Dwulufowe i koncentryczne mikroelektrody do pomiaru zewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w tkance mózgowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrywanie i analiza dynamiki jonów w przestrzeni zewnątrzkomórkowej tkanki mózgowej. Pomiar przejściowy jonów jest realizowany przy użyciu mikroelektrod selektywnych jonowo, które mogą być przygotowane w oparciu o konstrukcję dwukanałową lub koncentryczną. W pierwszym kroku mikroelektrody są kalibrowane w kąpieli eksperymentalnej.

Następnie elektrody są wprowadzane do ostrych skrawków hipokampa mysiego w celu rejestracji; aby wywołać pozakomórkowe przesunięcia jonowe, podaje się neuroprzekaźnik glutaminian lub agonistę glutaminianu. Glutaminian wiąże się z receptorami jonotropowymi w kolcach postsynaptycznych i otwiera je, co umożliwia napływ sodu do wnętrza komórek oraz wypływ potasu na zewnątrz. W konsekwencji prowadzi to do spadku stężenia sodu pozakomórkowego oraz wzrostu stężenia potasu pozakomórkowego, co jest wykrywane przez mikroelektrody selektywne jonowo.

Metoda ta jest stosowana do badania regulacji jonów zewnątrzkomórkowych oraz indukowanych aktywnością przemian stężeń żelaza w mózgu. W niniejszym materiale opisujemy przygotowanie i kalibrację dwóch rodzajów mikroelektrod selektywnych jonowo. Pokazujemy, w jaki sposób można je wykorzystać w ostrych skrawkach tkanki mózgowej do pomiaru zmian stężeń potasu lub sodu w przestrzeni zewnątrzkomórkowej w odpowiedzi na aplikację neuroprzekaźników.

Procedura zostanie zademonstrowana przez Nicole Hark i Simona z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować kapilarę szklaną borokrzemianową z włóknem, która posłuży jako kanał czuły na jony, oraz drugą kapilarę do późniejszego przygotowania kanału referencyjnego. Następnie należy użyć kleju dwuskładnikowego lub małego paska folii aluminiowej, aby przymocować do siebie obie kapilary (długą i krótką) na obu końcach.

Ogrzewaj podwójną kapilarę w piecu w temperaturze 60°C przez jedną godzinę, aby usunąć resztkową wilgoć. Następnie przechowuj elektrody w eksykancie do czasu użycia. Umieść podwójną kapilarę centralnie w pionowym wyciągaczu z obrotowym uchwytem. Użyj uchwytu, aby zapobiec wydłużeniu kapilary.

Ogrzewaj cewkę delikatnie, aż szkło stanie się wystarczająco miękkie, aby umożliwić poziomy obrót uchwytu. Po schłodzeniu obróć go o 180 stopni i usuń blokadę mechaniczną. Zastosuj drugi protokół grzania, aby wyciągnąć kapilarę, w wyniku czego powstaną dwie ostre kapilary dwukanałowe.

Średnica końcówki kapilary podwójnej powinna wynosić blisko jeden mikron. Następnie należy napełnić rurkę referencyjną wodą destylowaną aż do jej końcówki, aby zapobiec kolonizacji. W poniższej procedurze należy umieścić kapilarę podwójną końcówką do góry na specjalnie wykonanym uchwycie.

Następnie umieść ten uchwyt na butelce z szerokim otworem zawierającej wstępnie ogrzany HMDS i inkubuj przez 70 minut. Po tym czasie przenieś kapilarę na metalowy stojak. Następnie umieść ją w wstępnie podgrzanym piecu na dwie godziny, aby osuszyć oba ramiona po kolonizacji; przechowuj kapilarę w suchym miejscu w eksykatorze do momentu użycia.

W dniu przeprowadzenia eksperymentu należy przygotować elektrodę jonoselektywną, wypełniając końcówkę wysilikonizowanego kapilary od dwóch do trzech mikrolitrów sensora jonoselektywnego. Następnie należy wypełnić kapilarę od tyłu 100 milimolarnym chlorkiem sodu w przypadku mikroelektrody czułej na sód lub 100 milimolarną solą chlorkową potasu w przypadku mikroelektrody czułej na potas. Należy uważać, aby podczas tej procedury nie wprowadzić dodatkowych pęcherzyków powietrza.

Jeśli proces utwardzania przebiegł pomyślnie i czujnik został prawidłowo wypełniony, powierzchnia czujnika powinna być widoczna jako wyraźna wklęsłość na tle wypełnienia tylnego. Następnie należy wypełnić kanał referencyjny, wprowadzić druty srebrno-chlorkowe do obu cylindrów i uszczelnić każdy z nich woskiem dentystycznym. W tej procedurze należy wyciągnąć kapilarę o długości dwóch milimetrów w wyciągaczu poziomym, aby uzyskać krótki stożek i średnicę końcówki wynoszącą cztery mikrony.

Tuż przed użyciem należy napełnić sylikonyzowaną kapilarę 0,2 µL sensora. Aby przygotować kapilarę wewnętrzną, należy wyciągnąć kapilarę o małej średnicy, tak aby uzyskać dwie kapilary z długimi zwężeniami i ostrymi końcówkami. Następnie należy napełnić je 100 mM roztworem chlorku sodu lub 100 mM roztworem chlorku potasu.

Umieść wypełniony czujnikiem oraz wypełnione solą fizjologiczną kapilary bezpośrednio w jednej linii na specjalnie wykonanym korku z szkiełek podstawkowych. Wsuń mniejszą kapilarę częściowo do większej kapilary. Następnie przymocuj kapilary do innego szkiełka podstawkowego.

Używając plasteliny, przenieś kapilary na stolik mikroskopu i zwizualizuj je przy 100-krotnym powiększeniu. Za pomocą szklanej rurki zamocowanej na mikromanipulatorze powoli przesuwaj kapilarę zewnętrzną nad kapilarą wewnętrzną, aż odległość między ich końcami wyniesie około pięciu mikronów. Przymocuj otwarty koniec kapilary zewnętrznej do kapilary wewnętrznej za pomocą wosku dentystycznego i włóż srebrny drut.

Aby przygotować elektrodę odniesienia, wyciągnij kapilarę z włóknem w pionowej wyciągarku, odrzuć górną pipetę, następnie otwórz dolny uchwyt i unieś dolną pipetę o około pięć milimetrów. Zamknij ponownie uchwyt i podnoś go, aż końcówka dolnej elektrody znajdzie się około pięciu milimetrów nad cewką grzejną. Następnie rozgrzej cewkę i za pomocą pęsety zegnij końcówkę o około 45 stopni w bok.

Zagnij go ponownie o około minus 45 stopni, aby skierować końcówkę z powrotem równolegle do głównego trzpienia. Następnie napełnij baryłkę referencyjną roztworem HEPS. Włóż do niej drut srebrny chlorowany i uszczelnij baryłkę woskiem dentystycznym.

W tym kroku należy przymocować zarówno elektrodę jonoselektywną, jak i elektrodę odniesienia do mikromanipulatorów, a następnie opuścić je do komory eksperymentalnej perfundowanej A CSF. Pod mikroskopem stereoskopowym należy połączyć chlorowane druty srebrne z odpowiednimi wejściami modułu przedwzmacniacza wzmacniacza różnicowego. Następnie należy wyznaczyć rezystancję elektrod.

Następnie należy ustawić sygnały napięcia na zero i rozpocząć rejestrację w celu kalibracji. Po uzyskaniu stabilnej linii bazowej należy przełączyć na roztwór soli fizjologicznej zawierający określone stężenia mierzonego jonu. Teraz należy przenieść skibek hipokampa o grubości 250 µm do komory eksperymentalnej i przymocować go za pomocą siatki.

Obniż skalibrowaną mikroelektrodę selektywną jonowo na powierzchnię skrawka. Następnie wprowadź elektrodę głębiej, o około 50 µm, do warstwy promienistej (stratum radiatum) obszaru CA1. Aby podać agonistę przekaźnika, napełnij pipetę aplikacyjną 0,5 mM glutaminianu.

Przymocuj pipetę do mikromanipulatora i podłącz ją do urządzenia do aplikacji ciśnienia. Następnie opuść pipetę aplikacyjną do tkanki i ostrożnie umieść ją w pobliżu końcówki mikroelektrody selektywnej jonowo. Rozpocznij aplikację ciśnienia przy wartości 40 millibars.

Przedstawiono tutaj zmianę napięcia elektrod referencyjnych elektrody dwukanałowej oraz elektrody koncentrycznej w odpowiedzi na zmiany stężenia sodu w kąpieli. a tutaj zmiany napięcia potencjału sodowego elektrody dwukanałowej oraz elektrody koncentrycznej w odpowiedzi na zmiany stężenia sodu w kąpieli. Rysunek ten przedstawia półlogarytmiczny wykres stężenia sodu w kąpieli w funkcji napięcia potencjału sodowego dla obu elektrod.

Wykresy liniowe wykazują nachylenie wynoszące około 48 mV dla obu elektrod. Przedstawiono tutaj odpowiedź elektrody dwukanałowej oraz koncentrycznej na szybką zmianę stężenia w kąpieli. Stężenie sodu zmienia się z 152 mM do 70 mM.

Należy zauważyć, że czas odpowiedzi elektrody koncentrycznej jest znacznie krótszy. Rysunek ten przedstawia przejściowe zmiany stężenia sodu zewnątrzkomórkowego wykryte za pomocą elektrod dwukanałowych i koncentrycznych; przejściowe zmiany napięcia w kanałach referencyjnych oraz stężenia sodu zewnątrzkomórkowego zostały wywołane perfuzją kąpieli 10 mM aspartanu przez 120 s, co zaznaczono paskiem. Z kolei na tym rysunku przejściowe zmiany napięcia w kanałach referencyjnych i stężenia sodu zewnątrzkomórkowego zostały wywołane lokalną aplikacją ciśnieniową 10 mM glutaminianu przez 0,2 s.

Należy zauważyć, że czas odpowiedzi elektrody stożkowej jest w tych warunkach znacznie krótszy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o tym, że prawidłowe polerowanie jest kluczowym etapem w pomyślnym wykonaniu mikroelektrod selektywnych wobec żelaza. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować i wykorzystać te elektrody do wykrywania zewnątrzkomórkowego żelaza przejściowego w tkance mózgowej.