Name: Technika mocowania głowy oparta na żywicy akrylowej u gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj nową technikę mocowania głowy opartą na żywicy akrylowej u gryzoni, która eliminuje potrzebę metalowych ram. Ta metoda ułatwia badania nad mózgiem i zachowaniem w laboratoriach bez dostępu do obróbki CNC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Program Badań Nauk Podstawowych poprzez NRF finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii (2010-0022362) i (2012R1A2A2A02046812).

Oświadczenie etyczne: 
Eksperyment ten został zatwierdzony przez Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee i został przeprowadzony zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (National Institute of Health, 1996). Po eksperymencie zwierzęta zostały złożone w ofierze w ramach eutanazji dwutlenku węgla.
1. Projekt drążka do mocowania głowy dla szczurów
UWAGA: Ten krok jest ogólną wskazówką dla projektu drążka mocującego. Możliwa jest dowolna modyfikacja wymiaru i materiału w zależności od zwierząt lub implantów. Projektowanie belki mocującej głowicę za pomocą oprogramowania CAD jest zalecane, ale nie jest konieczne.
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania CAD, aby zaprojektować listwę mocującą.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj pręt mocujący o kształcie prostokątnym (123 × 35 × 6 mm) (Rysunek 1A). Wykonaj prostokątne wcięcie (16 × 20 mm; port) na środku pręta mocującego. Dodaj nachylenia lub wgłębienia, które służą jako szyna prowadząca na granicach portu (Rysunek 1A-a, Rysunek 1B-strzałki). 
		UWAGA: Upewnij się, że obszar portu pokrywa szacowany prostokąt czaszki szczura nad mózgiem, aby umożliwić pionowy dostęp za pomocą manipulatora stereotaktycznego do większości obszarów mózgu przez kraniotomię.</li>
		<li>Przymocować płytki (50 × 20 × 6 mm) z dwoma podłużnymi otworami kotwiącymi po obu stronach listwy mocującej. Upewnij się, że te otwory przechodzą przez o średnicy 6 mm (Rysunek 1A-d). Wykonaj otwór o średnicy 3 mm przed portem na hak blokujący (Rysunek 1A-b).</li>
		<li>Wykonaj pudełko z podłogą (135 × 305 mm) i ścianami bocznymi (305 × 76 mm). Wywierć dwa otwory o średnicy 6 mm, jak pokazano na rysunku 1A (wstawka). Dodaj ściany nośne na belce mocującej (Rysunek 1A-e).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj zaprojektowaną prowadnicę i pudełko i zmontuj każdy z nich za pomocą cyjanoakrylanu, jak pokazano na rysunku 1A (wstawka). Zamontuj pręt na pudełku za pomocą o średnicy 6 mm. Zastosuj nachylenie, regulując położenie pręta w celu ergonomicznego zamocowania głowicy (Rysunek 1A-wstawka). 
	UWAGA: W przypadku myszy wymiar listwy mocującej wynosi 60 × 20 × 4 mm (składa się z dwóch warstw paneli akrylowych o grubości 2 mm). Port jest kwadratowy o szerokości 8 mm (górny) i 9 x 10 mm (dolny), jak pokazano na rysunku 1C. Płyty kotwiące są tej samej wielkości co u szczurów. Płyta skrzynkowa i ściany boczne mają odpowiednio 100 × 72 mm i 100 × 50 mm.</li>
</ol>
2. Konstrukcja głowicy podczas operacji implantacji
UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas pracy z dentystyczną żywicą akrylową. Płyn może powodować podrażnienie skóry. Załóż maskę i załóż rękawiczki. Pracuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
<ol>
	<li>Przygotowanie przed zabiegiem
	<ol>
		<li>Szczelnie owinąć krawędź portu pręta mocującego za pomocą folii parafinowej, aby zapobiec przywieraniu nałożonej żywicy akrylowej do pręta (patrz rysunek 1B i rysunek 2A). Pokryj granicę portu pokrytą folią parafinową cienką warstwą żywicy akrylowej.</li>
		<li>Używaj wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych. Dokładnie zdezynfekuj ramę stereotaktyczną i jej otoczenie za pomocą 70% alkoholu etylowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj operację implantacji stereotaktycznej
	<ol>
		<li>Znieczulić zwierzę przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszanki koktajlowej (2 ml/kg) ketaminy 10 ml (50 mg/ml), chlorowodorku ksylazyny 1,5 ml (23,32 mg/ml) i soli fizjologicznej 2,5 ml. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone i nie reaguje na szczypanie ogona i palców. W razie potrzeby wstrzyknąć mieszankę koktajlową o objętości 1 ml/kg podczas zabiegu.</li>
		<li>Przymocuj zwierzę do aparatu stereotaktycznego. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu. Gol i oczyść skórę głowy 70% etanolem. Wykonać wstrzyknięcie podskórne 2% lidokainy i naciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej czaszki. Całkowicie zeskrob okostną. Kilkakrotnie spłucz solą fizjologiczną.</li>
		<li>Wykonaj wiercenie otworu na zadziory w pobliżu krawędzi czaszki. Implant wkręca się w odległości 4-5 obrotów (do 1 mm głębokości) od powierzchni czaszki, aby zapobiec naruszeniu opony twardej. Upewnij się, że po implantacji nie ma wycieku płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi na powierzchni czaszki. Spłucz solą fizjologiczną i osusz powierzchnię czaszki za pomocą podmuchu powietrza, szczególnie wokół.</li>
		<li>Pokryj powierzchnię czaszki cienką warstwą "kleju dentystycznego (Super-Bond C&B)". Nie zakrywaj całkowicie powierzchni czaszki, w tym bregmy, jeśli planowana jest dodatkowa implantacja elektrody. Użyj bregmy do oznaczania współrzędnych kraniotomii. Wszczepić elektrody i/lub mikronapęd i przymocować go do czaszki, nakładając wokół niego żywicę akrylową.</li>
		<li>Nałóż dodatkową żywicę akrylową na wierzch cementu dentystycznego. Użyj odpowiedniej ilości żywicy akrylowej, aby pozostawić wystarczającą przestrzeń między żywicą pokrytą prętem a żywicą do wstępnego montażu podczas mocowania i/lub elektrod (Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść pręt mocujący głowę 5 mm lub więcej nad powierzchnią czaszki i wyrównaj jego środek (Rysunek 2A-Po lewej).</li>
	<li>Nałóż żywicę akrylową w szczelinę między podstawą czaszki a żywicami początkowego montażu. (Rysunek 2A-Środek). Poczekaj, aż żywica stanie się twarda.</li>
	<li>Zdejmij nausznik i wyciągnij uformowany uchwyt montażowy z portu listwy mocującej. (Rysunek 2A-po prawej). W razie potrzeby ostrożnie nałóż dodatkową żywicę akrylową wokół szyn krawędziowych formowanego uchwytu.</li>
	<li>Powierzchnię rany skóry głowy spłukać sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Bezpośrednio po zabiegu wstrzyknąć antybiotyk (enrofloksacyna, 5 mg/kg s.c.) i środek przeciwbólowy (winian butorfanolu, 2 mg/kg s.c.). Trzymaj zwierzę pojedynczo w jednej klatce.</li>
</ol>
3. Przyzwyczajanie zwierząt do fiksacji na głowie
Uwaga: Ten krok opisuje harmonogramy habituacji oparte na empirycznie udanych ocenach autorów. Aby zapoznać się z przeglądem procedury habituacji do fiksacji głowy, zobacz pracę Schwartza10 lubGuo 11.
<ol>
	<li>Zapewnić zwierzętom wystarczający okres rekonwalescencji (tydzień lub dłużej). W dniu 1 często zajmuj się zwierzętami podczas podzielonych krótkich sesji.</li>
	<li>Następnego dnia (Dzień 2) wystawić zwierzę na działanie środowiska fiksacji (pudełko). Nie wkładaj uchwytu na głowę do portu listwy mocującej. Pozwól zwierzętom przyzwyczaić się do środowiska. Chwyć bezpiecznie uchwyt na głowę ręką na 1 do 2 sekund i natychmiast go zwolnij. Powtórz krótkotrwałe utrwalanie przez chwytanie ręczne kilka razy.</li>
	<li>W dniu 3 przyzwyczaj zwierzęta do fiksacji głowy.
	<ol>
		<li>Przynieś zwierzęta z domowych klatek i umieść je w pudełku, kierując głowy w stronę portu pręta mocującego. Chwyć uchwyt do montażu głowicy i włóż go do portu listwy mocującej.</li>
		<li>Przymocuj mocowanie (głowę zwierzęcia) do haka blokującego listwy mocującej za pomocą gumki recepturki. Stoisko przez 5 min. 
		UWAGA: Nie dotykaj tułowia ani ogona zwierzęcia po unieruchomieniu, co prowadzi do piszczenia i szarpania się, zwiększając stres zwierzęcia. Gdy zwierzę będzie się męczyć dłużej niż 1 minutę, puść je i spróbuj później. Na tym etapie zwierzęta wykazują wydalanie moczu i kału za każdym razem, gdy są narażone na fiksację głowy, ale stopniowo zmniejsza się to w miarę postępu przyzwyczajenia.</li>
		<li>Wyjmij gumkę blokującą i wysuń uchwyt z portu. Umieść zwierzęta z powrotem w klatce domowej i w nagrodę włóż do niej kawałek zboża lub ziarno słonecznika. Następna próba rozpoczyna się za 30 minut. Powtórz 3.4.1 do 3.4.4 pięć lub więcej w ciągu dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniach od 4 do 7 należy poddać zwierzę fiksacji głowy, jak opisano w Protokole 3.4. Stopniowo zwiększaj czas stabilizacji głowy (10 min, 20 min, 30 min i 50 min w miarę postępu habituacji). 
	UWAGA: Jeśli zwierzęta nie karmią nagrody w postaci pokarmu, może to być oznaką wysokiego poziomu stresu. Nie wydłużaj czasu utrwalania. Jeśli zwierzęta wykazują powtarzające się zachowania związane z walką, przyzwyczajaj je przez dłuższy czas.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj masę ciała zwierzęcia. Rozważ nieudaną habituację, gdy masa ciała spada. Przejdź do zadań behawioralnych z fiksacją głowy po udanej habituacji. 
	UWAGA: Udana habituacja ułatwia późniejszy trening behawioralny (ryc. 3E i F).</li>
</ol>

<ol><li>Mayrhofer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+two-alternative+forced+choice+paradigm+for+bilateral+vibrotactile+whisker+frequency+discrimination+in+head-fixed+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Novel two-alternative forced choice paradigm for bilateral vibrotactile whisker frequency discrimination in head-fixed mice and rats.</a> J Neurophysiol. 109, 273-284 (2013).</li>
<li>Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+stereotaxic+recordings+of+neuronal+activity+in+awake%2C+head-restrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice.</a> J Neurosci Methods. 178, 75-79 (2009).</li>
<li>Ollerenshaw, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+tactile+inputs+in+the+rat+vibrissa+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Detection of tactile inputs in the rat vibrissa pathway.</a> J Neurophysiol. 108, 479-490 (2012).</li>
<li>Lee, M. G., Manns, I. D., Alonso, A., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep-wake+related+discharge+properties+of+basal+forebrain+neurons+recorded+with+micropipettes+in+head-fixed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Sleep-wake related discharge properties of basal forebrain neurons recorded with micropipettes in head-fixed rats.</a> J Neurophysiol. 92, 1182-1198 (2004).</li>
<li>Lutcke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+neuronal+activity+with+a+genetically-encoded+calcium+indicator+in+anesthetized+and+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Optical recording of neuronal activity with a genetically-encoded calcium indicator in anesthetized and freely moving mice.</a> Front Neural Circuits. 4, 9(2010).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Kimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinforcing+operandum%3A+rapid+and+reliable+learning+of+skilled+forelimb+movements+by+head-fixed+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents.</a> Journal of neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).</li>
<li>Hadlock, T., Kowaleski, J., Mackinnon, S., Heaton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+of+head+fixation+for+the+study+of+rodent+facial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">A novel method of head fixation for the study of rodent facial function.</a> Experimental neurology. 205, 279-282 (2007).</li>
<li>Roh, M., Jang, I. S., Lee, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Push-in+Head+Restraining+Apparatus+for+Intracranial+Self+Stimulation+Tasks+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Push-in Head Restraining Apparatus for Intracranial Self Stimulation Tasks in Rats.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 18, 103-108 (2014).</li>
<li>Schwarz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-fixed+behaving+rat--procedures+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensory+%26+motor+research%22%5BJournal%5D)">The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls.</a> Somatosensory & motor research. 27, 131-148 (2010).</li>
<li>Guo, Z. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+Behavioral+Experiments+in+Head-Fixed+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Procedures for Behavioral Experiments in Head-Fixed Mice.</a> PLoS ONE. 9, (2014).</li>
<li>Osborne, J. E., Dudman, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIVETS%3A+a+mechanical+system+for+in+vivo+and+in+vitro+electrophysiology+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RIVETS: a mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging.</a> PLoS One. 9, e89007(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten demonstruje prostą i wygodną metodę mocowania głowy przy użyciu dostępnych materiałów. Aby fizycznie udane mocowanie głowy, pierwszym krytycznym krokiem podczas operacji jest wyraźne spłukanie i wysuszenie powierzchni czaszki przed nałożeniem cementu z żywicy adhezyjnej. Po drugie, metoda ta nie wykorzystuje wszczepianych pod mięśnie skroniowe i zależy tylko od na czaszce, ich prostopadłe zagnieżdżenie do powierzchni krawędzi czaszki ma kluczowe znaczenie10. Zmniejsza to możliwość przypadkowego od...

Unieruchomienie głowy lub krępowanie głowy to technika unieruchamiania głowy zwierzęcia poprzez przymocowanie ramy lub płytki do czaszki w celu sztywnego zaciskania. Technika ta została przyjęta do precyzyjnej stymulacji sensorycznej, wykrywania behawioralnego z lub bez rejestracji neuronalnej u obudzonych zwierząt1-3 oraz do znakowania komórkowego w cyklu snu i czuwania4. Jest również stosowany do obrazowania mózgu in vivo 5,6. Obecnie technika fiksacji głowy jest powszechnie stosowanym narzędziem w neurobiologii i badaniach behawioralnych.
Zasadniczo, tradycyjne mocowanie głowy wymaga chirurgicznego mocowania metalowych słupków na szczycie czaszki6-8. Nasadki są następnie mocowane do nieruchomej platformy, co powoduje unieruchomienie głowy. Badania neurofizjologiczne na obudzonych zwierzętach, takie jak zapis neuronalny i/lub optyczny, interwencja obwodów mózgowych, obrazowanie mózgu towarzyszą zabiegi implantacji przy użyciu akryli dentystycznych. Dlatego wydaje się, że prostym zadaniem jest wdrożenie fiksacji głowy w tych laboratoriach, gdy jest to konieczne eksperymentalnie. Ramki powinny być zaprojektowane tak, aby były lekkie i na tyle małe, aby nie zakłócać naturalnego zachowania zwierząt w ich domowych klatkach. Zapewnia również sztywność mechaniczną po zamocowaniu na nieruchomej platformie. Ponadto ma biokompatybilność w zależności od celów eksperymentalnych. Dlatego technicznie trudno jest zaprojektować i wyprodukować takie słupki czołowe w ogólnym sprzęcie laboratoryjnym.
W tym badaniu opisana jest nowatorska metoda mocowania głowicy, zapewniająca mechaniczną sztywność poprzez wygodne mocowanie bez użycia metalowych słupków głównych. Dzięki zastosowaniu tej metody można uzyskać stabilizację głowy w ogólnych warunkach laboratoryjnych, w których operacja implantacji jest zwykle wykonywana u gryzoni w celu zbadania mózgu. Metalowe słupki są zastępowane cementem z żywicy akrylowej, częściowo formowanym przez wykonany na zamówienie pręt mocujący głowicę, a proces formowania odbywa się podczas operacji implantacji. Listwa mocująca zapewnia wysoką kompatybilność przestrzenną z innymi implantami, takimi jak sondy rejestrujące neuronie, elektrody stymulacyjne. Upraszcza również etapy zaciskania głowy zwierzęcia na platformie mocującej poprzez usunięcie mocujących. Zastosowaliśmy tę metodę w poprzednim badaniu behawioralnym i doszliśmy do wniosku, że metoda ta jest łatwa do wdrożenia i wygodna w praktycznych eksperymentach9.

<table><tbody><tr><td>Dentystyczna żywica akrylowa</td><td>Lang Dental Manufacturing</td><td>Ortho-Jet</td><td>do produkcji formowanego montażu</td></tr><tr><td>Folia parafinowa</td><td>Bemis</td><td>Parafilm</td><td>zapobiegający przywieraniu żywicy akrylowej do pręta</td></tr><tr><td>Klej dentystyczny</td><td>Sun Medical</td><td>Super-Bond C& B</td><td>do łączenia żywicy akrylowej z czaszką</td></tr><tr><td>Plexglass lub inna płyta</td><td></td><td></td> akrylowa <td>do wykonania pręta mocującego i platformy skrzynkowej</td></tr><tr><td>Cyjanoakrylan</td><td></td><td></td><td>do łączenia płyt akrylowych</td></tr></tbody></table>

technika mocowania głowy oparta na żywicy akrylowej u gryzoni

Acrylic Resin Molding Based Head Fixation Technique in Rodents

Unieruchomienie głowy zwierzęcia to technika unieruchamiania głowy zwierzęcia poprzez przymocowanie słupka głowy do czaszki w celu sztywnego zaciskania. Tradycyjne mocowanie głowy wymaga chirurgicznego zamocowania metalowych ramek na czaszce. Przymocowane ramy są następnie mocowane do nieruchomej platformy, co powoduje unieruchomienie głowy. Jednak metalowe ramy do mocowania głowy były technicznie trudne do zaprojektowania i wdrożenia w ogólnym środowisku laboratoryjnym. W tym badaniu przedstawiamy nowatorską metodę stabilizacji głowy. Za pomocą wykonanego na zamówienie pręta mocującego głowę, podczas operacji implantacji konstruowany jest uchwyt na głowę. Po nałożeniu żywicy akrylowej do mocowania implantów, takich jak elektrody i kaniula, na czaszkę, nakłada się na nią dodatkowe żywice, aby zbudować formę dopasowaną do portu pręta mocującego. Formowany uchwyt do montażu głowy służy jako szyny prowadzące, badacze wygodnie mocują głowę zwierzęcia, wkładając uchwyt na głowę do portu pręta mocującego. Ta metoda może być łatwo zastosowana, jeśli konieczna jest chirurgia implantacji przy użyciu akryli dentystycznych i może być przydatna dla laboratoriów, które nie mogą łatwo wyprodukować metalowych słupków głowic obrabianych CNC.

Ta metoda fiksacji głowy ma zastosowanie zarówno do szczurów, jak i myszy. Łącznie osiem szczurów poddano obustronnej implantacji elektrod stymulujących do pęczka przedmózgowego (medial forebrain bundle). U czterech z nich dodatkowo wszczepiono dostosowane elektrody z drutu wolframowego (mikronapędy) do obszaru M1 kończyny przedniej (Rycina 2C). U myszy (n = 2) cztery elektrody z drutu stalowego wszczepiono do czołowych i potylicznych obszarów kory. Podczas operacji u szczurów i myszy uformowano uchwyty ...

Tradycyjne techniki mocowania głowy wykorzystywały metalowe ramki przymocowane do czaszki jako interfejs dla aparatu do mocowania głowy. Protokół ten demonstruje bezramkową, opartą na żywicy akrylowej technikę mocowania głowy do zadań behawioralnych u gryzoni.

Technika mocowania głowy oparta na żywicy akrylowej u gryzoni

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie nowatorskiej techniki fiksacji głowy z wykorzystaniem akrylu stomatologicznego, który jest szeroko dostępny w laboratoriach przeprowadzających operacje implantacji u gryzoni. Metoda ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad mózgiem i zachowaniem. Główną zaletą tej techniki jest brak konieczności stosowania metalowych trzpieni lub płytek fiksacyjnych, dzięki czemu może być ona wykorzystywana w laboratoriach, które nie mają możliwości łatwego wytwarzania trzpieni obrabianych metodą CNC.Używając oprogramowania CAD, zaprojektuj prostokątny pasek mocujący o wymiarach 123 na 35 na 6 mm z wycentrowanym prostokątnym otworem o wymiarach 16 na 20 mm. Otwór ten służy do dostępu do mózgu, dlatego jego rozmiar należy dostosować w razie potrzeby. Dodaj skośne krawędzie lub wgłębienia, które będą pełnić funkcję prowadnic wzdłuż brzegów otworu. Po obu stronach paska mocującego przygotuj płytki do przytwierdzenia za pomocą wydłużonych otworów kotwiczących.Otwory powinny umożliwiać przejście śruby o średnicy 6 mm, a przed portem należy dodać otwór o średnicy 3 mm, aby pasował do haczyka blokującego. Następnie należy zaprojektować ścianki i dno sześcianu o wymiarach 135 na 305 na 76 mm wysokości. Większe ścianki boczne służą do podparcia pręta.Do tego celu potrzebne są otwory o średnicy 6 mm. Po obrobieniu wszystkich części z akrylu, należy zmontować pudełko i pręt za pomocą cyjanoakrylanu. Następnie pręt należy przymocować do ścianek nośnych pudełka, używając śrub 6 mm.Na koniec, dostosuj nachylenie uchwytu, aby odpowiednio pasował do głowy szczura, regulując położenie śruby. W przypadku myszy zastosuj ten sam projekt, używając pręta o mniejszych wymiarach, tych samych płytek kotwiczących oraz mniejszego pudełka. Rozpocznij od przygotowania pręta.Najpierw należy owinąć port folią parafinową. Następnie krawędź folii parafinowej należy pokryć cienką warstwą żywicy akrylowej. W kolejnym kroku ramkę należy zdezynfekować, dokładnie oczyszczając ją 70% ethanolem.Po znieczuleniu szczura należy potwierdzić stan anestezji za pomocą ucisku palca u stopy. W razie potrzeby należy podać połowę dawki koktajlu leków, aby utrzymać znieczulenie. Po unieruchomieniu szczura w aparacie stereotaksycznym należy nałożyć maść oftalmiczną i ogolić sierść z czaszki.Następnie wykonaj podskórny zastrzyk 2% lidokainy w miejscu nacięcia. Teraz należy naciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej i całkowicie zeskrobać okostną. Następnie kilkakrotnie przepłucz obszar solą fizjologiczną, aby odsłonić czystą część czaszki.Następnie wykonaj otwory trepanacyjne pod śruby w pobliżu krawędzi czaszki. Wkręć śruby prostopadle do czaszki. Z miejsc implantacji śrub nie powinny wyciekać żadne płyny.Przepłucz okolice miejsc implantacji i wysusz preparat strumieniem powietrza. Następnie pokryj większość powierzchni czaszki cienką warstwą kleju stomatologicznego, pozostawiając jednak odsłonięte bregma w celu nawigacji po współrzędnych.Przeprowadź pozostałe implantacje elektrod lub hyperdrive'ów. Następnie zabezpiecz implanty żywicą akrylową na warstwie cementu dentystycznego. Podczas tego procesu pozostaw na żywicy montażowej wystarczająco dużo miejsca, aby można było przykleić pręt do czaszki.Następnie ustaw pręt do stabilizacji głowy około 5 milimetrów nad czaszką. Nanieś nieco więcej żywicy pomiędzy czaszkę a żywicę znajdującą się na pręcie. Po utwardzeniu żywic wyjmij pręty uszne, a następnie wysuń formę i uchwyt z otworu pręta stabilizującego.Aby zakończyć procedurę, wstrzyknij zwierzęciu antybiotyki oraz środek przeciwbólowy. Następnie przenieś je do klatki rekonwalescencyjnej i umieść w indywidualnym zakwaterowaniu, gdy odzyska ono zdolność do leżenia w pozycji brzusznej. Pozostaw zwierzę w regeneracji przez co najmniej tydzień przed rozpoczęciem habituacji do stabilizacji głowy.W pierwszym dniu habituacji często manipuluj zwierzętami w krótkich sesjach. W drugim dniu wprowadź pudełko do unieruchomienia. Pozwól zwierzętom swobodnie zapoznać się z otoczeniem.Kilkakrotnie w okresie zapoznawczym chwyć na sekundę lub dwie uchwyt mocujący głowę. Trzeciego dnia wprowadź doświadczenie unieruchomienia głowy. Umieść zwierzę w pudełku i skieruj głowę do portu na belce do unieruchamiania głowy.Następnie należy wziąć uchwyt głowy i umieścić go w pręcie stabilizacyjnym. Głowę należy unieruchomić za pomocą haczyka blokującego i gumki recepturki. Następnie należy pozostawić zwierzę na pięć minut bez dotykania go, gdyż mogłoby to spowodować zwiększenie poziomu stresu i walki zwierzęcia.Wydalanie i defekacja są zjawiskami oczekiwanymi i będą stopniowo ustępować wraz z dłuższym kontaktem z zestawem unieruchamiającym. Po pięciu minutach zdejmij gumkę recepturkę i wysuń pręt montażowy. Następnie przenieś zwierzę z powrotem do jego klatki domowej i podaj mu płatek zbożowy lub ziarno słonecznika w ramach nagrody.Po pół godzinie powtórz cały proces. Przeprowadź fiksację zwierzęcia pięciokrotnie w tym pierwszym dniu utrwalania. W czwartym dniu zwiększ liczbę ekspozycji na utrwalacz do siedmiu.W dalszej kolejności stopniowo wydłużaj czas fiksacji z pięciu do dziesięciu minut, następnie do 20 minut, do pół godziny i ostatecznie do 50 minut. Jeśli na jakimkolwiek etapie zwierzę przestanie przyjmować nagrodę, nie zwiększaj dalej czasu fiksacji, ponieważ jest to oznaka wysokiego poziomu stresu. Podczas procesu habituacji waż zwierzęta codziennie.Jeśli masa ciała zwierzęcia spadnie w trakcie procesu, nie powinno ono być wykorzystywane w badaniu. W eksperymencie z udziałem ośmiu szczurów obustronne elektrody stymulujące umieszczono w pęczku przedniego pola mózgu. W obszarze M1 kończyny przedniej szczury wyposażono w mikronapędy i elektrody z drutu wolframowego.Po okresie aklimatyzacji szczury wykonywały zadania behawioralne przez 40 do 60 minut podczas unieruchomienia głowy. Wszystkie odlewane uchwyty głowowe pozostawały przymocowane do zwierząt przez całe 40 dni eksperymentu. W ramach badania zwierzęta zostały nauczone pociągania za dźwignie w celu uzyskania nagród w postaci stymulacji.W eksperymencie z myszami, którym wszczepiono cztery elektrody, uchwyt głowowy pozostawał przymocowany przez 80 dni. Przez ten czas myszy były codziennie unieruchamiane za głowę przez okres od 20 do 40 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat projektowania pręta do unieruchamiania głowy oraz sposobu opieki nad takimi zwierzętami.Dzięki praktyce implantacja akrylowego uchwytu głowowego może zostać przeprowadzona w ciągu kilku minut. Późniejsza fiksacja głowy jest szybka i łatwa, ponieważ nie wymaga użycia śrub ani zacisków. Należy pamiętać, że praca z dentystyczną żywicą akrylową może prowadzić do podrażnień skóry.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie maski i rękawiczek oraz praca w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.

acrylic-resin-molding-based-head-fixation-technique-in-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy metodę tworzenia okna obrazującego w czaszce myszy, które obejmuje obszar o wielkości kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy bez wywoływania stanu zapalnego mózgu. Metoda ta jest odpowiednia do podłużnych badań przepływu krwi, dynamiki komórkowej oraz struktury komórkowej i naczyniowej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

Ten film pokazuje operację wszczepienia sztyftu głowy na modelu mysim. Słupek główny służy nie tylko do mocowania głowy, a tym samym przytrzymywania myszy podczas eksperymentów, ale także do bezpiecznego mocowania urządzenia na głowę u swobodnie poruszających się zwierząt.

Implantacja sztyfty myszy: metoda mocowania głowy u gryzoni

Źródło: Lee, H. et. al., Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje obrazowanie wapnia in vivo u myszy przy użyciu gradientowego współczynnika załamania światła lub soczewki GRIN i zminiaturyzowanego mikroskopu. Konfiguracja łączy mocowanie głowy w beztarciowym mobilnym systemie klatek, stymulując neurony i wyzwalając napływ jonów wapnia. Soczewka GRIN...

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszającej się myszy

Opisujemy nowatorską technikę obrazowania in vivo, która łączy fluorescencyjne chimeryczne myszy z oknami wewnątrzczaszkowymi i mikroskopią 2-fotonową o wysokiej rozdzielczości. Ta platforma obrazowania wspomaga badania dynamicznych zmian w tkance mózgowej i mikrokrążeniu na poziomie pojedynczej komórki, po patologicznych urazach i jest przystosowana do oceny wewnątrzczaszkowego dostarczania i dystrybucji leków.

Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie

Ta praca wprowadza metodę niezawodnego wykonywania optogenetycznego zapisu pojedynczej jednostki z obudzonej myszy za pomocą specjalnie wykonanej szklanej optrody.

Optogenetyka Identyfikacja typu neuronalnego za pomocą szklanej optrody u obudzonych myszy

Prezentowany protokół powoduje uporczywy konflikt sensoryczny w eksperymentach mających na celu badanie długoterminowej nauki. Nosząc na stałe urządzenie na głowie, myszy są stale narażone na niedopasowanie sensoryczne między bodźcami wzrokowymi i przedsionkowymi podczas swobodnego poruszania się w klatkach domowych.

Długotrwały konflikt sensoryczny u swobodnie zachowujących się myszy

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia in vivo jest nieocenionym narzędziem, które umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się zwierząt. Jednak zastosowanie tej techniki do ciała migdałowatego było trudne. Protokół ten ma na celu dostarczenie użytecznych wskazówek do skutecznego celowania w komórki ciała migdałowatego za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu u myszy.

Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu do montażu na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy

Szczegółowo opisana jest nowa procedura funkcjonalnego obrazowania u szczurów obudzonych z głową.

Implanty głowy do neuroobrazowania u przytomnych, nieruchomych szczurów

Tutaj przedstawiamy lekki, opłacalny system implantacji sond dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni, zoptymalizowany pod kątem łatwości użycia, odzyskiwania sondy, wszechstronności eksperymentalnej oraz zgodności z zachowaniem.

Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się

Artykuł opisuje procedury eksperymentalne dla powszechnie używanego paradygmatu wirtualnej rzeczywistości (VR) na myszach, a także określa wykonalność wykonywania złożonych zadań VR poprzez testowanie zadania dyskryminacji sygnału w kształcie litery Y.

Procedury treningu behawioralnego dla wirtualnej rzeczywistości z głową u myszy

Poznaj nową technikę mocowania głowy opartą na żywicy akrylowej u gryzoni, która eliminuje potrzebę metalowych ram. Ta metoda ułatwia badania nad mózgiem i zachowaniem w laboratoriach bez dostępu do obróbki CNC.

Technika mocowania głowy oparta na żywicy akrylowej u gryzoni

Przeglądaj więcej filmów