Tkanka mielona w skompresowanym kolagenie: bioprzeszczep zawierający komórki do jednoetapowej naprawy rekonstrukcyjnej

Ogólnym celem poniższej procedury jest przeszczepienie tkanki autologicznej w celu jej ekspansji podczas operacji rekonstrukcyjnej. Osiąga się to najpierw poprzez pobranie biopsji z tkanki docelowej. Następnie biopsja jest rozdrabniana, a następnie tworzy się plastikowy, skompresowany aut przeszczep kolagenowy z polikaprolaktonu (PCL).

Następnie PCL i autologiczne rozdrobnione tkanki są integrowane w celu stworzenia rusztowania 3D. Zastosowaliśmy stopień ekspansji od jednego do sześciu. W kolejnym kroku rusztowanie jest transplantowane z powrotem do badanego osobnika.

Ostatecznie regenerację tkanki przeszczepionej autologicznie można ocenić za pomocą analizy immunohistochemicznej proliferacji i reorganizacji komórek w obrębie rusztowań oraz rozdrobnionych cząsteczek tkanki. Metoda ta zostanie zaprezentowana na modelu zwierzęcym, na skórze oraz na urothelium. Zastosowanie tej techniki obejmuje leczenie tkanek z ciężkimi deformacjami lub stanów po urazach w przypadkach, gdy występuje znaczny niedobór tkanki niezbędnej do naprawy chirurgicznej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak hodowla in vitro, jest możliwość przeprowadzenia tej procedury jako jednowypadkowego zabiegu chirurgicznego. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy od pobrania tkanki do transplantacji muszą być wykonane w warunkach sterylnych. Aby pobrać wycinek pęcherza świni, najpierw chwyć pęcherz pęsetą, a następnie użyj wysterylizowanej taśmy mierniczej, aby określić wymiary tkanki.

Następnie za pomocą wysterylizowanego pisaka należy zaznaczyć biopsjat w kształcie elipsy o wymiarach 2x1 cm, dążąc do uzyskania współczynnika ekspansji od 1 do 6. Po tym wyciąć zaznaczoną tkankę skalpelem i umieścić próbkę biopsji pęcherza w medium DMEM w warunkach sterylnych. Aby pobrać próbkę biopsji skóry, należy użyć dermatomu do pobrania wycinka o grubości częściowej 0,3 mm.

Następnie umieść tkankę w DMEM i przykryj obszar rany opatrunkiem. Potem dwukrotnie przemyj biopsjat pęcherza w DMEM i przenieś tkankę na wysterylizowaną płytkę do sekcji, stroną błony śluzowej do góry. Za pomocą szpilek sekcyjnych przymocuj jedną stronę preparatu do płytki, a następnie użyj precyzyjnych nożyczek i pęsety, aby oddzielić tkankę śluzową od mięśnia detrusora.

Następnie należy umieścić urządzenie do siekania na wierzchu błony śluzowej i przesuwać je w pionie i poziomie od jednego końca tkanki do drugiego, aby uzyskać posiekane fragmenty tkanki o wymiarach 0,8 na 0,8 milimetra. Należy pamiętać, że urządzenie do siekania musi być dociskane do tkanki podczas przesuwania. Aby przygotować plastikowy aut przeszczep z kolagenu kompresowanego, należy najpierw dodawać kroplami wodorotlenek sodu o standardowym stężeniu do 10X DMEM uzupełnionego o kolagen typu I, aż medium zmieni barwę z intensywnie żółtej na różową.

Po potwierdzeniu, że pH wynosi od 7,4 do 8, ostrożnie wymieszaj dwa mililitry DMEM z roztworem. Następnie wlej około dwóch mililitrów kolagenu do dołka stalowej prostokątnej formy o wymiarach 20x30x10 milimetrów i inkubuj kolagen przez dziesięć minut. Gdy kolagen stężeje, nanieś odpowiednią objętość biomateriału PCL na powierzchnię żelowego kolagenu i wlej pozostałe sześć mililitrów kolagenu na wierzch PCL.

Umieść formę z powrotem w inkubatorze na kolejne 20 minut. Następnie ułóż grubą warstwę gazików na sterylnej powierzchni. Potem połóż na gazikach stalową siatkę o grubości 400 micron, a następnie arkusz siatki nylonowej o grubości 110 micron.

Ostrożnie przenieś żel kolagenowy na nylonową siatkę i uważnie zdejmij prostokątną stalową formę. Przenieś posiekane tkanki na kolagen. W tym przypadku dążymy do uzyskania stopnia rozszerzenia od jeden do sześciu.

Następnie na żelu kolagenowym i tkance należy umieścić nową warstwę nylonowej siatki, a na niej drugą stalową siatkę oraz płytkę obciążającą o masie minimum 120 gramów. Po pięciu minutach należy zdjąć obciążnik, siatki stalowe i nylon z autoszczepu. W celu hodowli autoszczepu in vitro, należy najpierw pociąć zwężoną konstrukcję na fragmenty wystarczająco małe, aby zmieściły się w płytkach 12-dołkowych.

Następnie do każdej studni należy dodać 1 mL pożywki dla keratynocytów i inkubować tkanki przez od trzech do sześciu tygodni. Aby przeszczepić autograft z posiekaną błoną śluzową pęcherza do pęcherza świni, należy zwilżyć przeszczep DMEM. Następnie konstrukt należy przymocować do zdrowej tkanki za pomocą cienkich, jednowłóknowych szwów ciągłych.

Potwierdź szczelność przeszczepu, wypełniając pęcherz solą fizjologiczną za pomocą wprowadzonego cewnika moczowego. Aby przeszczepić autoszczep z rozdrobnionym naskórkiem skóry do rany pełnej grubości, nawilż przeszczep pożywką DMEM. Następnie, używając szwów przerywanych w narożnikach i na środku autoszczepu, przymocuj konstrukt do dna rany skóry pełnej grubości.

Na koniec należy przykryć ranę opatrunkiem z tworzywa sztucznego, aby utrzymać jej wilgotność. Jak widać na tym obrazie posiekanego autotransplantatu skóry, kompozytowy biosztuczny przeszczep wytrzymuje chwytanie, szycie i manipulacje chirurgiczne. Badania immunohistochemiczne w różnych punktach czasowych podczas hodowli in vitro wykazują, że komórki proliferują, migrują i reorganizują się w ciągły nabłonek o mikroarchitekturze typowej dla danego fenotypu komórkowego.

Na przykład po dwóch tygodniach warstwa komórek na powierzchni autoprzeszczepu skóry ma grubość około dwóch warstw. Po prawej stronie nabłonek pęcherza moczowego po tym samym okresie hodowli ma grubość około ośmiu warstw. Po pięciu do sześciu tygodniach ciągły nabłonek ma grubość około ośmiu do dziesięciu warstw komórek zarówno w przypadku rozdrobnionego nabłonka skóry, jak i rozdrobnionej błony śluzowej pęcherza moczowego w autoprzeszczepach.

W porównaniu do ekspansji tkanek in vitro, metoda ta jest szybka, mniej pracochłonna i nie wymaga zaawansowanych zasobów laboratoryjnych. Ponadto wszystkie elementy posiadają zatwierdzenie FDA, co umożliwia ich zastosowanie w standardowych warunkach chirurgicznych. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o przygotowaniu żelu, biotransplantatów oraz tkanek autologicznych w warunkach sterylnych.

W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące proliferacji i różnicowania komórek można zastosować tę procedurę oraz inne metody, takie jak hodowla komórek in vitro. Po dopracowaniu technika ta może utorować drogę badaczom w dziedzinie medycyny regeneracyjnej. Dzięki tym środkom możliwe byłoby leczenie ciężkich malformacji skóry lub układu moczowego za pomocą autologicznych przeszczepów z inżynierii tkankowej.