Name: Dwulufowe i koncentryczne mikroelektrody do pomiaru zewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w tkance mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Poznaj metodę pomiaru sygnałów jonowych w tkance mózgowej myszy przy użyciu dwulufowych i koncentrycznych mikroelektrod selektywnych. Technika ta pozwala analizować dynamikę potasu i sodu pozakomórkowego podczas aktywności nerwowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować C. Roderigo za fachową pomoc techniczną. Dziękujemy S. Köhlerowi (Centrum Zaawansowanego Obrazowania, Uniwersytet Heinricha Heinego w Düsseldorfie) za pomoc w produkcji wideo. Badania w laboratorium autora zostały sfinansowane przez Niemieckie Stowarzyszenie Badawcze (DFG: Ro 2327/8-1 do CRR), Uniwersytet Heinricha Heinego w Düsseldorfie (do NH) oraz przez grant National Institutes of Health R01NS032123 (do MC).

<ol><li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+regulation+in+the+brain%3A+implications+for+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li>
<li>Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-induced+changes+in+extracellular+Na%2B+and+Cl-+concentration+in+relation+to+changes+in+the+size+of+the+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space.</a> Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).</li>
<li>Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+potassium+changes+in+extracellular+microenvironment+of+cat+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex.</a> J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).</li>
<li>Rice, M. E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-+and+aspartate-induced+extracellular+potassium+and+calcium+shifts+and+their+relation+to+those+of+kainate%2C+quisqualate+and+N-methyl-D-aspartate+in+the+isolated+turtle+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 38, 295-310 (1990).</li>
<li>Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+extracellular+potassium+activity+in+cat+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex.</a> Brain Res. 50, 489-495 (1973).</li>
<li>Deitmer, J. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+regulation+and+proton+signalling+by+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">pH regulation and proton signalling by glial cells.</a> Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).</li>
<li>Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+modulation+of+pH+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation and modulation of pH in the brain.</a> Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).</li>
<li>Kofuji, P., Newman, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKofuji%2C+P+%22Regulation+of+potassium+by+glial+cells+in+the+central+nervous+system%22">Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system</a>. , Springer. (2009).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).</li>
<li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+use+of+high-speed%2C+concentric+h%2B-+and+Ca2%2B-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).</li>
<li>Stephan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kir4.1+channels+mediate+a+depolarization+of+hippocampal+astrocytes+under+hyperammonemic+conditions+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ.</a> Glia. 60, 965-978 (2012).</li>
<li>Haack, N., Rose, C. R. Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaack%2C+N+%22Microelectrodes%22">Microelectrodes</a>. Lei, K. F. , Nova Science Publishers. 87-105 (2014).</li>
<li>Roos, A., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH.</a> Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).</li>
<li>Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+Intracellular+Sodium+Imaging+Combined+with+UV-mediated+Focal+Uncaging+of+Glutamate+in+CA1+Pyramidal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li>
<li>Hertz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+astrocytic+Na+%2CK+-ATPase+and+glycogenolysis+for+K+homeostasis+in+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain.</a> J Neurosci Res. , (2014).</li>
<li>Pumain, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-+and+amino+acid-induced+calcium+and+potassium+changes+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex.</a> J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).</li>
<li>Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate%2C+AMPA%2C+NMDA+Induced+Changes+in+Extracellular+Space+Volume+and+Tortuosity+in+the+Rat+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).</li>
<li>Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+is+not+necessary+for+the+generation+of+epileptiform+neuronal+activity+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices.</a> J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).</li>
<li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322, 1551-1555 (2008).</li>
<li>Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+changes+and+alterations+in+the+size+of+the+extracellular+space+during+epileptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity.</a> Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).</li>
<li>Zanotto, L., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate+and+glutamate+induced+reductions+in+extracellular+free+calcium+and+sodium+concentration+in+area+CA1+of+%27in+vitro%27+hippocampal+slices+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats.</a> Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).</li>
<li>Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+making+ion-selective+microelectrodes+suitable+for+intracellular+recording+in+vertebrate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells.</a> J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).</li>
<li>Ammann, D., Anker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+carrier+sodium+ion-selective+microelectrode+for+extracellular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies.</a> Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).</li>
<li>Deitmer, J. W., Schlue, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Na%2B+and+Ca2%2B+in+leech+Retzius+neurones+during+inhibition+of+the+Na%2B-K%2B+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump.</a> Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).</li>
<li>Schwiening, C. J., Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+intracellular+calcium+and+its+muffling+measured+by+calcium+iontophoresis+in+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones.</a> J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).</li>
<li>Chesler, M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+of+astrocytes+increases+rapidly+with+cortical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation.</a> Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).</li>
<li>Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valinomycin-based+K%2B+selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).</li>
<li>Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicarbonate-dependent+changes+of+intracellular+sodium+and+pH+in+identified+leech+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells.</a> Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).</li>
<li>Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+recording+ion+specific+microelectrodes%3A+their+use+in+pharmacological+studies+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS.</a> Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).</li>
<li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li>
<li>Chesler, M., Chan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-induced+extracellular+pH+transients+in+the+in+vitro+turtle+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 27, 941-948 (1988).</li>
<li>Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+sodium+activity+and+the+sodium+pump+in+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones.</a> J Physiol. 220, 55-71 (1972).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Elektrody jonoselektywne oparte na nośnikach cieczy są z powodzeniem stosowane od dziesięcioleci, a dla wielu jonów dostępne są wysoce specyficzne czujniki 22-26. W przypadku stosowania w przestrzeni zewnątrzkomórkowej (ECS) preparatów mózgu kręgowców należy jednak pamiętać, że jest to technika dość inwazyjna: o ile szerokość ECS wynosi tylko około 20-50 nm, o tyle średnica mikroelektrod jonoselektywnych wynosi około 1 μm (elektrody dwulufowe) lub większe (elektrody koncentryczne). Końcówki mikroelektrod jonoselektywnych nie tylko uszkadzają tkankę podczas nabijania tkanki, ale także powiększają ECS, sprzyjając niedoszacowaniu stanów przejściowych jonów. Pomimo tych pułapek, zewnątrzkomórkowe stany przejściowe jonów w odpowiedzi na aktywność neuronalną są niezwykle spójne między różnymi laboratoriami 7,8, co świadczy o niezawodności tej metody.
Wydajność i przydatność elektrod jonoselektywnych zależy od ich czułości i selektywności, która jest określana przez zastosowany koktajl czujników ("jonofor z ciekłą membraną"). Koktajle sensoryczne zawierają specjalną cząsteczkę nośnikową, np. walinomycynę dla mikroelektrod selektywnych K+, która wykazuje wysoką selektywność dla potasu 27. Niezależnie od tego może wystąpić reaktywność krzyżowa z innymi jonami i musi być testowana. Walinomycyna wykazuje znaczącą reaktywność krzyżową w stosunku do amonu, co należy wziąć pod uwagę przy interpretacji wyników (np. 11,12). Ponadto, ponieważ odpowiedź napięciowa jonoforów przebiega zgodnie z zachowaniem Nernsti'a (por. równanie 1), stosunek sygnału do szumu i próg detekcji zależą od stężenia mierzonego jonu. Tak więc, podczas gdy małe stany nieustalone [K+]o wywołują duże zmiany napięcia w stosunku do niskiej linii podstawowej [K+]o, małe stany nieustalone [Na+]o są znacznie trudniejsze do wykrycia w stosunku do wysokiej linii podstawowej [Na+]o (por. rysunek 5 i 6).
Wydajność elektrod jonoselektywnych zależy również od rozdzielczości czasowej, która jest w dużej mierze regulowana przez elektryczną stałą czasową. Ta ostatnia zależy głównie od rezystancji osiowej czujnika oraz od pojemności rozłożonej na całej długości pipety, między jej roztworami wewnętrznymi a płynem zewnętrznym. W konfiguracji dwulufowej rezystancja jest wysoka dzięki długiej kolumnie czujnika jonów z zasypką. Dla danego dielektryka izolacyjnego (w tym przypadku szkła borokrzemianowego) pojemność zależy od grubości dielektryka. W elektrodach dwulufowych szerokość dielektryka jest równa szklanej ściance pipety. Gdy szkło cienkie zbliża się do końcówki, szerokość dielektryka spada, a pojemność wzrasta. Czynniki te łączą się, aby wytworzyć elektrody o czasach reakcji wahających się od kilkuset milisekund do kilku sekund, ponieważ czynniki te są zróżnicowane.
Główną zaletą konstrukcji koncentrycznej jest to, że zarówno opór osiowy, jak i pojemność kąpieli są znacznie zmniejszone. Koncentryczna pipeta bocznikuje większość rezystancji zasypanego wymiennika jonowego, pozostawiając tylko pozostałość w ostatnich kilku mikrometrach przed końcówką. Ponadto roztwór napełniający w pipecie koncentrycznej jest fizycznie oddalony od wanny, oddzielony grubością dwóch szklanych ścianek, co znacznie zmniejsza pojemność. Jak pokazano wcześniej 10, połączonym efektem zmniejszonej rezystancji i pojemności jest poprawa rozdzielczości czasowej o dwa rzędy wielkości. W przypadku koncentrycznych mikroelektrodCa2+ i pH 90% czasy odpowiedzi wynosiły zaledwie 10-20 ms10. Istotną zaletą konstrukcji koncentrycznej jest niższy poziom hałasu (por. rysunek 8). Dzięki znacznie zmniejszonej rezystancji, stany przejściowe napięcia wynikające z jakiegokolwiek hałasu otoczenia są zminimalizowane. Co więcej, powrót do zdrowia po takich stanach nieustalonych jest szybki ze względu na szybką stałą czasową. Takie artefakty są zatem małe i szybkie oraz mają mniej destrukcyjny wpływ na zapisy fizjologiczne (por. ryc. 8).
Istnieją również wady techniki koncentrycznej. Po pierwsze, ich montaż jest bardziej złożony i czasochłonny. Drugą wadą jest konieczność umieszczenia oddzielnej mikroelektrody referencyjnej wraz z końcówką, co wiąże się z użyciem oddzielnego mikromanipulatora lub specjalistycznego podwójnego manipulatora. Wreszcie, mikroelektrody dwulufowe można rozszerzyć do konstrukcji trzylufowej, co pozwala na wykrywanie dwóch różnych gatunków jonów w tym samym czasie 28, co nie jest możliwe w przypadku elektrod koncentrycznych.
Najczęstsze pułapki
Nieefektywna silanizacja.
Najważniejszym krokiem i główną przeszkodą w wytwarzaniu jakiejkolwiek mikroelektrody jonoselektywnej opartej na czujniku cieczy jest procedura silanizacji. Gdy elektrody nie reagują na zmiany stężenia jonów specyficznych lub reagują odpowiedzią sub-Nernstiańską (tj. znacznie mniej niż 58 mV na dziesięciokrotną różnicę stężeń), przyczyną jest zwykle słaba skuteczność silanizacji. Z naszego doświadczenia wynika, że może się to zdarzyć, gdy wilgotność powietrza jest zbyt wysoka lub zbyt niska, typowa dla warunków panujących odpowiednio w środku lata lub zimy. Jeśli możliwe jest wywarcie pewnej kontroli nad wilgotnością w pomieszczeniu, problemy te można przezwyciężyć.
Rezystancja elektrody jest zbyt wysoka.
W razie potrzeby rezystancję cylindra wrażliwego na jony można zmniejszyć poprzez ukosowanie. W tym celu należy na kilka sekund wystawić jego końcówkę na działanie silnego strumienia ścierniwa zawieszonego w wodzie. Spowoduje to złamanie jego najwyższej końcówki i obniżenie oporu do pożądanej wartości.
Mosty solne.
Mostki solne między beczkami jonowymi i referencyjnymi skutkują słabą reakcją elektrod lub ich brakiem, a tym samym mogą znacznie zakłócić ich działanie podczas kalibracji. Jak wspomniano powyżej (patrz punkt 1.6.), jest to głównie problem, gdy wybierane jest dwulufowe szkło theta, ale jest rzadkim zjawiskiem w przypadku stosowania opisanej tutaj techniki offsetowej, skręconej lufy.
Mając na uwadze łatwość produkcji, oryginalna dwulufowa konstrukcja Lux 29 może być często wykorzystywana z zyskiem. Metoda ta wykorzystuje wstępne napełnianie beczek jonowych i referencyjnych roztworami soli, szybką ekspozycję na roztwór silanu poprzez jego zasysanie i wydalenie z końcówki, a następnie wprowadzanie jonitariusza, również przez końcówkę (patrz 30,31). Elektrody te można wytworzyć w około 10 minut, ale ich rozmiar końcówki wynosi zwykle 4 μm lub więcej i są bardziej podatne na awarie podczas eksperymentu. W przeciwieństwie do tego, metody silanizacji, które obejmują wystawienie na działanie oparów silanu i ogrzewanie, mogą wytwarzać elektrody z mniejszymi końcówkami, które wystarczają na dni, a czasem tygodnie.
Podsumowując, istnieje kilka protokołów i podejść do przygotowania mikroelektrod jonoselektywnych. W tym miejscu opisaliśmy dwie główne procedury wytwarzania skręconych, dwulufowych i koncentrycznych mikroelektrod, które działają dobrze i niezawodnie w naszych laboratoriach, a ogólny wskaźnik sukcesu jest bliski 100%. Co ważne, techniki te będzie można zastosować do pomiaru innych rodzajów jonów, w tym pH czy wapnia, a także będą miały zastosowanie do innych preparatów niż mózg, w tym jam wypełnionych płynem lub płynów w ogóle. Wreszcie, co nie mniej ważne, mikroelektrody jonoselektywne umożliwiają określenie stężenia jonów wewnątrz komórek. Ze względu na ich stosunkowo duży rozmiar końcówki (~ 1 μm) będzie to jednak możliwe tylko w komórkach o dużym korpusie komórkowym, np. takich jak znalezione w preparatach bezkręgowców 28,32.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Sygnalizacja elektryczna w mózgu opiera się na przepływie jonów przez błony plazmatyczne. Główne ruchy jonów do i z przestrzeni zewnątrzkomórkowej są nie tylko pośredniczone przez przejście przez kanały jonowe bramkowane napięciem, ale także przez postsynaptyczne receptory jonotropowe, a także transportery jonów. Aktywności neuronalnej towarzyszą zatem złożone zmiany w zewnątrzkomórkowym stężeniu wszystkich głównych jonów 1. Na przykład wykazano, że napływ sodu do neuronów podczas aktywności pobudzającej powoduje spadek zewnątrzkomórkowego stężenia sodu ([Na+]o) 2. To samo dotyczy zewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, ponieważ jony wapnia szybko wnikają zarówno do struktur pre-, jak i postsynaptycznych 3. W tym samym czasie potas porusza się w przeciwnym kierunku, co pośredniczy we wzroście zewnątrzkomórkowego stężenia potasu ([K+]o) w niskim zakresie mM 4,5. Aktywność synaptyczna powoduje również zmiany w pH zewnątrzkomórkowym, które są częściowo łagodzone przez współistniejące strumienie błony glejowej, które zmieniają pH wewnątrzglejowe 6,7. Te związane z aktywnością zmiany w stężeniach jonów zewnątrzkomórkowych mają znaczące konsekwencje funkcjonalne. Na przykład, nawet niewielki wzrost [K+]o depolaryzuje neurony, a także komórki glejowe, zmieniając w ten sposób pobudliwość neuronów, a istnieje kilka mechanizmów usuwania nadmiaru potasu 8. Ich niepowodzenie może skutkować epileptyczną aktywnością neuronów lub zjawiskami takimi jak rozprzestrzenianie się depresji 1. 
Ze względu na ich krytyczne znaczenie, ilościowe określenie stężeń jonów zewnątrzkomórkowych jest często konieczne i wymagane do zrozumienia funkcji i dysfunkcji sieci neuronowych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Przez dziesięciolecia dwulufowe mikroelektrody jonoselektywne okazywały się doskonałymi narzędziami do takich pomiarów w tkance mózgowej 9. Dla wielu jonów dostępne są wysoce specyficzne czujniki o niskiej reaktywności krzyżowej dla innych jonów. Oprócz klasycznych elektrod dwulufowych wprowadzono ostatnio tak zwane elektrody koncentryczne. Te ostatnie zapewniają lepszą rozdzielczość czasową, ale wymagają trochę więcej czasu i wysiłku, aby zbudować 10. 
W dalszej części opiszemy przygotowanie i kalibrację tych dwóch typów mikroelektrod jonoselektywnych. Następnie pokazujemy, w jaki sposób elektrody te mogą być wykorzystane w przygotowaniach do wycinków mózgu do pomiaru zmian w [K+]o lub [Na+]o wywołanych aktywnością pobudzającą zgodnie z różnymi paradygmatami stymulacji, w tym kąpielą i uciskiem leków.

<table><tbody><tr><td>Ścierniwo&nbsp; &nbsp;</td><td>MikroPolskie&nbsp;</td><td>Buehler GmbH</td><td>rozpuszczona w A.dest</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>1405059</td><td>Hilgenberg</td><td>Pipeta aplikacyjna; 75 mm x 2 mm, grubość ścianki 0,3 mm</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem</td><td>GC 150 F-15&nbsp;</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>Do czujnika mikroelektrod dwulufowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem</td><td>GC100-F-15</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>Dla odniesienia mikroelektrod dwulufowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem</td><td>GB-200TF-15&nbsp;</td><td>Science Products</td><td>Koncentryczny, kanał zewnętrzny. Średnica zewnętrzna 2,0 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem</td><td>GB-120TF-10</td><td>Science Products</td><td>Koncentryczny, kanał wewnętrzny. O.D. 1,2 mm</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz elektrometryczny ze sceną</td><td></td> czołową <td>Wykonane na zamówienie</td><td>Rin = 10 T&Omega; i Ibias=50 fA-1pA (dostępne w handlu&nbsp; alternatywy: np. Dagan IX2-700, ze sceną czołową (rezystor sprzężenia zwrotnego 10 Gig) lub EPMS-07, NPI, Tamm, Niemcy)</td></tr><tr><td>Komora</td><td></td> doświadczalna <td>Wykonana na zamówienie</td><td>Komercyjnie dostępna od np. &nbsp; Warner Instruments, Stany Zjednoczone; &nbsp; Scientifica, Wielka Brytania</td></tr><tr><td>Piec</td><td></td><td>Heraeus</td><td>Musi pozostać stały na poziomie 200 &deg; C</td></tr><tr><td>Twardy lepki wosk / wosk dentystyczny&nbsp;</td><td>Deiberit 502&nbsp;</td><td>Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH</td><td></td></tr><tr>Płyta <td></td><td>grzejna</td><td>na zamówienie Musi</td><td>pozostać na stałym poziomie 40 & stopni; C</td></tr><tr><td>Uchwyt mikroelektrod wykonany z pleksi</td><td></td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>Podwójna: O.D. &nbsp; kapilary 1,5 mm, koncentryczne: O.D.&nbsp; kapilary 2 mm</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td></td><td>Leitz</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>MD4R</td><td>Mikroskop stereoskopowy Leica</td><td></td></tr><tr><td></td><td>M205C</td> Plan <td>obiektywu Leica</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.8xLWD</td> Ściągacz do pipet <td>Leica</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Model PP-830</td><td>Mikroelektrody koncentryczne Narishige</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>model P-97</td><td>Sutter Instruments&nbsp;</td><td>Czujnik koncentrycznych mikroelektrod&nbsp;</td></tr><tr><td>Pneumatyczny system wyrzucania leków</td><td>Picospritzter Typ II</td><td>Zawór ogólny TM Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Stopień jazdy na jaskółczy ogon</td><td>DT 25/M</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>Klej dwuskładnikowy</td><td>&nbsp; Araldite</td><td>Huntsman advanced materials GmbH</td><td>Można również użyć małego paska folii aluminiowej do sklejenia naczyń włosowatych&nbsp;</td></tr><tr><td>Drut srebrny</td><td>99.9%&nbsp;</td><td>Wieland Edelmetalle</td><td></td></tr><tr><td>Slicer / Vibratome</td><td>Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>AxoScope 8.1&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz pionowy&nbsp;</td><td>Typ PE-2</td><td>Narishige Scientific Instruments</td><td>Z obrotowym uchwytem do&nbsp; dwulufowych mikroelektrod</td></tr><tr><td>x/y stopień</td><td></td> translacyjny Wykonane <td></td><td>na zamówienie</td></tr><tr><td>1(S),9(R)-(&minus;)-Metocydek bicukuliny</td><td>Sigma aldrich</td><td>14343</td><td>Kompetycyjny antagonista receptorów GABAA (wrażliwy na światło); UWAGA toksyczny</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA/antagonista receptora kainianowego; UWAGA toksyczny</td></tr> Antagonista receptora <tr><td>dimetylosulfotlenku (DMSO)</td> <td>Sigma aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>Antagonista receptora NMDA; UWAGA toksyczny</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan (HMDS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td>UWAGA: Łatwopalna, ostra toksyczność (doustna, skórna, wdychanie) i dla metali i skóry</td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Sigma aldrich</td><td>A9256</td><td>Aktywuje NMDA i nie-NMDA oraz EAATs</td></tr><tr><td>Hydrat soli monosodowej kwasu L-glutaminowego</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1626</td><td>Aktywuje NMDA-R, AMPA-R, QA-R i KA-R),&nbsp; mGluRs i EAAT</td></tr><tr><td>Jonofor potasowy I - koktajl B</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>60403</td><td>Na bazie walinomycyny; UWAGA toksyczny</td></tr><tr><td>Jonofor sodowy II - koktajl A</td><td>Fluka&nbsp; &nbsp;</td><td>71178</td><td>Oparty na ETH 157</td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inhibitor kanałów Na+ zależnych od napięcia; UWAGA toksyczna</td></tr><tr><td>Woda, ultra czysta</td><td>Sigma aldrich</td><td>W3500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

dwulufowe i koncentryczne mikroelektrody do pomiaru zewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w tkance mózgowej

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Aktywności elektrycznej w mózgu towarzyszą znaczne strumienie jonów przez błony, co powoduje złożone zmiany w zewnątrzkomórkowym stężeniu wszystkich głównych jonów. Ponieważ te przesunięcia jonów mają znaczące konsekwencje funkcjonalne, ich ilościowe określenie jest często wymagane do zrozumienia funkcji i dysfunkcji sieci neuronowych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. W niniejszym badaniu demonstrujemy wytwarzanie i kalibrację dwulufowych mikroelektrod jonoselektywnych, które okazały się doskonałymi narzędziami do takich pomiarów w tkance mózgowej. Ponadto opisano tak zwane "koncentryczne" mikroelektrody jonoselektywne, które, w oparciu o swoją odmienną konstrukcję, oferują znacznie lepszą rozdzielczość czasową szybkich zmian jonów. Następnie pokazujemy, w jaki sposób te elektrody mogą być wykorzystane w ostrym przygotowaniu wycinków mózgu w hipokampie myszy. Za pomocą dwulufowych, selektywnych mikroelektrod potasowych wykazano zmiany w zewnątrzkomórkowym stężeniu potasu ([K+]o) w odpowiedzi na egzogenne zastosowanie agonistów receptora glutaminianu lub podczas aktywności padaczkowej. Ponadto ilustrujemy charakterystykę odpowiedzi elektrod wrażliwych na sód, dwulufowych i koncentrycznych oraz porównujemy ich wykrywanie zmian w zewnątrzkomórkowym stężeniu sodu ([Na+]o) wywołanych kąpielą lub ciśnieniowym zastosowaniem leków. Pomiary te pokazują, że chociaż amplitudy odpowiedzi są podobne, koncentryczne mikroelektrody sodowe wykazują lepszy stosunek sygnału do szumu i czas reakcji w porównaniu z konstrukcją dwulufową. Ogólnie rzecz biorąc, zademonstrowane procedury będzie można łatwo przenieść do pomiaru innych gatunków jonów, w tym pH czy wapnia, a także będą miały zastosowanie do innych preparatów.

Aby monitorować [K+]o oraz zmiany zachodzące w odpowiedzi na aktywność pobudzeniową, do stratum radiatum obszaru CA1 wprowadzono dwukanałową mikroelektrodę selektywną w stosunku do potasu. Kilka minut po wprowadzeniu, kanał elektrody selektywny względem jonów osiągnął stabilną wartość bazową (Rysunek 7A), odpowiadającą [K+]o na poziomie około 2,8 mM, co jest wartością bliską [K+] stosowanego ACSF (2,5 mM). Aplikacja do kąpieli 0,5 mM glutaminianu przez 10 s wywołała odwracalny wzrost [K+]o o około 4 mM, po którym nastąpił spadek poniżej poziomu bazowego o około 0,7 mM (Rysunek 7A). Obniżenie stężenia glutaminianu do 0,4, 0,3 i 0,2 mM spowodowało odpowiedni spadek amplitudy zarówno przejściowego wzrostu, jak i spadku [K+]o (Rysunek 7A).
<img alt="Wykres neuronalnych prądów jonowych; dynamika K+, elektrofizjologia, potencjał czynnościowy, blokada APV, CNQX, TTX." src="/files/ftp_upload/53058/53058fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Zewnątrzkomórkowe przejściowe zmiany stężenia potasu wodpowiedzi na aktywność pobudzeniową. (A) Przejściowe zmiany [K+]o, składające się ze wzrostu, po którym następuje spadek poniżej poziomu bazowego, wywołane aplikacją do kąpieli różnych stężeń glutaminianu przez 10 sec, jak wskazano. (B) Wpływ perfuzji blokerami receptorów glutaminianu (CNQX, 100 µM; APV, 100 µM) i tetrodotoksyną (TTX; 0,5 µM) na przejściowe zmiany [K+]o wywołane aplikacją do kąpieli 0,5 mM glutaminianu przez 10 sec. (C) Spontaniczne przejściowe zmiany [K+]o w obecności 0Mg2+/BIC. Eksperymenty przedstawione w A-C zostały przeprowadzone przy użyciu elektrod dwukanałowych. W celach ilustracyjnych ślady zostały wygładzone filtrem Savitzky-Golaya (szerokość 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że takie sygnały [K+]o indukowane glutaminianem nie ulegają znaczącym zmianom podczas aplikacji TTX i są zatem w dużej mierze niezależne od otwierania napięciowo zależnych kanałów sodowych oraz generowania potencjałów czynnościowych neuronów 15,16. Aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw obserwowanych zmian [K+]o w odpowiedzi na glutaminian, zastosowano blokery receptorów glutaminianowych, mianowicie CNQX (100 µM; bloker receptorów AMPA) oraz APV (100 µM; bloker receptorów NMDA) w obecności TTX (0.5 µM). Po perfuzji kąpieli z tymi blokerami zmiany [K+]o indukowane glutaminianem zostały praktycznie zniesione, co potwierdziło ich zależność od otwierania kanałów jonotropowych receptorów glutaminianowych, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami (np. 17; Rycyna 7B).
Aby dalej wykazać znaczenie pobudzenia glutaminergicznego dla generowania sygnałów pozakomórkowego [K+], skrawki perfundowano nominalnie beztlenkowym z Mg2+ roztworem soli zawierającym 10 µM metjodydku bikukuliny (0Mg2+/BIC). Pozwala to na zniesienie woltażowej blokady receptorów NMDA przez Mg2+ oraz osłabia inhibicję poprzez blokowanie receptorów GABAA, co wywołuje spontaniczną, nawracającą aktywność epileptiformną w sieci (np. 18,19). Zgodnie z oczekiwaniami 20, w roztworze 0Mg2+/BIC wykryto spontaniczne, nawracające przejściowe wzrosty [K+]o o wartości około 1,5 mM (Rysunek 7C). Pomiędzy tymi odpowiedziami występowały mniejsze przejściowe wzrosty [K+]o o średniej amplitudzie około 0,2 mM (Rysunek 7C).
W drugim zestawie eksperymentów wykorzystano mikroelektrody wrażliwe na [Na+], aby określić zmiany [Na+]o wywołane aplikacją agonistów glutaminianu. Porównano również charakterystykę odpowiedzi mikroelektrod dwukanałowych oraz koncentrycznych przy zastosowaniu dwóch różnych paradygmatów aplikacji. Mikroelektrody wrażliwe na [Na+] umieszczono w stratum radiatum na głębokości około 50 µM. Po uzyskaniu stabilnej linii bazowej aplikowano agonistę glutaminianu, L-asparaginian, poprzez perfuzję kąpieli (10 mM, 120 sec, perfuzja kąpieli z prędkością 2,5 ml/min). Jak zaobserwowano wcześniej 21, aplikacja asparaginianu spowodowała powolny spadek [Na+]o o około 15 mM, który trwał około 5 min, a następnie zaczął powracać do poziomu bazowego (Rysunek 8A). Warto zauważyć, że choć amplitudy szczytowe i kinetyka sygnałów [Na+]o wyznaczonych przez obie elektrody były w tych warunkach praktycznie identyczne, elektrody koncentryczne wykazały bardziej stabilną linię bazową i niższy poziom szumów (Rysunek 8A).
Aby przetestować charakterystykę odpowiedzi różnych elektrod w warunkach szybszego podawania substancji, zastosowano aplikację glutaminianu pod ciśnieniem za pomocą cienkiej szklanej pipety umieszczonej w stratum radiatum w odległości 20-40 µm od końcówki mikroelektrody selektywnej jonowo. Zgodnie z oczekiwaniami 21, podawanie glutaminianu (10 mM) przez 200 ms spowodowało spadek stężenia [Na+]o (Rysunek 8B). Amplitudy szczytowe spadku [Na+]o znajdowały się w tym samym zakresie dla obu typów elektrod (podwójne: 4,5 - 13,5 mM, n=14; koncentryczne: 2,0 - 19,1 mM, n=15). Jednakże, w przeciwieństwie do wyników uzyskanych podczas powolnej perfuzji kąpieli (patrz. powyżej), różniły się istotnie nie tylko stosunek sygnału do szumu, ale także przebieg czasowy sygnałów [Na+]o wykrywanych przez oba typy elektrod. Średni czas do osiągnięcia szczytu wynosił 3,5 s dla mikroelektrod podwójnych i zaledwie 1,3 s dla mikroelektrod koncentrycznych.
Zatem wyniki te wykazują i potwierdzają szybszą kinetykę odpowiedzi mikroelektrod selektywnych względem Na+ o konstrukcji koncentrycznej w porównaniu do mikroelektrod dwukanałowych (por. Rysunek 6C i 8B), co odnotowano również w przypadku ich odpowiedników selektywnych względem Ca2+ i pH 10. W przeciwieństwie do poprzedniego badania, w którym zastosowano krótkie serie stymulacji synaptycznej w celu wywołania szybkich, indukowanych synaptycznie przejściowych zmian stężenia jonów, w naszym schemacie aplikacyjnym zaobserwowano jedynie tendencję, ale nie stwierdzono istotnej różnicy w średnich amplitudach szczytowych między elektrodami koncentrycznymi a dwukanałowymi. Wynikało to prawdopodobnie z faktu, że odległość pipety aplikacyjnej od wierzchołka mikroelektrody selektywnej względem jonów różniła się dwukrotnie (20-40 µm), a w konsekwencji maksymalne stężenie glutaminianu w obszarze docelowym nie było takie samo w różnych eksperymentach, co uniemożliwiło wykazanie istniejących różnic w amplitudach szczytowych.
(A) Górne przebiegi: Zmiana napięcia elektrod odniesienia (Vref) w elektrodzie dwukanałowej (czarna kropkowana linia) i elektrodzie koncentrycznej (szara linia) w odpowiedzi na wskazane zmiany stężenia Na+ w kąpieli ([Na+]b). Należy zauważyć, że odpowiedzi napięciowe obu elektrod są praktycznie identyczne. Dolne przebiegi: Zmiany napięcia potencjału Na+ (VNa+) elektrody dwukanałowej (czarna linia) i elektrody koncentrycznej (szara linia) w odpowiedzi na zmiany [Na+]b. (B) Wykresy półlogarytmiczne zależności [Na+]b od VNa+ dla obu elektrod. Liniowe wykresy danych wykazują nachylenie wynoszące około 48 mV dla obu elektrod. (C) Odpowiedź VNa+ elektrody dwukanałowej (czarna linia) i elektrody koncentrycznej (szara linia) na szybką zmianę [Na+]b z 152 mM do 70 mM. Zauważalny jest znacznie szybszy czas odpowiedzi elektrody koncentrycznej. W celach ilustracyjnych przebiegi zostały wygładzone filtrem Sawitzky'ego-Golaya (szerokość 20).
<img alt="Wykres elektrofizjologiczny pokazujący zmiany napięcia i stężenia jonów sodu z użyciem elektrod dwukanałowych i koncentrycznych." src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Zewnętrzne przejścia sodowe wykryte za pomocą elektrod dwukanałowych i koncentrycznych. (A) Przejściowe zmiany Vref i [Na+]o wywołane perfuzją kąpieli 10 mM aspartatem przez 120 sec, zaznaczone paskiem. Górne ślady przedstawiają pomiar wykonany elektrodą dwukanałową, dolne ślady zarejestrowano za pomocą elektrody koncentrycznej. (B) Przejściowe zmiany Vref i [Na+]o wywołane lokalną aplikacją pod ciśnieniem 10 mM glutaminianu przez 0,2 sec, zaznaczone grotem strzałki. Górne ślady przedstawiają pomiar wykonany elektrodą dwukanałową, dolne ślady zarejestrowano za pomocą elektrody koncentrycznej. Czerwone linie przerywane reprezentują dopasowania liniowe okresu od początku sygnału do jego maksimum. Należy zauważyć, że czas odpowiedzi elektrody koncentrycznej w tych warunkach jest znacznie krótszy. W celach ilustracyjnych ślady zostały wygładzone filtrem Sawitzky-Golay (szerokość 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Demonstrujemy wykonanie, kalibrację i właściwości dwóch typów mikroelektrod selektywnych jonowo (dwulufowych i koncentrycznych) do pomiaru stężeń jonów w tkance mózgowej. Są one następnie wykorzystywane w przygotowaniu plastra hipokampa myszy, aby pokazać, że aktywność pobudzająca zmienia zarówno zewnątrzkomórkowe stężenie potasu, jak i sodu.

Dwulufowe i koncentryczne mikroelektrody do pomiaru zewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w tkance mózgowej

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrywanie i analiza dynamiki jonów w przestrzeni zewnątrzkomórkowej tkanki mózgowej. Pomiar przejściowy jonów jest realizowany przy użyciu mikroelektrod selektywnych jonowo, które mogą być przygotowane w oparciu o konstrukcję dwukanałową lub koncentryczną. W pierwszym kroku mikroelektrody są kalibrowane w kąpieli eksperymentalnej.Następnie elektrody są wprowadzane do ostrych skrawków hipokampa mysiego w celu rejestracji; aby wywołać pozakomórkowe przesunięcia jonowe, podaje się neuroprzekaźnik glutaminian lub agonistę glutaminianu. Glutaminian wiąże się z receptorami jonotropowymi w kolcach postsynaptycznych i otwiera je, co umożliwia napływ sodu do wnętrza komórek oraz wypływ potasu na zewnątrz. W konsekwencji prowadzi to do spadku stężenia sodu pozakomórkowego oraz wzrostu stężenia potasu pozakomórkowego, co jest wykrywane przez mikroelektrody selektywne jonowo.Metoda ta jest stosowana do badania regulacji jonów zewnątrzkomórkowych oraz indukowanych aktywnością przemian stężeń żelaza w mózgu. W niniejszym materiale opisujemy przygotowanie i kalibrację dwóch rodzajów mikroelektrod selektywnych jonowo. Pokazujemy, w jaki sposób można je wykorzystać w ostrych skrawkach tkanki mózgowej do pomiaru zmian stężeń potasu lub sodu w przestrzeni zewnątrzkomórkowej w odpowiedzi na aplikację neuroprzekaźników.Procedura zostanie zademonstrowana przez Nicole Hark i Simona z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować kapilarę szklaną borokrzemianową z włóknem, która posłuży jako kanał czuły na jony, oraz drugą kapilarę do późniejszego przygotowania kanału referencyjnego. Następnie należy użyć kleju dwuskładnikowego lub małego paska folii aluminiowej, aby przymocować do siebie obie kapilary (długą i krótką) na obu końcach.Ogrzewaj podwójną kapilarę w piecu w temperaturze 60°C przez jedną godzinę, aby usunąć resztkową wilgoć. Następnie przechowuj elektrody w eksykancie do czasu użycia. Umieść podwójną kapilarę centralnie w pionowym wyciągaczu z obrotowym uchwytem. Użyj uchwytu, aby zapobiec wydłużeniu kapilary.Ogrzewaj cewkę delikatnie, aż szkło stanie się wystarczająco miękkie, aby umożliwić poziomy obrót uchwytu. Po schłodzeniu obróć go o 180 stopni i usuń blokadę mechaniczną. Zastosuj drugi protokół grzania, aby wyciągnąć kapilarę, w wyniku czego powstaną dwie ostre kapilary dwukanałowe.Średnica końcówki kapilary podwójnej powinna wynosić blisko jeden mikron. Następnie należy napełnić rurkę referencyjną wodą destylowaną aż do jej końcówki, aby zapobiec kolonizacji. W poniższej procedurze należy umieścić kapilarę podwójną końcówką do góry na specjalnie wykonanym uchwycie.Następnie umieść ten uchwyt na butelce z szerokim otworem zawierającej wstępnie ogrzany HMDS i inkubuj przez 70 minut. Po tym czasie przenieś kapilarę na metalowy stojak. Następnie umieść ją w wstępnie podgrzanym piecu na dwie godziny, aby osuszyć oba ramiona po kolonizacji; przechowuj kapilarę w suchym miejscu w eksykatorze do momentu użycia.W dniu przeprowadzenia eksperymentu należy przygotować elektrodę jonoselektywną, wypełniając końcówkę wysilikonizowanego kapilary od dwóch do trzech mikrolitrów sensora jonoselektywnego. Następnie należy wypełnić kapilarę od tyłu 100 milimolarnym chlorkiem sodu w przypadku mikroelektrody czułej na sód lub 100 milimolarną solą chlorkową potasu w przypadku mikroelektrody czułej na potas. Należy uważać, aby podczas tej procedury nie wprowadzić dodatkowych pęcherzyków powietrza.Jeśli proces utwardzania przebiegł pomyślnie i czujnik został prawidłowo wypełniony, powierzchnia czujnika powinna być widoczna jako wyraźna wklęsłość na tle wypełnienia tylnego. Następnie należy wypełnić kanał referencyjny, wprowadzić druty srebrno-chlorkowe do obu cylindrów i uszczelnić każdy z nich woskiem dentystycznym. W tej procedurze należy wyciągnąć kapilarę o długości dwóch milimetrów w wyciągaczu poziomym, aby uzyskać krótki stożek i średnicę końcówki wynoszącą cztery mikrony.Tuż przed użyciem należy napełnić sylikonyzowaną kapilarę 0,2 µL sensora. Aby przygotować kapilarę wewnętrzną, należy wyciągnąć kapilarę o małej średnicy, tak aby uzyskać dwie kapilary z długimi zwężeniami i ostrymi końcówkami. Następnie należy napełnić je 100 mM roztworem chlorku sodu lub 100 mM roztworem chlorku potasu.Umieść wypełniony czujnikiem oraz wypełnione solą fizjologiczną kapilary bezpośrednio w jednej linii na specjalnie wykonanym korku z szkiełek podstawkowych. Wsuń mniejszą kapilarę częściowo do większej kapilary. Następnie przymocuj kapilary do innego szkiełka podstawkowego.Używając plasteliny, przenieś kapilary na stolik mikroskopu i zwizualizuj je przy 100-krotnym powiększeniu. Za pomocą szklanej rurki zamocowanej na mikromanipulatorze powoli przesuwaj kapilarę zewnętrzną nad kapilarą wewnętrzną, aż odległość między ich końcami wyniesie około pięciu mikronów. Przymocuj otwarty koniec kapilary zewnętrznej do kapilary wewnętrznej za pomocą wosku dentystycznego i włóż srebrny drut.Aby przygotować elektrodę odniesienia, wyciągnij kapilarę z włóknem w pionowej wyciągarku, odrzuć górną pipetę, następnie otwórz dolny uchwyt i unieś dolną pipetę o około pięć milimetrów. Zamknij ponownie uchwyt i podnoś go, aż końcówka dolnej elektrody znajdzie się około pięciu milimetrów nad cewką grzejną. Następnie rozgrzej cewkę i za pomocą pęsety zegnij końcówkę o około 45 stopni w bok.Zagnij go ponownie o około minus 45 stopni, aby skierować końcówkę z powrotem równolegle do głównego trzpienia. Następnie napełnij baryłkę referencyjną roztworem HEPS. Włóż do niej drut srebrny chlorowany i uszczelnij baryłkę woskiem dentystycznym.W tym kroku należy przymocować zarówno elektrodę jonoselektywną, jak i elektrodę odniesienia do mikromanipulatorów, a następnie opuścić je do komory eksperymentalnej perfundowanej A CSF. Pod mikroskopem stereoskopowym należy połączyć chlorowane druty srebrne z odpowiednimi wejściami modułu przedwzmacniacza wzmacniacza różnicowego. Następnie należy wyznaczyć rezystancję elektrod.Następnie należy ustawić sygnały napięcia na zero i rozpocząć rejestrację w celu kalibracji. Po uzyskaniu stabilnej linii bazowej należy przełączyć na roztwór soli fizjologicznej zawierający określone stężenia mierzonego jonu. Teraz należy przenieść skibek hipokampa o grubości 250 µm do komory eksperymentalnej i przymocować go za pomocą siatki.Obniż skalibrowaną mikroelektrodę selektywną jonowo na powierzchnię skrawka. Następnie wprowadź elektrodę głębiej, o około 50 µm, do warstwy promienistej (stratum radiatum) obszaru CA1. Aby podać agonistę przekaźnika, napełnij pipetę aplikacyjną 0,5 mM glutaminianu.Przymocuj pipetę do mikromanipulatora i podłącz ją do urządzenia do aplikacji ciśnienia. Następnie opuść pipetę aplikacyjną do tkanki i ostrożnie umieść ją w pobliżu końcówki mikroelektrody selektywnej jonowo. Rozpocznij aplikację ciśnienia przy wartości 40 millibars.Przedstawiono tutaj zmianę napięcia elektrod referencyjnych elektrody dwukanałowej oraz elektrody koncentrycznej w odpowiedzi na zmiany stężenia sodu w kąpieli. a tutaj zmiany napięcia potencjału sodowego elektrody dwukanałowej oraz elektrody koncentrycznej w odpowiedzi na zmiany stężenia sodu w kąpieli. Rysunek ten przedstawia półlogarytmiczny wykres stężenia sodu w kąpieli w funkcji napięcia potencjału sodowego dla obu elektrod.Wykresy liniowe wykazują nachylenie wynoszące około 48 mV dla obu elektrod. Przedstawiono tutaj odpowiedź elektrody dwukanałowej oraz koncentrycznej na szybką zmianę stężenia w kąpieli. Stężenie sodu zmienia się z 152 mM do 70 mM.Należy zauważyć, że czas odpowiedzi elektrody koncentrycznej jest znacznie krótszy. Rysunek ten przedstawia przejściowe zmiany stężenia sodu zewnątrzkomórkowego wykryte za pomocą elektrod dwukanałowych i koncentrycznych; przejściowe zmiany napięcia w kanałach referencyjnych oraz stężenia sodu zewnątrzkomórkowego zostały wywołane perfuzją kąpieli 10 mM aspartanu przez 120 s, co zaznaczono paskiem. Z kolei na tym rysunku przejściowe zmiany napięcia w kanałach referencyjnych i stężenia sodu zewnątrzkomórkowego zostały wywołane lokalną aplikacją ciśnieniową 10 mM glutaminianu przez 0,2 s.Należy zauważyć, że czas odpowiedzi elektrody stożkowej jest w tych warunkach znacznie krótszy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o tym, że prawidłowe polerowanie jest kluczowym etapem w pomyślnym wykonaniu mikroelektrod selektywnych wobec żelaza. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować i wykorzystać te elektrody do wykrywania zewnątrzkomórkowego żelaza przejściowego w tkance mózgowej.

double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Jontoforeza agonistów i antagonistów neuronalnych podczas zewnikomórkowych rejestracji in vivo jest potężnym sposobem manipulowania mikrośrodowiskiem neuronu. Manipulacje te można najłatwiej przeprowadzić za pomocą wielokanałowych elektrod typu „piggy-back”. W niniejszej pracy opisujemy sposób ich wykonania oraz zastosowania podczas rejestracji słuchowych.

Wytwarzanie i zastosowanie wielokanałowych elektrod typu „piggy-back” do farmakologicznych manipulacji odpowiedziami neuronalnymi in vivo

Ten film pokazuje, jak scharakteryzować przestrzeń zewnątrzkomórkową w wycinku mózgu za pomocą mikroelektrod jonoselektywnych i jonoforetycznych do pomiaru i porównywania sygnałów elektrycznych. Proces ten pomaga określić objętość, frakcję przestrzeni i stopień skręcenia.

Charakterystyka przestrzeni zewnątrzkomórkowej w wycinku mózgu za pomocą mikroelektrod jonoselektywnych i jonoforetycznych

Tutaj tworzymy szklaną pipetę o podwójnej funkcji: hamowaniu głębokich struktur mózgu za pomocą mikroiniekcji leków i monitorowaniu ich efektów w czasie rzeczywistym poprzez jednoczesne zapisy elektrofizjologiczne.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia

Transportery w błonach komórkowych umożliwiają różnicową segregację jonów przez błony komórkowe lub warstwy komórkowe i odgrywają kluczową rolę podczas fizjologii, naprawy i patologii tkanek. Opisujemy jonoselektywną, samoreferencyjną mikroelektrodę, która umożliwia pomiar określonych strumieni jonów w pojedynczych komórkach i tkankach in vivo.

Pomiar zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą techniki jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych

Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy

Jony potasu przyczyniają się do spoczynkowego potencjału błonowego komórek, a zewnątrzkomórkowe stężenie K+ jest kluczowym regulatorem pobudliwości komórek. Opisujemy, jak wykonać, skalibrować i stosować monopolarne mikroelektrody selektywne K+. Zastosowanie takich elektrod umożliwia pomiar elektrycznie wywołanej dynamiki stężenia K+ w dorosłych wycinkach hipokampa.

Wytwarzanie, testowanie i stosowanie mikroelektrod selektywnych jonów potasu w wycinkach tkanek mózgu dorosłego człowieka

Tutaj opisujemy metodę mikrodializy in vivo do analizy uwalniania asparaginianu i glutaminianu w brzusznym hipokampie u szczurów z padaczką i bez padaczki, w połączeniu z zapisami EEG. Zewnątrzkomórkowe stężenia asparaginianu i glutaminianu mogą być skorelowane z różnymi fazami choroby.

Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Ten protokół opisuje procedurę konstruowania układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych zapisów elektrofizjologicznych in vivo u myszy (Mus musculus) i fretki (Mustela putorius furo) z wielu obszarów mózgu. Każdy krok, po zakupie surowych włókien węglowych do implantacji matrycy mikroelektrodowej, jest szczegółowo opisany, z naciskiem na budowę matrycy mikroelektrodowej.

Budowa i implementacja układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo

Obecny protokół opisuje konstrukcję specjalnie wykonanych układów mikroelektrod do rejestrowania lokalnych potencjałów pola in vivo z wielu struktur mózgu jednocześnie.

Budowa mikroelektrod potencjału lokalnego pola do nagrań in vivo z wielu struktur mózgu jednocześnie

Proponuje się tani system zapisu elektroencefalograficznego w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do napędzania przezczaszkowej stymulacji magnetycznej mózgu myszy in vivo. Korzystając z konwencjonalnych elektrod śrubowych z niestandardowym, elastycznym podłożem z matrycą wieloelektrodową, można przeprowadzić zapis w wielu miejscach z mózgu myszy w odpowiedzi na przezczaszkową stymulację magnetyczną.

Niedrogi elektroencefalograficzny system zapisu w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do przezczaszkowej stymulacji mózgu myszy in vivo

Poznaj metodę pomiaru sygnałów jonowych w tkance mózgowej myszy przy użyciu dwulufowych i koncentrycznych mikroelektrod selektywnych. Technika ta pozwala analizować dynamikę potasu i sodu pozakomórkowego podczas aktywności nerwowej.

Dwulufowe i koncentryczne mikroelektrody do pomiaru zewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w tkance mózgowej

Przeglądaj więcej filmów