Wytwarzanie biomembrany metodą dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB)

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie podpartych błon metodą dwuwarstwową lipidów wspomaganą rozpuszczalnikiem. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii błon, takich jak zrozumienie podstawowych właściwości lipidów i białek błonowych, a także w realizacji takich zastosowań, jak odkrywanie leków i diagnostyka molekularna. Główną zaletą tej techniki jest to, że w wielu przypadkach może ona wytwarzać lipidy podporowe warstwami, co nie jest możliwe w przypadku konwencjonalnej metody.

Procedura jest również łatwa w użyciu i wymaga minimalnego przygotowania próbki. Implikacje tej techniki rozciągają się na naszą terapię i diagnostykę, ponieważ pozwala ona na badanie ważnych celów leków, takich jak białka błonowe. Metoda ta może być również stosowana do wytwarzania biokompatybilnych substratów do zastosowań w materiałoznawstwie.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy omówiliśmy trudność konwencjonalnych metod wytwarzania membran, pokazując, że procedura będzie średnia i SHA dla absolwentów naszego laboratorium. Przygotować podstawowy roztwór lipidów o stężeniu 10 miligramów na mililitr lipidu DOPC, rozpuszczając proszek lipidowy w roztworze izopropanolu. Następnie rozpuść proszek lipidowy DOPE znakowany ruminą w roztworze izopropanolu, aby uzyskać podstawowy roztwór lipidów o objętości jednego miligrama na mililitr.

Rozcieńczyć i wymieszać roztwory podstawowe w izopropanolu w celu przygotowania pożądanej mieszaniny lipidów o końcowym stężeniu do fluorescencji, mikroskopii i odzyskiwania fluorescencji po eksperymentach z fotowybielaniem lub frapem, w mieszaninie lipidów należy uwzględnić 0,5 procenta wagowego dominy R znakowanej DOPE. Wstrzyknąć mieszaninę lipidów z izopropanolem do kanału mikroprzepływowego, aż zostanie on wypełniony. Inkubuj mieszaninę lipidów na powierzchni szkła przez około 10 minut.

Wymiana soli powinna odbywać się przy bardzo niskim natężeniu przepływu, w przeciwnym razie jakość dwuwarstwy będzie niska. Stopniowo zastępować roztwór lipidowy wodą lub roztworem buforowym za pomocą pompy perystaltycznej przy bardzo niskim natężeniu przepływu. Następnie dokładnie przepłukać kanał nadmiarem buforu w celu usunięcia pozostałości izopropanolu w celu wytworzenia błon podporowych wzbogaconych w cholesterol

Przygotować roztwór podstawowy zawierający DOPC, cholesterol lipidowy i rho dominę, oznaczony jako lipid DOPE, najpierw rozpuszczając odpowiednie proszki w izopropanolu, a następnie powtarzając ten sam protokół, co poprzednio, aby przeprowadzić test płynności błony. Najpierw zanurz szklankę, wsuń 1% roztwór siarczanu sodu ESAL na 10 minut. Następnie dokładnie umyj szkiełka wodą dejonizowaną i spłucz etanolem.

Wysusz szkiełka suszarką przy użyciu delikatnego strumienia azotu. Następnie wystaw szkiełka na działanie plazmy tlenowej przez 30 sekund z maksymalną mocą częstotliwości radiowej w komorze plazmy tlenowej. Następnie usuń powłokę ochronną z bezdennej komercyjnej komory mikroprzepływowej za pomocą pęsety i przymocuj szklane szkiełko do lepkiej strony komory.

Zamontuj złącza i rurki w pozycjach wlotowych i wylotowych komory, a następnie umieść kanał mikroprzepływowy na stoliku mikroskopu, tworząc fluorescencyjnie znakowaną dwuwarstwę lipidową w kanale mikroprzepływowym, tak jak poprzednio, używając pożądanej kompozycji lipidowej, w tym 0,5 procenta wagowego rho domin, oznaczonej rozpuszczalnikiem nieorganicznym DOPE Lipid. Następnie zlokalizuj płaszczyznę dwuwarstwową z obiektywem zanurzeniowym 60 x w olejku. Aby uchwycić obrazy, najpierw zrób dwa zdjęcia wstępne przed fotowybielaniem.

Rozgrzej laser, aż jego intensywność stanie się stabilna. Następnie fotowybielaj okrągłą plamkę o szerokości 30 mikronów za pomocą wiązki laserowej o długości 100 miliwatów o długości 532 nanometrów. Natychmiast po fotowybielaniu.

Rób serię zdjęć co sekundę przez dwie minuty, aby śledzić regenerację i intensywność fluorescencji w miejscu wybielania w celu ilościowego określenia poziomu cholesterolu. Najpierw wystaw chip czujnika kryształu kwarcu pokrytego dwutlenkiem krzemu na plazmę tlenową przez 30 sekund przy maksymalnej mocy częstotliwości radiowej w komorze plazmy tlenowej. Wyjmij chip z komory i natychmiast zamontuj chip w komorze pomiarowej, tutaj Q Sense E cztery A czterokanałowa mikrowaga kryształu kwarcu jest używana przed eksperymentem.

Uzyskaj częstotliwość i rozproszenie cenzury i powietrza, aby zapewnić prawidłowe montaż. Aby to zrobić, uruchom oprogramowanie qof. Kliknij akwizycję i wybierz ustawienie pomiaru w nowym oknie, które się pojawi, sprawdź alikwoty: 3, 5, 7, 9, 11 i 13.

Następnie kliknij znajdź i uruchom. W celu sprawdzenia widm rezonansowych należy ustawić temperaturę na 24 stopnie Celsjusza. Po prawidłowym zamontowaniu uruchom pompę perystaltyczną i roztwór bufora przepływu do komory pomiarowej przy natężeniu przepływu 100 mikrolitrów na minutę w oprogramowaniu, kliknij akwizycję i wybierz wznów pomiar, aby zarejestrować częstotliwość rezonansową i sygnały rozpraszania energii.

Powtarzaj ten krok, aż do uzyskania stabilnej linii podstawowej. Dla zmian częstotliwości i rozpraszania. Wstrzykiwać izopropanol bez lipidów przez 10 minut.

Następnie wstrzyknąć mieszaninę lipidów i cholesterolu DOPC w pożądanym stosunku molowym o całkowitym stężeniu lipikowym 0,5 miligrama na mililitr w izopropanolu przez 10 minut. Następnie wstrzykiwać bufor przez 20 minut przy natężeniu przepływu 100 mikrolitrów na minutę. Następnie wstrzyknąć roztwór jednej milimolowej beta-cyklodekstryny metylowej przygotowany w buforze, aż sygnał częstotliwości osiągnie stabilną wartość.

Zmierz względne dodatnie przesunięcia częstotliwości, które są spowodowane przez etap leczenia beta-cyklodekstryną metylu i oblicz masywne lipidy cholesterolu i DOPC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie oblicz ułamek molowy cholesterolu w podpartej dwuwarstwie lipidowej, biorąc pod uwagę masy cząsteczkowe lipidów DOPC i cholesterolu. Pokazano tutaj reprezentatywny obraz mikroskopii fluorescencyjnej dwuwarstwy lipidowej A-D-O-P-C zawierającej 0,5 procenta wagowego lipidu DOPE znakowanego żawą utworzonego na powierzchniach szklanych metodą SAL.

Odzysk fluorescencyjny po eksperymencie fotowybielania wykazał prawie całkowite odzyskanie fluorescencji, co wskazuje na boczną płynność dwuwarstwy lipidowej. Tutaj reprezentatywne krzywe QCMD częstotliwości i przesunięć rozpraszania dla wspieranego tworzenia dwuwarstw. Za pomocą metody SAL pokazano końcowe przesunięcia częstotliwości rezonansowej i przesunięcia dyssypacji, które odpowiadają powstaniu dwuwarstwy strugarki po opanowaniu.

Tę technikę można wykonać w 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać podparte błony biologiczne przy użyciu metody dwuwarstwowej lipidów wspomaganej rozpuszczalnikiem Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać o przygotowaniu świeżych roztworów lipidowych przed eksperymentem i optymalizacji wymiany rozpuszczalnika fluorku w zależności od konfiguracji eksperymentalnej zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak mikroskopia sił atomowych, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak tworzenie domen błonowych.