Name: Wytwarzanie biomembrany metodą dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę SALB do wytwarzania dwuwarstw lipidowych na podłożach stałych bez użycia wesykul. Technika ta umożliwia badanie białek błonowych i znajduje zastosowanie w odkrywaniu leków oraz diagnostyce molekularnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Narodowej Fundacji Badawczej (NRF -NRFF2011-01 i NRF2015NRF-POC0001-19), Narodowej Rady Badań Medycznych (NMRC/CBRG/0005/2012) oraz Uniwersytetu Technologicznego Nanyang dla N.J.C.

1. Tworzenie podpartej dwuwarstwy lipidowej na hydrofilowym stałym podłożu
<ol>
	<li>Przygotować podstawowe roztwory lipidów zawierające 1,2 mg/ml 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC) i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(lisamina rodamina Bsulfonyl) (Rh-PE) przez rozpuszczenie odpowiednich proszków lipidowych (odpowiednio zważonych uprzednio za pomocą analitycznego bilansu masy) w roztworze izopropanolu.</li>
	<li>Rozcieńczyć i wymieszać roztwory podstawowe w izopropanolu w celu przygotowania pożądanej mieszaniny lipidów o końcowym stężeniu. W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej i eksperymentów FRAP w mieszaninie lipidów należy uwzględnić 0,5% wag.</li>
	<li>Wstrzyknąć mieszaninę lipidów z izopropanolem do kanału mikroprzepływowego, aż zostanie on wypełniony.</li>
	<li>Mieszaninę lipidów należy inkubować na powierzchni szkła przez około 10 minut.</li>
	<li>Stopniowo zastępować roztwór lipidowy wodą lub roztworem buforowym za pomocą pompy perystaltycznej przy bardzo niskim natężeniu przepływu (10-50 μl/min). Alternatywnie, mieszaninę lipidów można zastąpić przez wielokrotne pipetowanie.</li>
	<li>Dokładnie przepłukać kanał nadmiarem buforu w celu usunięcia pozostałości izopropanolu.</li>
</ol>
2. Tworzenie błon podporowych wzbogaconych w cholesterol
Uwaga: Stała powierzchnia (SiO2) wspomaga fuzję pęcherzyków, ale skład membrany (wysoki poziom cholesterolu) hamuje fuzję pęcherzyków, ponieważ pęcherzyki wzbogacone w cholesterol mają wysoką sztywność zginania30.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy zawierający 10 mg/ml lipidów DOPC, 10 mg/ml cholesterolu i 1 mg/ml Rh-PE, rozpuszczając najpierw odpowiednie proszki w izopropanolu.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.2-1.6, używając roztworów podstawowych przygotowanych w kroku 2.1.</li>
</ol>
3. Test płynności membrany
<ol>
	<li>Zanurzyć szkiełko w roztworze dodecylosiarczanu sodu (SDS) (1%) na 10 minut.</li>
	<li>Dokładnie umyj szkiełka wodą dejonizowaną i spłucz etanolem.</li>
	<li>Suszyć szkiełka suszarką przy użyciu delikatnego strumienia azotu.</li>
	<li>Wystaw szkiełka na działanie plazmy tlenowej przez 30 sekund przy maksymalnej mocy częstotliwości radiowej w komorze plazmy tlenowej.</li>
	<li>Usuń powłokę folii ochronnej z komercyjnej komory mikroprzepływowej bez dna (Rysunek 1A) za pomocą pęsety i przymocuj szklane szkiełko do lepkiej strony komory (Rysunek 1B).</li>
	<li>Zamontuj złącza i rurki w pozycji wlotowej i wylotowej komory i umieść kanał mikroprzepływowy na stoliku mikroskopu (Rysunek 1C).</li>
	<li>Utworzyć znakowaną fluorescencyjnie dwuwarstwę lipidową w kanale mikroprzepływowym [powtórzyć krok 1, stosując żądany skład lipidowy (np. 0,5 mg/ml DOPC) w tym 0,5% wag. Rh-PE w rozpuszczalniku organicznym].</li>
	<li>Zlokalizuj płaszczyznę dwuwarstwową za pomocą obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 60X (NA 1.49), aby uchwycić obrazy.</li>
	<li>Wykonaj dwa zdjęcia przed wybielaniem, a następnie wybiel foto okrągłą plamkę o szerokości 30 μm za pomocą wiązki laserowej o długości fali 532 nm i 100 mW. Przed fotowybielaniem rozgrzej laser, aż jego intensywność się ustabilizuje. Natychmiast po fotowybielaniu wykonuj serię zdjęć co 1 sekundę przez 2 minuty, aby śledzić powrót intensywności fluorescencji w wybielonym miejscu.</li>
</ol>
4. Test ilościowy cholesterolu
<ol>
	<li>Wystaw chip czujnika kryształu kwarcu pokrytego dwutlenkiem krzemu na działanie plazmy tlenowej przez 30 sekund przy maksymalnej mocy częstotliwości radiowej w komorze plazmy tlenowej. Wyjmij chip z komory i natychmiast zamontuj chip w komorze pomiarowej.</li>
	<li>Przed eksperymentem najpierw uzyskaj częstotliwość i rozproszenie chipa czujnika w powietrzu, aby zapewnić prawidłowy montaż.
	<ol>
		<li>W przypadku komercyjnego przyrządu Q-Sense E1 lub E4 QCM-D uruchom oprogramowanie Q-Soft i kliknij "Akwizycja" i wybierz "Ustaw pomiar".</li>
		<li>W nowym oknie, które się pojawi, sprawdź alikwoty: 3, 5, 7, 9, 11 i 13, a następnie kliknij Znajdź i uruchom, aby sprawdzić widma rezonansowe. Ustaw temperaturę na 24 °C. Jeśli jedna lub więcej częstotliwości rezonansowych nie zgadza się z oczekiwanymi wartościami, sprawdź mocowanie chipa i powtarzaj ten krok, aż do osiągnięcia porozumienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchomić pompę perystaltyczną i roztwór buforowy przepływu (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) do komory pomiarowej przy natężeniu przepływu 100 μl/min.</li>
	<li>W oprogramowaniu kliknij "Akwizycja" i wybierz "Uruchom ponownie pomiar", aby zarejestrować częstotliwość rezonansową i sygnały rozpraszania energii. Powtarzaj ten krok, aż do uzyskania stabilnej linii podstawowej dla zmian częstotliwości i rozpraszania. Uwaga: W przypadku kolejnych kroków będą występować dodatkowe przesunięcia częstotliwości i rozpraszania, które można zarejestrować w funkcji czasu.</li>
	<li>Wstrzyknąć izopropanol (bez lipidów) na 10 minut.</li>
	<li>Mieszaninę lipidów/cholesterolu DOPC o pożądanym stosunku molowym o całkowitym stężeniu lipidów 0,5 mg/ml wstrzyknąć w izopropanol przez 10 minut.</li>
	<li>Wstrzykiwać bufor przez 20 minut przy natężeniu przepływu 100 μl/min.</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór 1 mM metylo-β-cyklodekstryny (MβCD) przygotowany w buforze (szybkość przepływu 100 μl/min) do momentu, gdy sygnał częstotliwości osiągnie stabilną wartość.</li>
	<li>Zmierzyć względne dodatnie przesunięcia częstotliwości, które są spowodowane etapem leczenia MβCD i obliczyć masę cholesterolu i lipidów DOPC, przeliczając wartościΔf cho i Δf DOPC na wartości masy, stosując równanie Sauerbreya [Δm = -(C/n)×Δf, gdzie C=17,7 ng/cm2, n:alikwot].</li>
	<li>Obliczyć ułamek molowy cholesterolu w SLB, biorąc pod uwagę masy cząsteczkowe lipidów DOPC (786,1 g/mol) i cholesterolu (386,6 g/mol).</li>
</ol>

<ol><li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+Scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: Scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+of+lipid+membranes+analyzed+with+high-resolution+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phase separation of lipid membranes analyzed with high-resolution secondary ion mass spectrometry.</a> Science. 313, 1948-1951 (2006).</li>
<li>Kalb, E., Engel, J., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+proteins+to+specific+target+sites+in+membranes+measured+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of proteins to specific target sites in membranes measured by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biochemistry. 29, 1607-1613 (1990).</li>
<li>Bally, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+GII.+4+Virus-like+Particles+Recognize+Galactosylceramides+in+Domains+of+Planar+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Norovirus GII. 4 Virus-like Particles Recognize Galactosylceramides in Domains of Planar Supported Lipid Bilayers.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 12020-12024 (2012).</li>
<li>Bally, M., Graule, M., Parra, F., Larson, G., Höök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virus+biosensor+with+single+virus-particle+sensitivity+based+on+fluorescent+vesicle+labels+and+equilibrium+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">A virus biosensor with single virus-particle sensitivity based on fluorescent vesicle labels and equilibrium fluctuation analysis.</a> Biointerphases. 8, 10-1186 (2013).</li>
<li>Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+in+studies+on+immune+cell+adhesion+and+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers in studies on immune cell adhesion and communication.</a> Journal of Immunological Methods. 278, 10-1016 Forthcoming.</li>
<li>Mager, M. D., Melosh, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Bilayer+Deposition+and+Patterning+via+Air+Bubble+Collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Lipid Bilayer Deposition and Patterning via Air Bubble Collapse.</a> Langmuir. 23, 9369-9377 (2007).</li>
<li>Lenhert, S., Sun, P., Wang, Y., Fuchs, H., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Dip-Pen+Nanolithography+of+Heterogeneous+Supported+Phospholipid+Multilayer+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography of Heterogeneous Supported Phospholipid Multilayer Patterns.</a> Small. 3, 71-75 (2007).</li>
<li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+solid-supported+lipid+bilayers+by+spin-coating%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+supported+planar+bilayers+by+fusion+of+vesicles+to+supported+phospholipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers.</a> Biochim Biophys Acta. 1103, 307-316 (1992).</li>
<li>Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+vesicle+adsorption+and+supported+biomembrane+formation+from+vesicles+in+solution%3A+influence+of+surface+chemistry%2C+vesicle+size%2C+temperature%2C+and+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.</a> Langmuir. 19, 1681-1691 (2003).</li>
<li>Cho, N. -J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-Driven+assembly+of+various+supported+lipid+platforms%3A+A+comparative+study+on+silicon+oxide+and+titanium+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: A comparative study on silicon oxide and titanium oxide.</a> Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).</li>
<li>Boudard, S., Seantier, B., Breffa, C., Decher, G., Felix, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+pathway+of+formation+of+supported+lipid+bilayers+of+DMPC+by+varying+the+sodium+chloride+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Controlling the pathway of formation of supported lipid bilayers of DMPC by varying the sodium chloride concentration.</a> Thin Solid Films. , 495-4246 (2006).</li>
<li>Stanglmaier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+anionic+phospholipids+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of anionic phospholipids in supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 28, 10818-10821 (2012).</li>
<li>Jackman, J. A., Choi, J. -H., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+osmotic+pressure+on+adhesion+of+lipid+vesicles+to+solid+supports%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Influence of osmotic pressure on adhesion of lipid vesicles to solid supports.</a> Langmuir. 29, 11375-11384 (2013).</li>
<li>Rossetti, F. F., Bally, M., Michel, R., Textor, M., Reviakine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+titanium+dioxide+and+phosphatidyl+serine-containing+liposomes%3A+formation+and+patterning+of+supported+phospholipid+bilayers+on+the+surface+of+a+medically+relevant+material%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Interactions between titanium dioxide and phosphatidyl serine-containing liposomes: formation and patterning of supported phospholipid bilayers on the surface of a medically relevant material.</a> Langmuir. 21, 6443-6450 (1021).</li>
<li>Cho, N. -J., Cho, S. -J., Cheong, K. H., Glenn, J. S., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Employing+an+amphipathic+viral+peptide+to+create+a+lipid+bilayer+on+Au+and+TiO2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Employing an amphipathic viral peptide to create a lipid bilayer on Au and TiO2.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 10050-10051 (2007).</li>
<li>Hardy, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+supported+lipid+bilayers+with+high+cholesterol+content+formed+by+%5Bsmall+alpha%5D-helical+peptide-induced+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by [small alpha]-helical peptide-induced vesicle fusion.</a> Journal of Materials Chemistry. 22, 19506-19513 (2012).</li>
<li>Wallin, M., Choi, J. -H., Kim, S. O., Cho, N. -J., Andersson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-induced+formation+of+a+tethered+lipid+bilayer+membrane+on+mesoporous+silica%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Peptide-induced formation of a tethered lipid bilayer membrane on mesoporous silica.</a> European Biophysics Journal. , 1-10 (2014).</li>
<li>Coutable, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+tethered-lipid+bilayers+on+gold+surfaces+for+the+incorporation+of+integral+membrane+proteins+synthesized+by+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of tethered-lipid bilayers on gold surfaces for the incorporation of integral membrane proteins synthesized by cell-free expression.</a> Langmuir. 30, 3132-3141 (2014).</li>
<li>Zan, G. H., Jackman, J. A., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AH+peptide-mediated+formation+of+charged+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">AH peptide-mediated formation of charged planar lipid bilayers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 118, 3616-3621 (2014).</li>
<li>Jackman, J. A., Zhao, Z., Zhdanov, V. P., Frank, C. W., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+adhesion+and+rupture+on+silicon+oxide%3A+Influence+of+freeze%E2%80%93thaw+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Vesicle adhesion and rupture on silicon oxide: Influence of freeze–thaw pretreatment.</a> Langmuir. 30, 2152-2160 (2014).</li>
<li>Tabaei, S. R., Choi, J. -H., Haw Zan,, Zhdanov, G., P, V., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-Assisted+Lipid+Bilayer+Formation+on+Silicon+Dioxide+and+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Solvent-Assisted Lipid Bilayer Formation on Silicon Dioxide and Gold.</a> Langmuir. 30, 10363-10373 (2014).</li>
<li>Hohner, A., David, M., Rädlera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+solvent-exchange+deposition+of+phospholipid+membranes+onto+solid+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Controlled solvent-exchange deposition of phospholipid membranes onto solid surfaces.</a> Biointerphases. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, S. -O., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-Assisted+Lipid+Self-Assembly+at+Hydrophilic+Surfaces%3A+Factors+Influencing+the+Formation+of+Supported+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly at Hydrophilic Surfaces: Factors Influencing the Formation of Supported Membranes.</a> Langmuir. 31, 3125-3134 (2015).</li>
<li>Tabaei, S. R., Vafaei, S., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Charged+Membranes+by+the+Solvent-Assisted+Lipid+Bilayer+%28SALB%29+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Method+on+SiO2+and+Al2O3.+Physical+Chemistry+Chemical+Physics.%2C+doi%3A10.1039%2FC5CP01428J%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Charged Membranes by the Solvent-Assisted Lipid Bilayer (SALB) Formation.</a> Method on SiO2 and Al2O3. Physical Chemistry Chemical Physics., doi:10.1039/C5CP01428J. , (2015).</li>
<li>Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembly+Formation+of+Lipid+Bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Coatings+on+Bare+Aluminum+Oxide%3A+Overcoming+the+Force+of+Interfacial+Water.+ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Self-Assembly Formation of Lipid Bilayer.</a> Coatings on Bare Aluminum Oxide: Overcoming the Force of Interfacial Water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).</li>
<li>Keller, C., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+specific+kinetics+of+lipid+vesicle+adsorption+measured+with+a+quartz+crystal+microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance.</a> Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).</li>
<li>Sundh, M., Svedhem, S., Sutherland, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+phase+separating+lipids+on+supported+lipid+bilayer+formation+at+SiO2+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Influence of phase separating lipids on supported lipid bilayer formation at SiO2 surfaces.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 453-460 (2010).</li>
<li>Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+crystal+microbalance+with+dissipation+monitoring+of+supported+lipid+bilayers+on+various+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates.</a> Nature Protocols. 5, 1096-1106 (2010).</li>
<li>Beseničar, M. P., Bavdek, A., Kladnik, A., Maček, P., Anderluh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+cholesterol+extraction+from+lipid+membranes+by+methyl-%CE%B2-cyclodextrin%E2%80%94A+surface+plasmon+resonance+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Kinetics of cholesterol extraction from lipid membranes by methyl-β-cyclodextrin—A surface plasmon resonance approach.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1778, 175-184 (2008).</li>
<li>Pedersen, S., Jørgensen, K., Baekmark, T. R., Mouritsen, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+evidence+for+lipid-domain+formation+in+the+transition+region+of+phospholipid+bilayers+by+two-probe+fluorescence+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Indirect evidence for lipid-domain formation in the transition region of phospholipid bilayers by two-probe fluorescence energy transfer.</a> Biophysical journal. 71, 554-560 (1996).</li>
<li>Okonogi, T., McConnell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+inversion+in+the+epifluorescence+of+cholesterol-phospholipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Contrast inversion in the epifluorescence of cholesterol-phospholipid monolayers.</a> Biophysical Journal. 86, 880-890 (2004).</li>
<li>McConnell, H. M., Radhakrishnan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensed+complexes+of+cholesterol+and+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Condensed complexes of cholesterol and phospholipids.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1610, 159-173 (2003).</li>
<li>Tabaei, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Cholesterol-Rich+Supported+Membranes+Using+Solvent-Assisted+Lipid+Self-Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of Cholesterol-Rich Supported Membranes Using Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly.</a> Langmuir. 30, 13345-13352 (2014).</li>
<li>Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Liedberg, B., Parikh, A. N., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+Stripe+Superstructure+in+the+%CE%B2-Two-Phase+Coexistence+Region+of+Cholesterol%E2%80%93Phospholipid+Mixtures+in+Supported+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Observation of Stripe Superstructure in the β-Two-Phase Coexistence Region of Cholesterol–Phospholipid Mixtures in Supported Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136, 16962-16965 (2014).</li>
<li>Salamon, Z., Wang, Y., Tollin, G., Macleod, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+molecular+organization+of+self-assembled+lipid+bilayers+on+solid+substrates+monitored+by+surface+plasmon+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Assembly and molecular organization of self-assembled lipid bilayers on solid substrates monitored by surface plasmon resonance spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. , 1195-11267 (1994).</li>
<li>Yuan, C., Johnston, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+evolution+in+cholesterol%2FDPPC+monolayers%3A+atomic+force+microscopy+and+near+field+scanning+optical+microscopy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Phase evolution in cholesterol/DPPC monolayers: atomic force microscopy and near field scanning optical microscopy studies.</a> Journal of microscopy. 205, 136-146 (2002).</li>
<li>Schneider, J., Dufrêne, Y. F., Barger, W. R. Jr, Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscope+image+contrast+mechanisms+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscope image contrast mechanisms on supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 79, 1107-1118 (2000).</li>
<li>Tamm, L. K., Tatulian, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+spectroscopy+of+proteins+and+peptides+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+reviews+of+biophysics%22%5BJournal%5D)">Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers.</a> Quarterly reviews of biophysics. 30, 365-429 (1997).</li>
<li>Miller, C. E., Majewski, J., Gog, T., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biological+thin+films+at+the+solid-liquid+interface+by+X-ray+reflectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Characterization of biological thin films at the solid-liquid interface by X-ray reflectivity.</a> Physical Review Letters. 94, 238104(2005).</li>
<li>Koenig, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+reflectivity+and+atomic+force+microscopy+studies+of+a+lipid+bilayer+in+water+adsorbed+to+the+surface+of+a+silicon+single+crystal%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal.</a> Langmuir. 12, 1343-1350 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

W niniejszej pracy przedstawiono protokół wymiany rozpuszczalnika, w którym lipidy w alkoholu (izopropanolu, etanolu lub n-propanolu) są inkubowane ze stałym podłożem, a następnie alkohol jest stopniowo zastępowany wodnym roztworem buforowym w celu wywołania szeregu przemian fazowych, ostatecznie tworząc dwuwarstwy lipidowe w fazie blaszkowatej24. Wykazano, że metoda ta umożliwia wytwarzanie podpartych dwuwarstw lipidowych na powierzchniach takich jak złoto, co jest niewykonalne w przypadku metody fuzji pęcherzykowej.
Określono optymalny zakres stężeń lipidów (0,1 - 0,5 mg/ml) dla pełnego utworzenia dwuwarstw w standardowych formatach eksperymentalnych testowanych do tej pory. Przy stężeniach lipidów poniżej 0,1 mg/ml tworzą się dyskretne, mikroskopijne plamy dwuwarstw. Z drugiej strony przy stężeniach powyżej 0,1 mg/ml i niższych niż 0,5 mg/ml tworzy się kompletna i jednolita dwuwarstwa. Przy stężeniach lipidów powyżej tego zakresu nadal tworzyła się płynna dwuwarstwa, co zweryfikowano za pomocą analizy FRAP, jednak mikroskopia fluorescencyjna ujawnia obecność dodatkowych struktur lipidowych na wierzchu dwuwarstwy. Uderzające jest to, że morfologia tych dodatkowych struktur lipidowych, określona za pomocą analizy QCM-D, zależała od alkoholu, który został użyty na etapie inkubacji. W przypadku etanolu stosunkowo wysokie przesunięcia Δf i ΔD przypominają sygnaturę QCM-D uzyskaną dla zaadsorbowanej warstwy pęcherzyków. Gdy zamiast tego zastosowano izopropanol lub n-propanol, Δf było nieco wyższe niż wartość oczekiwana dla dwuwarstwy (końcowe Δf między -30 a -40 Hz), podczas gdy ΔD było znacznie wyższe. Takie odpowiedzi QCM-D można by się spodziewać w przypadku rozszerzonych struktur lipidowych (np. miceli przypominających robaki) wystających na zewnątrz z powierzchni błony (co w niektórych przypadkach widać pod mikroskopią fluorescencyjną).
Szybkość wymiany rozpuszczalnika jest kolejnym ważnym parametrem, który może mieć kluczowe znaczenie, zwłaszcza gdy stosowane są niższe stężenia lipidów (np. 0,1 mg/ml). Szybka wymiana rozpuszczalnika przy niskim stężeniu lipidów może prowadzić do powstania niekompletnych dwuwarstw. W standardowej komorze pomiarowej używanej do pomiarów QCM-D w tym artykule (komora pomiarowa Q-Sense E4) natężenia przepływu wynoszące około 100 μl/min były odpowiednie do wysoce powtarzalnego kompletnego tworzenia dwuwarstw. W przypadku komór przepływowych o innych geometriach i objętości optymalne natężenie przepływu może się różnić i musi zostać empirycznie określone na podstawie kroków sugerowanych w niniejszym dokumencie.
Oprócz tworzenia podpartych dwuwarstw lipidowych na powierzchniach, które są trudne do fuzji pęcherzyków, SALB może być stosowany do obejścia potrzeby pęcherzyków lipidowych, które mogą pękać, otwierając w ten sposób drzwi do wytwarzania wspieranych błon o złożonym składzie. Jako przykładowy skład przedstawiono mieszaniny lipidowe o wysokiej zawartości cholesterolu. Cholesterol jest ważnym składnikiem błon komórkowych ssaków, a jego frakcja może zbliżać się do 45−50% mol% składu lipidowego błony (np. w erytrocytach). Tak więc nawet prosty model dwuwarstwy lipidowej reprezentującej błonę komórkową człowieka powinien zawierać cholesterol.
Podczas gdy fuzja pęcherzykowa może być wykorzystana do wytwarzania płynnych dwuwarstw lipidowych zawierających tylko 10-15% cholesterolu, metoda SALB umożliwia tworzenie płynnych dwuwarstw lipidowych zawierających wysokie frakcje cholesterolu (do 57% mol., jak określono ilościowo za pomocą pomiarów QCM-D)36. Jednak, gdy poziom cholesterolu był jeszcze bardziej podwyższony (do 63 mol.), zaobserwowano domeny w kształcie pasków37. Współistniejące domeny były płynne, przypominające te obserwowane w regionie β na schemacie fazowym monowarstwy cholesterol/fosfolipidy na granicy faz powietrze-woda.
Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że metoda SALB jest prostym i skutecznym podejściem do tworzenia dwuwarstw lipidowych, szczególnie w przypadkach wykraczających poza zakres konwencjonalnej metody fuzji pęcherzyków. Do tej pory technika QCM-D i mikroskopia fluorescencyjna były wykorzystywane głównie do charakteryzowania dwuwarstw lipidowych utworzonych metodą SALB. Patrząc w przyszłość, szeroki zakres technik pomiarów analitycznych wrażliwych na powierzchnię, w tym powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)38, mikroskopia sił atomowych (AFM)39,40, spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera41, promieniowanie rentgenowskie42 i odbicie neutronów43, mogą być wykorzystane do dalszego charakteryzowania i badania prostych i złożonych konfiguracji dwuwarstwowych przygotowanych metodą SALB. Te pojawiające się możliwości otwierają drzwi dla większej liczby naukowców, którzy mogą badać sztuczne błony komórkowe, korzystając z prostego i solidnego protokołu eksperymentalnego.

Dwuwarstwa lipidowa1 (SLB) na stałym nośniku jest wszechstronną platformą, która zachowuje podstawowe cechy biomembran, takie jak grubość dwuwarstwy, dwuwymiarowa dyfuzyjność lipidów i zdolność do przyjmowania biomolekuł związanych z błoną. Ze względu na złożoność naturalnych błon komórkowych wykazano, że ta prosta platforma działa jako skuteczna platforma do badań in vitro procesów związanych z błonami, takich jak tworzenie tratw2, wiązanie białek3, wiązanie wirusów i cząstek wirusopodobnych4,5 oraz sygnalizacja komórkowa6. Utworzona w bliskiej odległości od solidnego podłoża, platforma SLB jest kompatybilna z szeregiem technik pomiarowych wrażliwych na powierzchnię, takich jak mikroskopia całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), rozpraszanie mikrowagi kryształów kwarcu (QCM-D) i spektroskopia impedancji.
Opracowano kilka metod do produkcji różnych typów SLB, w tym zapadanie się pęcherzyków powietrza7 i nanolitografia zanurzeniowa8 dla submikronowych plam lipidowych, powlekanie spinowe9 dla dwuwarstwowych stosów oraz Langmuir-Blodgett (LB)10 i fuzja pęcherzyków (VF)11 dla pełnozakresowych, jednowarstwowych powłok lipidowych. Metoda VF polega na adsorpcji małych pęcherzyków jednowarstwowych do stałego podłoża, a następnie spontanicznym pęknięciu i fuzji w celu utworzenia ciągłej dwuwarstwy lipidowej. Jednak w warunkach fizjologicznych spontaniczne pękanie pęcherzyków ogranicza się głównie do materiałów na bazie krzemu, takich jak dwutlenek krzemu, szkło i mika. Ponadto pękanie pęcherzyków nie następuje spontanicznie w przypadku pęcherzyków o złożonym składzie lipidowym, takich jak te zawierające wysokie frakcje cholesterolu lub ujemnie naładowane lipidy. W zależności od systemu, pękanie pęcherzyków może być wywołane przez dalsze dostosowanie warunków eksperymentalnych, takich jak temperatura12, pH roztworu13 i zasolenie14, szok osmotyczny15 lub ciśnienie16 lub dodanie jonów dwuwartościowych, takich jak Ca2 + 17 . Alternatywnie, aktywny błonowo peptyd AH może być wprowadzony w celu destabilizacji warstwy zaadsorbowanych pęcherzyków, co prowadzi do pęknięcia pęcherzyków i powstania dwuwarstwowych na różnych powierzchniach18-22.
Ponadto, pomyślne tworzenie dwuwarstw wymaga przygotowania dobrze kontrolowanej populacji małych pęcherzyków jednowarstwowych, co może być czasochłonne i trudne do osiągnięcia dla niektórych kompozycji błonowych. W związku z tym, pomimo wysokiej skuteczności w optymalnych przypadkach (np. po intensywnej obróbce wstępnej pęcherzyków metodą zamrażania i rozmrażania23), ogólne zastosowanie fuzji pęcherzyków jest ograniczone zakresem odpowiednich substratów i kompozycji membranowych.
Metoda dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB)24-28 jest alternatywną techniką wytwarzania, która nie wymaga pęcherzyków lipidowych. Metoda opiera się na osadzaniu cząsteczek lipidów na powierzchni ciała stałego w obecności mieszającego się z wodą rozpuszczalnika organicznego, a następnie stopniowej wymianie tego rozpuszczalnika na wodny roztwór buforowy w celu wywołania tworzenia SLB. Na etapie wymiany rozpuszczalnika trójskładnikowa mieszanina lipidów, rozpuszczalnika organicznego i wody ulega szeregowym przemianom fazowym ze wzrostem frakcji wodnej, co prowadzi do powstania struktur fazy lamelarnej w roztworze masowym i SLB na podłożu stałym. Co ważne, ta droga samoorganizacji omija potrzebę pęknięcia pęcherzyka, co zwykle jest etapem granicznym dla przekształcenia zaadsorbowanych pęcherzyków w SLB. Protokół ma zastosowanie do szerokiej gamy powierzchni, w tym dwutlenku krzemu, tlenku glinu, chromu, tlenku indu i cyny i złota. W niniejszej pracy oraz w towarzyszącym jej filmie przedstawiono porównanie depozycji lipidów metodą SALB i fuzji pęcherzykowej. W szczególności omówiono wpływ parametrów doświadczalnych, w tym stężenia lipidów, natężenia przepływu oraz wyboru mieszalnego z wodą rozpuszczalnika organicznego, na jakość dwuwarstwy utworzonej metodą SALB. Charakterystyka analityczna wytworzonych SLB jest wykonywana za pomocą technik QCM-D, mikroskopii fluorescencyjnej i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Monitorowanie QCM-D jest wrażliwą powierzchniowo techniką pomiaru masy, która od czasu pionierskich prac przeprowadzonych przez Kellera i Kasemo29 jest szeroko stosowana do ilościowego badania powstawania dwuwarstw. Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia kontrolę jednorodności błony, a także wizualizację domen błonowych. Technika FRAP jest standardowym narzędziem do określania ruchliwości bocznej cząsteczek lipidów w SLB, co jest istotną właściwością błon płynowych.
Pierwsza część tego badania obejmuje analizę QCM-D metod SALB i fuzji pęcherzyków stosowanych do próby tworzenia dwuwarstw na dwutlenku krzemu i złocie. W drugiej części przedstawiono przygotowanie i scharakteryzowanie podpartych błon zawierających szereg stężeń cholesterolu metodą SALB oraz porównano wyniki z uzyskanymi metodą fuzji pęcherzykowej.

<table><tbody><tr><td>QCM-D Podłoża powlekane dwutlenkiem krzemu</td><td>QSense AB,&nbsp; </td><td></td><td></td>Szwecja</tr><tr><td>QCM-D pozłacane podłoża</td><td>QSense AB,&nbsp; </td><td></td><td></td>Szwecja</tr><tr><td>Moduł Q-Sense E4</td><td>QSense AB,&nbsp; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szwedzki środek do czyszczenia plazmowego, PDC-32G</td><td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td><td>PDC-001 (115V)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoiloilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lisamina rodamina B sulfonyl) (sól amonowa) (Rh-PE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150P</td><td></td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>Metylo-&beta;-cyklodekstryna</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>673773</tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>459844</tr><tr><td>n-propanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>279544</tr><tr><td>Sticky-Slide I 0,1 Luer</td><td>IBIDI</td><td>81128</td><td></td></tr><tr><td>Kolano męskie 1/8"</td><td>Cole-Parmer</td><td>30505-70</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa 1.6&#160; mm ID</td><td>IBIDI</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe szklane nr 1,5H, 25 mm x 75 mm</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Reglo Digital M2-2/12 Pompa perystaltyczna</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Numer telefonu 71725</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie biomembrany metodą dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (salb)

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Aby naśladować błony komórkowe, wspierana dwuwarstwa lipidowa (SLB) jest atrakcyjną platformą, która umożliwia badanie in vitro procesów związanych z błonami, jednocześnie nadając biokompatybilność i biofunkcjonalność substratom stałym. Spontaniczna adsorpcja i pękanie pęcherzyków fosfolipidowych jest najczęściej stosowaną metodą tworzenia SLB. Jednak w warunkach fizjologicznych fuzja pęcherzyków (VF) jest ograniczona tylko do podzbioru kompozycji lipidowych i stałych podpór. W tym miejscu opisujemy jednoetapową ogólną procedurę zwaną metodą tworzenia dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB) w celu utworzenia SLB, które nie wymagają pęcherzyków. Metoda SALB polega na osadzaniu cząsteczek lipidów na powierzchni ciała stałego w obecności mieszających się z wodą rozpuszczalników organicznych (np. izopropanolu), a następnie wymianie rozpuszczalnika z wodnym roztworem buforowym w celu wywołania tworzenia SLB. Etap ciągłej wymiany rozpuszczalnika umożliwia zastosowanie metody w konfiguracji przepływowej odpowiedniej do monitorowania tworzenia się dwóch warstw i późniejszych zmian przy użyciu szerokiej gamy bioczujników wrażliwych na powierzchnię. Metoda SALB może być stosowana do wytwarzania SLB na szerokiej gamie hydrofilowych powierzchni stałych, w tym tych, które są trudne do fuzji pęcherzykowej. Ponadto umożliwia wytwarzanie SLB złożonych z kompozycji lipidowych, których nie można wytworzyć metodą fuzji pęcherzykowej. W niniejszym artykule porównujemy wyniki uzyskane za pomocą SALB i konwencjonalnych metod fuzji pęcherzykowej na dwóch ilustracyjnych powierzchniach hydrofilowych, dwutlenku krzemu i złocie. W celu optymalizacji warunków doświadczalnych do przygotowania wysokiej jakości dwuwarstw przygotowanych metodą SALB, omówiono wpływ różnych parametrów, w tym rodzaju rozpuszczalnika organicznego na etapie osadzania, szybkości wymiany rozpuszczalnika i stężenia lipidów wraz ze wskazówkami dotyczącymi rozwiązywania problemów. Za pomocą metody SALB wykazano również tworzenie podpartych błon zawierających wysokie frakcje cholesterolu, co podkreśla możliwości techniczne techniki SALB dla szerokiego zakresu konfiguracji membran.

Przedstawiamy eksperymentalny protokół tworzenia dwuwarstwy lipidowej na stałych podłożach bez użycia pęcherzyków lipidowych. Demonstrujemy jednoetapową metodę tworzenia dwuwarstwy lipidowej na dwutlenku krzemu i złocie, a także na membranach nośnych z domeną wzbogaconą w cholesterol do różnych zastosowań biologicznych.

Wytwarzanie biomembrany metodą dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB)

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie membran wspieranych metodą lipidowej dwuwarstwy wspomaganej rozpuszczalnikiem. Metoda ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii błon, takie jak zrozumienie podstawowych właściwości lipidów i białek błonowych, a także umożliwia zastosowania w obszarze odkrywania leków i diagnostyki molekularnej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość warstwowego tworzenia lipidów wspierających, co w wielu przypadkach nie jest możliwe przy zastosowaniu metody konwencjonalnej.Procedura ta jest również łatwa w użyciu i wymaga minimalnego przygotowania próbek. Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapię i diagnostykę, ponieważ umożliwia badanie istotnych celów terapeutycznych, takich jak białka błonowe. Metoda ta może być również wykorzystywana do wytwarzania biokompatybilnych podłoży w zastosowaniach z zakresu inżynierii materiałowej.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy dyskutowaliśmy o trudnościach związanych z konwencjonalnymi metodami wytwarzania membran; zaprezentowanie tej procedury będzie pomocne i przystępne dla studentów studiów magisterskich z naszego laboratorium. Przygotuj roztwór zapasowy lipidów DOPC o stężeniu 10 mg/ml, rozpuszczając proszek lipidowy w izopropanolu. Następnie rozpuść proszek lipidowy DOPE znakowany rutenem w izopropanolu, aby uzyskać roztwór zapasowy lipidów o stężeniu 1 mg/ml.Rozcieńczyć i wymieszać roztwory zapasowe w izopropanolu, aby przygotować odpowiednią mieszaninę lipidów w stężeniu końcowym do eksperymentów z fluorescencją, mikroskopią oraz odzyskiwaniem fluorescencji po fotobleachingu (frap); mieszanina lipidów powinna zawierać 0,5% wagowo DOPE znakowanego R-domine. Wstrzyknąć mieszaninę lipidów w izopropanolu do kanału mikroprzepływowego, aż zostanie on całkowicie wypełniony. Inkubować mieszaninę lipidów na powierzchni szklanej przez około 10 minut.Wymiana soli powinna być przeprowadzona przy bardzo niskim przepływie, w przeciwnym razie jakość dwuwarstwy będzie niska. Stopniowo zastępuj roztwór lipidów wodą lub roztworem buforowym, używając pompy perystaltycznej przy bardzo niskiej prędkości przepływu. Następnie dokładnie przepłucz kanał nadmiarem buforu, aby usunąć pozostały izopropanol w celu utworzenia wspieranych membran wzbogaconych w cholesterol.Przygotować roztwór zapasowy zawierający DOPC, cholesterol lipidowy oraz rho domine, oznakowany lipidem DOPE, najpierw rozpuszczając odpowiednie proszki w izopropanolu, a następnie powtarzając ten sam protokół co poprzednio w celu przeprowadzenia testu płynności błony. Najpierw zanurzyć szklaną lamelkę w 1% roztworze ESAL sulfate sodu na 10 minut. Następnie dokładnie wypłukać lamelki wodą dejonizowaną i przepłukać etanolem.Wysusz szkiełka, używając łagodnego strumienia azotu. Następnie poddaj szkiełka działaniu plazmy tlenowej przez 30 sekund przy maksymalnej mocy częstotliwości radiowej w komorze plazmy tlenowej. Następnie, za pomocą pęsety, usuń folię ochronną z dna komercyjnej komory mikroprzepływowej bez dna i przyłóż szkiełko do lepkiej strony komory.Zmontuj złączki i rurki w pozycjach wlotowych i wylotowych komory, a następnie umieść kanał mikrofluidyczny na stoliku mikroskopu. Sformuj w kanale mikrofluidycznym fluorescencyjnie znakowaną wspieraną dwuwarstwę lipidową, tak jak wcześniej, używając pożądanej kompozycji lipidów, zawierającej 0,5% wagowych rho domine, znakowanego lipidu DOPE oraz rozpuszczalnika nieorganicznego. Następnie zlokalizuj płaszczyznę dwuwarstwy za pomocą obiektywu imersyjnego 60 x. Aby zarejestrować obrazy, wykonaj najpierw dwa obrazy wstępne przed fotowybielaniem.Rozgrzewaj laser, aż jego intensywność stanie się stabilna. Następnie przeprowadź fotowybielanie okrągłego obszaru o szerokości 30 µm za pomocą wiązki lasera o długości fali 532 nm i mocy 100 mW. Bezpośrednio po fotowybielaniu.Należy rejestrować serię obrazów co jedną sekundę przez dwie minuty, aby śledzić regenerację i intensywność fluorescencji w miejscu wybielenia w celu przeprowadzenia ilościowego oznaczania cholesterolu. Najpierw wystawić chip czujnika z kryształu kwarcu pokrytego dwutlenkiem krzemu na działanie plazmy tlenowej przez 30 sekund przy maksymalnej mocy częstotliwości radiowej w komorze plazmy tlenowej. Wyjąć chip z komory i natychmiast zamontować go w komorze pomiarowej; przed eksperymentem wykorzystano czterokanałową mikrowagę kwarcową Q Sense E four A four.Wyznacz częstotliwość oraz dyssypację sensora i powietrza, aby zapewnić prawidłowy montaż. W tym celu uruchom program oprogramowania qof. Kliknij akwizycję i wybierz konfigurację pomiaru w nowo otwartym oknie, a następnie zaznacz alikwoty 3 5 7 9 11 oraz 13.Następnie kliknij „find” (znajdź) i „run” (uruchom). Aby sprawdzić widma rezonansowe, ustaw temperaturę na 24 °C. Po uzyskaniu właściwego montażu uruchom pompę perystaltyczną i wprowadź roztwór buforowy do komory pomiarowej z szybkością przepływu 100 µL/min w programie komputerowym, kliknij „acquisition” (akwizycja) i wybierz „restart measurement” (zrestartuj pomiar), aby zarejestrować sygnały częstotliwości rezonansowej i dyssypacji energii.Powtarzaj ten krok do momentu uzyskania stabilnej linii bazowej dla przesunięć częstotliwości i dysypacji. Wstrzykuj izopropanol bez lipidów przez 10 minut.Następnie przeprowadź iniekcję mieszaniny lipidu DOPC i cholesterolu o pożądanym stosunku molowym z całkowitym stężeniem lipidów 0,5 mg/ml w izopropanolu przez 10 minut. Następnie wstrzykuj bufor przez 20 minut z szybkością przepływu 100 µl/min. Po tym wstrzykuj roztwór 1 mM metylo-beta-cyklodekstryny przygotowany w buforze, aż sygnał częstotliwości osiągnie stabilną wartość.Zmierz względne dodatnie przesunięcia częstotliwości wywołane etapem traktowania metylo-beta-cyklodekstryną i oblicz masę lipidów cholesterolu oraz DOPC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie oblicz ułamek molowy cholesterolu w podpartej dwuwarstwie lipidowej, uwzględniając masy cząsteczkowe lipidów DOPC i cholesterolu. Przedstawiono tutaj reprezentatywny obraz z mikroskopii fluorescencyjnej dwuwarstwy lipidowej DOPC zawierającej 0,5% wagowo znaczonego luminą lipidu DOPE, utworzonej na powierzchniach szklanych metodą SAL.Eksperyment fluorescencyjnego powrotu po fotoblaknięciu wykazał niemal całkowity powrót fluorescencji, co wskazuje na płynność boczną dwuwarstwy lipidowej. Przedstawiono tutaj reprezentatywne krzywe QCMD przesunięć częstotliwości i dyssypacji dla formowania dwuwarstwy na podłożu. Zastosowanie metody SAL pozwoliło na uzyskanie końcowych przesunięć częstotliwości rezonansowej i przesunięć dyssypacji, które po opanowaniu techniki odpowiadają utworzeniu płaskiej dwuwarstwy.Tę technikę można przeprowadzić w 30 minut, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wytwarzać wspierane biomembrany przy użyciu metody lipidowej dwuwarstwy wspomaganej rozpuszczalnikiem. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o przygotowaniu świeżych roztworów lipidów przed eksperymentem oraz o optymalizacji wymiany rozpuszczalnika w zależności od konfiguracji eksperymentalnej. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak mikroskopia sił atomowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące tworzenia się domen błonowych.

biomembrane-fabrication-solvent-assisted-lipid-bilayer-salb

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie demonstrujemy procedurę badania organizacji septyny na dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym in vitro przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Planarny dwuwarstwowy test lipidowy: oparta na mikroskopii technika in vitro do badania składania septyny na mimikach błon biologicznych

Ten film opisuje technikę badania składania białek septyny na mikrosferach pokrytych dwuwarstwami lipidowymi. Technika ta pomaga w zrozumieniu zależnych od krzywizny zespołów białek na zakrzywionych powierzchniach.

Test dwuwarstwowy lipidów ze sferycznym wsparciem: technika obserwacji składania się septyny na mikrosferach

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę SALB do wytwarzania dwuwarstw lipidowych na podłożach stałych bez użycia wesykul. Technika ta umożliwia badanie białek błonowych i znajduje zastosowanie w odkrywaniu leków oraz diagnostyce molekularnej.

Wytwarzanie biomembrany metodą dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB)

Przeglądaj więcej filmów