Generowanie i analiza ilościowa pulsacyjnych ultradźwięków o niskiej częstotliwości w celu określenia wrażliwości sonicznej nieleczonych i leczonych komórek nowotworowych

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ocena skuteczności i powtarzalności impulsowego ultradźwięku o niskiej częstotliwości w niszczeniu populacji ludzkich komórek białaczki w obecności lub przy braku czynnika usuwającego cholesterol. Jest to realizowane poprzez oczyszczenie systemu sonikacji i ocenę jego stabilności. Następnie ludzkie komórki białaczki są poddawane sonikacji w obecności oraz przy braku metylo-beta-cyklodekstryny.

Następnie wykorzystuje się automatyczne liczniki komórek do oceny żywotności komórek oraz efektów sonikacji i uszczuplenia poziomu cholesterolu. Aktywność mitochondrialna komórek białaczki jest oceniana za pomocą testu XTT. Ostatecznie dane sugerują, że ultradźwięki o niskiej częstotliwości mogą być wykorzystane do uszkadzania komórek nowotworowych, co jest potęgowane przez zastosowanie środka uszczuplającego poziom cholesterolu.

Nasze laboratorium interesuje się terapią sonodynamiczną, nowatorską metodą terapeutyczną, która łączy działanie przeciwnowotworowe ultradźwięków ze specjalistycznymi czynnikami w celu wzmocnienia efektów sonacji. Nasz protokół ocenia wrażliwość soniczną komórek nowotworowych oraz prawidłowych, aby określić potencjalne podejścia sonochemiczne, które wymagają dalszych badań przedklinicznych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z obsługą sprzętu służącego do oceny stabilności układu sonicznego, ponieważ nauka optymalnego stosowania tych urządzeń może zająć pewien czas.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ procedury czyszczenia i stabilizacji stosowane do oceny systemu sonikacji są niezbędne do uzyskania powtarzalnych wyników. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy użyć chloroformu i patyczka higienicznego, aby oczyścić miejsce połączenia tuby sonikacyjnej z przetwornikiem. Następnie na gwinty tuby i przetwornika należy nanieść niewielką ilość oleju.

Aby dodatkowo usunąć wszelkie opiłki metalu, rdzę lub osady utleniania, należy oczyścić złącze z oleju i innych zanieczyszczeń przy użyciu dodatkowej ilości chloroformu, a następnie ponownie przymocować tubę do przetwornika. Aby prawidłowo dokręcić system, należy wysunąć tubę z dna kubka i umieścić klucz płaski w jednym z trzech małych otworów znajdujących się w górnej części przetwornika. Następnie należy ustawić klucz dynamometryczny z końcówką typu „kurza stopka” o rozmiarze 1/2 cala na naciętej części tuby i dokręcać w standardowym kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, aż miernik momentu obrotowego wskaże wartość 39,99 foot pounds.

Po dokręceniu umieść przetwornik i tubę z powrotem w naczyniu i zamocuj elementy do statywu w pozycji pionowej, podłącz ponownie przetwornik do zasilacza, a następnie ustaw system na dozowanie impulsowe. Stosując jednosekundową sonikację z jednosekundowymi przerwami między impulsami, dostrój system do pożądanych amplitud, aby ocenić intensywność i działanie systemu sauna Fire. Rozpocznij od trzymania miernika kawitacji w odległości 1,5 centymetra, dbając o to, aby na powierzchni sondy miernika nie znajdowały się pęcherzyki powietrza.

Odczytaj wartość z ekranu kawitometru, aby potwierdzić, że system pracuje z odpowiednią intensywnością. Następnie całkowicie zanurz czujnik hydrofonu w fiolce z próbką zawierającej 12,5 milliliters wody i użyj statywu z obręczami, aby zawiesić hydrofon. Aby potwierdzić stabilność charakterystyki przebiegu fali, podłącz hydrofon do wejścia oscyloskopu i upewnij się, że widoczna jest wyraźna fala sinusoidalna, ponieważ fale aberracyjne mogą zmienić częstotliwość systemu.

Aby przygotować komórki do sonikacji, najpierw wysiej je w gęstości 4 × 10⁴ komórek na ml w kolbie o powierzchni 25 cm², używając świeżo przygotowanej pożywki. Po określeniu liczby żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanu, inkubuj kulturę w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aż osiągnie ona pożądane stężenie. Gdy komórki będą gotowe do sonikacji, użyj pompy próżniowej i kolby Buchnera, aby odgazować objętość dejonizowanej wody destylowanej.

Następnie należy użyć wody, aby napełnić róg naczynia do poziomu 15 milimetrów powyżej jego górnej krawędzi. System należy uruchomić z wodą odgazowaną przez około siedem minut. Następnie należy przenieść trzy mililitry komórek do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 mililitrów i przymocować fiolkę do uchwytu.

Następnie przymocuj uchwyt do górnej części tuby sonikatora i za pomocą mechanizmu przesuwanego ustaw uchwyt na wysokości 15 milimetrów od górnej krawędzi tuby przy powierzchni wody. Teraz poddaj komórki sonikacji, stosując trzy jednosekundowe impulsy ultradźwięków w odstępach jednosekundowych przy amplitudzie 33 i 50%, a następnie oceń żywotność komórek po sonikacji za pomocą testu wykluczania błękitu trypanu. Aby ocenić uszkodzenia komórek, przemyj otwór analizatora cząstek Z2 co najmniej dwa razy solą fizjologiczną.

Następnie dodaj 100 µL sonikowanych komórek do 20 ml izotonicznej soli fizjologicznej i przenieś próbkę komórek do uchwytu licznika. Następnie podnieś platformę do otworu i przeanalizuj uszkodzenia komórek, ich żywotność oraz obecność szczątków zgodnie z instrukcjami producenta. Aby ocenić żywotność sonikowanych komórek za pomocą testu XTT, poddaj komórki sonikacji w zakresie od jednej do trzech.

Aplikuj jednosekundowe impulsy w odstępach jednej sekundy, aby uzyskać zakres uszkodzeń do oceny za pomocą zestawu XTT, następnie odwirowuj komórki i resuspenduj osady do stężenia 1×10⁵ komórek/ml w świeżo przygotowanym medium wzrostowym. Następnie nanieś 100 µL zawiesiny komórek na dołek w poszczególnych 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych z płaskim dnem, wykonując pomiary w trzech powtórzeniach, w tym trzy dołki kontrolne zawierające jedynie 100 µL kompletnego medium wzrostowego w celu odczytu absorbancji tła.

Inkubować komórki przez 24 godziny w dniu przeprowadzenia analizy. Delikatnie wymieszać przez wirowanie alikwoty XTT oraz odczynników aktywujących, uprzednio ogrzanych do 37 °C, aż roztwory staną się klarowne. Następnie dodać 0,1 ml odczynnika aktywującego do 5 ml odczynnika XTT. W kolejnym kroku dodać 50 µl aktywnego roztworu XTT do każdej studni płytek zaszczepionych komórkami U 9 37 oraz THP 1 i przenieść komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.

Po dwóch godzinach delikatnie potrząśnij płytkami, aby równomiernie rozprowadzić pomarańczowy barwnik w dołkach dodatnich, a następnie zmierz absorbancję za pomocą czytnika płytek mikrotitracyjnych w zakresie od 450 do 500 nanometrów. Na koniec ponownie zmierz absorbancję we wszystkich dołkach testowych w zakresie od 630 do 690 nanometrów. Zgodnie z oczekiwaniami, bardziej rozległe uszkodzenia komórek obserwuje się w populacji komórek poddanej sonikacji przy amplitudzie 50% niż przy 33%.

Amplituda na poziomie 33% pozwala jednak na wykrycie dalszych uszkodzeń po zastosowaniu odpowiednich czynników. Wykorzystano to w niniejszym doświadczeniu, w którym oceniono zależne od dawki efekty czynnika usuwającego cholesterol – metylo-beta-cyklodekstryny – w zakresie potęgowania wrażliwości ultradźwiękowej komórek U 9 37.

Chociaż przeżywalność komórek traktowanych metylo-beta-cyklodekstryną bez zastosowania sonikacji była zbliżona do przeżywalności komórek nietraktowanych, odnotowano znaczny spadek przeżywalności po zastosowaniu trzech jednosekundowych impulsów ultradźwięków o częstotliwości 40 kHz. Co więcej, spadek przeżywalności po sonikacji wydawał się być zależny od dawki, ponieważ 5 mM czynnika usuwającego cholesterol spowodowało największy spadek liczby komórek, a następnie mniejsze spadki dla stężeń 1 mM i 0,5 mM metylo-beta-cyklodekstryny, co oceniono za pomocą testu XTT. Chociaż komórki THP-1 wydawały się być nieco bardziej odporne na sonikację niż komórki U937, obie linie komórkowe białaczki ludzkiej uległy uszkodzeniu w sposób zależny od dawki.

Dodatkowo, połączenie wyższych stężeń metylo-beta-cyklodekstryny z większą liczbą impulsów ultradźwiękowych spowodowało najmniejszą redukcję XTT do rozpuszczalnej, jaskrawopomarańczowej pochodnej zarówno w przypadku komórek U 9 37, jak i THP one, co odpowiadało niższej żywotności komórek i aktywności mitochondrialnej dla obu linii komórkowych. Po przeprowadzeniu tej procedury można ocenić inne środki uwrażliwiające na ultradźwięki, takie jak środki skierowane na cytoszkielet lub generujące reaktywne formy tlenu, pod kątem ich zdolności do zwiększania wrażliwości na ultradźwięki, co pozwoli na opracowanie nowych podejść terapeutycznych, których skuteczność przedkliniczną będzie można zbadać. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby odpowiednio zorganizować dane SON pozyskane z liczników TC i Z two, ponieważ dostarczają one szczegółowych informacji o skuteczności protokołu leczenia, które mogą zostać utracone.

Jeśli nie stosuje się schematu logistycznego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać ultradźwięki o niskiej częstotliwości w połączeniu z potencjalnymi sensytyzatorami w przedklinicznych modelach in vitro w celu oceny ich potencjalnej użyteczności terapeutycznej.