Name: Łączenie kultur neuronalnych 3D z matrycami mikroelektrod: innowacyjny model eksperymentalny in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych sieci neuronalnych sprzężonych z matrycami mikroelektrod. Technika ta umożliwia zaawansowane rejestracje elektrofizjologiczne w modelu in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Giorgio Carliniemu za wsparcie techniczne w rozwijaniu struktury zamknięcia i kropki. Ornella LoBrutto za gruntowną korektę rękopisu. Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały dofinansowanie z 7. programu ramowego Unii Europejskiej (ICT-FET FP7/2007-2013, program FET Young Explorers) w ramach umowy o grant 284772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).

Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Europejskie Ustawodawstwo dotyczące Opieki nad Zwierzętami (2010/63/UE), przez włoskie Ministerstwo Zdrowia zgodnie z D.L. 116/1992 oraz przez wytyczne Uniwersytetu w Genui (Prot. N. 13130, maj 2011). Dołożono wszelkich starań, aby zmniejszyć liczbę zwierząt na potrzeby projektu i zminimalizować ich cierpienie.
1. Przygotowanie materiałów i podpór
<ol>
	<li>Zbuduj formę do budowy ograniczenia PDMS (Poly-Dimethyl-Siloxane) za pomocą frezarki CNC (Computer Numerical Control). Taka forma jest wykonana z poliwęglanu z centralnym cylindrem z politetrafluoroetylenu (PTFE). Materiał ten umożliwia łatwiejsze wyjęcie maski po stwardnieniu PDMS. 
	UWAGA: Projekt formy został wykonany przez Computer-Aided-Design (CAD), a następnie dostarczony do frezarki CNC.</li>
	<li>Przygotować elastomer PDMS. PDMS jest polimerem organicznym. Składa się z dwóch pierwiastków, utwardzacza i polimeru. Wymieszaj je w stosunku objętościowym 1:10, jedną część utwardzacza i dziewięć części polimeru. Umieść oba składniki na szalce Petriego, wstrząśnij i włóż mieszaninę do komory próżniowej na 10 minut, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza. 3 g PDMS wystarczają na jedno ograniczenie.</li>
	<li>Skonstruuj wiązanie PDMS. Włóż materiał PDMS do formy i wstaw go do piekarnika na 30 minut w temperaturze 120 °C. Ograniczenie PDMS ma kształt idealnego walca o średnicy zewnętrznej i wewnętrznej odpowiednio 22,0 i 3,0 mm oraz wysokości 650 μm.</li>
	<li>Dzień przed posiewem połączyć maskę z obszarem aktywnym matryc mikroelektrod (MEA) za pomocą pęsety pod mikroskopem stereoskopowym i wysterylizować maskę PDMS w piecu w temperaturze 120 °C.</li>
	<li>Sterylizuj szklane mikrogranulki (średnica nominalna 40±2 μm; certyfikowana średnia średnica 42,3±1,1 μm) w 70% etanolu przez 2 godziny w stożkowej fiolce i obracaj co 30 minut, aby odsłonić wszystkie mikrogranulki. </li>
	<li>Usunąć roztwór etanolu z fiolki i dwukrotnie przepłukać mikrogranulki wysterylizowaną wodą.</li>
	<li>Kondycjonować środkową część obszaru MEA ograniczoną maską PDMS (średnica równa 3,0 mm) 24 μl zmieszanego roztworu poli-D-lizyny i Lamininy o stężeniu 0,05 μg/ml.</li>
	<li>Pokryj mikrogranulki białkami adhezyjnymi, laminą i poli-D-lizyną w stężeniu 0,05 μg/ml i pozostaw je na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby uzyskać stabilną i długotrwałą sieć neuronalną.</li>
	<li>Usuń współczynniki adhezji zarówno ze szklanej powierzchni MEA, jak i z mikrokulek szklanych. Odessać około 95% roztworu powlekającego za pomocą pipety i nanieść niewielką objętość - 24 μl - sterylnej wody na powierzchnię MEA. Ponownie zassać ponad 95% wody i pozostawić MEA do wyschnięcia pod kapturem laminarnym przez 1 godzinę przed posianiem komórek. 
	UWAGA: W przypadku mikrogranulek należy zamiast tego odessać roztwór powlekający i wykonać pierwsze przemycie wysterylizowaną wodą, a drugie pożywką podstawową i jej dodatkiem, takim jak B27, w celu kondycjonowania szklanej powierzchni, na której zostaną platerowane neurony. Nie pozwól, aby mikrogranulki wyschły. Pozostawić je w zawiesinie w pożywce hodowlanej wewnątrz fiolki.</li>
	<li>Rozprowadzić za pomocą pipety -200 μl-, zawiesinę poddanych działaniu środka mikrogranulek (około 32 000) na płytce wielodołkowej z wkładką membranową (średnica porów 0,4 μm), gdzie ulegną one samoorganizacji, tworząc jednolitą warstwę.</li>
	<li>Napełnić każdą studzienkę błony 0,5 ml pożywki i umieścić ją w inkubatorze (T = 37,0 oC, CO2 = 5%), aż neurony będą gotowe do posiewu (3.2).</li>
</ol>
2. Sekcja zarodków i dysocjacja tkanek
<ol>
	<li>Dorosłe samice szczurów (200-250 g) trzymane są w pomieszczeniach dla zwierząt w stałej temperaturze (22 ± 1 °C) i wilgotności względnej (50%) w regularnym harmonogramie jasno-ciemnym (światło 7–19). Upewnij się, że jedzenie i woda są swobodnie dostępne.</li>
	<li>Znieczulenie ciężarnej samicy szczura po 18 dniach rozwoju (E18) za pomocą 3% izofluranu. Następnie złóż zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Usuń hipokampy z każdego zarodka szczura i umieść je w lodowatym roztworze soli Hanka bez Ca2+ i Mg2+. W 18 dniu rozwoju tkanki hipokampa i kory są bardzo miękkie i nie trzeba ich kroić na małe kawałki. Więcej szczegółów można znaleźćpod adresami 18,19.</li>
	<li>Zdysocjuj tkankę w 0,125% roztworze trypsyny/Hanka zawierającym 0,05% DNAzy przez 18-20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór sklarowany nad osadem za pomocą pipety Pasteura i zatrzymać trawienie enzymatyczne, dodając pożywkę z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) na 5 minut.</li>
	<li>Usuń pożywkę za pomocą FBS i przemyj raz pożywką z jej suplementem, 1% L-glutaminy, gentamycyna 10 μg/ml. Usuń ponownie pożywkę za pomocą pipety Pasteura i ponownie napełnij ją niewielką ilością (500 μl) pożywki wzrostowej z jej suplementem, 1% L-glutaminy, gentamycyną 10 μg/ml.</li>
	<li>Oddzielić osad tkankowy mechanicznie za pomocą wąskiej pipety Pasteura, aż do uzyskania mlecznej zawiesiny komórek. Nie ma potrzeby odwirowywania zawiesiny komórek.</li>
	<li>Rozcieńczyć małą objętość zawiesiny komórkowej pożywką wzrostową, aby uzyskać końcową objętość 2,0 ml. Policz uzyskane stężenie komórkowe za pomocą komory hemocytometru. Rozcieńczyć to stężenie w stosunku 1:5 w celu uzyskania pożądanego stężenia komórek 600-700 komórek/μl.</li>
</ol>
3. Poszycie komórek
<ol>
	<li>Płytki komórkowe o gęstości około 2,000 komórek/mm2 na obszarze aktywnym MEA, zdefiniowanym przez ograniczenie PDMS do stworzenia sieci neuronalnej 2D. 
	UWAGA: Każdy hipokamp zawiera około 5 x 105 komórek (1 x 106 dla pojedynczego zarodka). Wypreparuj 6 zarodków, aby uzyskać łączną ilość 6 x 10 6 komórek w 2 ml i szacowane stężenie 3,000 komórek/μl. Rozcieńczyć to stężenie w stosunku 1:5 w celu uzyskania pożądanego stężenia komórek i płytki około 600-700 komórek/μl. Jeśli obszar MEA ograniczony ograniczeniem PDMS wynosi około 7,065mm2, a całkowita liczba posianych komórek 600 komórek/μl x 24 μl = 14 400 komórek, końcowa gęstość wynosi 2,038 komórek/mm2.</li>
	<li>Umieścić urządzenia MEA w inkubatorze z nawilżoną atmosferą CO2 (5%) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rozprowadzić 160 μl zawiesiny o stężeniu komórek 600-700 komórek/μl (około 100 000 komórek) na powierzchnię monowarstwy mikrogranulek umieszczonej wewnątrz płytek wielodołkowych, aby zakończyć wstępny etap budowy hodowli trójwymiarowej. Umieścić płytki wielodołkowe w inkubatorze z wilgotną atmosferą CO2 (5%) w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. 3D Budowa sieci neuronowej
<ol>
	<li>6-8 godzin po posiewie bardzo ostrożnie przenieść zawiesinę (mikrogranulki z neuronami) z płytek wielodołkowych do obszaru ograniczonego ograniczeniem PDMS za pomocą zestawu pipet na objętość około 30-40 μl. Po każdym przeniesieniu odczekaj około pół minuty, aby mikrogranulki mogły się samozorganizować w sześciokątną, zwartą strukturę.</li>
	<li>Gdy wszystkie warstwy zostaną osadzone i spontanicznie złożone, ponownie napełnij dużą kroplą około 300 μl podłoża w górnej części obszaru ograniczonego ograniczeniem PDMS.</li>
	<li>Umieść strukturę 3D sprzężoną z MEA w inkubatorze (T = 37,0 oC, CO2 = 5%) na 48 godzin przed dodaniem końcowej objętości (około 1 ml) kultury pożywki wzrostowej z jej suplementem. 
	UWAGA: Weź pod uwagę całkowitą liczbę koralików na płytkach wielodołkowych z wkładką membranową (30 000) oraz liczbę koralików na pojedynczej warstwie na urządzeniu MEA (6 000). Powstała struktura 3D składa się z 5 warstw mikrogranulek i komórek. Biorąc pod uwagę, że sieć neuronowa 3D nie jest geometrycznie idealna, powstała struktura 3D może składać się z 5-8 warstw.</li>
	<li>Następnego dnia po posiewie ostrożnie dodać końcową objętość pożywki (około 900 μl) do pierścienia MEA. Utrzymuj kultury 3D w wilgotnej atmosferze CO2 (5%) w temperaturze 37 °C przez 4-5 tygodni. Wymieniaj połowę podłoża raz w tygodniu.</li>
</ol>
5. Akwizycja mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Przymocuj próbki biologiczne do stolika mikroskopu w uchwycie. Ustaw laser (argon, 496-555 nm), prędkość skanowania (400 Hz), przy której chcesz uzyskać obraz, wzmocnienie i przesunięcie (-0,3%) PMT dla każdego obrazu, aby uchwycić odpowiedni filtr emisji pasma oraz aby uniknąć nasycenia i zwiększyć stosunek sygnału do szumu. Sekcja wyników zawiera wartości użyte do uzyskania obrazów przedstawionych na rysunku 4.</li>
	<li>Aby uzyskać sekwencję z-stack, najpierw wybierz wartość pozycji z górnej i dolnej warstwy próbki, a następnie wybierz rozmiar kroku, aby dokonać akwizycji.</li>
</ol>

<ol><li>Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stability+and+developmental+changes+in+spontaneous+network+burst+firing+patterns+in+dissociated+rat+cerebral+cortex+cell+cultures+on+multi-electrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays.</a> Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).</li>
<li>Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precisely+timed+spatiotemporal+patterns+of+neural+activity+in+dissociated+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures.</a> Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).</li>
<li>Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectronic+system+for+high-resolution+mapping+of+extracellular+electric+fields+applied+to+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).</li>
<li>Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microdrop+delivery+system+for+neuronal+network+patterning+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays.</a> J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).</li>
<li>Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+compartment+neurofluidic+system+for+electrophysiological+measurements+in+physically+segregated+and+functionally+connected+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroeng%22%5BJournal%5D)">Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture.</a> Front. Neuroeng. 4, (2011).</li>
<li>Kanagasabapathi, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+and+dynamics+of+cortical-thalamic+networks+co-cultured+in+a+dual+compartment+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Eng%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device.</a> J. Neural. Eng. 9, (2012).</li>
<li>Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering+and+biohybridized+microsystems+for+neurobiological+investigation+in+vitro+%28Part+1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1).</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Bursting+in+Cortical+Cultures+with+Closed-Loop+Multi-Electrode+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation.</a> J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).</li>
<li>Shany, B., Vago, R., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+primary+hippocampal+neuronal+tissue+on+an+aragonite+crystalline+biomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss.+Eng%22%5BJournal%5D)">Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix.</a> Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).</li>
<li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering%3A+strategies+for+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).</li>
<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+stem+and+progenitor+cell+differentiation+into+functional+neuronal+circuits+in+three-dimensional+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels.</a> Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).</li>
<li>Baranes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interconnected+network+of+ganglion-like+neural+cell+spheres+formed+on+hydrozoan+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+En%22%5BJournal%5D)">Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton.</a> Tissue En. 13, 473-482 (2007).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+B%2C+Review%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).</li>
<li>Schuz, A., Palm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+of+neurons+and+synapses+in+the+cerebral+cortex+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).</li>
<li>Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloid-guided+assembly+of+oriented+3D+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Method%22%5BJournal%5D)">Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks.</a> Nat. Method. 5, 735-740 (2008).</li>
<li>Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+dynamics+of+3D+engineered+neuronal+cultures%3A+a+new+experimental+model+for+in-vitro+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology.</a> Sci. Rep. 4, (2014).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+functional+brain-like+cortical+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S%22%5BJournal%5D)">Bioengineered functional brain-like cortical tissue.</a> Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cell%22">Culturing Nerve Cell</a>. , 2nd edition, MIT Press. (1998).</li>
<li>Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+culture%2C+record+and+stimulate+neuronal+networks+on+Micro-electrode+arrays+%28MEAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs).</a> J. Vis. Exp. (39), (2010).</li>
<li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+in+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Adv%22%5BJournal%5D)">Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications.</a> Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).</li>
<li>Crompton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polylysine-functionalised+thermoresponsive+chitosan+hydrogel+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterial%22%5BJournal%5D)">Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering.</a> Biomaterial. 28, 441-449 (2007).</li>
<li>3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W niniejszej pracy zaprezentowano nowatorską eksperymentalną platformę in vitro składającą się z kultur neuronalnych zaprojektowanych w 3D sprzężonych z MEA do elektrofizjologii sieci. Zastosowanie mikrogranulek jako rusztowania umożliwiającego rozrost neurytów wzdłuż osi z zostało dostosowane do integracji z płaskim MEA. W ten sposób uzyskany mikrosystem skutkuje ważnym i wiarygodnym modelem 3D in vitro do badania powstającej dynamiki elektrofizjologicznej16.
<p class="jove_cont...

Dwuwymiarowe (2D) sieci neuronowe in vitro sprzężone z matrycami mikroelektrod (MEA) są złotym standardem eksperymentalnego modelu przyjętego do badania wzajemnych zależności między dynamiką neuronów a leżącą u jej podstaw łącznością. Podczas rozwoju neurony odtwarzają złożone sieci, które wykazują dobrze zdefiniowane wzorce czasoprzestrzenne aktywności1,2 (tj. wybuchy, wybuchy sieci, losowa aktywność impulsowa). MEA rejestrują aktywność elektrofizjologiczną z wielu miejsc (od dziesiątek do tysięcy mikroelektrod), co pozwala na szczegółowe badanie wyrażonej dynamiki na poziomie sieci. Ponadto zastosowanie kultur zdysocjowanych umożliwia projektowanie sieci inżynieryjnych. W ten sposób łatwiej jest zrozumieć funkcjonalne zależności między rejestrowaną aktywnością elektrofizjologiczną a parametrami organizacji sieci, takimi jak gęstośćkomórek3, stopień modularności4,5, obecność heterogenicznych populacjineuronalnych6 itp. Jednak wszystkie badania in vitro na zdysocjowanych hodowanych komórkach opierają się na sieciach neuronalnych 2D. Takie podejście prowadzi do nadmiernych uproszczeń w odniesieniu do systemu in vivo (wewnętrznie 3-wymiarowego, 3D): (i) w modelu 2D somaty i stożki wzrostu są spłaszczone, a wyrostek aksonów-dendrytów nie może rozprzestrzeniać się we wszystkich kierunkach7. (ii) Sieci 2D in vitro wykazują stereotypową dynamikę elektrofizjologiczną zdominowaną przez aktywność eksplozywną obejmującą większość neuronów sieci8.
Ostatnio opracowano różne rozwiązania umożliwiające budowę in vitro 3D dysocjowanych sieci neuronowych. Powszechny pomysł polega na stworzeniu rusztowania, na którym neurony mogą rosnąć w sposób 3D. Takie rusztowanie można wykonać za pomocą żeli polimerowych i stałych porowatych matryc9-13. Wykorzystując właściwości mechaniczne polimerów, możliwe jest osadzenie komórek wewnątrz tych struktur poprzez zdefiniowanie jednolitego bloku kultur 3D neurosfer11. Główną cechą tego podejścia jest sztywna właściwość mechaniczna neurosfer9,12. Materiały te mają jednak ograniczoną porowatość i nie gwarantują migracji komórek wewnątrz matrycy. Aby przezwyciężyć tę wadę, możliwym rozwiązaniem jest podzielenie macierzy na moduły "jednostkowe". Niestety, różnorodność rozmiarów i kształtów cząstek może utrudniać upakowanie w regularne struktury warstwowe. W7 Cullen i współpracownicy zaprojektowali trójwymiarowy konstrukt neuronalny składający się z neuronów i / lub astrocytów w bioaktywnym rusztowaniu opartym na macierzy zewnątrzkomórkowej. Tak zmodyfikowana tkanka neuronalna pozwoliła na badania in vitro w celu zbadania i manipulowania reakcjami neurobiologicznymi w mikrośrodowiskach 3D. Model ten składał się z neuronów i komórek glejowych rozmieszczonych w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i/lub rusztowań hydrożelowych (o grubości 500-600 μm). W tym stanie optymalną żywotność komórek (ponad 90%) stwierdzono poprzez posiew komórek o końcowej gęstości około 3,750 - 5,000 komórek/mm3. Należy zauważyć, że taka wartość gęstości jest znacznie niższa niż w warunkach in vivo, gdzie gęstość komórek kory mózgowej myszy wynosi około 90 000 komórek/mm314. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, Pautot i jego współpracownicystworzyli system 3D in vitro, w którym gęstość komórek i łączność sieciowa są kontrolowane tak, aby przypominały warunki in vivo, umożliwiając jednocześnie obrazowanie sieci w czasie rzeczywistym. W praktyce metoda ta opiera się na koncepcji, że zdysocjowane hodowane neurony są w stanie rosnąć na mikrogranulkach krzemionki. Koraliki te zapewniają powierzchnię wzrostu wystarczająco dużą, aby ciała komórek nerwowych mogły przylegać, a ich arboryzacja rosła, dojrzewała, rozciągała się i definiowała kontakty synaptyczne z innymi neuronami. Metoda ta wykorzystuje właściwości spontanicznego składania monorozproszonych kulek do tworzenia warstwowych sześciokątnych tablic 3D zawierających odrębne podzbiory neuronów na różnych warstwach z ograniczoną łącznością między neuronami na różnych koralikach. Osiągnięta gęstość komórek tą metodą wyniosła około 75 000 komórek/mm3.
Ostatnio dostosowaliśmy metodę Pautota do MEAs16: uzyskane wyniki pokazują, że aktywność elektrofizjologiczna 3D prezentuje szerszy repertuar działań niż ten wyrażony przez 2D networks. 3D dojrzałe kultury wykazują zwiększoną dynamikę, w której współistnieją zarówno pęknięcia sieci, jak i losowe skoki. Podobnie, Tang-Schomer i współpracownicyzrealizowali porowate rusztowanie na bazie białka jedwabiu, które utrzymuje pierwotną kulturę korową in vitro przez kilka miesięcy i zarejestrowali aktywność elektrofizjologiczną za pomocą elektrody wolframowej.
W tej pracy zostaną opisane eksperymentalne procedury budowy sieci neuronalnych 3D sprzężonych z MEA.

<table><tbody><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>0,05 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>0,05 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>25050-014</td><td>0,125% rozcieńczona 1:2 w HBSS w\o CA++, MG++</td></tr><tr><td>DNAaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>0,05% rozcieńczona&nbsp; w roztworze Hanksa</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21103049</td><td>pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>17504044</td><td>2% średni suplement</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td>10%</td></tr><tr><td>Glutamax-I&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>0,5 mM</td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G.1272</td><td>5 mg/L</td></tr><tr><td>Poli-dimetylo-Siloksan (PDMS)</td><td>Utwardzacz Corning Sigma</td><td>481939</td><td>oraz polimerowe</td></tr><tr><td>układy mikroelektrod</td><td>Multi Channel Systems (MCS)</td><td>60MEA200/30-Ti-pr</td><td>MEA z: Siatka elektrod 8x8; Rozstaw i średnica elektrod 200 i 30 &mikro; m, odpowiednio; plastikowy pierścień bez gwintu</td></tr><tr><td>Microbead</td><td>Distrilab-Duke Scientific</td><td>9040</td><td>&nbsp; 1 gr Część szklana. Rozmiar Stds 40 i mikro; m</td></tr><tr>Płytki wielodołkowe<td>Transwell</td><td>Costar Sigma</td><td>CLS 3413</td><td>z wkładką membranową (średnica 6,5 mm, porowate 0,4 &mikro; m)</td></tr><tr><td>HBSS w\o Ca++ ,Mg++&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14175-052</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy Hanksa&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Teflon</td><td>Sigma</td><td>430935-5G</td><td>politetrafluoroetylen</td></tr><tr><td>Szczur</td><td>Sprague Dawley</td><td>Wistar Szczur</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia konfokalna Pionowy</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>20.0x0.50 WODA</td><td>obiektyw Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40.0x0.80 WATER obiektyw</td><td>Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>25.0x0.95 WATER obiektyw</td><td>Leica</td><td>HCX IRAPO L</td><td></td></tr></tbody></table>

Łączenie kultur neuronalnych 3d z matrycami mikroelektrod: innowacyjny model eksperymentalny in vitro

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Obecnie, wielkoskalowe sieci wywodzące się z dysocjowanych neuronów rosnących i rozwijających się in vitro na zewnątrzkomórkowych mikroprzetwornikach są złotym standardem eksperymentalnego modelu do badania podstawowych neurofizjologicznych mechanizmów związanych z tworzeniem i utrzymywaniem zespołów komórek neuronalnych. Jednak badania in vitro ograniczyły się do rejestracji aktywności elektrofizjologicznej generowanej przez dwuwymiarowe (2D) sieci neuronowe. Niemniej jednak, biorąc pod uwagę skomplikowany związek między strukturą a dynamiką, konieczne jest znaczne ulepszenie w celu zbadania powstawania i rozwijania się sieci trójwymiarowych (3D). W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską platformę eksperymentalną, w której sieci 3D hipokampa lub kory mózgowej są sprzężone z planarnymi matrycami mikroelektrod (MEA). Sieci 3D są realizowane poprzez umieszczanie neuronów w rusztowaniu utworzonym ze szklanych mikrokulek (o średnicy 30-40 μm), na których neurony są w stanie rosnąć i tworzyć złożone, połączone ze sobą zespoły 3D. W ten sposób możliwe jest projektowanie inżynieryjnych sieci 3D składających się z 5-8 warstw o oczekiwanej końcowej gęstości komórek. Rosnąca złożoność organizacji morfologicznej zespołu 3D powoduje poprawę wzorców elektrofizjologicznych wyświetlanych przez tego typu sieci. W porównaniu ze standardowymi sieciami 2D, w których pojawia się wysoce stereotypowa aktywność burstingu, struktura 3D zmienia aktywność burstingu pod względem czasu trwania i częstotliwości, a także pozwala na obserwację bardziej losowej aktywności burstingu. W tym sensie opracowany model 3D bardziej przypomina sieci neuronowe in vivo.

W niniejszej procedurze eksperymentalnej istotną rolę odgrywają mikrokuleczki, które stanowią rusztowanie mechaniczne dla wzrostu trójwymiarowej sieci neuronalnej. Rysunki 1A i B przedstawiają rozmieszczenie mikrokuleczek (średnica nominalna 40±2 µm; certyfikowana średnica średnia 42.3± 1.1 µm) w płaszczyźnie. Charakterystyczną cechą takich struktur jest to, że mikrokuleczki ulegają spontanicznej samoorganizacji, tworząc zwartą geometrię heksagonalną (Rysunek 1B i C). Tak wygenerowane ru...

W tej pracy nowatorski model eksperymentalny, w którym hodowle neuronów 3D są sprzężone z płaskimi matrycami mikroelektrod (MEAs), presented. 3D sieci są budowane przez umieszczanie neuronów w rusztowaniu wykonanym ze szklanych mikrokulek, na których neurony rosną i tworzą połączone ze sobą struktury 3D.

Łączenie kultur neuronalnych 3D z matrycami mikroelektrod: innowacyjny model eksperymentalny in vitro

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Ogólnym celem tej procedury jest przedstawienie nowego modelu trójwymiarowych sieci neuronalnych in vitro sprzężonych z macierzami mikrolektrod. Osiąga się to poprzez uprzednie kondycjonowanie centralnej części MEA mieszanym roztworem poli-D-lizyny i lamininy, a następnie powlekanie mikrokulek białkami adhezyjnymi, lamininą i poli-lizyną. Drugim krokiem jest rozdzielenie zawiesiny potraktowanych mikrokulek na płytkę wielodołkową, gdzie ulegną one samoorganizacji i utworzą jednolitą warstwę.Trzecim krokiem procedury jest wysianie komórek na obszar aktywny MEA z gęstością 2000 komórek na milimetr kwadratowy w celu stworzenia dwuwymiarowych (2D) sieci neuronalnych. Od sześciu do ośmiu godzin po wysianiu zawiesina jest przenoszona z płytek wielodołkowych na MEA, a mikrokulki samoorganizują się w zwartą strukturę heksagonalną. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię konfokalną do wizualizacji sieci 3D, które są porównywane z konwencjonalnymi sieciami neuronalnymi 2D hodowanymi na MEA.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak dwuwymiarowe hodowle komórkowe in vitro, jest to, że w modelu dwuwymiarowym ciała komórek i stożki wzrostu są spłaszczone, przez

interfacing-3d-engineered-neuronal-cultures-to-micro-electrode-arrays

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten protokół dostarcza niezbędnych informacji do zakładania, pielęgnacji, rejestrowania i elektrycznego stymulowania kultur na MEA. Sieci in vitro dostarczają środków do zadawania fizjologicznie istotnych pytań na poziomie sieci i komórki, co prowadzi do lepszego zrozumienia funkcji i dysfunkcji mózgu.

Jak hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe na matrycach mikroelektrod (MEA)

Ten film pokazuje rozwój hodowli neuronów 3D połączonej z planarnym układem mikroelektrod z neuronami hipokampa. Izolowane neurony tworzą sieć 2D w obszarze aktywnym układu mikroelektrod i przylegają do szklanych mikrokulek w wielodołkowej płytce z wkładką membranową. Po przeniesieniu tych pokrytych neuronami mikrokulek do elektrody, organizują się one w połączoną sieć neuronową 3D.

Budowa trójwymiarowych sieci neuronowych sprzężonych z układami mikroelektrod

Ten film demonstruje procedurę użycia matrycy wieloelektrodowej (MEA) do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D. Metoda ta pozwala zrozumieć dynamikę sieci neuronowych i aktywność impulsów sieci synaptycznych w sferach 3D.

Wykorzystanie matryc wieloelektrodowych do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D

Ten manuskrypt opisuje protokół do budowy in vitro modułowych sieci składających się z przestrzennie ograniczonych, funkcjonalnie połączonych obwodów neuronalnych. Maska polimerowa służy do modelowania warstwy białka w celu promowania adhezji komórkowej nad substratem hodowlanym. Platerowane neurony rosną na pokrytych obszarach, tworząc spontaniczne połączenia i wykazując aktywność elektrofizjologiczną.

Projektowanie, obróbka powierzchniowa, posiewanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów

Przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych eksplantatów neuronów spiralnych myszy na matrycach wieloelektrodowych w celu zbadania profili odpowiedzi neuronalnej i optymalizacji parametrów stymulacji. Takie badania mają na celu poprawę interfejsu neuron-elektroda implantów ślimakowych z korzyścią dla słuchu pacjentów, a także zużycia energii przez urządzenie.

Hodowla eksplantatów neuronów zwojów spiralnych i elektrofizjologia na układach wieloelektrodowych

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Druk 3D w skali mikrometrycznej umożliwia szybkie prototypowanie urządzeń polimerowych do hodowli komórek neuronalnych. Jako dowód słuszności zasady, połączenia strukturalne między neuronami były ograniczane przez tworzenie barier i kanałów wpływających na rozrost neurytów, podczas gdy funkcjonalne konsekwencje takiej manipulacji zaobserwowano za pomocą elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej.

Polimeryzacja dwufotonowa: druk 3D urządzeń do hodowli komórek neuronalnych w mikroskali

Tutaj używamy HD-MEA, aby zagłębić się w dynamikę obliczeniową dużych zespołów neuronalnych, szczególnie w hipokampie, obwodach opuszki węchowej i ludzkich sieciach neuronowych. Uchwycenie aktywności czasoprzestrzennej w połączeniu z narzędziami obliczeniowymi zapewnia wgląd w złożoność zespołu neuronalnego. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć funkcje mózgu, potencjalnie identyfikując biomarkery i metody leczenia zaburzeń neurologicznych.

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych sieci neuronalnych sprzężonych z matrycami mikroelektrod. Technika ta umożliwia zaawansowane rejestracje elektrofizjologiczne w modelu in vitro.

Łączenie kultur neuronalnych 3D z matrycami mikroelektrod: innowacyjny model eksperymentalny in vitro

Przeglądaj więcej filmów