Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zidentyfikowanie toksyczności mitochondrialnej lub korzystnego działania leków z wykorzystaniem organizmu modelowego. C elegancja. Osiąga się to poprzez ilościowe oznaczanie in vivo poziomów TP w transgenicznych szczepach Sea Elgan, które wyrażają enzym krzyżowy świetlika połączony z białkiem zielonej fluorescencji.

Gen fuzyjny nadaje nicieniom dwie odrębne właściwości. Po pierwsze, po podaniu substratu Lucyfera, nicienie emitują światło w zakresie widzialnym proporcjonalnie do swoich komórkowych rezerw A TP. A po drugie, po oświetleniu odpowiednią długością fali, będą wykazywać silną zieloną fluorescencję.

Fluorescencja jest niezależna od poziomu nicieni a TP i jest proporcjonalna do ich masy lub liczby. Dlatego może być stosowany do normalizacji pomiarów bioluminescencji. Podczas typowego testu populacja zsynchronizowanych rozwojowo robaków jest hodowana do stadium larwalnego L cztery.

Nicienie są następnie traktowane badanymi związkami leczniczymi przez pewien czas przed pomiarem zarówno fluorescencji, jak i bioluminescencji. Wyniki wskazują na potencjalną toksyczność leku. Gdy bioluminescencja jest zmniejszona, wzmocniony sygnał wskazuje na trafienie w celu przeprowadzenia dalszych badań pod kątem korzystnego wpływu na funkcję mitochondriów.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak badania przesiewowe leków na hodowanych komórkach, jest to, że badania przesiewowe są przeprowadzane w kontekście fizjologicznym całego żywego organizmu wielokomórkowego z blisko 50% genetyką okulistyczną u ludzi. I podobnie jak ludzie, elegancja w rzeczywistości wymaga mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej, aby rozwinąć się w dorosłość, a jej mitochondria mają również wiele cech wspólnych z mitochondriami ssaków pod względem ich struktury, funkcji, bioenergetyki Parametry krytyczne w protokole obejmują etap rozwoju, w którym ekspozycje zainicjowały długość ekspozycji na nicienie, do interesującego leku i wysiewu podobnej liczby nicieni do każdej ze studni i oczywiście unikania zanieczyszczenia pierwszego dnia. W sterylnych warunkach przenieś nicienie z jednej sześciocentymetrowej pożywki do hodowli nicieni w dwóch mililitrach kompletnej pożywki S do kolby z 30 gramami na litr e. coli.

OP 50 w kompletnym pożywce S, następnie inkubować kolbę z wytrząsaniem w czwartym dniu, wybielać kulturę nicieni GR w celu zebrania jaj i zsynchronizowania populacji robaków. Następnie inkubuj jaja przez noc w szklanej kolbie zawierającej 15 mililitrów kompletnej pożywki S z potrząsaniem następnego dnia, piątego dnia, nicienie będą na tym samym etapie wzrostu. Aby określić liczbę wyklutych robaków za pomocą czystej końcówki za każdym razem, przenieś trzy 100-mikrolitrowe porcje nicieni do oddzielnych mikroprobówek zawierających 900 mikrolitrów pożywki, uzupełnionych 0,01% tween 20, pipetując kilka razy w górę iw dół, aby uwolnić wszelkie robaki przylegające do końcówki.

Następnie policz nicienie w czterech oddzielnych kropelkach o pojemności 10 mikrolitrów z każdej z potrójnych probówek rozcieńczających i oblicz objętość zawiesiny nicieni wymaganej do założenia dwóch 20-mililitrowych kultur z 10 nicieniami na 10 mikrolitrów, zdekantuj przybliżone objętości do dwóch wstępnie zważonych 15-mililitrowych stożkowych probówek. Zważyć probówki, aby określić rzeczywistą dozowaną objętość. Następnie, aby wyregulować objętość docelową, delikatnie wiruj i usuń nadmiar objętości.

Teraz umyj nicienie w sumie 14 mililitrach świeżego S, kompletną pożywkę na probówkę i ponownie zawieś granulki w pięciu mililitrach kompletnego podłoża S z 30 gramami na litr równegoi. OP 50. Przenieść nicienie do stożkowych szklanych kolb zawierających 15 mililitrów S wraz z 30 gramami na litr równości.

OP 50 do całkowitej objętości 20 mililitrów na kolbę i rejestrować czas karmienia. Uśrednić liczbę nicieni w dziewięciu 10-mikrolitrowych kropelkach, aby potwierdzić, że kultury są rozcieńczone do 10 nicieni na 10 mikrolitrów. Umieść kultury w inkubatorze na 42 do 44 godzin.

Siódmego dnia wciągnij kultury nicieni do jednej kolby, ciągle delikatnie obracając. Następnie przenieś trzy, cztery mililitrowe porcje nicieni do jednego 60-mililitrowego sterylnego koryta. Użyj ośmiokanałowej pipety do Eloqua, 25 mikrolitrów zawieszonych nicieni na studzienkę do 96.

Dobrze czarne płytki do mikromiareczkowania z płaskim, przezroczystym dnem. Następnie włóż pokrywki z powrotem na talerze i odłóż talerze na bok. Za każdym razem, gdy dwie płytki zostaną wysiane, przenieś kolejne dwie 2,5 mililitra porcji nicieni do koryta, aby zastąpić utraconą objętość.

Po wysianiu od 13 do 14 płytek z nicieniami, dodaj 74 mikrolitry kompletnego podłoża S do każdej studzienki i przenieś płytki do wilgotnej komory i inkubatora wstrząsającego do czasu podania leku, podczas gdy płytki się trzęsą. Rozmrozić 2 96 spawanych płytek lekowych do testów. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej i za każdym razem zmieniając końcówki.

Przenieść jeden mikrolitr z pierwszej kolumny pierwszej płytki leku do kolumn od pierwszej do piątej płytki z nicieniami. Przenieś kolejny mikrolitr z drugiej kolumny płytki z lekiem do kolumn od ósmej do dwunastej płytki z nicieniami. Następnie dodać jeden mikrolitr pojazdu do kolumn szóstej i siódmej płytki nicienia.

Użyj pozostałych kolumn w tabliczce leku, aby potraktować resztę płytek z nicieniami w ten sam sposób, upewniając się, że zawierają one również dwie płytki poddane działaniu wszystkich nośników. Następnie umieść wszystkie płytki z powrotem w wilgotnych komorach w inkubatorze z wytrząsaniem na kolejne 20 do 22 godzin w ósmym dniu. Aby przygotować tło płytki kontrolnej do odczytów fluorescencji, należy połączyć zawartość studzienki z płytki dla nicieni poddanych działaniu całego nośnika i pozostawić nicieniom na dwie do trzech minut.

Następnie zbierz bakterie zawierające snat i załaduj 100 mikrolitrów próbek do każdej studzienki czarnej mikropłytki z przezroczystym dnem. Obserwuj płytkę pod mikroskopem, zwracając uwagę na studzienki, w których można zobaczyć nicienie, aby umożliwić wykluczenie tych studzienek z oszacowania tła fluorescencyjnego. Następnie na koniec odczytaj fluorescencję, aby zmierzyć bioluminescencję dla każdej płytki.

Z kolei każdemu z nich dozuj 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu luminescencyjnego, dobrze umieść płytkę na platformie wstrząsającej i uruchom minutnik po trzech minutach. Odczytaj luminescencję co jedną sekundę na pomiar. W tym pierwszym reprezentatywnym eksperymencie, zgnilizna znana jako inhibitor mitochondrialnego kompleksu jeden, zmniejszyła emitację światła przez nicienie zarówno po stosunkowo krótkiej, jak i dłuższej ekspozycji w zakresie stężeń.

W tym eksperymencie wykazano, że parakwat herbicydu znacznie zmniejsza bioluminescencję fluorescencji GFP i normalizuje bioluminescencję szczepu C PE 2 54. Co więcej, spadek bioluminescencji był większy niż fluorescencji, co jest zgodne ze znanymi skutkami zmniejszonej funkcji mitochondriów i zmniejszonej produkcji TP wywołanej przez lek. Ten wykres ilustruje przykład związku, który zwiększa bioluminescencję nicieni, pośredni szczawiooctan cyklu kwasu cytrynowego w pojedynczym stężeniu ośmiu milimolów.

Zauważ, że eksperymentalna zmienność obserwowana między tymi powtórzeniami nie jest niczym niezwykłym dla eksperymentów opartych na Lucyferze. W tym przypadku zaobserwowano, że związki hamujące lucyferazy świetlików wpływają na aktywność lucyferów in vitro przy 25 mikromolach i 100 mikromolach z prawie całkowitym osłabieniem aktywności przez związek DDD. 1, 4 3 4, chociaż nie jest to bezpośrednio porównywalne, znaczny spadek bioluminescencji zaobserwowano również po leczeniu związkiem hamującym Lucyfer in vivo.

Wykazanie, że zmiany w bioluminescencji mogą wynikać z działania inhibitorów enzymu Lucyfer, a nie ze zmian w poziomach TP A in vivo. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że związki mogą wpływać na aktywność enzymu lucyferazy świetlika bezpośrednio, a nie wpływać na stan energetyczny robaka. W związku z tym podtemperatury mogą być walidowane przy użyciu wielu technik oceny funkcji mitochondriów, takich jak na przykład określanie zużycia tlenu, określanie potencjału błony mitochondrialnej reaktywnych form tlenu lub wizualizacja mitochondriów w szczepach o morskiej elegancji.

Ze znacznikiem GFP, mitochondria.