Name: Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Poznaj metodę przesiewowego testu in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans. Technika umożliwia identyfikację związków o działaniu toksycznym lub korzystnym dla mitochondriów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Davidowi Grayowi z Dundee Drug Discovery za uprzejme przekazanie związków hamujących lucyferazy świetlika DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 i DDD00023047; Tiborowi Harkani (Uniwersytet Medyczny w Wiedniu) za propozycję szczawiooctanu jako związku testowego; oraz Charlie Dear (University of Aberdeen) za ilustracje. Praca ta została sfinansowana przez BBSRC Pathfinder Award (BB/FOF/PF/4/11) oraz Uniwersytet w Aberdeen.

UWAGA: Wszystkie kroki należy wykonywać w sterylnych warunkach (komora z przepływem laminarnym) i przy użyciu wstępnie wysterylizowanych materiałów (autoklawując w 126 °C, 11 min). Wymagana jest płytka LB z prążkowanymi E. coli OP50 przechowywana w temperaturze 4 °C, rozsypana na świeże płytki LB i ponownie paskowana co miesiąc.
1. Pokarm bakteryjny (Escherichia coli OP50) Przygotowanie
<ol>
	<li>Dzień 1. Zaszczepić 2 x 5 ml LB w dwóch uniwersalnych butelkach pojedynczą kolonią E. coli OP50 i umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C (220 obr./min) na 8 godzin.</li>
	<li>Po 8 godzinach inkubacji użyć 2 ml kultury E. coli OP50 LB do zaszczepienia każdej z 3 x 200 ml LB. Umieścić kolby w inkubatorze z wytrząsaniem (220 obr./min) O/N (17 godz.) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zważyć 20 probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i zapisać wagę na probówce.</li>
	<li>Dzień 2. Za pomocą pipety serologicznej podsycić 30 ml kultury O/N E. coli OP50 do wstępnie zważonych probówek wirówkowych. Wirować przy 7 741 x g, 10 °C, 8 min.</li>
	<li>Ostrożnie zdekantować supernatant, trzymać probówkę odwróconą pokrywką i odstawić na kilka minut. Za pomocą pipety usunąć nadmiar supernatantu, który mógł zebrać się w pokrywce. Zważ rurkę i oblicz wagę granulki.</li>
	<li>Obliczyć objętość potrzebną do uzyskania zawiesiny 30 g/l i zaznaczyć tę objętość na probówce. Opatrzyć datą, oznaczyć i umieścić probówki w temperaturze -20 °C do użytku w ciągu 1-3 miesięcy lub w temperaturze -80 °C w przypadku przechowywania dłuższego niż 3 miesiące.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę bakteryjną do hodowli nicieni; pozostawić osad bakteryjny do rozmrożenia i dodać wymaganą objętość kompletnego podłoża S11,12 do każdej probówki, delikatnie zwirować, aby ponownie zawiesić osad, zebrać zawartość różnych probówek, aby uzyskać wymaganą objętość. Praca w sterylnych warunkach.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wzorców leków w formacie płytki 96-dołkowej
UWAGA: Jeśli korzystasz z biblioteki leków, tabliczki z lekami są dostarczane przy pojedynczym stężeniu związku w DMSO. Podstawowe badania przesiewowe będą testować związki w pojedynczym stężeniu. Poniżej znajdują się instrukcje dotyczące przygotowania płytki leku do potwierdzającego badania związku w zakresie stężeń w zakresie 0-160 μM, wybranych po istotności statystycznej przy 10 μM. Poniższe kroki można dostosować do testowania innych stężeń.
UWAGA! Przestrzegaj niezbędnych środków ostrożności podczas obchodzenia się z narkotykami (zazwyczaj wymagana jest maska na twarz, okulary ochronne, rękawice).
<ol>
	<li>Przygotować tabliczkę z roztworem mechanicznym do potwierdzającego badania przesiewowego: zważyć wymaganą ilość związku do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml i przygotować 16 mM związku w DMSO (tj. 100 razy skoncentrowany w stosunku do pożądanego stężenia górnego do ekspozycji).</li>
	<li>Seryjnie rozcieńczać 16 mM zapasu 1:2 w DMSO, aby uzyskać wzorce 8, 4, 2, 1, 0,5 i 0,25 mM (warunki sterylne). Są one 100-krotnie skoncentrowane i zostaną rozcieńczone do końcowych stężeń 0 (tylko nośnik), 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 i 160 μM (w 1% DMSO) podczas ekspozycji na lek</li>.
	<li>W komorze z przepływem laminarnym umieścić 20-50 μl na studzienkę wzorców związków w kolumnie 96-dołkowej płytki, na przykład pozycja płytki A1: 16 mM, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: 0,25 mM leku i H1: DMSO. Używaj różnych kolumn do rozcieńczania serii różnych leków.</li>
	<li>Podwielokrotność nośnika do studzienek w kolumnie 12 na tabliczce leku. 
	UWAGA: Ułatwi to badanie kolumn sterowniczych pojazdu w dół oprócz badania wzdłuż rzędu H, zapewniając, że pojazd jest badany w pozycjach reprezentatywnych dla całej tablicy. 
	UWAGA: Każda tabliczka leku do potwierdzających badań przesiewowych zawiera serię rozcieńczeń dla maksymalnie 11 różnych leków, które mają być badane, plus kontrola pojazdu.</li>
	<li>Oznaczyć etykietą i uszczelnić płytkę, przykryć folią i umieścić w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie to wymagane.</li>
</ol>
3. Eksperymenty z nicieniami
UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w sterylnych warunkach, aseptycznie i przy użyciu wstępnie wysterylizowanych materiałów i odczynników. Rutynowo utrzymuj szczepy C. elegans na płytkach NGM z E. coli OP50. 12 Sugerowane terminy poszczególnych etapów protokołu przedstawiono w tabeli 1.
<ol>
	<li>Zadanie dnia 1: skonfigurowanie płynnej kultury szczepu biosensora do późniejszej synchronizacji.
	<ol>
		<li>Pobrać nicienie z jednej płytki NGM o średnicy 6 cm (z dużą ilością młodych larw, w miejscach, gdzie właśnie skończył się pokarm) w 2 ml S complete i przenieść do kolby z 30 g/l E. coli OP50 w S complete (całkowita objętość 30 ml w stożkowej szklanej kolbie o pojemności 250 ml). Inkubować przez 3 dni w temperaturze 20 °C, 160 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zadanie dnia 4 (odczekaj około 30-35 minut): kultura wybielania w celu zebrania jaj i zsynchronizowania populacji robaków. Przeprowadzaj wszystkie etapy wirowania przez 1 min, 600 x g.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór wybielacza tuż przed użyciem: do każdych 16 ml 0,156 M KOH/NaOH dodaj 4 ml wybielacza.</li>
		<li>Wlać 2 x 14 ml kultury robaków do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Pozwól robakom osiąść grawitacyjnie (3 min). Usuń i wylej płyn powyżej osiadłych nicieni. Dodaj 5 ml roztworu wybielacza do każdej probówki i uruchom minutnik. Połącz objętości w jedną probówkę.</li>
		<li>Delikatnie odwróć probówkę przez 2 minuty, sprawdź pod stereoskopem, czy robaki się rozbiły i czy jaja zostały uwolnione do zawiesiny. Gdy większość jaj zostanie uwolniona lub w maksymalnym czasie 2 minut w roztworze wybielacza, odwirować.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant. Przemyć granulat 1x 14 ml S complete i odwirować.</li>
		<li>Odrzuć supernatant, dodaj 10 ml roztworu wybielacza i uruchom timer (ten drugi etap wybielania zapewnia, że większość tusz robaków rozpada się i nie jest już widoczna w stereoskopie). Po maksymalnym czasie w roztworze wybielacza wynoszącym 2 minuty odwirować.</li>
		<li>Po każdym odwirowaniu przemyć granulat 3x in S, delikatnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 14 ml S complete. Po ostatnim umyciu ponownie zawiesić granulki jaj w 14 ml S complete.</li>
		<li>Przenieść objętość do stożkowej szklanej kolby. Inkubować 18-24 godziny w temperaturze 20 °C, 160 obr./min. 
		UWAGA: Zebrane jaja wykluwają się O/N i zatrzymują rozwój w pierwszym stadium larwalnym (L1) z powodu braku pożywienia, stąd wszystkie będą na tym samym etapie wzrostu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zadanie dnia 5: skonfiguruj zsynchronizowane kultury robaków do testów leków. 
	UWAGA: Robaki zawieszone w pożywce głodowej mają tendencję do przylegania do hydrofobowych powierzchni z tworzywa sztucznego, takich jak końcówki do pipet i rurki. 0,01% tween-20 jest środkiem powierzchniowo czynnym stosowanym tutaj w celu nadania powierzchniom tworzyw sztucznych bardziej hydrofilowego charakteru i umożliwienia większej dokładności liczenia (można również użyć 0,01% trytonu-X100). Kiedy nicienie znajdują się w pożywce z dodatkiem bakterii, nie mają tendencji do przyklejania się do plastiku.
	<ol>
		<li>Określić liczbę wyklutych L1 w kolbie, trzymać kolbę na platformie wytrząsającej (160 obr./min).
		<ol>
			<li>Pobrać 3 próbki po 100 μl z kolby (za każdym razem używać czystej końcówki) do oddzielnych mikroprobówek o pojemności 1,7 ml z 900 μl płynnego podłoża 0,01% Tween-20, 
			UWAGA: Wsuń 100 μl próbki do czystej końcówki tylko raz. Następnie, podczas dozowania, należy kilkakrotnie pipetować w górę i w dół do podłoża uzupełnionego z kwecinami, aby uwolnić wszelkie robaki przylegające do końcówki.</li>
			<li>Policz nicienie w 4 kropelkach po 10 μl z każdej probówki do trzykrotnego rozcieńczenia. Obliczyć wartość średnią i oszacować liczbę robaków obecnych w stożkowej szklanej kolbie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obliczyć objętość wyklętej zawiesiny nicieni wymaganą do założenia kultury o pojemności 2 x 20 ml z 10 nicieniami na 10 μl. Zwiększyć obliczoną objętość o 10 %, aby uwzględnić pewną późniejszą utratę nicieni podczas etapów wirowania.</li>
		<li>Wymagana objętość dekantacji do 2 probówek wirówkowych o pojemności 15 ml (wstępnie zważonych). Zważyć probówki, aby uzyskać rzeczywistą objętość, delikatnie wymieszać i dostosować do objętości docelowej, usuwając nadmiar objętości za pomocą pipety o pojemności 5 ml (tylko sterylna końcówka powinna wejść do probówki).</li>
		<li>Uzupełnić objętość do 14 ml świeżym płynem S complete do przemywania nicieni. Wirówka (1 min, 600 g). Usunąć i wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu nicieni.</li>
		<li>Dodać 5 ml S w komplecie z 30 g/l E. coli OP50 do granulowanych nicieni. Przenieść 5 ml z każdej probówki do stożkowej szklanej kolby zawierającej 15 ml S wraz z 30 g/l E. coli OP50. Zanotuj czas, w którym nicienie po raz pierwszy zostały zaopatrzone w pożywienie.</li>
		<li>Delikatnie wstrząsnąć kolbą (160 obr./min), pobrać 9 kropelek po 10 μl na szkiełka mikroskopowe (za każdym razem używać świeżych końcówek), aby policzyć nicienie i potwierdzić średnią około 10 (±2) na 10 μl.</li>
		<li>Umieścić kolby nicieni w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 20 °C, 160 obr./min przez 42-44 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zadanie dnia 7: przenieś nicienie do 96 płytek dołkowych i rozpocznij ekspozycję na lek.
	<ol>
		<li>Połączyć kultury nicieni w jednej kolbie, delikatnie obracać kolbą i umieścić 3 x 4 ml kultury nicieni w sterylnym korycie o pojemności 60 ml. Umieść koryto na platformie wigrowającej (160 obr./min).</li>
		<li>Za pomocą pipety 8-kanałowej należy podać 25 μl zawieszonych nicieni na dołek 96-dołkowych czarnych płytek do mikromiareczkowania z płaskim przezroczystym dnem (do pomiaru zarówno luminescencji, jak i fluorescencji; lub białych płytek tylko do luminescencji). Przykryj pokrywką talerza i odłóż na bok.
		<ol>
			<li>Po ustawieniu każdych 2 płytek umieść kolejne 2 x 2,5 ml nicieni w korycie, aby zastąpić utraconą objętość (utrzymuj "martwą objętość" w korycie około 7 ml).</li>
			<li>Ustaw 13/14 płytek z nicieniami. Do przetestowania dwóch 96-dołkowych płytek z lekiem potrzebnych będzie 11 płytek z nicieniami. Dwunasta płytka nicienia zostanie załadowana wyłącznie pojazdem jako kontrola. Trzynasta płytka zostanie użyta do ustalenia fluorescencji tła w dniu 8 (patrz poniżej). Można przygotować dodatkową płytę do użycia w przypadku wystąpienia błędów podczas konfiguracji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Porcję 74 μl siarki uzupełnić do każdej studzienki i umieścić na płytce w wilgotnej komorze (patrz wykaz materiałów) w inkubatorze do wytrząsania (20 °C, 160 obr./min) do momentu, gdy będzie gotowa do podwielokrotnienia badanych związków w ustalonym wcześniej czasie rozwoju (np. 45 godzin 30 minut po dostarczeniu pokarmu). [Objętość na studzienkę wynosi teraz 99 μl].</li>
		<li>Rozmrozić płytkę (płytki) z lekiem do przetestowania.</li>
		<li>Użyj pipety wielokanałowej, aby ustawić płytki nicieni z lekiem, zmieniając końcówki za każdym razem. Odczekać 5 minut na płytkę 96-dołkową do porcjowania leku.
		<ol>
			<li>Pobrać 1 μl z 1. kolumny płytki leku i dodać do kolumn 1-5 płytki zawierającej nicienie; powtórzyć od 2. kolumny płytki z lekiem do kolumn 8-12 płytki zawierającej nicienie. Dodać 1 μl nośnika do kolumn 6 i 7 płytki dotyczącej nicieni. 
			UWAGA: Całkowita objętość na studzienkę w płytce nicienia wyniesie 100 μl, co spowoduje rozcieńczenie związku/nośnika w stosunku 1:100.</li>
			<li>Powtórzyć proces, dodając 1 μl 3/4 kolumny płytki z lekiem do kolumn 1-5/8-12 drugiej płytki z nicieniami; dodać nośnik do kolumn 6 i 7 płytki z nicieniami.</li>
			<li>Kontynuuj testowanie pozostałych kolumn z płytką leku. Umieścić co najmniej jedną tabliczkę z nicieniami z nośnikiem we wszystkich studzienkach, pobierając próbki z kolumny 12 tabliczki dotyczącej leku. Umieść płytki z powrotem w wilgotnych komorach w inkubatorze z wytrząsaniem (20 °C, 160 obr./min) na 20-22 godziny (patrz uwaga dla dnia 8).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Częściowo przygotuj bufor luminescencyjny na następny dzień: dodaj DMSO i 10% Triton-X-100 do wymaganej objętości S complete, aby uzyskać 1% DMSO i 0,15% Triton X-100. Odczekać, aby 5 ml na płytkę odczytać pod kątem luminescencji, plus 1 ml na zalewanie wtryskiwacza luminometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zadanie dnia 8: Odczyt eksperymentalnych punktów końcowych — fluorescencji i bioluminescencji. (Odczyty fluorescencji GFP są zalecane jako sposób na normalizację danych bioluminescencyjnych). 
	UWAGA: Należy dążyć do odczytania punktów końcowych do 66-67 godzin po podaniu nicieniom pokarmu, aby zapobiec znaczącej produkcji potomstwa w opisanych warunkach doświadczalnych.
	<ol>
		<li>Skonfiguruj płytę, która będzie używana jako kontrolka tła dla odczytów GFP. Połączyć zawartość studzienki z 13. płytki do probówki o pojemności 15 ml. Pozwól nicieniom się uspokoić (2-3 min). Użyć supernatantu, aby załadować mikropłytkę (czarną z przezroczystym dnem) ze 100 μl zawiesiny bakteryjnej na studzienkę.
		<ol>
			<li>Obserwuj płytkę kontrolną tła pod mikroskopem, notując dołki, w których można zobaczyć nicienie. Należy je wykluczyć z szacunków tła wykorzystywanych w późniejszej analizie danych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odczytaj fluorescencję każdej płytki 96-dołkowej, w tym kontrolę tła. (Ustawienia: optyka od spodu płyty; filtry 485/20 wzbudzenie; emisja 528/20.)</li>
		<li>Przygotuj bufor do odczytów luminescencji: dodaj lucyferynę (20 mM) do częściowo przygotowanego buforu (z poprzedniego dnia), aby otrzymać bufor luminescencyjny z 1% DMSO (1x), 0,15% Triton-X100 (3x) i 0,3 mM lucyferyny (3x). Główny wtryskiwacz luminometru 6x z buforem luminescencyjnym 150 μl.
		<ol>
			<li>W poprzednim kroku założono 1% DMSO jako nośnik podczas ekspozycji na lek. Gdy nośnikiem jest woda, dostosuj stężenie DMSO w buforze luminescencyjnym do 3% (tj. 3x).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pracuj z jedną płytą na raz. Dozować 50 μl buforu luminescencyjnego na dołek. (150 μl objętości końcowej w studzience; 3x rozcieńczenie buforu luminescencyjnego: 1% DMSO, 0,05% Triton-X100 i 0,1 mM końcowe stężenia lucyferyny.) Umieść natychmiast na platformie do wytrząsania i uruchom timer.
		<ol>
			<li>Po 3 minutach na platformie wibracyjnej (160 obr./min) odczytaj luminescencję (1 s na pomiar).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Odejmij średni odczyt tła GFP od wyników fluorescencji. Podziel bioluminescencję przez odpowiedni odczyt GFP.
	<ol>
		<li>W przypadku wykrycia wysokiej wartości GFP dla nicieni narażonych na działanie związku, należy zmierzyć fluorescencję samego związku, aby uwzględnić fluorescencję związku. Jeśli jest wyższa niż średnia, użyj tego jako tła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyraź bioluminescencję, znormalizowane dane dotyczące bioluminescencji GFP i fluorescencji GFP jako procent średniej wartości kontroli pojazdu na każdej tablicy.</li>
	<li>Wykreślić wartości średnie i słupki błędów dla każdego stężenia.</li>
	<li>Przetestuj istotność statystyczną za pomocą dwukierunkowej analizy wariancji (ANOVA) z efektami "Koncentracji", "Eksperymentu" i ich interakcji (każdy punkt danych odnosi się do pojedynczego dołka), a następnie użyj testu Dunnetta jako testu post hoc (w porównaniu z kontrolą pojazdu). 
	UWAGA: Jeśli warunki "eksperymentu" lub "interakcji" są znaczące, mogą być konieczne dalsze eksperymenty w celu potwierdzenia odpowiedzi. W przypadku gdy brak jest oczywistej zmienności między doświadczeniami na podstawie obserwacji wykresów danych, jednoczynnikową ANOVA można przeprowadzić na zbiorczych danych z niezależnych eksperymentów.
	<ol>
		<li>Do celów analizy statystycznej płytki (płytek) tylko z nośnikiem należy wybrać wszystkie studzienki w kolumnach 6 -7 i wszystkie studzienki w wierszu H jako grupę kontrolną (są to pozycje rutynowo przypisywane nośnikowi podczas badania złożonego).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+phenotypic+gap%3A+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7(2008).</li>
<li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans%2C+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li>
<li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503(2012).</li>
<li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li>
<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobacco-specific+nitrosamine+4-%28methylnitrosamino%29-1-%283-pyridyl%29-1-butanone+%28NNK%29+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li>
<li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content%2C+transcription%2C+ATP+production%2C+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9(2013).</li>
<li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li>
<li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-11 (2006).</li>
<li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li>
<li>Lagido, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLagido%2C+C+%22Nematodes+as+environmental+indicators%22">Nematodes as environmental indicators</a>. Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. , CABI. 225-251 (2009).</li>
<li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+in+chemical+biology%3A+a+compendium+of+inhibitors%2C+mechanistic+evaluation+of+chemotypes%2C+and+suggested+use+as+a+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li>
<li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li>
<li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li>
<li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li>
<li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Phys+A%22%5BJournal%5D)">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li>
<li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li>
<li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877(2013).</li>
<li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7%2C+two+major+components+of+the+hypodermis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li>
<li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li>
<li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li>
<li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li>
<li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress%3A+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+Grow+or+Not+to+Grow%3A+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li>
<li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li>
<li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li>
<li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Soc+Test+Mater%22%5BJournal%5D)">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li>
<li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH%2C+salinity%2C+and+hardness+in+aquatic+media%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Environ+Con+Tox%22%5BJournal%5D)">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li>
<li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li>
<li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biol%22%5BJournal%5D)">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Organizm modelowy C. elegans stanowi potężny system doświadczalny. Jest łatwy w hodowli i daje obfite, genetycznie identyczne potomstwo o 3,5-dniowym cyklu życiowym od jaja do rozrodu dorosłego (poprzez młode stadia larwalne od L1 do L4). Ze względu na niewielkie rozmiary można ją wygodnie uprawiać na 96-dołkowych płytkach, co ułatwia przesiewanie złożone. Przedstawiamy fenotypowy protokół badań przesiewowych oparty na szczepach C. elegans , które działają jak czujniki poziomu energii in vivo . 14 Protokół ma zastosowanie do każdego laboratorium, chociaż wymagany jest luminometr na 96-dołkowej płytce i sterylna szafka. Ważne jest, aby zapobiegać zanieczyszczeniu w testach poprzez stosowanie dobrej techniki laboratoryjnej. W przypadku pracy ręcznej maksymalna możliwa do osiągnięcia liczba płytek z nicieniami wynosi 13 na eksperyment, co pozwala na przetestowanie 2 96-dołkowych płytek z lekiem i w tym dwóch płytek z nośnikiem. Przedstawiono reprezentatywne wyniki dla inhibitora mitochondrialnego kompleksu I rotenonu, generatora ponadtlenkowego parakwatu, pośredniego szczawiooctanu cyklu kwasu cytrynowego oraz czterech związków o znanej aktywności hamującej lucyferazy świetlika. Pierwsze dwa związki doprowadziły do spadku bioluminescencji zgodnie z przewidywaniami, podczas gdy szczawiooctan doprowadził do wzmocnienia, co prawdopodobnie wynikało z większego wytwarzania ATP. Zestawy danych szczawiooctanu wykazują również wewnętrzną zmienność w eksperymentach opartych na lucyferazy świetlików jako reporterze. Zaleca się przeprowadzenie co najmniej trzech niezależnych eksperymentów w celu ustalenia odporności reakcji na nieznane związki.
Hamowanie aktywności lucyferazy świetlików można było zidentyfikować za pomocą testu in vitro przy użyciu komercyjnego zestawu. 3 Jeden ze związków spowodował znaczny wzrost fluorescencji GFP, co jest zgodne z inhibitorem zwiększającym poziomy lucyferazy świetlika znakowanej GFP poprzez wiązanie się z miejscem aktywnym enzymu lucyferazy i czynienie go bardziej stabilnym. 15 W niektórych przypadkach (nie w tym konkretnym przypadku) może to prowadzić do zwiększonego poziomu bioluminescencji, gdy inhibitor jest wypierany przez nadmiar substratu. 15 Dlatego ważne jest, aby nie interpretować błędnie wyników dotyczących związków, które wchodzą w interakcje z enzymem świetlika, jako obniżonych lub zwiększonych poziomów ATP/funkcji mitochondriów. Zmiany sygnału luminescencji dość często korelują z dodatkowymi pomiarami zdrowia, takimi jak ruch, rozwój i wzrost. Na przykład związek jest podejrzanym inhibitorem lucyferazy, jeśli wykryty zostanie dramatyczny spadek sygnału bioluminescencji, ale robaki są nie do odróżnienia od kontroli przez obserwację mikroskopową. Wzrost fluorescencji GFP, niewyjaśniony wzrostem lub autofluorescencją złożoną, może również wskazywać na inhibitor. Znanych jest wiele inhibitorów lucyferazy15, które zostały wprowadzone do PubChem. Dlatego w pierwszej kolejności dobrą praktyką jest zapoznanie się z informacjami na temat inhibitorów lucyferazy będącymi w posiadaniu PubChem; następnie przeprowadza się badanie skutków złożonych w testach in vitro z użyciem oczyszczonegoenzymu3 i/lub potwierdzenie wpływu na funkcję mitochondriów za pomocą dodatkowych środków. Pytania z dnia 16,17 na dzień
Pomiary fluorescencji GFP umożliwiają wykrycie poziomów lucyferazy świetlików (i potencjalne wykrycie niektórych inhibitorów enzymów lucyferazy, jak omówiono powyżej), co stanowi silny argument za pomiarem tego punktu końcowego wraz z bioluminescencją, jeśli to możliwe. Normalizacja odczytów bioluminescencji do GFP jest również sposobem na uwzględnienie różnic w liczbie robaków między odwiertami (chociaż można to również osiągnąć poprzez włączenie wielu powtórzeń technicznych). Aby uzyskać większą czułość, ważne jest, aby odjąć fluorescencję tła od odczytów. Protokół ocenia udział zawiesiny bakteryjnej we fluorescencji tła, jednak autofluorescencja nicieni nie jest uwzględniana (ograniczenie obecnego testu, szczególnie krytyczne dla wszelkich badań starzenia, biorąc pod uwagę, że autofluorescencja nicieni wzrasta wraz z wiekiem). Równolegle należy również oceniać autofluorescencję badanych związków. Normalizacja GFP wydaje się niezbędna tam, gdzie naukowcy chcą dostosować protokół do porównywania komórkowych pul ATP w różnych mutantach genetycznych lub po wyciszeniu różnych genów, w celu kontrolowania wszelkich różnic w szczepach na poziomie ekspresji transgenu bioluminescencji.
Krytyczne parametry w protokole obejmują etap rozwojowy, w którym rozpoczyna się ekspozycja, długość ekspozycji oraz uzyskanie podobnej liczby nicieni w różnych studzienkach. Narażenie można rozpocząć na każdym etapie rozwoju nicieni, jednak preferowane jest stadium L3 lub starsze. Od tego etapu nicienie są zależne od fosforylacji oksydacyjnej w celu rozwoju do dorosłości, o czym świadczy bardzo znaczący wzrost zawartości mtDNA, zużycia tlenu i poziomu ATP. 18,19,20 Niniejszy protokół inicjuje ekspozycję na etapie L4. Powodem podawania nicieni na płytki 96-dołkowe tylko na tym etapie (a nie wtedy, gdy po raz pierwszy dostarczono im pokarmu na etapie L1), jest to, że chociaż płytki są umieszczane w wilgotnych komorach, aby zminimalizować parowanie, w naszym inkubatorze wstrząsowym nadal występuje pewien stopień parowania, widoczny jako bardzo małe kropelki tworzące się na pokrywkach (może to nie stanowić problemu w przypadku innych inkubatorów z wytrząsaniem). Poprzez podawanie nicieni na płytki tuż przed dodaniem wzorców leków, na rzeczywiste stężenie leku nie ma wpływu żadna niewielka zmiana objętości spowodowana parowaniem. Załadowanie płytki z nicieniami samym pojazdem jest przydatne do sprawdzenia, czy nicienie były równomiernie rozmieszczone między studzienkami. Wszelkie znaczące różnice stwierdzone tylko dla tabliczki dla pojazdu wskazywałyby na słabą technikę dozowania nicieni do studzienek.
Długość ekspozycji jest ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę. Jeśli interesujący jest wpływ na stan energetyczny niezależnie od wzrostu, protokół może zostać zmodyfikowany w celu uwzględnienia krótszych ekspozycji (od niemal natychmiastowych reakcji do, na przykład, 2 godzin). Z drugiej strony, wnikanie związków do tkanek C. elegans może zająć trochę czasu. Na przykład 12-24 godziny są potrzebne do osiągnięcia maksymalnych wewnętrznych stężeń resweratrolu i 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FuDR). 21 W związku z tym dłuższa ekspozycja (od 18 do 24 godzin) może być uzasadniona w celu maksymalizacji poziomów ekspozycji. Czas ekspozycji powinien być ograniczony do czasów, które nie pozwalają na zaprowadzenie znacznych poziomów reprodukcji w studni. Zalecamy, aby całkowity czas rozwoju nicieni nie przekraczał 66-67 godzin. Chociaż jest to wygodne, nicienie są już wtedy ciężkie i rozpoczęły składanie jaj. Niemniej jednak stwierdziliśmy, że odczyty bioluminescencji z preparatów jajecznych są znikome (nie pokazano). Ekspresja transgenu napędzana przez promotor sur-5 jest po raz pierwszy wykrywana zaledwie dwie do dwóch i pół godziny po zapłodnieniu w stadium22 100 komórek, a chitynowa skorupka jaja prawdopodobnie ogranicza wnikanie lucyferyny. Inni odkryli, że zarodkowe jaja nie przyczyniały się znacząco do metabolizmu dorosłych osobników. 23 Należy jednak unikać warunków pozwalających na produkcję znacznego potomstwa. Jeśli jest to preferowane, skala czasowa eksperymentu może zostać cofnięta: wcześniej rozpoczęliśmy ekspozycję na toksynę środowiskową w późnym stadium larwalnym L3 (36 godzin) i przeprowadziliśmy pomiary bioluminescencji i GFP po 55 godzinach.2 Alternatywnie, tła genetyczne, które są warunkowo sterylne, mogą być wykorzystane do zapobiegania produkcji potomstwa, jak na przykład fer-15(b16) II; podwójny mutant fem-1(hc17) IV, który może być utrzymywany w temperaturze 15 °C, ale jest sterylny w temperaturze 25 °C.24 Nie zaleca się stosowania FuDR w celu wywołania bezpłodności, ponieważ może to samo w sobie wpływać na metabolizm nicieni. 25 Test można również przeprowadzić w szczepach o bardziej przepuszczalnych skórkach, takich jak mutanty bus-8 z częściową utratą funkcji, które są wrażliwe na wiele leków ze względu na zwiększoną przepuszczalność leków. 26 Ułatwi to krótsze narażenie i obniżenie stężeń związków. Warunki dodawania lucyferyny do tych nicieni mogą również wymagać dostosowania, tj. 1% DMSO i 0,05% Triton-X100 w buforze luminescencyjnym mogą nie być wymagane w celu zwiększenia dostępności lucyferyny.
Protokół wykorzystuje 1% DMSO jako nośnik do dostarczania mieszanki. Chociaż nie jest śmiertelne, to stężenie DMSO ma pewne skutki biologiczne, jak omówiliśmy w poprzedniej publikacji. 3 Wiele z dostępnych bibliotek leków jest przygotowywanych w 100% DMSO, w stężeniach, które będą odpowiednie do testów komórkowych po rozcieńczeniu podłoża do 0,1%. Wyższe stężenia związków są wymagane do wywołania odpowiedzi u C. elegans w porównaniu z komórkami ludzkimi, tak że często nie jest możliwe przeprowadzenie testów przy wartości niższej niż 1% DMSO. Ponownie, stosowanie szczepów o bardziej przepuszczalnych skórkach może prowadzić do badań z niższymi stężeniami nośnika. Stężenia DMSO wyższe niż 1% nie są zalecane.
Należy przestrzegać ustalonego czasu inkubacji z lucyferyną przed odczytami. Jak wykazano wcześniej, luminescencja osiąga maksymalny poziom w ciągu drugiej minuty po dodaniu lucyferyny, pozostając względnie stabilna przez pierwsze 5 minut, po czym następuje powolny, stopniowy spadek luminescencji w ciągu następnych 30minut. Reakcje kinetyczne na określoną substancję chemiczną można przeprowadzić w tym początkowym etapie 30 minut po początkowym dozowaniu lucyferyny.
Protokół obejmuje etap głodzenia po zebraniu jaj w celu osiągnięcia synchronizacji populacji nicieni. Zalecamy synchronizację populacji testowych nicieni, ponieważ różne etapy rozwoju różnią się poziomami ATP w komórkach i mogą różnie reagować na badane związki. Przeprowadzając głód w pożywce S complete, w przeciwieństwie do M9, nicienie wylęgające się są zaopatrywane w źródło węgla (etanol), dzięki czemu larwy nie rozwijają się, ale nie są całkowicie głodzone. 27,28 Wykazano również, że zatrzymane L1 są przygotowane do szybkiej reakcji na pokarm, a normalne tempo wzrostu L1 osiąga się w ciągu 3 godzin po tym, jak pokarm staje się dostępny. 29 Nie można jednak wykluczyć, że etap głodzenia może zmienić metabolizm C. elegans. 30 Z tego powodu długość głodu nie powinna przekraczać 24 godzin (18 godzin jest wystarczające do synchronizacji). Niektóre laboratoria mogą mieć możliwość użycia biosortera Copas do synchronizacji wieku, całkowicie pomijając etap głodówki. Inne laboratoria mogą preferować rozszerzanie populacji nicieni na pożywkach stałych (płytki NGM z OP50) przed bieleniem (krok 3.1) i to również będzie działać. Używamy pożywki S podczas ekspozycji na związki jako standardowej pożywki do hodowli nicieni, jednak można wybrać inne pożywki, na przykład pożywka K lub EPA umiarkowanie twarda woda są często używane do badań ekotoksykologicznych. 31,32 TGL
Protokół zapewnia środki do badań przesiewowych i identyfikacji kandydatów do dalszych badań pod kątem wpływu na funkcję mitochondriów. Na etapie pierwotnych badań przesiewowych istnieje prawdopodobieństwo, że niektóre związki zostaną pominięte z powodu badania tylko jednego stężenia, dlatego badań przesiewowych leków nie należy uważać za wyczerpujące. Trafienia można zwalidować za pomocą technik oceny różnych aspektów funkcji mitochondriów, na przykład zużycia tlenu, szczepów C. elegans z ekspresją mitochondriów GFP, barwienia potencjału błony mitochondrialnej i/lub pomiary ROS. 16,33,34 Największym znaczeniem tej metodologii jest dysponowanie środkami do badań przesiewowych dużej liczby związków i/lub warunków na poziomie organizmów wielokomórkowych, a co ważne, możliwość wykorzystania genetycznej zdolności C . elegans do badania mechanizmów działania. Technika ta może pomóc w przyspieszeniu i znalezieniu nowych ścieżek do odkrycia interesujących związków i celów. Przewiduje się, że połączenie czujnika z tłem genetycznym związanym z chorobą człowieka w celu badań przesiewowych bibliotek związków w kontekście istotnym z chorobą będzie miało wiele do zaoferowania.

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie ilościowe określenie stanu energetycznego C. elegans in vivo z zamiarem wykorzystania go jako punktu końcowego w badaniach przesiewowych związków. Uzasadnienie opiera się na transgenicznej ekspresji lucyferazy świetlika w nicieniu C. elegans1-3 za pośrednictwem plazmidu pSLGCV (1<a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862</a>). Enzym lucyferazy jest połączony z zielonym białkiem fluorescencyjnym GFP i ulega konstytutywnej i wszechobecnej ekspresji w cytoplazmie (usunięto sygnał celowania w peroksysomy lucyferazy). Prowadzi to do emisji światła, gdy substrat lucyferyna jest dostarczany egzogennie. Ponieważ robak jest przezroczysty, światło może być mierzone w luminometrze jako względne jednostki światła (RLU). Komórkowe ATP napędza reakcję bioluminescencji, a jego dostępność determinuje poziom wytwarzanego światła. W związku z tym luminometria oferuje wygodny sposób oceny względnych poziomów ATP, a co za tym idzie, funkcji mitochondriów, ponieważ produkcja ATP zachodzi głównie w mitochondriach. Związek między funkcją mitochondriów a poziomem bioluminescencji wykazano już wcześniej poprzez wyciszenie mitochondrialnych genów łańcucha transportu elektronów i jednoczesne zmniejszenie emisji światła. 1
Wygenerowane szczepy bioluminescencji zostały oznaczone jako PE254(feIs4) i PE255(feIs5)1 (zobacz listę materiałów) i mogą być używane zamiennie. 3 W wielu badaniach wykorzystano te szczepy czujników do raportowania komórkowych poziomów ATP in vivo po narażeniu na różne ksenobiotyczne chemikalia, takie jak azydek sodu1, kadm2, ekstrakt z osadów ściekowych3, 5'-fluoro-2-deoksyurydyna6 i nitrozoaminaspecyficzna dla tytoniu 7. Szczepy te okazały się również przydatne do monitorowania skutków ekspozycji na promieniowanie ultrafioletoweC 8 oraz skutków zakłócenia funkcji mitochondrialnego łańcucha oddechowego. 1,9 Wczesna wersja czujnika luminescencji wyrażającego gen lucyferazy bez fuzji GFP (PE39) została również wykorzystana w badaniu wpływu metali ciężkich i rozprzęgania układu oddechowego. Wykazano, że 10 szczepów PE254 i PE255 przenoszą lucyferazę: fuzję GFP i fluorescencję GFP zwiększają się proporcjonalnie do masy nicieni, oferując wygodny sposób normalizacji wartości luminescencji. 6,9 Wpływ zróżnicowanej liczby robaków na studzienkę można również uwzględnić poprzez włączenie do testu wielu powtórzeń technicznych (co najmniej 5 studzienek na warunek). 3
Protokół oferuje możliwość monitorowania poziomów energii in vivo (w przeciwieństwie do bardziej pracochłonnych technicznie oznaczeń ATP in vitro), umożliwiając badanie przesiewowe związków i repozycjonowanie w kontekście fizjologicznym całego organizmu wielokomórkowego. Procedura może być rozszerzona na różne tła genetyczne poprzez skrzyżowanie chromosomalnie zintegrowanego transgenu z dostępnymi zmutowanymi szczepami i/lub poprzez wyciszenie genów przez interferencję RNA; w ten sposób w pełni wykorzystując C. elegans jako organizm modelowy. Metoda ta powinna przyczynić się do zmniejszenia niepowodzeń w późnej fazie leczenia potencjalnych leków z powodu toksyczności mitochondrialnej i przyczynić się do zmniejszenia liczby badań na zwierzętach.

<table><tbody><tr><td>Luminometr mikropłytkowy Orion II</td><td>Berthold Systemy</td><td></td> detekcji <td>z wtryskiwaczem i oprogramowaniem Simplicity 4.2; przesyłanie danych do Excela po zakończeniu pomiaru płytki</td></tr><tr><td>Fluorymetr FLx800&nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td>z oprogramowaniem Gen5; przesyłaj dane do Excela po zakończeniu pomiaru płyty</td></tr><tr><td>Podstawowa platforma wytrząsająca Ks 130</td><td>Ika</td><td>#0002980000</td><td></td></tr><tr><td>Innova 4349</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Wytrząsarka z inkubatorem z chłodzeniem</td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>z wirnikiem eppendorf A-4-44&nbsp; (dla 50/15&#160; ml probówki)</td></tr><tr><td>Stripette, Costar</td><td>Corning</td><td>#4489</td><td>Pipeta serologiczna</td></tr><tr><td>Cellstar 50 ml probówki</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227661</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 15 ml probówki</td><td>Greiner bio-one</td><td>#188261</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych Cellstar 60 mm&nbsp;</td><td>Greiner bio-one</td><td>#628160</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost</td><td>VWR</td><td>#631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna szpatułka</td><td>Corning</td><td>#3007; #3004</td><td>do odważania chemikaliów</td></tr><tr><td>0,22 mM Filtry Millex GP</td><td>Millipore</td><td>#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Axygen Probówki Eppendorf 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-dołkowa płytka testowa</td><td>VWR</td><td>#3603</td><td>płytka przezroczyste dno z pokrywką</td></tr><tr><td>Płytka testowa studzienna Nunc 96</td><td>Fisher Scientific</td><td>#236105</td><td>Biała płytka z pokrywką</td></tr><tr><td>Odczynnik zbiornikowy 60 ml</td><td>Thermo Scientific Finnpipeta</td><td>#9510027</td><td>używana jako koryto dla nicieni w sekcji protokołu 4.4.1</td></tr><tr><td>Skrzynka magazynowa/komora wilgotna</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#10 800 058 001</td><td>174 x 101 x 56,6 mm, służy jako wilgotna komora z mokrymi ręcznikami papierowymi; 2x 96-dołkowe płytki z pokrywkami mogą zmieścić się w jednej, dolna część znajduje się na pokrywie mikropłytki</td></tr><tr><td>Wybielacz: Roztwór podchlorynu sodu 4-4,99% Zawartość chloru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#239305</td><td>Przechowywać w porcjach pod numerem 4&#160; &deg; C,&nbsp; uszczelnić za pomocą Parafilm, aby zapobiec utracie chloru i pokryć folią</td></tr><tr><td>D-Lucyferyna, sól potasowa</td> Sondy molekularne <td>Biotium Inc</td> <td># 10101-2</td><td>mogą być również używane jako dostawca; przygotować zapas 20 mM w ddH2O, utrzymywać w temperaturze -20 &deg; C w porcjach</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td># P9416</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>CalBiochem</td><td>#317275</td><td>Czystość 99,99%</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Alfa Aesar</td><td>#A16046</td><td>Rozcieńcz do 10% w ddH2O</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>CalBiochem</td><td>#475914</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans szczepy bioluminescencyjne</td><td>Własne laboratorium</td><td>PE254, PE255</td><td>zawierają zintegrowane matryce feIs4 i feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] odpowiednio na chromosomie V i X; co jakiś czas wybieraj do jednorodnej i silnej ekspresji luc::GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (np. wybierz 15 robaków).</td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemikalia ogólne</td><td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Modelowy organizm wielokomórkowy Caenorhabditis elegans to mały nicień o wielkości około 1 mm w wieku dorosłym, który jest genetycznie i eksperymentalnie podatny na manipulacje. Jest ekonomiczny i łatwy do hodowli i dozowania w płynnym podłożu, dzięki czemu dobrze nadaje się do badań przesiewowych o średniej przepustowości. Wcześniej przeprowadziliśmy walidację zastosowania transgenicznych szczepów C. elegans wykazujących ekspresję lucyferazy, aby zapewnić szybką ocenę in vivo poziomów ATP nicieni. 1-3 W tym miejscu przedstawiamy wymagane materiały i procedurę do przeprowadzenia testów biologicznych na bioluminescencyjnych szczepach C. elegans PE254 lub PE255 (lub dowolnym z ich pochodnych szczepów). Protokół pozwala na wykrywanie in vivo subletalnych skutków leków, które mogą identyfikować toksyczność mitochondrialną, a także na wykrywanie in vivo potencjalnych korzystnych skutków leków. Przedstawiono reprezentatywne wyniki dla substancji chemicznych parakwatu, rotenonu, szczawiooctanu i czterech związków hamujących lucyferazy świetlika. Metodologia ta może być rozbudowywana, aby zapewnić platformę do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków zdolnych do modulowania funkcji mitochondriów. Przedkliniczna ocena toksyczności leków jest często przeprowadzana na unieśmiertelnionych liniach komórek nowotworowych człowieka, które pochodzą z ATP głównie z glikolizy i często tolerują toksyczne substancje mitochondrialne. 4,5 W przeciwieństwie do tego, C. elegans zależy od fosforylacji oksydacyjnej, aby podtrzymać rozwój do dorosłości, rysując paralelę z ludźmi i zapewniając wyjątkową okazję do oceny związku w kontekście fizjologicznym całego żywego organizmu wielokomórkowego.

Reprezentatywne wyniki ilustrujące metodę uzyskano dla rotenonu (Rycina 1), parakwatu (Rycina 2), szczawiooctanu (Rycina 3) oraz 4 związków zidentyfikowanych jako inhibitory lucyferazy świetlika podczas przesiewania biblioteki leków13 (Rycina 4). We wszystkich przypadkach ekspozycję na lek rozpoczęto w stadium L4, jednak w przypadku eksperymentów z parakwatem ekspozycję rozpoczęto 41 h po pierwszym podaniu pokarmu nicieniom, w porównaniu do 45-46 h dla pozostałych związków. Protokół pozwala na pewną elastyczność w wyborze czasu rozpoczęcia ekspozycji na lek oraz czasu trwania ekspozycji. Jednakże w celach przesiewowych, po wyborze konkretnych ram czasowych, należy się ich trzymać, aby zapewnić powtarzalność między eksperymentami. Punkty końcowe należy zmierzyć do 66-67 h czasu rozwoju, aby zapobiec intensywnemu składaniu jaj i wykluciu się potomstwa w dołkach. Wytyczne dotyczące czasu trwania procedur podano w Tabeli 1.
Rotenon, inhibitor kompleksu I mitochondriów, zmniejszył bioluminescencję zarówno po stosunkowo krótkiej (2 hr) jak i dłuższej ekspozycji (24 hr) na szereg stężeń (Rysunek 1). W tym przypadku nie przeprowadzono pomiarów GFP, jednak liczba wykorzystanych powtórzeń technicznych (n=6) jest wystarczająca, aby zniwelować różnice w liczbie nicieni między dołkami3. Ekspozycja trwająca 24 hr obejmuje okres wzrostu nematod, a spodziewano się, że spowolnienie rozwoju w wyniku inhibicji kompleksu I przyczyni się do spadku bioluminescencji. Zostało to potwierdzone poprzez obserwację wizualną pod stereoskopem, która wykazała opóźnienie rozwoju, szczególnie przy stężeniach 20 μM i wyższych; dodatkowo zauważono pewną letalność przy 40 μM (obserwacje jakościowe nie zostały skwantyfikowane). Po 2 hr ekspozycji nie zaobserwowano letalności, ale odnotowano wpływ na ruch nicieni. Gwałtowny spadek bioluminescencji w stosunku do kontroli wystąpił przy najniższym przetestowanym stężeniu rotenonu 2.5 μM, dla którego efekty nie były łatwo wykrywalne podczas szybkiej obserwacji wizualnej po 2 hr ekspozycji. Spadek bioluminescencji ten jest zgodny ze zmniejszoną ilością komórkowego ATP. Maksymalna inhibicja została osiągnięta przy najniższym zastosowanym stężeniu rotenonu (2.5 μM), co wskazuje, że wszelkie kolejne eksperymenty ukierunkowane konkretnie na rotenon powinny być przeprowadzane w zakresie od 0 do 5 μM [zakres stężeń 0-160 μM wybrano w ramach porównania z innymi lekami, które początkowo zidentyfikowano jako wykazujące istotne efekty przy 10 μM (zostanie to opublikowane w innym opracowaniu)].
Herbicyd paraquat wpływa na funkcję mitochondriów poprzez zwiększenie ilości reaktywnych form tlenu. W niniejszej pracy demonstrujemy jego wpływ na bioluminescencję szczepu PE254 C. elegans po ekspozycji na szereg stężeń przez 24 h (Rysunek 2). Ponieważ szczep ten posiada fuzję luc::GFP, zmierzono również fluorescencję GFP w celu normalizacji.6,9 Paraquat znacząco zmniejszył bioluminescencję, fluorescencję GFP oraz znormalizowaną bioluminescencję. Test post-hoc Dunnetta wykazał, że stężenia paraquatu wykazujące istotne różnice w stosunku do kontroli nośnika to 4 i 8 mM dla bioluminescencji i znormalizowanej bioluminescencji, a także 2 mM dla znormalizowanej bioluminescencji. Jedynym stężeniem istotnie redukującym fluorescencję GFP było 8 mM – stężenie, przy którym zaobserwowano wpływ na wzrost oraz sporadycznie martwe nicienie (obserwacje jakościowe). Spadek bioluminescencji (oraz znormalizowanej bioluminescencji) był większy niż spadek fluorescencji, co jest spójne ze zmniejszeniem funkcji mitochondriów i wpływem na produkcję ATP.
Produkt pośredni cyklu kwasu cytrynowego, szczawiooctan, przetestowany na szczepie C. elegans PE254 w pojedynczym stężeniu 8 mM, doprowadził do zwiększenia bioluminescencji (Rysunek 3). Nie uzyskano pomiarów fluorescencji GFP ani nie przeprowadzono dodatkowych obserwacji wizualnych; jednakże taka odpowiedź na pojedyncze stężenie uzasadniałaby dalszą ekspozycję potwierdzającą w zakresie różnych stężeń oraz bardziej szczegółowe obserwacje efektów. Wzmocnienie bioluminescencji przez ten związek nie jest zaskakujące, ponieważ można postawić hipotezę, że prowadzi ono do większej aktywności cyklu kwasu cytrynowego, a w konsekwencji do większej produkcji ATP (niemniej jednak w kolejnych eksperymentach zalecałoby się kontrolę wszelkich efektów wpływających na poziom lucyferazy poprzez ocenę fluorescencji GFP). Przedstawione zestawy danych dla szczawiooctanu ujawniają zakres zmienności odpowiedzi obserwowanej w eksperymentach opartych na lucyferazie. W naszym doświadczeniu zmienność ta jest cechą systemu testowego, szczególnie w przypadku mniej szkodliwych warunków ekspozycji.
Związki hamujące lucyferazę świetlika DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 oraz DDD00023047 zostały przetestowane zarówno in vitro, poprzez analizę efektów na oczyszczony enzym, jak i in vivo, z wykorzystaniem szczepu C. elegans luc:GFP. Nie stwierdzono, aby którykolwiek z testowanych związków powodował śmierć nicieni w warunkach ekspozycji. Wszystkie 4 związki wpłynęły na aktywność lucyferazy in vitro w obu testowanych stężeniach: 25 oraz 100 μM (Rycyna 4A). Związek DDD00001434 niemal całkowicie znosił aktywność oczyszczonej lucyferazy, co stanowiło wiarygodne uzasadnienie dla znacznego spadku bioluminescencji in vivo (Rycyna 4B). Chociaż testy in vitro i in vivo nie są bezpośrednio porównywalne, odpowiedź na DDD00023047 była podobna w obu analizach. Związki DDD0001477 oraz DDD00000635 wywołały większy spadek in vivo niż in vitro. Związki te podano żywym nicieniom 22 h przed dodaniem substratu lucyferyny, a wyniki mogą odzwierciedlać fakt, że nie zostały one łatwo wyparte z centrum aktywnego lucyferazy w momencie udostępnienia lucyferyny. Alternatywnie, DDD0001477 i DDD00000635 mogą mieć dodatkowy wpływ na komórkowe poziomy ATP. Musiałoby to zostać ocenione metodami niewykorzystującymi lucyferazy świetlika. Zauważalne było silne wzmocnienie sygnału GFP u żywych nicieni eksponowanych na związek DDD00000635. Zostanie to omówione poniżej.
<img alt="Wykres bioluminescencji; stężenie względem czasu; efekt leku po 2 h i 24 h; analiza zależności dawka-odpowiedź." src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Inhibitor kompleksu I mitochondriów, rotenon, obniżył status energetyczny C. elegans, co zmierzono za pomocą bioluminescencji szczepu PE254. Zsynchronizowane nicienie w stadium L4 (45-46 h po dostarczeniu pokarmu larwom L1) wystawiono na działanie 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 i 160 μM rotenonu w 1% DMSO przez 2 h (krótka ekspozycja) lub 24 h (długa ekspozycja), a następnie dokonano odczytów bioluminescencji odpowiednio w 48. i 69. godzinie rozwoju nicieni po dostarczeniu pokarmu. Bioluminescencję (wyrażoną w jednostkach RLU, Relative Light Units) przedstawiono jako procent wartości dla kontroli nośnika (1% DMSO). Słupki błędów przedstawiają SEM powtórzeń technicznych dla każdego stężenia rotenonu (n=6). Wszystkie przetestowane stężenia wykazały wysoką istotność statystyczną w stosunku do kontroli nośnika (p&lt;0.001).
<img alt="Wykres bioluminescencji i fluorescencji pokazujący wpływ stężeń w mM wraz z istotnością statystyczną." src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Stresor oksydacyjny paraquat obniżył stan energetyczny szczepu PE254 C. elegans w sposób zależny od stężenia (pomiar bioluminescencji). Zsynchronizowane nicienie w stadium L4 (w tym przypadku dla ułatwienia 41 h po dostarczeniu pokarmu larwom L1) poddano działaniu 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 lub 8 mM paraquatu przez 24 h. Do normalizacji danych bioluminescencji (jednostka RLU) wykorzystano fluorescencję GFP (jednostka Relative Fluorescence Units, RFU); oba punkty końcowe uzyskano w 65 h rozwoju. Dane przedstawiono jako procent wartości kontrolnych (1% DMSO). Słupki błędów oznaczają SEM powtórzeń technicznych (n=5 dla różnych stężeń; n=18 dla kontroli). Jednoczynnikowa analiza ANOVA: *** p&lt;0,001 względem kontroli nośnika.
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający procent bioluminescencji w stosunku do kontroli nośnika w sześciu zestawach danych." src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Pośrednik cyklu kwasu cytrynowego, szczawiooctan (8 mM), zwiększył bioluminescencję szczepu PE254 C. elegans. Zsynchronizowane nicienie w stadium L4 (45–46 h po dostarczeniu pokarmu larwom L1) poddano działaniu świeżo przygotowanego 8 mM szczawiooctanu przez 18 h ± 30 min. Bioluminescencję (jednostka RLU) odczytano w czasie rozwojowym 63,5 h ± 1 h i wyrażono jako procent kontroli nośnika (ddH2O). Różne kolumny reprezentują różne zestawy danych obejmujące 8 powtórzeń technicznych rozmieszczonych na różnych płytkach 96-dołkowych w ramach tego samego eksperymentu. Słupki błędów przedstawiają SEM powtórzeń technicznych (n=8). Dwuczynnikowa analiza wariancji (2-way ANOVA) z czynnikami „zestaw” i „stężenie”: „zestaw” p&gt;0,05, „stężenie” p&lt;0,001 oraz człon interakcji p&gt;0,05.
A 
<img alt="Wykres słupkowy porównujący luminescencję in vitro przy stężeniach 25μM i 100μM dla czterech związków." src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
B 
<img alt="Wykres słupkowy porównujący bioluminescencję, znormalizowaną bioluminescencję i fluorescencję przy różnych stężeniach." src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Badanie odpowiedzi na 4 związki z biblioteki związków Dundee drug discovery13 (C1:DDD00001434, C2:DDD0001477, C3:DDD00000635 i C4:DDD00023047) o znanej aktywności inhibicyjnej wobec luminescencji lucyferazy świetlika. (A) Wpływ związków na aktywność oczyszczonej lucyferazy świetlika (mierzoną jako jednostki światła, RLU), wyrażony jako procent kontroli nośnika. Zestaw ATP bioluminescence CLSII (Roche, Manheim, Niemcy) zastosowano zgodnie z instrukcją, dozując do dołków (białe płytki mikrotitracyjne 96-dołkowe) taką samą ilość enzymu lucyferazy. ATP podano w stężeniu końcowym 10 μM, a następnie dodano 1 μl związku (stężenie końcowe wskazane na wykresie) lub DMSO (1%). Sygnał luminescencji integrowano przez 10 s. Słupki błędów przedstawiają SEM powtórzeń technicznych (n=4). Analiza: jednostronna ANOVA; *p&lt;0.05 lub *** p&lt;0.001 względem kontroli nośnika. Różnice między 25 a 100 μM były wysoce istotne dla C1 (DDD00001434; p&lt;0.001) oraz istotne dla C2 i C3 (odpowiednio DDD0001477 i DDD00000635; p&lt;0.05). (B) Pomiary in vivo bioluminescencji, bioluminescencji znormalizowanej do fluorescencji GFP oraz fluorescencji GFP szczepu C. elegans PE254 w 67. godzinie rozwoju po 22-godzinnej ekspozycji na badane związki. Słupki błędów przedstawiają SEM powtórzeń technicznych (n=8). Analiza statystyczna (jednostronna ANOVA) przeprowadzona na połączonych danych z 3 zestawów danych (3 x n=8). *p&lt;0.05 lub *** p&lt;0.001 względem odpowiedniej kontroli nośnika. Różnice między 25 a 100 μM były statystycznie istotne (p&lt;0.05) jedynie dla znormalizowanej bioluminescencji po ekspozycji na C4 (DDD00023047).
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pora dnia</td>
			<td>Dzień 1</td>
			<td>Dzień 2</td>
			<td>Dzień 3</td>
			<td>Dzień 4</td>
			<td>Dzień 5</td>
			<td>Dzień 6</td>
			<td>Dzień 7</td>
			<td>Dzień 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Krok 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Krok 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11-12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Krok 4</td>
			<td>Krok 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-13</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Krok 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-14</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14-15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-16</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-17</td>
			<td>Krok 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Krok 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-18</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-19</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Krok 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Przegląd kroków protokołu wykonywanych każdego dnia eksperymentów z nicieniami (Sekcja 3) oraz sugerowany harmonogram.

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zidentyfikowanie toksyczności mitochondrialnej lub korzystnego działania leków z wykorzystaniem organizmu modelowego *C. elegans*. Jest to osiągane poprzez ilościowe oznaczenie poziomu ATP in vivo w transgenicznych szczepach nicieni *C. elegans* wykazujących ekspresję lucyferazy świetlika połączonej z zielonym białkiem fluorescencyjnym.Gen fuzyjny nadaje nicieniom dwie odrębne właściwości. Pierwszą jest to, że po podaniu substratu Lucifer nicienie emitują światło w zakresie widzialnym proporcjonalnie do ich komórkowych zapasów ATP. Drugą jest to, że po naświetleniu odpowiednią długością fali wykazują one silną zieloną fluorescencję.Fluorescencja jest niezależna od poziomów TP w nicieniach i proporcjonalna do ich masy lub liczby. Dlatego może być wykorzystana do normalizacji pomiarów bioluminescencji. Podczas typowego testu populacja zsynchronizowanych rozwojowo nicieni jest hodowana do czwartego stadium larwalnego L4.Następnie nicienie są traktowane testowanymi związkami leków przez określony czas przed pomiarem fluorescencji i bioluminescencji. Wyniki wskazują na potencjalną toksyczność leków. W przypadku zmniejszenia bioluminescencji, wzmocniony sygnał wskazuje na tzw. „hit”, który wymaga dalszych badań pod kątem korzystnego wpływu na funkcje mitochondriów.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przesiewy leków na hodowlach komórkowych, jest to, że przesiewy są przeprowadzane w kontekście fizjologicznym całego żywego organizmu wielokomórkowego, wykazującego blisko 50% podobieństwa genetycznego do ludzi pod kątem okulistyki. Podobnie jak u ludzi, organizm ten wymaga fosforylacji oksydacyjnej mitochondriów, aby rozwinąć się do wieku dorosłego, a jego mitochondria dzielą z mitochondriami ssaków wiele cech pod względem struktury, funkcji oraz bioenergetyki. Krytyczne parametry w ramach protokołu obejmują stadium rozwoju, w którym rozpoczyna się ekspozycję, czas ekspozycji nicienia na badany lek, zasiacie podobnej liczby nicieni do każdej z studni, a oczywiście unikanie kontaminacji. W dniu pierwszym, w warunkach sterylnych, przenieś nicienie z jednej 6 cm płytki z podłożem do wzrostu nicieni w 2 ml kompletnego medium S do kolby zawierającej 30 g/l E. coli.OP 50 w pełnym medium S, następnie inkubować kolbę z wytrząsaniem; w czwartym dniu poddać kulturę nicieni GR działaniu wybielacza, aby zebrać jaja i zsynchronizować populację robaków. Następnie inkubować jaja przez noc w szklanej kolbie zawierającej 15 ml pełnego medium S z wytrząsaniem; następnego dnia, w dniu piątym, nicienie będą w tym samym stadium wzrostu. Aby określić liczbę wyklutych robaków, przenosić za pomocą czystego tipa każdorazowo trzy alikwoty nicieni po 100 µL do osobnych mikroprobówek zawierających 900 µL medium uzupełnionego o 0,01% tween 20, pipetując w górę i w dół kilka razy, aby uwolnić wszelkie robaki przylegające do tipa.Następnie należy policzyć nicienie w czterech oddzielnych kroplach o objętości 10 µL z każdej z trzech probówek z rozcieńczeniami i obliczyć objętość zawiesiny nicieni potrzebną do przygotowania dwóch kultur o objętości 20 mL z zagęszczeniem 10 nicieni na 10 µL, a następnie odlać przybliżone objętości do dwóch wcześniej zważonych stożkowych probówek o pojemności 15 mL. Zważyć probówki, aby określić faktyczną objętość odmierzoną cieczy. W celu dostosowania objętości do wartości docelowych, delikatnie wymieszać zawartość za pomocą wortexa i usunąć nadmiar objętości.Następnie przemyj nicienie w łącznie 14 mililitrach świeżego medium S, complete na probówkę i ponownie zawieś osady w pięciu mililitrach medium S complete z 30 gramami na litr equali. OP 50. Przenieś nicienie do stożkowych kolb szklanych zawierających 15 mililitrów S complete z 30 gramami na litr equali.do całkowitej objętości 20 mililitrów na kolbę i zapisz godzinę podawania pokarmu. Oblicz średnią liczbę nicieni w dziewięciu kroplach o objętości 10 mikrolitrów, aby potwierdzić, że kultury zostały rozcieńczone do stężenia 10 nicieni na 10 mikrolitrów. Umieść kultury w inkubatorze na 42 do 44 godzin.Siódmego dnia przenieś kultury nicieni do jednej kolby, stale i delikatnie nią potrząsając. Następnie przelej trzy aliquoty nicieni po 4 ml do jednego sterylnego koryta o pojemności 60 ml. Za pomocą pipety ośmiokanałowej nanieś 25 µL zawiesiny nicieni do każdej studzienki płytki 96-dołkowej.Użyj czarnych płytek mikrotitracyjnych z płaskim, przezroczystym dnem. Następnie nałóż pokrywki z powrotem na płytki i odstaw je na bok. Po każdym zasianiu dwóch płytek przenieś do korytki kolejne dwie alikwoty nicieni o objętości 2,5 mililitra, aby uzupełnić ubytek objętości.Po wysianiu nicieni na 13 do 14 płytek, do każdej studni dodaj 74 µL pełnego medium S, a następnie przenieś płytki do wilgotnej komory i inkubatora wytrząsającego do momentu podania leku, przy jednoczesnym wytrząsaniu płytek. Rozmroź 2 płytki z lekiem w formacie 96-dołkowym do testów. Następnie użyj pipety wielokanałowej, zmieniając końcówki przy każdym użyciu.Przenieś jeden mikrolitr z pierwszej kolumny pierwszej płytki z lekiem do kolumn od jednej do piątej płytki z nicieniami. Przenieś kolejny mikrolitr z drugiej kolumny płytki z lekiem do kolumn od ósmej do 12. Następnie dodaj jeden mikrolitr rozpuszczalnika do kolumn szóstej i siódmej płytki z nicieniami.Wykorzystaj pozostałe kolumny na płytce z lekiem, aby w ten sam sposób potraktować resztę płytek z nicieniami, pamiętając o uwzględnieniu dwóch płytek traktowanych samym nośnikiem. Następnie przenieś wszystkie płytki z powrotem do wilgotnych komór w inkubatorze z wytrząsaniem na kolejne 20 do 22 godzin w ósmym dniu. Aby przygotować płytkę kontrolną tła do pomiarów fluorescencji, połącz zawartość studzienek z płytki z nicieniami traktowanymi samym nośnikiem i odczekaj dwie do trzech minut, aż nicienie opadną na dno.Następnie należy zebrać bakterie zawierające snat i nanieść próbki o objętości 100 µL do każdej studzienki czarnej mikropłytki z przezroczystym dnem. Płytkę należy obejrzeć pod mikroskopem, zaznaczając studzienki, w których widoczne są nicienie, aby wykluczyć je z pomiaru tła fluorescencji. Na koniec należy odczytać fluorescencję, aby zmierzyć bioluminescencję dla każdej płytki.Następnie do każdej studzienki odmierzyć 50 µL świeżo przygotowanego buforu luminescencyjnego, umieścić płytkę na platformie wstrząsowej i uruchomić czasomierz na trzy minuty. Odczytać luminescencję z częstotliwością jednej sekundy na pomiar. W tym pierwszym reprezentatywnym eksperymencie rot, znany inhibitor kompleksu I mitochondriów, zredukował emisję światła u nicieni zarówno po stosunkowo krótkiej, jak i dłuższej ekspozycji w zakresie różnych stężeń.W tym eksperymencie wykazano, że herbicyd paraquat znacząco zmniejsza fluorescencję GFP oraz znormalizowaną bioluminescencję szczepu PE 2 54 C. Co więcej, spadek bioluminescencji był większy niż spadek fluorescencji, co jest zgodne ze znanym działaniem leku prowadzącym do pogorszenia funkcji mitochondriów i zmniejszenia produkcji ATP. Ten wykres przedstawia przykład związku zwiększającego bioluminescencję nicieni – szczawiooctanu, produktu pośredniego cyklu kwasu cytrynowego, w pojedynczym stężeniu 8 mM.Należy zauważyć, że zmienność eksperymentalna obserwowana pomiędzy tymi powtórzeniami nie jest nietypowa dla eksperymentów opartych na lucyferazie. W tym przypadku zaobserwowano, że związki hamujące lucyferazę świetlikową wpływają na aktywność lucyferazy in vitro przy stężeniach 25 micromolar i 100 micromolar, przy czym związek DDD spowodował prawie całkowite zniesienie aktywności. Chociaż nie są one bezpośrednio porównywalne, po zastosowaniu związku hamującego lucyferazę in vivo zaobserwowano również znaczny spadek bioluminescencji.Wykazanie, że zmiany w bioluminescencji mogą wynikać z działania inhibitorów enzymu lucyferazy, a nie ze zmian poziomów ATP in vivo. Podczas przeprowadzania tej procedury należy wziąć pod uwagę, że związki mogą bezpośrednio wpływać na aktywność enzymu lucyferazy świetlikowej, zamiast oddziaływać na status energetyczny nicienia. W związku z tym wyniki można zwalidować za pomocą wielu technik oceny funkcji mitochondriów, takich jak na przykład oznaczenie zużycia tlenu, pomiar potencjału błony mitochondrialnej, oznaczenie reaktywnych form tlenu lub wizualizacja mitochondriów w szczepach C. elegans.Z oznakowaniem GFP, mitochondria.

a-screenable-vivo-assay-for-mitochondrial-modulators-using-transgenic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Źródło: Anderson, Q. L. i wsp. Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych z wykorzystaniem Caenorhabditis elegans do badania knockdownów genów podczas interakcji gospodarz-patogen. Przedstawiono w nim procedurę przygotowania powalanych robaków i przenoszenia ich na płytki testowe w celu oceny skutków zabijania robaków przez patogeny.

Wielodołkowy test na bazie płynu do badań przesiewowych nokautów C. elegans

Ten film demonstruje test in vivo do badania mitofagii u Caenorhabditis elegans. Po wystawieniu nicieni na działanie leku indukującego mitofagię, występowanie mitofagii ocenia się na podstawie kolokalizacji między DCT-1, receptorem mitofagii na uszkodzonych mitochondriach, a autofagosomalnym białkiem błonowym LGG-1.

Test in vivo do wykrywania mitofagii u nicieni transgenicznych

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

Optogenetyczna mutageneza losowa z wykorzystaniem histonów-miniSOG u C. elegans

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Tutaj opisujemy prosty protokół szybkiego wytwarzania setek pożywek hodowlanych dla nicieni, 96-dołkowych płytek hodowlanych ze stałą liczbą Caenorhhabditis elegans na studzienkę. Kultury te są przydatne do fenotypowych badań przesiewowych całych organizmów. Skupiamy się tutaj na wykorzystaniu tych kultur do badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem efektów sprzyjających długowieczności.

Prosta metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku Caenorhabditis elegans

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.

Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

Poznaj metodę przesiewowego testu in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans. Technika umożliwia identyfikację związków o działaniu toksycznym lub korzystnym dla mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów