Badanie funkcji białek i roli zmienionej ekspresji białek przez interferencję przeciwciał i rekonstrukcje trójwymiarowe

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie funkcji białek i roli zmienionej ekspresji białek w efektywny i ściśle kontrolowany sposób. Osiąga się to poprzez zastosowanie przeciwciał w celu zmniejszenia ilości funkcjonalnego białka dostępnego dla komórki. Aby to osiągnąć, przeciwciała są sprzężone z peptydem o nazwie Chariot, który pośredniczy w przejściu przez błony komórkowe.

Następnie obrazowane są interesujące struktury komórkowe i rekonstruowane w 3D w celu oceny efektów zabiegu. Wyniki pokazują, że peptydy Chariot są szczególnie dobrze przystosowane do celowania w białka jądrowe poprzez interferencję przeciwciał. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak interferencja RNA, jest to, że przeciwciała przenoszone do komórki są skuteczne natychmiast, a badacz może ściśle kontrolować stopień interferencji, dostosowując dawki przeciwciał.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat funkcji białek w wielu typach komórek, jest szczególnie interesująca w przypadku celowania w białka w pierwotnych kulturach neuronalnych, które są bardzo wrażliwe na leczenie, ale bardzo dobrze tolerują Chariot. Podczas przygotowania, ponownie zamieszać liofilizowany proszek peptydu Chariot w sterylnej wodzie w stężeniu dwóch mikrogramów na mikrolitr. Ostrożnie postukaj w probówkę, aby wymieszać proszek z roztworem.

Następnie przygotuj małe robocze porcje, do każdej reakcji potrzebne są tylko dwa mikrolitry i przechowuj podwielokrotności w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj komórki ssaków do transfekcji, wysiewając je na 24-dołkową płytkę z pół mililitra pożywki zawierającej antybiotyki. Używając neuronów, zasiewaj komórki tylko w dwóch środkowych rzędach i przy niskiej gęstości.

Puste studnie przydadzą się później. Bądź szybki. Wyhodowane neurony nie powinny przebywać poza inkubatorem na dłużej niż kilka minut.

Dopóki neurony nie osiągną pożądanego etapu rozwoju, wymieniaj około jednej czwartej do połowy ich pożywki dwa razy w tygodniu. Hodowle nieneuronalne powinny być stosowane, gdy komórki są w 50% zbieżności. Poniższa procedura jest przedstawiona dla sześciu badań i sześciu próbek kontrolnych.

Dla każdego ładunku należy przygotować rozcieńczenie od 0,1 do 2 mikrogramów w 50 mikrolitrach 1X PBS na próbkę. Kompleksy wielkocząsteczkowe wstępnie związanych przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych mogą być również używane jako ładunek. Wymieszaj roztwór z delikatnym wirem, a następnie krótko odwiruj.

Następnie rozcieńczyć dwa mikrolitry roztworu podstawowego rydwanu w 50 mikrolitrach PBS na każdą reakcję. Do każdej próbki należy używać oddzielnych probówek, aby zapobiec samokojarzeniu się rydwanu. Teraz połącz przygotowane białka w rozcieńczeniach rydwanu.

Wymieszaj i odwiruj połączone białka. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów ładunkowych rydwanów. Optymalna ilość peptydów białkowych zależy od ładunku i rodzaju użytej komórki.

Dlatego kwotę tę należy określić empirycznie. Wcześniej podgrzej trochę podłoża bez dodatków, a także 1X PBS zawierający 0,5 milimolowy chlorek magnezu i chlorek wapnia do 37 stopni Celsjusza. Teraz, aby rozpocząć, rozcieńczyć przygotowane kompleksy rydwanów 100 mikrolitrami pożywki.

Usunąć pożywkę z posianych komórek i przenieść do pustych studzienek w celu ponownego użycia. Następnie delikatnie umyj komórki 500 mikrolitrami wstępnie podgrzanego 1X PBS, roztworu wapnia, chlorku magnezu. Nałóż pożywkę przenoszącą kompleksy rydwanu na komórki i delikatnie kołysz płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie roztworu.

Szybko włóż komórki z powrotem do inkubatora i odczekaj godzinę przed wykonaniem poprzedniego zabiegu. W przypadku neuronów po godzinie inkubacji przenieś zapisane pożywki do studzienek. W przypadku wszystkich innych komórek dodaj surowicę do końcowego stężenia 10%Hodowane neurony są bardzo wrażliwe, na przykład na zmiany temperatury pożywki i pH.

Dlatego komórki te należy delikatnie umyć i przetoczyć transfekcję wstępnie podgrzanymi roztworami i jak najszybciej zwrócić do inkubatora. Kontynuować inkubację tak długo, jak jest to konieczne, w zależności od transfekowanego ładunku i typu komórki. Po inkubacji przetworzyć komórki do kolejnych analiz w zwykły sposób.

Zarówno protokoły fiksacji, jak i obrazowanie na żywo są kompatybilne z tą techniką. Za pomocą laserowego mikroskopu skaningowego z obiektywem 63X wykonuj obrazy z odległości około 0,25 do 0,5 mikrona, aby uzyskać stosy Z o wystarczającej szczegółowości, unikając wybielania. Dokładny rozstaw warstw zależy od wielkości konstrukcji, która ma być zrekonstruowana i należy ją określić indywidualnie.

Aby zrekonstruować obraz, otwórz pliki LSM w Imaris. W tym oprogramowaniu przycisk Escape służy do przełączania między Select i Navigate. Ponadto można wybrać wiele obiektów, przytrzymując Control.

Korzystając z regulacji wyświetlania, przejdź do każdego kanału i dostosuj kontrast, aż najjaśniejsze struktury osiągną nasycenie. Ta regulacja nie ma wpływu na konstrukcję powierzchni, ale pomaga w progowaniu obrazu. Jeśli obiekt, który ma zostać zrekonstruowany, znajduje się w różnych plikach, użyj funkcji Edytuj i Dodaj plasterki, aby połączyć odpowiednie pliki.

Następnie kliknij ikonę Dodaj nowe powierzchnie i wybierz opcję Segmentuj tylko obszar zainteresowania. Teraz dostosuj marginesy pola wyboru, aby dopasować je do interesującego Cię obiektu. Dostosuj kształt i nachylenie prostokątnego kształtu, aż wszystkie wymagane struktury znajdą się w pudełku.

Zaznaczenie musi być dostosowane na każdym obrazie na całej płaszczyźnie Z. Niepożądane obiekty mogą zostać usunięte później. Następnie wybierz odpowiedni kanał.

Aby kontynuować, użyj narzędzia progowego, aby zrekonstruować strukturę zainteresowania. Poziom szczegółowości pola powierzchni lub średnica kuli powinny być ustawione tak, aby odpowiadały rekonstruowanym strukturom. W zależności od charakterystyki sygnału można zastosować natężenie bezwzględne lub kontrast lokalny.

Ogólnie rzecz biorąc, kontrast lokalny działa lepiej w przypadku sygnałów rozproszonych. Ze względu na charakterystykę tego sygnału, do rekonstrukcji białka wewnątrz jądra stosuje się kontrast miejscowy. W każdym przypadku ustawienia należy dostosować osobno dla każdego sygnału lub struktury będącej przedmiotem zainteresowania.

Zakończ rekonstrukcję, klikając zieloną strzałkę u dołu ekranu. Następnie dostosuj obiekt dalej za pomocą narzędzia Ołówek. Ostrożnie porównaj rekonstrukcje z oryginalnym sygnałem, a następnie wycinaj i usuwaj powierzchnie, przechylając obrazy zgodnie z potrzebami, aby narzędzie Wytnij mogło dokładnie spełnić swoje zadanie.

Teraz zmierz objętość, obszar i intensywność każdej powierzchni, wybierając Statystyki, Statystyki szczegółowe i Wartości średnie. W razie potrzeby można utworzyć statystyki oznaczone kolorami, wybierając kartę Kolor odpowiedniej powierzchni i zmieniając wybraną opcję z Bazowej na Zakodowaną statystycznie. Korzystając z narzędzia Take Snapshot, można robić zdjęcia do publikacji.

Jeśli ma zostać zrekonstruowanych kilka obiektów w tym samym regionie, do zapisania informacji można użyć funkcji Parametry przechowywania. Simiate ulegający ekspresji w komórkach HEK293 został specyficznie wykryty przez przeciwciała Simiate przenoszone do komórek przez peptydy Chariot. Zespoły przeciwciał symulacyjnych dostają się zarówno do somy, jak i do jądra, po aplikacji, gdzie kolokalizują się specyficznie z FLAG-Simiate, jak oznaczono żółtymi strzałkami.

W sposób zależny od dawki, przeciwciała Simiate indukowały masową apoptozę w komórkach HEK293, podczas gdy przeciwciała kontrolne nie miały żadnego wpływu. Biorąc pod uwagę, że komórki neuronalne są bardzo wrażliwe na działanie toksyczne, technikę tę zastosowano do pierwotnych kultur hipokampa, w których nie stwierdzono wpływu na żywotność neuronów podczas porównywania komórek pozorowanych lub nieleczonych i leczonych rydwanem. Zgodnie z tym samym schematem aplikacji, zespoły przeciwciał przeciwko śwince morskiej Alexa568 zaobserwowano w około 83% komórek, w których występowały w różnych zakresach w somatach, a także w jądrach.

Obserwacje te zostały dodatkowo poparte analizą 3D, która była zgodna z wynikami z komórek HEK293. W związku z tym technika rydwanu może być z powodzeniem stosowana do transfekcji zdysocjowanych pierwotnych neuronów hipokampa. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Złożone formowanie się rydwanu i interesującego nas białka trwa około 40 minut. Transfekcja komórek tymi kompleksami zajmie 70 minut i dodatkowe od jednej do czterech godzin, w zależności od wielkości i właściwości ładunku. Po tej procedurze można zastosować inne metody w celu bardziej szczegółowej analizy funkcji białka, takie jak obrazowanie na żywo i testy ruchliwości, analiza i zapisy elektrofizjologiczne.