rekonstrukcji do badania funkcji białek po knock-down.
Aktywny motyw Rydwanu, sam w sobie peptyd o masie 2,8 kDa, jest używany do transportu peptydów, białek i przeciwciał przez błony komórek ssaków15. Peptyd wiąże się z POI, tworząc niekowalencyjnie sprzężone kompleksy makromolekularne wykorzystujące oddziaływania hydrofobowe, po czym kompleksy Chariot-POI są internalizowane do komórek w sposób niezależny od endosomów. Co ważne, wykazano, że Chariot nie wpływa ani na wewnątrzkomórkową lokalizację transportowanych białek, ani nie wywiera efektów cytotoksycznych, ani nie wpływa na aktywność biologiczną swojego ładunku15.

<table><tbody><tr><td>Rydwan</td><td>Active Motif</td><td>30025</td><td>sklep pod adresem -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Technologie życia</td><td>21103-049</td><td>rozgrzej do 37 & deg; C przed użyciem</td></tr><tr><td>1x B27</td><td>Life technologies</td><td>17504044</td><td>przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life technologies</td><td>25030-149</td><td>sklep pod adresem -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna</td><td>Technologie życia</td><td>15140-122</td><td>sklep pod adresem -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane</td><td>n.a.</td> <td>drogi, ale bezkonkurencyjny</td></tr><tr><td>laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Zeiss</td><td>n.d.</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie funkcji białek i roli zmienionej ekspresji białek przez interferencję przeciwciał i rekonstrukcje trójwymiarowe

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Ścisłe zarządzanie ekspresją białek jest nie tylko niezbędne dla każdego żywego organizmu, ale także stanowi ważną strategię badania funkcji białek w modelach komórkowych. Dlatego w ostatnich badaniach wynaleziono różne narzędzia do celowania w ekspresję białek w liniach komórkowych ssaków, a nawet w modelach zwierzęcych, w tym interferencję RNA i przeciwciał. Podczas gdy pierwsza strategia przyciągnęła wiele uwagi w ciągu ostatnich dwóch dekad, peptydy pośredniczące w translokacji ładunków przeciwciał przez błony komórkowe do komórek spotkały się ze znacznie mniejszym zainteresowaniem. W tej publikacji przedstawiamy szczegółowy protokół, w jaki sposób wykorzystać nośnik peptydu o nazwie Chariot w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych, a także w pierwotnych neuronach hipokampa do przeprowadzania eksperymentów interferencji przeciwciał i dalszego ilustrowania zastosowania trójwymiarowych rekonstrukcji w analizie funkcji białka. Nasze odkrycia sugerują, że Chariot, prawdopodobnie ze względu na swój sygnał lokalizacji jądrowej, jest szczególnie dobrze przystosowany do docelowych białek znajdujących się w somie i jądrze. Co ciekawe, po zastosowaniu Chariot do pierwotnych kultur hipokampa, odczynnik okazał się zaskakująco dobrze akceptowany przez zdysocjowane neurony.

W poniższych akapitach zaprezentowano przykładowe wyniki ilustrujące funkcjonalny knockdown POI (Simiate, więcej szczegółów w 16,17) z wykorzystaniem odczynnika Chariot oraz interferencji przeciwciał. Wyniki te wykazują, że obniżona ekspresja Simiate upośledza aktywność transkrypcyjną i w sposób zależny od dawki indukuje apoptozę, co prowadzi do wskaźników śmiertelności przekraczających 99% w przypadku zastosowania wyższych ilości przeciwciał (&gt; 1 µg przeciwciała) (odkrycia te zostały ...

Kontrolowanie ekspresji białek jest nie tylko niezbędne dla każdego żyjącego organizmu, ale także stanowi ważną strategię badania funkcji białek w modelach komórkowych. Przedstawiony protokół przedstawia zastosowanie interferencji przeciwciał w komórkach ssaków, w tym w pierwotnych neuronach hipokampa, a także demonstruje zastosowanie trójwymiarowych rekonstrukcji w badaniu funkcji białek.

Badanie funkcji białek i roli zmienionej ekspresji białek przez interferencję przeciwciał i rekonstrukcje trójwymiarowe

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest badanie funkcji białek oraz roli zmienionej ekspresji białek w sposób wydajny i ściśle kontrolowany. Osiąga się to poprzez zastosowanie przeciwciał w celu zmniejszenia ilości funkcjonalnego białka dostępnego dla komórki. Aby to zrealizować, przeciwciała są sprzęgane z peptydem o nazwie Chariot, który pośredniczy w przenikaniu przez błony komórkowe.Następnie obrazowane są interesujące struktury komórkowe i poddawane rekonstrukcji 3D w celu oceny efektów zastosowanej terapii. Wyniki wykazują, że peptydy Chariot są szczególnie odpowiednie do celowania w białka jądrowe poprzez interferencję przeciwciał. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak interferencja RNA, są fakt, że przeciwciała przetransportowane do wnętrza komórki działają natychmiast, oraz możliwość ścisłej kontroli stopnia interferencji poprzez dostosowanie dawek przeciwciał.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat funkcji białek w wielu typach komórek, jest ona szczególnie interesująca w przypadku celowania w białka w pierwotnych kulturach neuronów, które są bardzo wrażliwe na zabiegi, lecz bardzo dobrze tolerują Chariot. W ramach przygotowania, resuspenduj liofilizowany proszek peptydowy Chariot w wodzie sterylnej w stężeniu 2 µg/µL. Ostrożnie opukaj probówkę, aby wymieszać proszek i przygotować roztwór.Następnie przygotuj małe alikwoty robocze – do każdej reakcji potrzebne są zaledwie 2 µL – i przechowuj je w temperaturze 20 °C. W kolejnym kroku przygotuj komórki ssaków do transfekcji, wysiewając je na płytkę 24-dołkową w 0,5 mL medium z antybiotykami. W przypadku użycia neuronów, wysiej komórki wyłącznie w dwóch środkowych rzędach i z niską gęstością.Puste dołki będą przydatne w późniejszym etapie. Należy działać szybko. Hodowane neurony nie powinny pozostawać poza inkubatorem dłużej niż przez kilka minut.Do momentu, aż neurony osiągną pożądany stopień rozwoju, wymieniaj około jedną czwartą do połowy ich pożywki dwa razy w tygodniu. W przypadku kultur nieneuronalnych należy przystąpić do pracy, gdy komórki osiągną 50% konfluencji. Poniższa procedura jest przedstawiona dla sześciu testów i sześciu próbek kontrolnych.Dla każdego ładunku przygotować rozcieńczenie od 0,1 do 2 µg w 50 µL 1X PBS na próbkę. Jako ładunku można użyć również kompleksów makromolekularnych z uprzednio związanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Roztwór wymieszać delikatnie za pomocą wortexa, a następnie krótko odwirować.Następnie rozcieńcz dwa µL roztworu zapasowego Chariot w 50 µL PBS dla każdej reakcji. Używaj oddzielnych probówek dla każdej próbki, aby zapobiec samoagregacji Chariot. Teraz połącz przygotowane białka z rozcieńczeniami Chariot.Wymieszać i odwirować połączone białka. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić formowanie się kompleksów ładunkowych Chariot. Optymalna ilość białka-peptydu zależy od ładunku oraz zastosowanego typu komórek.Z tego względu wartość ta powinna zostać określona empirycznie. Wcześniej należy podgrzać do 37 °C pożywkę wzrostową bez dodatków oraz 1X PBS zawierający 0,5 mM chlorku magnezu i chlorku wapnia. Aby rozpocząć, należy rozcieńczyć przygotowane kompleksy Chariot 100 µl pożywki.Usunąć pożywkę z wysianych komórek i przenieść ją do pustych dołków w celu ponownego użycia. Następnie delikatnie przemyć komórki 500 µL uprzednio ogrzanego 1X PBS, roztworu chlorku wapnia i magnezu. Nanieść na komórki pożywkę zawierającą kompleksy Chariot i delikatnie kołysać płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie roztworu.Szybko przenieś komórki z powrotem do inkubatora i odczekaj godzinę przed kontynuacją. W przypadku neuronów, po godzinie inkubacji, przenieś zachowane medium do dołków. Dla wszystkich pozostałych typów komórek dodaj surowicę do stężenia końcowego 10%. Hodowane neurony są bardzo wrażliwe, na przykład na zmiany temperatury i pH medium.W związku z tym komórki te należy płukać i transfekować ostrożnie, używając uprzednio ogrzanych roztworów, a następnie jak najszybciej przenieść z powrotem do inkubatora. Kontynuować inkubację przez wymagany czas, zależnie od wprowadzonego ładunku oraz typu komórek. Po inkubacji poddać komórki dalszym analizom zgodnie ze standardowymi procedurami.Technika ta jest kompatybilna zarówno z protokołami fiksacji, jak i z obrazowaniem żywych komórek. Korzystając z mikroskopu skaningowego z obiektywem 63X, należy wykonywać obrazy w odstępach około 0,25 do 0,5 mikrona, aby uzyskać stosy Z (Z-stacks) o wystarczającym stopniu szczegółowości, unikając jednocześnie blaknięcia fluorescencji. Dokładna odległość między warstwami zależy od rozmiaru rekonstruowanej struktury i musi zostać dobrana indywidualnie.W celu rekonstrukcji obrazu otwórz pliki LSM w programie Imaris. W tym oprogramowaniu klawisz Escape służy do przełączania się między trybami Select a Navigate. Ponadto, przytrzymując klawisz Control, można zaznaczyć wiele obiektów.Używając funkcji Display Adjustment, przejdź do każdego kanału i dostosuj kontrast tak, aby najjaśniejsze struktury osiągnęły nasycenie. Regulacja ta nie wpływa na rekonstrukcję powierzchni, ale pomaga w ustaleniu progu obrazu (thresholding). Jeśli obiekt do rekonstrukcji znajduje się w różnych plikach, użyj funkcji Edit and Add Slices, aby połączyć odpowiednie pliki.Następnie kliknij ikonę Add New Surfaces i wybierz Segment only a Region of Interest. Teraz dostosuj marginesy pola wyboru tak, aby dopasować je do badanego obiektu. Reguluj kształt i nachylenie prostokąta, aż wszystkie wymagane struktury znajdą się wewnątrz pola.Zaznaczenie należy skorygować na każdym obrazie w całej płaszczyźnie Z. Niepożądane obiekty można usunąć na późniejszym etapie. Następnie należy wybrać odpowiedni kanał.Aby kontynuować, należy użyć narzędzia do progowania w celu zrekonstruowania interesującej struktury. Poziom szczegółowości powierzchni, czyli średnica sfery, powinien być ustawiony tak, aby odpowiadał rekonstruowanym strukturom. W zależności od charakterystyki sygnału można zastosować intensywność bezwzględną lub kontrast lokalny.Zazwyczaj kontrast lokalny sprawdza się lepiej w przypadku sygnałów rozproszonych. Ze względu na charakterystykę tego sygnału, kontrast lokalny jest stosowany do rekonstrukcji białka wewnątrz jądra komórkowego. W każdym przypadku ustawienia muszą być dostosowane oddzielnie dla każdego sygnału lub interesującej nas struktury.Zakończ rekonstrukcję, klikając zieloną strzałkę na dole ekranu. Następnie dokonaj dalszych korekt obiektu za pomocą narzędzia Ołówek. Uważnie porównaj rekonstrukcje z oryginalnym sygnałem, a następnie wycinaj i usuwaj powierzchnie, przechylając obrazy w razie potrzeby, aby narzędzie Wytnij mogło zostać precyzyjnie wykorzystane zgodnie z przeznaczeniem.Następnie zmierz objętość, powierzchnię i intensywność każdej powierzchni, wybierając Statistics, Detailed statistics oraz Average Values. W razie potrzeby można wygenerować statystyki zakodowane kolorami, wybierając kartę Color odpowiedniej powierzchni i zmieniając zaznaczoną opcję z Base na Statistic Coded. Za pomocą narzędzia Take Snapshot można wykonać zdjęcia do publikacji.Jeśli do rekonstrukcji przeznaczonych jest kilka obiektów w tym samym obszarze, można użyć funkcji Zapisz parametry (Store Parameters), aby zapisać te informacje. Ekspresję białka Simiate w komórkach HEK293 wykryto specyficznie za pomocą przeciwciał Simiate wprowadzonych do komórek przez peptydy Chariot. Po aplikacji kompleksy przeciwciał Simiate wnikają zarówno do somy, jak i do jądra komórkowego, gdzie wykazują specyficzną kolokalizację z FLAG-Simiate, co zaznaczono żółtymi strzałkami.W sposób zależny od dawki przeciwciała Simiate indukowaly masywną apoptozę w komórkach HEK293, podczas gdy przeciwciała kontrolne nie wywołały żadnego efektu. Biorąc pod uwagę, że komórki neuronalne są bardzo wrażliwe na efekty toksyczne, technikę zastosowano w pierwotnych kulturach hipokampa, gdzie nie stwierdzono wpływu na żywotność neuronów przy porównaniu komórek mock (kontrolnych), nieleczonych oraz leczonych Chariot. Stosując ten sam schemat aplikacji, kompleksy przeciwciał kozich anty-świnkowych Alexa568 zaobserwowano w około 83% komórek, przy czym występowały one w somatach oraz jadrach w różnym stopniu.Obserwacje te zostały dodatkowo potwierdzone analizą 3D, która była zgodna z wynikami uzyskanymi z komórek HEK293. Zatem technika Chariot może być skutecznie wykorzystywana do transfekcji rozdzielonych pierwotnych neuronów hipokampa. Po opanowaniu metody, procedura ta może zostać przeprowadzona w ciągu od trzech do sześciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.Tworzenie kompleksów Chariot z białkiem docelowym trwa około 40 minut. Transfekcja komórek tymi kompleksami zajmuje 70 minut, a następnie od jednej do czterech dodatkowych godzin, w zależności od wielkości i właściwości ładunku. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody w celu bardziej szczegółowej analizy funkcji białka, takie jak obrazowanie na żywo, testy motywności, analiza oraz rejestracje elektrofizjologiczne.

studying-protein-function-role-altered-protein-expression-antibody

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ponad połowa białek to małe białka (masa cząsteczkowa &lt;200 kDa), które stanowią wyzwanie zarówno dla obrazowania mikroskopem elektronowym, jak i dla trójwymiarowych rekonstrukcji. Zoptymalizowane barwienie negatywowe to solidny i wysokoprzepustowy protokół umożliwiający uzyskanie obrazów o wysokim kontraście i stosunkowo wysokiej rozdzielczości (~1 nm) małych asymetrycznych białek lub kompleksów w różnych warunkach fizjologicznych.

Zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej

Przedstawiono protokół do badania online relacji sekwencja-struktura-dynamika białek za pomocą Bio3D-web.

Badanie zależności między sekwencją, strukturą i dynamiką białek za pomocą Bio3D-web

Przedstawione tutaj są dwie techniki badań interakcji białko-białko oparte na przeciwciałach: immunofluorescencja i immunoprecypitacja. Techniki te nadają się do badania fizycznych interakcji między białkami w celu odkrycia nowych składników komórkowych szlaków sygnałowych i zrozumienia dynamiki białek.<br...

Badanie interakcji białko-białko w badaniach nad autofagią

Prezentujemy podejścia do biofizycznej i strukturalnej charakterystyki glikoprotein z fałdowaniem immunoglobulin za pomocą interferometrii biowarstwowej, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej i krystalografii rentgenowskiej.

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy, jak można wykorzystać rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) do uzyskania informacji o obwiedniach o niskiej rozdzielczości reprezentujących struktury makromolekularne. W połączeniu z technikami strukturalnymi o wysokiej rozdzielczości, takimi jak krystalografia rentgenowska i magnetyczny rezonans jądrowy, SAXS może dostarczyć szczegółowych informacji na temat wielodomenowych białek i kompleksów makromolekularnych w roztworze.

Badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

Strukturalnie powiązane białka często pełnią odrębne funkcje biologiczne. Wymiana równoważnych regionów tych białek w celu wytworzenia białek chimerycznych stanowi innowacyjne podejście do identyfikacji krytycznych regionów białkowych, które są odpowiedzialne za ich funkcjonalną dywergencję.

Identyfikacja funkcjonalnych regionów białkowych poprzez budowę białek chimerycznych

Obecny protokół opisuje metody badania struktury i dynamiki dwóch modelowych białek, które odgrywają ważną rolę w zdrowiu człowieka. Technika ta łączy laboratoryjną charakterystykę biofizyczną ze spektroskopią echa spinowego neutronów, aby uzyskać dostęp do dynamiki w skalach czasu i długości istotnych dla ruchów międzydomenowych białek.

Badanie dynamiki białek za pomocą spektroskopii neutronowego echa spinowego

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj metodę interferencji przeciwciał i rekonstrukcji 3D do badania funkcji białek w neuronach hipokampu. Technika Chariot umożliwia natychmiastową i kontrolowaną zmianę ekspresji białek w komórkach ssaków.

Badanie funkcji białek i roli zmienionej ekspresji białek przez interferencję przeciwciał i rekonstrukcje trójwymiarowe

Przeglądaj więcej filmów