Uczenie się przestrzenne zależne od motoryki i hipokampa oraz ocena pamięci referencyjnej w transgenicznym szczurzym modelu choroby Alzheimera z udarem mózgu

Ogólnym celem tych testów behawioralnych jest ocena funkcji motorycznych, a także przestrzennego uczenia się i pamięci w nowym modelu szczura z chorobami współistniejącymi w postaci choroby Alzheimera i udaru. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie otępienia, takie jak sposób, w jaki patologia udaru i choroby Alzheimera oddziałują na siebie, powodując fenotyp potencjalnie zwiększonego deficytu motorycznego i przyspieszonego pogorszenia funkcji poznawczych. Główną zaletą tych technik jest to, że pozwalają one badać szereg funkcji mózgu, będąc jednocześnie łatwymi w wykonaniu, kosztowo efektywnymi i odpowiednimi do wielokrotnego powtarzania w późniejszych punktach czasowych.

Zastosowania tej techniki rozciągają się na zapobieganie otępieniu po udarze, ponieważ nowe związki zapobiegawcze mogą być testowane pod kątem ich potencjału do łagodzenia współistniejącego fenotypu behawioralnego. W pierwszej kolejności należy umieścić lustro pod kątem 45 stopni pod wcześniej zamontowanym aparatem z cylindrem. Następnie należy przymocować kamerę wideo do statywu i ustawić ją w odległości około 50 centymetrów od aparatu.

Upewnij się, że w lustrze widoczna jest cała średnica cylindra w polu widzenia kamery. Następnie wybierz zaaklimatyzowanego szczura i zapisz na białej tabliczce numer zwierzęcia oraz dodatkowe informacje o próbie. Umieść tabliczkę przed lustrem, a następnie naciśnij przycisk nagrywania w kamerze wideo.

Następnie chwyć szczura za nasadę ogona i umieść go w cylindrze. Po tym zabezpiecz pokrywę aparatury i usuń białą tablicę, aby nie zasłaniała ona lustra. Po usunięciu białej tablicy przystąp do filmowania zwierzęcia przez pięć minut; okres ten stanowi jedną próbę.

Po upływie tego czasu należy przerwać nagrywanie, zwrócić szczura do jego klatki domowej i oczyścić cylinder za pomocą ręczników papierowych oraz wody. Następnie należy powtórzyć opisane wcześniej kroki jeszcze dwukrotnie, aby uzyskać łącznie trzy próby dla każdego szczura. Po zebraniu danych dla wszystkich szczurów należy zaimportować pliki z kamery do programu do edycji wideo i przystąpić do ilościowego określenia liczby kontaktów czterech kończyn, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Najpierw ustaw dwa regały w odległości około 100 centymetrów od siebie przed czarną ścianą. Następnie za pomocą taśmy przymocuj końce wcześniej przygotowanej drewnianej belki do półek w taki sposób, aby między nimi pozostał około jeden metr niewspartego drewna. Następnie ustaw kamerę wideo na statywie w taki sposób, aby kamera obejmowała całą długość belki.

Należy wybrać szczura, który przeszedł sesję treningową chodzenia po belce, a następnie zapisać jego numer oraz dodatkowe informacje o próbie na białej tablicy. Po zakończeniu przymocuj tablicę taśmą do ściany za belką. Następnie ustaw klatkę domową zwierzęcia oraz rurkę do wzbogacenia środowiskowego, które służą jako motywujący sygnał, do którego szczur może natychmiast wejść po przejściu przez deskę, na jednym z końców belki.

Następnie naciśnij przycisk nagrywania w kamerze wideo. Bezzwłocznie po tym chwyć szczura za nasadę ogona i umieść go na przeciwległym końcu belki, bez klatki i rurki. Nagrywaj zwierzę do momentu, aż pomyślnie pokona całą długość podwyższonego drewnianego elementu, co oznacza koniec próby.

Jeśli szczur zatrzyma się w połowie belki, delikatnie dotknij jego ogona, aby pobudzić go do ruchu. Po zakończeniu zadania przez zwierzę, przenieś jego klatkę domową na drugi koniec belki. Zmień numer próby na tablicy i powtórz procedurę zgodnie z wcześniejszym opisem.

Po zarejestrowaniu wszystkich prób zwierząt, zaimportuj pliki z kamery do programu do edycji wideo i przeanalizuj odpowiedni krok, poślizgi kończyn oraz dane o upadkach zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozpocznij od zamocowania kamery wideo nad środkiem pustego, okrągłego basenu. Następnie wyznacz cztery kwadranty zbiornika, naklejając taśmę wzdłuż krawędzi basenu, i dopasuj je odpowiednio do obrysu zbiornika w programie do śledzenia.

Następnie napełnij zbiornik wodą do głębokości 36 centymetrów, a potem dodaj czarną, nietoksyczną farbę, aż ciecz stanie się nieprzezroczysta, aby upewnić się, że platforma nie jest widoczna poniżej powierzchni wody i aby lepiej widzieć białe szczury. Po przygotowaniu basenu otocz go gładkimi powierzchniami ścian. Następnie przygotuj wskazówki przestrzenne, wycinając cztery kształty z brystolu w różnych kolorach.

Następnie przymocuj jeden kształt do każdej ze ścian odpowiadających północnej, południowej, wschodniej i zachodniej lokalizacji basenu. Aby przeprowadzić eksperyment z uczenia się przestrzennego, umieść okrągłą platformę w południowo-zachodnim kwadrancie basenu. W dołączonym programie komputerowym upewnij się, że struktura ta jest wyrównana z wyznaczonym obszarem platformy w tym kwadrancie.

Należy chwycić szczura u nasady ogona i delikatnie umieścić go w wyznaczonym punkcie startowym w wodzie, wzdłuż ścianki basenu. Po umieszczeniu zwierzęcia w zbiorniku należy szybko wycofać się z jego pola widzenia i dać sygnał drugiemu eksperymentatorowi, aby uruchomił oprogramowanie do śledzenia. Pozostawić szczura, aby pływał, aż zlokalizuje platformę i wejdzie na nią.

W tym momencie drugi badacz powinien zakończyć próbę na komputerze. Pozostaw zwierzę na platformie przez 30 sekund. Jeśli szczur nie odnajdzie platformy w wyznaczonym czasie próby, w tym przypadku 90 sekund, poprowadź zwierzę do struktury i pozwól mu pozostać tam przez 30 sekund.

Następnie unieś szczura za nasadę ogona i wyjmij go z labiryntu, kładąc go na ręczniku rozłożonym na przedramieniu. Powtórz tę procedurę jeszcze trzy razy dla każdego zwierzęcia, zachowując 20-minutowy odstęp między próbami, tak aby każdy szczur ukończył łącznie cztery próby.

Po zakończeniu eksperymentu z uczeniem przestrzennym należy wyjąć platformę z basenu, aby rozpocząć próby sondażowe. W oprogramowaniu należy sprawdzić, czy poprzednia pozycja platformy w południowo-zachodnim kwadrancie pozostaje zdefiniowana. Następnie należy wprowadzić szczura do basenu.

Umieść zwierzę w wodzie przy ścianie zbiornika. Podobnie jak poprzednio, natychmiast wyjdź z zasięgu wzroku zwierzęcia i poleć innemu eksperymentatorowi uruchomienie oprogramowania do śledzenia. Po zakończeniu 30-sekundowej próby badawczej chwyć zwierzę u nasady ogona, wyjmij je ze zbiornika, a następnie połóż na ramieniu przykrytym ręcznikiem.

Powtórz tę procedurę po tygodniu. Po przeprowadzeniu prób uczenia przestrzennego i prób sondażowych dla wszystkich zwierząt, przeanalizuj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dane dotyczące wykorzystania czterech kończyn w aparacie cylindrycznym zbierano od transgenicznych szczurów APP21 na trzy dni przed oraz siedem i 20 dni po wywołaniu udaru.

Po standaryzacji i porównaniu z wartością reprezentującą równomierne wykorzystanie czterech kończyn, oznaczoną tutaj czerwoną linią, wyniki te wskazują, że u szczurów z obciążeniem komorbidnym nie wykazano statystycznie istotnego deficytu funkcji czterech kończyn. Podobne wyniki uzyskano dla zwierząt typu dzikiego z udarem lub bez, a także dla samych transgenicznych szczurów APP21. Jednakże u zwierząt z obciążeniem komorbidnym zaobserwowano różnice w funkcji motorycznej związanej z lokomocją.

Dane z zadania przejścia po belce, zebrane dla tych szczurów na siedem dni przed i 21 dni po wywołaniu udaru, wykazują istotny wzrost liczby kroków potrzebnych do przejścia po desce, czego nie zaobserwowano w innych grupach. Wyniki testu labiryntu wodnego Morrisa również ujawniają deficyty pamięci u zwierząt z chorobami współistniejącymi, co obrazuje ten wykres przedstawiający procentową zmianę czasu latencji, czyli czasu potrzebnego zwierzętom na dotarcie do kwadrantu basenu, w którym wcześniej znajdowała się platforma, pomiędzy pierwszym a drugim badaniem próbnym. Tutaj szczury APP21 po udarze potrzebują znacznie więcej czasu w drugiej próbie, aby wejść do docelowego kwadrantu.

Różnica ta nie została wykazana w przypadku samych szczurów transgenicznych ani zwierząt typu dzikiego z udarem. Wskazuje to, że zwierzęta z chorobami współistniejącymi mają deficyt pamięci długotrwałej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wszystkie zmienne pozostawały tak spójne, jak to możliwe, w trakcie i pomiędzy sesjami testowymi oraz aby stworzyć zwierzętom środowisko wolne od stresu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat oceny funkcji motorycznych i poznawczych w szczurzych modelach otępienia poudarowego.