Name: Pomiary kurczliwości izolowanych mięśni brodawkowatych w celu zbadania inotropii serca u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Poznaj metodę pomiaru kurczliwości izolowanych mięśni brodawkowatych u myszy w celu badania inotropii serca. Technika ta umożliwia analizę funkcji skurczowej mięśnia poza wpływem układu nerwowego i naczyń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (KFO 196 "Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen Remodelling-Prozessen", FR 1638/1-2) oraz przez DZHK (Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych, część Niemieckich Centrów Badań nad Zdrowiem, które jest inicjatywą BMBF (niemieckiego Ministerstwa Edukacji i Badań)).

UWAGA: Podstawowe kroki procedury izolacji są pokazane na rysunku 1. Wszystkie kroki są szczegółowo opisane w poniższym protokole. Izolacja mięśni brodawkowatych, montaż w komorze kąpieli narządowej, akwizycja i analiza odbywa się w sekwencyjnym i obowiązkowym przedziale czasowym.
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim ustawodawstwem dotyczącym ochrony zwierząt i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu w Heidelbergu.
1. Przygotowanie oprzyrządowania
<ol>
	<li>Do pomiarów kurczliwości należy użyć wielokomorowej kąpieli organowej. Elementy zestawu do kąpieli narządowej z kurczliwością ex vivo przedstawiono na rysunku 2. 
	UWAGA: Aby zminimalizować czas między przygotowaniem mięśnia brodawkowatego a rozpoczęciem protokołu eksperymentalnego, przed pobraniem doświadczalnej tkanki należy ustawić sprzęt i przygotować. Zapewnia to największą ilość czasu, w którym tkanka pozostaje zdolna do przeprowadzania eksperymentów.</li>
	<li>Uruchom komputer i sprzęt do akwizycji danych. Włącz podgrzewanie w łaźni organowej (ustawione na 32 °C) i pozwól urządzeniom ustawić temperaturę.</li>
	<li>Przygotuj sprzęt do akwizycji. Rozpocznij rejestrowanie danych zgodnie z instrukcją obsługi oprogramowania.</li>
	<li>Sprawdź i przeprowadź kalibrację (jeśli to konieczne) na każdym kanale i wyzeruj wszystkie kanały, aby ustandaryzować sygnał elektryczny dostarczany z odpowiedniego przetwornika siły (powiązanego z tym kanałem) na siłę 2 g dostarczaną przez certyfikowany wzorzec masy.</li>
	<li>Włączyć dopływ gazu (95% O2/5% CO2) do komór do kąpieli organowej. Ciągłe gazowanie wszystkich komór podczas całego protokołu pomiarów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i roztworów fizjologicznych
<ol>
	<li>Przygotować roztwór buforowy Krebsa-Henseleita w celu uzyskania końcowych stężeń 119 mM NaCl; 25 mM NaHCO3; 4,6 mM KCl; 11 mM glukozy; 1 mM Na-pirogronianu; 1,5 mM CaCl2; 1,64 mM MgSO4; 1,18 mM KH2PO4 i dostosować pH do 7,4 (patrz Tabela 1 Roztwór fizjologiczny).</li>
	<li>Przygotować oddzielny roztwór buforowy Krebsa-Henseleita do użycia podczas izolacji, jak opisano w kroku 2.1, z dodatkowymi 30 mM monoksymu 2,3-butanodionu (BDM) i 50 IE heparyny/ml. Chłodny roztwór do 4°C (patrz Tabela 1 Roztwór przygotowawczy). Do symulacji niedokrwienia należy przygotować roztwór niedokrwienny zgodnie z opisem w Tabeli 1.</li>
	<li>Aby uzyskać protokół kurczliwości zależnej odCa2+, dodać Ca2+ do roztworu buforowego Krebsa-Henseleita do żądanego stężenia końcowego. 
	UWAGA: przygotować te roztwory bezpośrednio przed ich użyciem i gazować karbogenem, aby uniknąć wytrącania się węglanu wapnia. Przed użyciem podgrzej roztwór do 32°C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie rurki gazowej i naczynia preparacyjnego używanych podczas procedury wycinania brodawek
<ol>
	<li>Podłącz miękką rurkę gazową (średnica zewnętrzna 2-4 mm) do przyłącza gazowego (100% tlenu, alternatywnie karbogen) z fachową pracą.</li>
	<li>Utworzyć zamknięty pierścień łącznika rurki gazowej wewnątrz naczynia rozwarstwiającego. Przekłuć rurkę gazową kilka razy, aby zapewnić ciągłe bulgotanie. Ta rurka gazowa może być używana kilka razy.</li>
	<li>Przygotuj naczynie preparacyjne z elastomerem silikonowym na dnie (o grubości 0,5 cm), tak aby można było w nie wbić szpilki. To danie może być używane kilka razy.</li>
</ol>
4. Izolacja lewego przedniego mięśnia brodawkowatego od myszy
UWAGA: Zanim rozpoczniesz izolację mięśnia brodawkowatego, sprawdź, czy przewody gazowe są wolne od zatorów.
<ol>
	<li>Przygotuj zestaw do kąpieli narządów, jak wspomniano w sekcji protokołu 1-3 przed rozpoczęciem przygotowania mięśni brodawkowatych. Przygotuj wszystkie roztwory w dniu eksperymentu.</li>
	<li>Złóż w ofierze mysz (w wieku około 8-12 tygodni) przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi ekspertów i instytucji.</li>
	<li>Zamocuj zwierzę w pozycji grzbietowej, mocując przednie i tylne łapy na desce rozdzielczej, otwórz klatkę piersiową boczną po obu stronach, przecinając żebra ostrymi nożyczkami do kości, a następnie przetnij przeponę cięciem poprzecznym. Usuń osierdzie. Teraz serce i aorta są dostępne.</li>
	<li>Przymocuj serce kleszczami do truncusa naczyniowego w pobliżu serca i szybko oddziel serce nożyczkami od płuc i otaczających tkanek.</li>
	<li>Przenieść bijące serce na szalkę Petriego wypełnioną schłodzonym roztworem preparatu zagazowanym tlenem (krok 2.2). Pozwól sercu bić i delikatnie stymuluj skurcze serca, dotykając wierzchołka serca kleszczami.</li>
	<li>Gdy tylko serce będzie całkowicie wykrwawione, przenieść je do naczynia rozwarstwiającego wypełnionego schłodzonym roztworem przygotowawczym (krok 2.2) i zagazowaćO2. Od tego kroku użyj mikroskopu stereoskopowego.</li>
	<li>Zamocuj serce za pomocą małej szpilki przez prawą komorę tak, aby serce było widoczne od strony grzbietowej (prawa komora znajduje się po prawej stronie z punktu widzenia operatora).</li>
	<li>Za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych oddziel oba przedsionki na poziomie przedsionkowo-komorowym, odetnij tkankę łączącą z komór i wyrzuć. Wykonaj przecięcie ściany komory od poziomu zastawki przedsionkowo-komorowej do wierzchołka serca, unikając jakiegokolwiek nacisku mechanicznego.</li>
	<li>Otwórz komorę i przymocuj lewą wolną ścianę kleszczami, przyglądając się w ten sposób obu mięśniom brodawkowatym lewej komory.</li>
	<li>Lekko odetnij tkankę komorową boczną po obu stronach lewego przedniego mięśnia brodawkowatego, zachowując część żagla zastawkowego na przygotowaniu mięśnia brodawkowatego i unikaj dotykania lub rozciągania mięśnia brodawkowatego tak bardzo, jak to możliwe. Wypreparuj pozostałą tkankę ściany komory z mięśnia brodawkowatego.</li>
	<li>Przymocować nici jedwabne (7/0, metryczne 0,5) po obu stronach preparatu mięśni brodawkowatych, jedną na żaglu zastawkowym i jedną na części mięśniowej. Preparat utrwalić w komorze do kąpieli narządowej wypełnionej roztworem do kąpieli narządowej i zagazowanej karbogenem, zgodnie z sugerowaną temperaturą 32 °C.</li>
</ol>
5. Równowaga i stymulacja mięśnia brodawkowatego
<ol>
	<li>Bezpośrednio po utrwaleniu w kąpieli narządowej stymulować preparat mięśni brodawkowatych impulsami prostokątnymi (czas trwania 2 ms i prąd 100 mA) o częstotliwości stymulacji 1 Hz.</li>
	<li>Należy zapewnić częstą wymianę roztworu do kąpieli narządowej, albo poprzez ciągłą wymianę, albo przez częstą ręczną wymianę (co 5 minut), w zależności od konfiguracji stosowanego rodzaju kąpieli organowej.</li>
	<li>Stopniowo zwiększaj napięcie wstępne, aż do osiągnięcia maksymalnej siły drgania. Maksymalna siła drgania jest osiągana, gdy po wzroście napięcia wstępnego nie następuje dalsze zwiększenie siły skurczu.</li>
	<li>Po 45-60 minutach równoważenia rozpocznij protokół eksperymentalny.</li>
</ol>
6. Sugerowane protokoły eksperymentalne do pomiarów kurczliwości
UWAGA: Opisany poniżej protokół eksperymentalny zawiera standardowe manewry do scharakteryzowania kurczliwości serca w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. W części dotyczącej reprezentatywności szczegółowo opisujemy te protokoły, podając również reprezentatywne wyniki (zob. również Tabela 2).
<ol>
	<li>Rejestrowanie i analiza protokołów eksperymentalnych
	<ol>
		<li>Do nagrywania należy użyć odpowiedniego oprogramowania o odpowiedniej rozdzielczości czasowej (szybkość akwizycji ≥ 1kHz).</li>
		<li>Przeanalizuj parametry, w tym amplitudę siły drgania (wysokość), czas do osiągnięcia szczytowego napięcia (TTP) i połowę maksymalnego czasu relaksacji (odpowiednio R50/TFall), jak wspomniano w oprogramowaniu (jako przykład wykres 5.5 przyrządów ADI, patrz rysunek 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Endoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Ca2%2B+signaling+and+Ca2%2B+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+J%22%5BJournal%5D)">Cardiac Ca2+ signaling and Ca2+ sensitizers.</a> Circ J. 12 (12), 1915-1925 (2008).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li>
<li>Bers, D., Despa, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2FK-ATPase%E2%80%94an+integral+player+in+the+adrenergic+fight-or+flight+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Na/K-ATPase—an integral player in the adrenergic fight-or flight response.</a> Trends Cardiovasc Med. 19, 111-118 (2009).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation%E2%80%93contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation–contraction coupling.</a> Nature. 415, 198-205 (2002).</li>
<li>Pieske, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((al.+Ca%282%2B%29-dependent+and+Ca%282%2B%29-independent+regulation+of+contractility+in+isolated+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">al. Ca(2+)-dependent and Ca(2+)-independent regulation of contractility in isolated human myocardium.</a> Basic Res Cardiol. 92, Suppl 1. 75-86 (1997).</li>
<li>Corbin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sildenafilcitrate+does+not+affect+cardiac+contractility+in+human+or+dog+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+ResOpin%22%5BJournal%5D)">Sildenafilcitrate does not affect cardiac contractility in human or dog heart.</a> Curr Med ResOpin. 19 (8), 747-752 (2003).</li>
<li>Romero-Vecchione, E., Vasquez, J., Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+negative+inotropic+effect+of+cocaine+in+rat+ventricle+strip%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cient+Venez%22%5BJournal%5D)">Direct negative inotropic effect of cocaine in rat ventricle strip.</a> Acta Cient Venez. 47 (1), 17-23 (1996).</li>
<li>Näbauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+inotropic+effects+in+isolated+ventricular+myocardium+from+nonfailing+and+terminally+failing+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Positive inotropic effects in isolated ventricular myocardium from nonfailing and terminally failing human hearts.</a> Eur J Clin Invest. 18 (6), 600-606 (1988).</li>
<li>Gao, W. D., Perez, N. G., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+and+contractile+activation+in+intact+mouse+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling and contractile activation in intact mouse cardiac muscle.</a> J Physiol. 507, 175-184 (1998).</li>
<li>Bluhm, W. F., Kranias, E. G., Dillmann, W. H., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholamban%3A+a+major+determinant+of+the+cardiac+force-frequency+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phospholamban: a major determinant of the cardiac force-frequency relationship.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (1), H249-H255 (2000).</li>
<li>Redel, A., Baumgartner, W., Golenhofen, K., Drenckhahn, D., Golenhofen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+activity+and+force-frequency+relationship+of+isolated+mouse+papillary+muscle%3A+effects+of+extracellular+calcium+concentration%2C+temperature+and+contraction+type%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mechanical activity and force-frequency relationship of isolated mouse papillary muscle: effects of extracellular calcium concentration, temperature and contraction type.</a> Pflugers Arch. 445 (2), 297-304 (2002).</li>
<li>Uhl, S., Mathar, I., Vennekens, R., Freichel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclase-mediated+effects+contribute+to+increased+Isoprenaline-induced+cardiac+contractility+in+TRPM4+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JMCC%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclase-mediated effects contribute to increased Isoprenaline-induced cardiac contractility in TRPM4 deficient mice.</a> JMCC. 74, 307-317 (2014).</li>
<li>Allen, D. G., Jewell, B. R., Wood, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+contractility+of+mammalian+myocardium+at+low+rates+of+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Studies of the contractility of mammalian myocardium at low rates of stimulation.</a> J Physiol. 254 (1), 1-17 (1976).</li>
<li>Pieske, B., Maier, L. S., Schmidt-Schweda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+load+in+human+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Sarcoplasmic reticulum Ca2+ load in human heart failure.</a> Basic Res Cardiol. 97, Suppl 1. 163-171 (2002).</li>
<li>Koch-Weser, J., Blinks, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+the+Interval+between+Beats+on+Myocardial+Contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The Influence of the Interval between Beats on Myocardial Contractility.</a> Pharmacol Rev. 15, 601-652 (1963).</li>
<li>Bocalini, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+remodeling+after+large+infarcts+in+rat+converts+post+rest-potentiation+in+force+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Arq+Bras+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial remodeling after large infarcts in rat converts post rest-potentiation in force decay.</a> Arq Bras Cardiol. 98 (3), 243-251 (2012).</li>
<li>Juggi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ischemia-reperfusion+on+the+post-rest+inotropy+of+isolated+perfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of ischemia-reperfusion on the post-rest inotropy of isolated perfused rat heart.</a> J Cell Mol Med. 6 (4), 621-630 (2002).</li>
<li>Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Bowditch%3A+the+convergence+of+cardiac+chronotropy+and+inotropy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Beyond Bowditch: the convergence of cardiac chronotropy and inotropy.</a> Cell Calcium. 35 (6), 629-624 (2004).</li>
<li>Taylor, D. G., Parilak, L. D., LeWinter, M. M., Knot, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+rat+left+ventricle+force+and+Ca2%2B+-frequency+relationships%3A+similarities+to+dog+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification of the rat left ventricle force and Ca2+ -frequency relationships: similarities to dog and human.</a> Cardiovasc Res. 61 (1), 77-86 (2004).</li>
<li>Schmidt, U., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+force-interval+relationship+in+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Card+Fail%22%5BJournal%5D)">The force-interval relationship in human myocardium.</a> J Card Fail. 1 (4), 311-321 (1995).</li>
<li>Rossman, E. I., Petre, R. E., Chaudhary, K. W., Piacentino, V. 3rd, Janssen, P. M., Gaughan, J. P., Houser, S. R., Margulies, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+frequency-dependentresponses+represent+the+pathophysiologic+signature+of+contractile+failure+inhuman+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22JMCC%22%5BJournal%5D)">Abnormal frequency-dependentresponses represent the pathophysiologic signature of contractile failure inhuman myocardium.</a> JMCC. 36 (1), 33-42 (2004).</li>
<li>Moran, A. E., Forouzanfar, M. H., Roth, G. A., Mensah, G. A., Ezzati, M., Murray, C. J., Naghavi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+trends+in+ischemic+heart+disease+mortality+in+21+world+regions%2C+1980+to+2010%3A+the+Global+Burden+of+Disease+2010+stud%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions, 1980 to 2010: the Global Burden of Disease 2010 stud.</a> Circulation. 129 (14), 1483-1492 (1980).</li>
<li>Lee, J. A., Allen, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+intracellular+free+calcium+concentration+during+long+exposures+to+simulated+ischemia+in+isolated+mammalian+ventricular+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in intracellular free calcium concentration during long exposures to simulated ischemia in isolated mammalian ventricular muscle.</a> Circ Res. 71 (1), 58-69 (1992).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym manuskrypcie opisujemy metodę badania kurczliwości mysiego mięśnia brodawkowatego in vitro , która może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kilka pytań naukowych związanych z fizjologią i patologią serca u myszy, a także do wsparcia analizy linii transgenicznych i odkrycia nowych podejść farmaceutycznych do leczenia dysfunkcji serca. Przedstawiono zastosowanie tej metody do oceny fizjologicznych, patologicznych i farmakologicznych właściwości kurczliwości mięśnia sercowego (patrz ryc. 3</s...

Badanie białek takich jak kanały jonowe, określające ich rolę w kurczliwości serca, jest niezbędne do odkrycia różnych patomechanizmów i ustalenia nowych strategii terapeutycznych dla chorób serca, takich jak niedokrwienie i niewydolność serca.
Wiadomo, że funkcja kurczenia się kardiomiocytów ssaków jest modulowana przez różne kanały jonowe, transportery i inne białka. Potencjał czynnościowy wywołany aktywacją zależnych od napięcia sarkolemmalnych kanałów Ca2 + typu L prowadzi do napływu Ca2 + z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, a następnie do indukowanego przez Ca2 + uwalniania Ca2 + (CICR)1, co wywołuje skurcz komórkowy2. Sygnalizacja Ca2 + odgrywa kluczową rolę w kurczliwości serca i adaptacji do stresu fizjologicznego lub patologicznego. Katecholaminy aktywują receptory β-adrenergiczne serca, stymulując w ten sposób cyklazę adenylową (AC), która syntetyzuje cAMP. Aktywowana kinaza białkowa A (PKA) fosforyluje różne białka wewnątrzkomórkowe i błonowe, takie jak kanały Ca2 + typu L, fosfalamban i receptory ryanodine, powodując modyfikację stanów przejściowych Ca2 + i kurczliwość serca1,3,4. cAMP jest degradowany przez fosfodiesterazę (PDE). Aktywacja receptorów sprzężonych z Gs innych niż β-adrenergiczne również prowadzi do akumulacji cAMP.
Technika pomiaru kurczliwości w izolowanych paskach mięśni komorowych jest dobrze znana dla większych gatunków ssaków5-8. Opierając się na możliwości celowania genów u myszy, ważne jest ustalenie metod analizy fizjologii serca myszy. Jednak istniejące dane dotyczące właściwości fizjologicznych izolowanych preparatów mięśniowych u myszy różnią się w zależności od warunków eksperymentalnych9-12.
Opisana metoda służy do analizy kurczliwości mięśni brodawkowatych lewej komory in vitro. Badanie kurczliwości serca przeprowadza się przy braku czynników modyfikujących kurczliwość serca in vivo, takich jak ciśnienie krwi, stymulacja neurohumoralna oraz stres fizyczny lub metaboliczny. Szybkość bicia preparatu mięśni kurczących się może być rygorystycznie zdefiniowana i dowolnie zmieniana. Siła drgań może być analizowana w kontekście konkretnych bodźców, takich jak stężenie wapnia, częstotliwość dudnień czy temperatura. Ponadto metoda ta może być wykorzystana do zbadania różnych komponentów szlaku sygnałowego oraz do porównania wydajności serca genetycznie zmodyfikowanych modeli myszy poprzez kontrolowanie warunków eksperymentalnych wymienionych powyżej.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 5655</td><td></td></tr><tr><td>Monoksym 2,3-butanodionu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>Zwrot wskazujący rodzaj zagrożenia H 302, rozpuścić w DMSO</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek izoprenaliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5627</td><td>Zwrot wskazujący rodzaj zagrożenia H 315-H319-H335</td></tr><tr><td>Heparyna sodowa 250 000 IE/10 ml</td><td>ratiopharm</td><td>PZN 3874685</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek histaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7250</td><td>Zwrot wskazujący rodzaj zagrożenia H 315-H 317-H319- H334-H335</td></tr></tbody></table>

pomiary kurczliwości izolowanych mięśni brodawkowatych w celu zbadania inotropii serca u myszy

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Mięsień brodawkowaty wyizolowany z serca dorosłej myszy może być używany do badania kurczliwości serca podczas różnych stanów fizjologicznych/patologicznych. Charakterystykę skurczową można ocenić niezależnie od wpływów zewnętrznych, takich jak tonus naczyniowy lub stan neurohumoralny. Przedstawiono w nim naukowe podejście do pomiarów pojedynczych komórek z izolowanymi miocytami serca i badań in vivo, takich jak echokardiografia. W związku z tym preparaty mięśni brodawkowatych służą jako doskonały model do badania fizjologii/patofizjologii serca i mogą być wykorzystywane do badań, takich jak modulacja za pomocą środków farmakologicznych lub eksploracja transgenicznych modeli zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania mysiego lewego przedniego mięśnia brodawkowatego w celu zbadania kurczliwości serca w konfiguracji kąpieli narządowej. W przeciwieństwie do preparatu paskowego wyizolowanego ze ściany komory, mięsień brodawkowaty może być przygotowany in toto bez poważnego uszkodzenia tkanki mięśniowej. Zestaw do kąpieli organowej składa się z kilku komór do kąpieli organowej o kontrolowanej temperaturze, gazowanych i wyposażonych w elektrody. Izolowany mięsień brodawkowaty jest mocowany w komorze kąpieli narządowej i stymulowany elektrycznie. Wywołana siła drgań jest rejestrowana za pomocą przetwornika ciśnienia i analizowane są takie parametry, jak amplituda siły drgania i kinetyka drgań. Można przeprowadzić różne protokoły eksperymentalne w celu zbadania kurczliwości zależnej od wapnia i częstotliwości, a także krzywych dawka-odpowiedź środków kurczliwych, takich jak katecholaminy lub inne farmaceutyki. Dodatkowo można symulować stany patologiczne, takie jak ostre niedokrwienie.

Protokół opisany w niniejszym manuskrypcie dla pomiarów kurczliwości izolowanych preparatów mięśnia brodawkowego myszy został dostrojony do warunków optymalnych, aby uzyskać powtarzalne wyniki eksperymentalne w warunkach fizjologicznych. W celu zdefiniowania optymalnych warunków eksperymentalnych przeprowadzono badania pilotażowe, w których zmieniano temperaturę kąpieli organowej oraz stężenie wapnia pozakomórkowego (patrz również12). Opisany tutaj protokół wykonano przy stężeniu wapnia pozakomórkowego 1.5 mM ...

Mysi mięsień brodawkowaty lewej komory może być użyty do zbadania kurczliwości serca in vitro. W tym artykule szczegółowo opisano izolację i protokoły eksperymentalne do badania charakterystyki kurczliwości serca.

Pomiary kurczliwości izolowanych mięśni brodawkowatych w celu zbadania inotropii serca u myszy

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie zdrowych, nienaruszonych mięśni papilarnych do badania funkcji skurczowej serca in vitro u myszy. Cel ten osiąga się poprzez najpierw wyizolowanie serca, a następnie przerwanie skurczów poprzez zanurzenie w roztworze kardioplegicznym, aby uniknąć uszkodzeń niedokrwiennych. W drugim kroku izolowany jest nienaruszony przedni mięsień papilarny lewej komory i wyposażany w szwy stabilizujące.Następnie mięsień zostaje zamocowany do przetwornika siły i przeniesiony do komory kąpieli organowej. W ostatnim kroku mięsień brodawkowy jest stymulowany impulsami elektrycznymi pola w celu wywołania skurczów mięśnia brodawkowego in vitro. W rezultacie wpływ różnych stanów fizjologicznych i patologicznych na kurczliwość mięśnia sercowego może zostać przeniesiony na przetwornik siły i zarejestrowany.Metodę tę można wykorzystać do analizy kurczliwości mięśni papilarnych lewej komory in vitro, w warunkach braku wpływów neurohumoralnych i naczyniowych, co umożliwia bezpośrednią ocenę interesujących właściwości kurczliwych serca. Preparaty mięśnia papilarnego stanowią doskonałe modele do badania fizjologii i patofizjologii serca, pozwalając na badanie wpływu środków farmakologicznych na kurczliwość serca.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy u myszy z niedoborem specyficznego, aktywowanego wapniem, nieselektywnego kanału jonowego zaobserwowaliśmy fenotyp sercowo-naczyniowy, co doprowadziło do odkrycia specyficznych zmian inotropowych w szlaku sygnalizacyjnym beta AIC. Należy rozpocząć od umieszczenia myszy w wieku od 8 do 12 tygodni w pozycji grzbietowej na stole sekcyjnym. Następnie, używając ostrych nożyczek do kości, należy otworzyć klatkę piersiową bocznie po obu stronach oraz przeciąć przeponę.Następnie, używając pęsety tępych, chwyć serce za fragmenty naczyń i za pomocą nożyczek szybko oddziel serce od płuc i otaczającej tkanki. Przenieś bijące serce do szalki Petriego wypełnionej schłodzonym roztworem preparatywnym, napowietrzonym tlenem, i delikatnie dotknij pęsetą szczytu serca, aby pobudzić skurcze mięśnia sercowego. Gdy serce zostanie całkowicie opróżnione z krwi, przenieś je do naczynia sekcyjnego i przebij prawą komorę małą szpilką, aby ustabilizować serce w pozycji grzbietowej.Następnie przenieś szalkę pod stereomikroskop i za pomocą nożyczek mikrosurgicalnych oddziel oba przedsionki na poziomie przedsionkowo-komorowym. Obróć serce o około 180 stopni i wykonaj cięcie przez ścianę lewej komory, od poziomu zastawki przedsionkowo-komorowej do wierzchołka serca, uważając, aby nie wywierać żadnego nacisku mechanicznego na serce.Następnie obróć serce z powrotem. Potem otwórz lewą komorę i za pomocą pęsety unieruchom wolną ścianę lewą, eksponując oba mięśnie brodawkowate lewej komory. Ostrożnie przetnij tkankę komorową bocznie po obu stronach przedniego mięśnia brodawkowatego lewej komory.Należy zadbać o zachowanie części zastawkowej SA w preparacie mięśnia brodawkowatego. Następnie należy oddzielić pozostałą tkankę ściany komory od mięśnia brodawkowatego i przymocować jedną jedwabną nić do części mięśniowej za pomocą dwóch węzłów oraz jedną nić do żagla zastawkowego mięśnia brodawkowatego. Preparat z jednym węzłem.Zamocuj preparat w uprzednio przygotowanej komorze kąpieli organowej. Następnie, bezpośrednio po zamocowaniu, stymuluj tkankę dwumilisekundowymi impulsami prostokątnymi przy natężeniu prądu 100 mA i częstotliwości stymulacji 1 Hz. Następnie rozpocznij rejestrację.Należy zmienić roztwór w zależności od rodzaju użytej kąpieli organowej. Stopniowo zwiększać mechaniczne napięcie wstępne w okresie od 45 do 60 minut, aż do momentu, gdy dalszy wzrost napięcia wstępnego nie spowoduje już zwiększenia siły skurczu, a następnie rozpocząć zaplanowaną analizę eksperymentalną. Kurczliwość serca można scharakteryzować za pomocą szeregu parametrów, w tym siły skurczu, czasu do osiągnięcia szczytu oraz czasu połowy rozkurczu.Korelację między częstotliwością skurczów a siłą skurczu oblicza się za pomocą zależności siły od częstotliwości. Na przykład w niniejszym doświadczeniu częstotliwość stymulacji zwiększano stopniowo od 0,1 do pięciu hertz, co prowadziło do zmian w kurczliwości serca. Protokół potęgowania po spoczynku ilustruje zmiany amplitudy siły skurczu obserwowane po uprzedniej stymulacji, po której nastąpił okres spoczynku o określonym czasie trwania.Poprzez zmianę stężenia wapnia w roztworze fizjologicznym w kąpieli organowej można ocenić wrażliwość aparatu kurczliwego na wapń, aby zbadać efekty inotropowe pośredniczone przez aktywację receptorów beta. Izolowany mięsień brodawkowy może być również traktowany izoprenem, jak pokazano w tym reprezentatywnym eksperymencie, w celu symulacji niedokrwienia. In vitro mięśnie są eksponowane na pozakomórkowy roztwór pozbawiony glukozy i pirogronianu, napowietrzany 95% azotem i 5% dwutlenkiem węgla, co prowadzi do spadku siły skurczu i rozwoju kurczu niedokrwiennego, co zostało przedstawione na wykresie.Po opanowaniu sekcji i equilibracji jednej populacji, przygotowanie mięśnia można ukończyć w około 19 minut, nawet poświęcając czas na ostrożną izolację i montaż preparatu, aby uniknąć uszkodzeń mechanicznych lub metabolicznych po zastosowaniu tej procedury. Po opracowaniu preparatu można przeprowadzić inne metody, takie jak pomiary elektrodą ostrej końcówki, testy immunoenzymatyczne (ELISA) oraz analiza Western blot, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania. Technika ta stanowi kluczowe podejście w badaniach nad fizjologią i farmakologią serca oraz w analizach fenotypu serca w różnych transgenicznych modelach gryzoni.

contractility-measurements-on-isolated-papillary-muscles-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Myszy transgeniczne okazały się niezwykle użyteczne w przypisywaniu funkcji fizjologicznych konkretnym genom. W związku z tym badania ogólne, a w szczególności studia funkcjonalne dróg oddechowych, przeszły znaczący zwrot w stronę modeli mysich. W niniejszym materiale przedstawiamy protokoły badań skurczu tchawicy in vitro w celu oceny funkcji mięśni gładkich w drogach oddechowych myszy.

In vitro pomiary skurczu tchawki u myszy

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Ten artykuł opisuje pomiar funkcji lewej komory myszy za pomocą analizy ciśnienia/objętości przy różnych częstościach akcji serca.

Cewnikowanie serca u myszy w celu pomiaru zależności objętości ciśnienia: badanie efektu Bowditcha

Ten artykuł opisuje protokół, który ocenia zmiany wrażliwości miofilamentu Ca2+ podczas skurczu w izolowanych miocytach serca szczura. Wraz z elektrofizjologią serca, skurczowymi/rozkurczowymi poziomami cytozolu Ca2+ i skurczem/rozluźnieniem, pomiar ten jest niezbędny do wzmocnienia mechanizmów pośredniczących w sprzężeniu pobudzenia-skurczu serca w zdrowych i chorych sercach.

Ocena wrażliwości miofilamentu ca2+ leżącej u podstaw sprzężenia wzbudzenia-skurczu serca

Ten protokół zawiera szczegółowy opis podejścia echokardiograficznego do kompleksowego fenotypowania funkcji serca i zastawki serca u myszy.

Podejścia echokardiograficzne i protokoły do kompleksowej charakterystyki fenotypowej choroby zastawkowej serca u myszy

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Prezentowany tutaj jest protokół do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej tkance serca mysiego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia perfuzji tętniczej i przepływu, który utrzymuje ciśnienie, a także składników drzewa naczyniowego, w tym łożysk naczyń włosowatych i perycytów, gdy tętnica przegrody jest kaniulowana i poddawana ciśnieniu.

Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

Przedstawiono zestaw protokołów, które opisują pomiar funkcji skurczu za pomocą wykrywania długości sarkomeru wraz z pomiarem przejściowym wapnia (Ca2+) w izolowanych miocytach szczurów. Uwzględniono również zastosowanie tego podejścia w badaniach na zwierzęcych modelach niewydolności serca.

Analiza dysfunkcji kurczliwości serca i stanów przejściowych Ca2+ w miocytach gryzoni

Ten protokół opisuje, jak mierzyć kurczliwość u pierwotnych kardiomiocytów dorosłych ludzi z serc dawców za pomocą systemu MyoBLAZER, niezawodnej platformy do oceny zmian kurczliwości wywołanych lekiem podczas rozwoju przedklinicznego.

Pomiar kurczliwości serca w izolowanych kardiomiocytach pierwotnych u dorosłych ludzi

Szybkie rozluźnienie mięśnia sercowego i serca jest niezbędne dla normalnej fizjologii. Obecnie wiadomo, że mechaniczne mechanizmy relaksacji są zależne od szybkości odkształcania. Protokół ten zawiera przegląd pozyskiwania i analizy eksperymentów w celu dalszego badania mechanicznej kontroli relaksacji.

Mechaniczna kontrola relaksacji za pomocą nienaruszonych beleczków serca

Poznaj metodę pomiaru kurczliwości izolowanych mięśni brodawkowatych u myszy w celu badania inotropii serca. Technika ta umożliwia analizę funkcji skurczowej mięśnia poza wpływem układu nerwowego i naczyń.

Pomiary kurczliwości izolowanych mięśni brodawkowatych w celu zbadania inotropii serca u myszy

Przeglądaj więcej filmów