Łączenie kultur neuronalnych 3D z matrycami mikroelektrod: innowacyjny model eksperymentalny in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest przedstawienie nowego modelu trójwymiarowych sieci neuronowych in vitro sprzężonych z układami mikroelektrod. Osiąga się to poprzez pierwsze kondycjonowanie, centralną część MEA zmieszanym roztworem polidelizyny i lamininy, a następnie pokrycie mikrokulek białkami adhezyjnymi, lamininą i polilizyną. Drugim krokiem jest rozprowadzenie zawiesiny poddanych działaniu mikrokulek poddanych działaniu środka na płytce wielodołkowej, gdzie ulegną one samoorganizacji i utworzą jednolitą warstwę.

Trzecim krokiem procedury jest umieszczenie komórek w obszarze aktywnym MEA w gęstości 2000 komórek na milimetr kwadratowy w celu stworzenia sieci neuronowych 2D. Sześć do ośmiu godzin po posiewie zawiesina jest przenoszona z płytek wielodołkowych do MEA, a mikrogranulki mogą się samoorganizować w sześciokątną, zwartą strukturę. Ostatecznie mikroskopia konfokalna jest wykorzystywana do wizualizacji sieci 3D, które są porównywane z konwencjonalnymi sieciami neuronalnymi 2D wyhodowanymi na MEA.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wymiarowe hodowle komórkowe BDI in vitro, jest to, że w modelu wymiarowym BDI somaty i stożki wzrostu są spłaszczone, Andon i wzrost nie mogą rozprzestrzeniać się we wszystkich kierunkach. Ponadto aktywność rozrywająca dominuje w elektrofizjologicznej dynamice sieci wymiarowych BDI, podczas gdy w sieci trójwymiarowej współistnieje również losowa aktywność plamkowania. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy przeczytaliśmy artykuł naukowy Sophie Potto opublikowany w Nature Method w 2008 roku, w którym użyła ona MICROBITS jako rusztowania do budowy trójwymiarowych sieci ne.

Następnie dostosowaliśmy tę metodę do moich potrzeb, aby dokonać pierwszych trójwymiarowych nagrań in vitro. Aby przygotować elastomer PDMS, należy wymieszać utwardzacz i polimer w stosunku objętościowym od jednego do dziewięciu na szalce Petriego. Następnie wstrząśnij mieszaniną i umieść ją w komorze próżniowej na 10 minut, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.

Aby skonstruować wiązanie PDMS, włóż materiał PDMS do starszej formy, a następnie wstaw go do piekarnika na 30 minut w temperaturze 120 stopni Celsjusza. Ograniczenie PDMS powinno mieć kształt walca o średnicy zewnętrznej i wewnętrznej odpowiednio 22,0 i 3,0 milimetrów oraz wysokości 650 mikrometrów w dniu poprzedzającym posiew. Połącz maskę z aktywnym obszarem MEA pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie wysterylizuj maskę PDMS w piekarniku w temperaturze 120 stopni Celsjusza.

Następnie sterylizuj szklane mikrogranulki w stożkowej fiolce z 70% etanolem przez dwie godziny, obracając co 30 minut, aby następnie odsłonić wszystkie mikrogranulki. Usunąć roztwór etanolu z fiolki i dwukrotnie przepłukać mikrogranulki wysterylizowaną wodą. Następnie kondycjonuj środkową część obszaru MEA ograniczoną maską PDMS za pomocą 24 mikrolitrów zmieszanego roztworu polilizyny i lamininy w stężeniu 0,05 mikrograma na mililitr.

Pokryj mikrogranulki białkami adhezyjnymi, laminatem i polilizyną w ilości 0,05 mikrograma na mililitr. Następnie umieść je na noc w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby uzyskać stabilną i długotrwałą sieć neuronalną. Następnie rozprowadź zawiesinę traktowanych mikrogranulek na płytce wielodołkowej za pomocą wkładki membranowej, gdzie same się zorganizują i utworzą jednolitą warstwę.

Następnie napełnij każdą studzienkę membrany 0,5 mililitra pożywki. Umieść go w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż neurony będą gotowe do posiewu na tym etapie. Po złożeniu w ofierze ciężarnej samicy szczura E 18 należy pobrać zarodki szczura, a następnie usunąć hipopotama campi z każdego zarodka szczura.

Umieść je w lodowatym Hanksie. Zrównoważyć roztwór soli bez wapnia i magnezu. Następnie zdysocjuj tkankę w 0,125% roztworu tryiny Hanksa zawierającego 0,05% DNA przez 18 do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie usunąć supernatant za pomocą pipety peor. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając pożywkę z 10% FBS na pięć minut. Następnie usuń pożywkę za pomocą FBS i przemyj raz pożywką wzrostową, jej suplement 1% L-glutaminy i Gentamycyny w ilości 10 mikrogramów na mililitr.

Następnie usuń pożywkę. Napełnij go ponownie 500 mikrolitrami wzrostu. Średni. Jego suplement 1% L-glutamina i gentamycyna w ilości 10 mikrogramów na mililitr.

Mechanicznie rozdzielić osad tkankowy za pomocą wąskiej pipety PEs, aż do uzyskania mlecznej zawiesiny komórek. Następnie rozcieńczyć niewielką objętość zawiesiny komórek pożywką wzrostową, aby uzyskać końcową objętość 2,0 mililitra. Policz uzyskane stężenie komórkowe za pomocą komory hemocytometru.

Następnie rozcieńczyć to stężenie w stosunku od jednego do pięciu, aby uzyskać pożądane stężenie komórek od 600 do 700 komórek na mikrolitr. Umieść komórki w gęstości 2000 komórek na milimetr kwadratowy w obszarze aktywnym MEA zdefiniowanym przez ograniczenie PDMS, aby utworzyć sieć neuronową 2D. Następnie umieść urządzenie MEA w inkubatorze z 5% nawilżoną atmosferą dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby zakończyć wstępny etap budowy hodowli 3D, należy rozprowadzić 160 mikrolitrów zawiesiny o stężeniu komórek od 600 do 700 komórek na mikrolitr na powierzchnię monowarstwy mikrogranulek umieszczonej wewnątrz płytek wielodołkowych. Następnie umieść płytki wielodołkowe w inkubatorze z 5% nawilżoną atmosferą dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza, sześć do ośmiu godzin po posiewie, przenieś od 30 do 40 mikrolitrów zawiesiny z mikrogranulkami i neuronami do obszaru MEA ograniczonego ograniczeniem PDMS. Po każdym przeniesieniu odczekaj około pół minuty, aby mikrogranulki mogły się samozorganizować w sześciokątną strukturę.

Po osadzeniu wszystkich warstw i spontanicznym złożeniu w 300 mikrolitrach pożywki na powierzchni ograniczonej ograniczeniem PDMS. Umieść strukturę 3D sprzężoną z MEA w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki wzrostowej z jej suplementem po trzech tygodniach in vitro, struktura 3D jest stabilna również bez pokazanego ograniczenia PDMS.

Poniżej znajduje się obraz DIC przedstawiający pojedynczą warstwę koralików sprzężoną z powierzchnią MEA. Położenie czarnych kropek reprezentuje układ przestrzenny elektrod. Barwienie immunofluorescencyjne dla mapy drugiej, które jest odbite przez czerwony sygnał, wyświetla rozkład arboryzacji dendrytycznej i ADA neuronów wokół mikrokulek bezpośrednio sprzężonych z płaszczyzną elektrody MEA.

Ten obraz pokazuje maksymalną projekcję sekwencji Zacka kultury 3D, pokazując wysoce połączoną sieć, w której neurony są znakowane dla nowego N wyrażonego w dojrzałych neuronach postmitotycznych. A dla gaba, oto reprezentatywny zapis elektrofizjologiczny sieci hipokampa w konfiguracji 3D. A oto reprezentatywny zapis elektrofizjologiczny sieci hipokampa w konfiguracji 2D.

Po opanowaniu tę procedurę można wykonać w ciągu siedmiu godzin. Warto jednak zauważyć, że z uwagi na fakt, że zabieg składa się z kilku etapów, które zostały wykonane w ciągu różnych dni, oszacowanie czasu realizacji całej procedury jest jedynie wskazówką. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby najpierw nałożyć warstwę 2D środka moczopędnego neuronów na elektrodę mea, a następnie bardzo ostrożnie przenieść zawiesinę mikrobitów i neuronu z płytki wielodołkowej do mea, aby zrealizować strukturę 3D po jej opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neuronauką obliczeniową do zbadania, w jaki sposób łączność sieciowa może kształtować powstającą dynamikę sieci. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbudować trójwymiarową sieć neuronalną in vitro sprzężoną z układami mikroelektrod.