Wzbogacanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej z tkanek i trawienie do peptydów do analizy spektrometrii mas

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie składu macierzy zewnątrzkomórkowych z tkanek za pomocą spektrometrii mas. Osiąga się to poprzez najpierw rozbicie wybranej tkanki, aż do jej całkowitej homogenizacji. Drugi etap polega na decelularyzacji tkanki w celu wzbogacenia w białka macierzy zewnątrzkomórkowej przy jednoczesnym zubożeniu wszelkich składników wewnątrzkomórkowych.

Następnie próbka białka wzbogacona w ECM jest denaturowana w ostatnim etapie, zdenaturowana próbka białka wzbogacona w ECM jest deklinowana glikozylowana i trawiona do peptydów. Zachodnia analiza krwi służy do monitorowania jakości decelularyzacji i wzbogacania białek ECM. Ostatecznie analiza peptydów za pomocą spektrometrii mas pozwala na scharakteryzowanie składu ECM dla tej konkretnej tkanki.

Metoda ta może zapewnić wgląd w skład macierzy zewnątrzkomórkowej normalnych tkanek, ale może być również stosowana do innych układów, takich jak tkanki chorobowe, takie jak rak. Aby rozpocząć, przygotuj wszystkie zgodnie ze wskazaniami w protokole tekstowym. Tabela pierwsza, w tym dodanie inhibitorów proteazy.

Następnie rozbić 100 miligramów tkanki w 500 mikrolitrach buforu C za pomocą homogenizatora tkankowego, aż do uzyskania jednolitej zawiesiny. Przenieść homogenat do rotatora probówki i inkubować przez 20 minut W temperaturze czterech stopni Celsjusza rura zawierała od 10 do 20 mikrolitrów próbki do probówki oznaczonej jako całkowity ekstrakt tkankowy lub błysk materiału wyjściowego. Zamrozić próbkę w ciekłym azocie i przechowywać ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Następnie odwirować homogenat w temperaturze 16 000 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant do czystej probówki i oznaczyć go jako frakcję cytozolową lub C. Błysk. Frakcję C zamrozić i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Tam pipeta. Zawiesić osad w 400 mikrolitrach buforu podwójnie, a następnie inkubować na rotatorze rurowym przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwirować próbkę i wyrzucić supernatant, aby najpierw wyekstrahować białka jądrowe.

Zawiesić osad w 150 mikrolitrach buforu N i inkubować na rotatorze probówkowym przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwirować próbkę i zebrać supernatant do czystej probówki. Powtórzyć inkubację w buforze N po centryfuzji.

Połącz supernatanty i oznacz je jako frakcję jądrową lub N. Błysk. Frakcję N zamrozić do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Dodaj 100 mikrolitrów buforu M i zreusować, zawiesić osad.

Następnie inkubuj próbkę na rotatorze probówkowym przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed odwirowaniem. Zebrać supernatant do czystej probówki i oznaczyć go jako membranę lub błysk frakcji M. Zamrozić frakcję M i przechowywać ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach buforu CS energicznie pipetując, a następnie inkubować próbkę na rotatorze probówkowym przez 30 minut. W temperaturze pokojowej odwirować próbkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zebrać supernatant w czystej probówce i oznaczyć go jako frakcję cytoszkieletu lub CS. Granulka powinna być teraz znacznie mniejsza.

Ponownie zawiesić osad w 150 mikrolitrach buforu C. Przenieść próbkę do rotatora probówki i inkubować ją przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wirować przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant. Następnie połącz supernatant z tym z bufora CS w probówce już oznaczonej jako frakcja cytoszkieletu lub CS. Błysk.

Zamroź frakcję CS i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby umyć reus granulek. Zawieś go w 500 mikrolitrach PBS, a następnie inkubuj na rotatorze rurowym przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odwirować probówkę i wyrzucić supernatant. Umyj w sumie trzy razy. Aby uzyskać granulat wzbogacony o ECM, należy przechowywać niewielką część frakcji ECM do analizy QC w bloku zachodnim eksperymentu.

Błyskawiczne zamrożenie frakcji w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć trawienie. Najpierw ponownie zawiesić osad wzbogacony w ECM w ośmiomolowym moczniku i dodać roztwór dihi trzech etolu w wodzie, aby uzyskać końcowe stężenie 10 milimolów.

Przenieś probówkę do inkubatora i potrząsaj nią z prędkością 1400 obr./min przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie schłodzić próbkę do temperatury pokojowej i dodać roztwór odtworzonego acetamidu joty w wodzie do końcowego stężenia 25 milimolów. Inkubuj mieszaninę w ciemności przez 30 minut.

W temperaturze pokojowej rozcieńczyć do stężenia dwumolowego mocznika 100 milimolowym wodorowęglanem amonu, a następnie dodać P PGA F. Przenieść próbkę do inkubatora i wstrząsać nią z prędkością 1400 obr./min przez dwie godziny. W temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj proteazę endo, pokrój C w plasterki do mieszaniny i wstrząsaj z prędkością 1400 obr./min przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj trypsynę i wstrząśnij z prędkością 1400 obr./min przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Mętny roztwór powinien stać się klarowny po całonocnym trawieniu w drugim delikatesowym kwadracie trypsyny i wstrząsać przez dodatkowe dwie godziny, aby dezaktywować pipetę trypsyny 50% kwas trifluorooctowy do mieszaniny w odstępach co jeden mikrolitr, aż pH będzie mniejsze niż dwa. Monitoruj pH, zaznaczając jeden mikrolitr roztworu peptydu na bibułce pH. Odwirowywać roztwór przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Na koniec zebrać supernatant w czystej probówce o niskiej retencji. Roztwór peptydu ECM należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Western blot z decelularyzacji lustrzanej tkanki płucnej wykazuje ekstrakcję składników wewnątrzkomórkowych, takich jak ASIN, beta, on, aktyna, GA, dh i histony we frakcjach pośrednich.

Składniki te są prawie całkowicie nieobecne we frakcji ECM, chociaż pozostaje pewne niewielkie zanieczyszczenie histonami. W przeciwieństwie do tego, kolagen jeden jest wysoce wzbogacony we frakcję ECM, ale nie jest wykrywany w innych frakcjach, co sugeruje, że kolagen nie jest tracony podczas pośrednich etapów ekstrakcji. Podobne wyniki uzyskano w przypadku raka pamięci ludzkiej.

Kolagen ksenoprzeszczepowy został znacznie wzbogacony we frakcję ECM z niewielkim ubytkiem frakcji CS. Pewne szczątkowe zanieczyszczenie aktyną pozostało we frakcji ECM po jej rozwoju. Technika ta utorowała drogę biologom i klinicystom do zbadania złożoności macierzy zewnątrzkomórkowej tkanek normalnych i chorych.