Name: Mikrośrodowiska przypominające kanapki w celu wykorzystania interakcji między komórkami a materiałami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Poznaj metodę montażu mikrośrodowisk przypominających kanapki do badania zachowań komórkowych w fizjologicznie trafnym środowisku 3D. Technika umożliwia dwustronną stymulację komórek i adaptację metod analizy 2D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Potwierdzamy wsparcie ze strony ERC za pośrednictwem HealInSynergy (306990) i programu FPU AP2009-3626.

1. Produkcja podłoży grzbietowych
<ol>
	<li>Produkcja płaskiej folii PLLA metodą odlewania rozpuszczalnikowego.
	<ol>
		<li>Pracować pod wyciągiem, aby przygotować roztwór 2% (w/v) PLLA w chloroformie (2 g PLLA w 100 ml chloroformu), mieszając w temperaturze pokojowej (RT) aż do całkowitego rozpuszczenia (około 3 godziny).</li>
		<li>Umieść podkładki na szklanej szalce Petriego. 
		Uwaga: Stosować podkładki ze stali nierdzewnej o średnicy wewnętrznej 10,5 mm (nieco mniejszej niż średnica brzuszna próbki) tak, aby podkładka była umieszczona na podłożu brzusznym. Można również zastosować inne materiały, takie jak politetrafluoroetylen (PTFE) lub podkładki szklane.</li>
		<li>Dodać 200 μl roztworu PLLA do myjki i pozostawić do powolnego odparowania przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Aby umożliwić powolne odparowywanie rozpuszczalnika, należy zamknąć szalkę Petriego folią aluminiową z kilkoma otworami.</li>
		<li>Ogrzewać próbki w temperaturze 120 °C przez 5 minut w celu odparowania śladowych ilości rozpuszczalnika.</li>
		<li>Poczekaj, aż próbki ostygną w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po ostygnięciu próbek (około 30 minut) zalać szalką Petriego wodą o mocy 18,2 MΩ·cm i inkubować przez 8 minut w temperaturze RT. 
		Uwaga: Jeśli próbki nie zostaną całkowicie schłodzone, mogą pobrać 18,2 MΩ·cm wody i przyjąć stan gumowaty. Dodatkowo inkubacja w wodzie o mocy 18,2 MΩ·cm przez mniej niż 8 minut może skutkować niewłaściwym odłączeniem, a przez ponad 8 minut odłączeniem od myjki.</li>
		<li>Za pomocą żyletki podważ podkładki, aby oderwać je od szalki Petriego.</li>
		<li>Usuń wszelkie niedoskonałości z krawędzi pralki za pomocą pęsety i pozostaw próbki do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Próbki należy przechowywać w eksykatorze próżniowym (80 mbar) do dnia eksperymentu, ponieważ PLLA ulega degradacji w procesie hydrolizy. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkcja włókien PLLA metodą elektroprzędzenia.
	<ol>
		<li>Pracować w dygestorium, aby przygotować roztwór 8% (w/v) PLLA w heksafluoroizopropanolu (8 g PLLA w 100 ml heksafluoroizopropanolu), mieszając w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozpuszczenia (około 3 godziny).</li>
		<li>Umieść podkładki z politetrafluoroetylenu (PTFE) na blasze aluminiowej lub na bębnie do elektroprzędzenia, aby uzyskać odpowiednio losowe lub wyrównane włókna. 
		Uwaga: Użyć podkładek z politetrafluoroetylenu (PTFE) o średnicy wewnętrznej 10,5 mm (nieco mniejszej niż średnica brzuszna próbki) tak, aby podkładka była umieszczona na podłożu brzusznym. Można również użyć innych materiałów, takich jak stal nierdzewna lub podkładki szklane. Bęben powinien obracać się z prędkością kątową 160,7 sec-1 (promień = 7 cm) w celu uzyskania wyrównanych włókien. Mniejsza prędkość może nie spowodować wyrównania włókien, a większa prędkość spowoduje uszkodzenie włókien.</li>
		<li>Naładować strzykawkę roztworem polimeru i umieścić ją na pompie strzykawkowej.</li>
		<li>Roztworu PLLA należy odwirować elektrolitycznie, wykorzystując natężenie przepływu 0,9 ml/h przy napięciu 30 kV i odległości od kolektora 12 cm.</li>
		<li>Przerwij proces elektroprzędzenia po 20-30 minutach, po osiągnięciu dobrej gęstości włókien (ponieważ komórki muszą oddziaływać z kilkoma włóknami jednocześnie).</li>
		<li>Ogrzewać próbki w temperaturze 120 °C przez 5 minut w celu odparowania śladowych ilości rozpuszczalnika.</li>
		<li>Próbki należy przechowywać w eksykatorze próżniowym (80 mbar) do dnia eksperymentu, ponieważ PLLA ulega degradacji w procesie hydrolizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kultura kanapkowa
<ol>
	<li>Złóż kulturę przypominającą kanapkę, gdy komórki przykleją się do brzusznego podłoża 2D.
	<ol>
		<li>Pracuj w kapturze hodowlanym, aby zapewnić sterylne warunki i wysterylizuj wszystkie materiały (szkiełka nakrywkowe, podłoża grzbietowe, pęsety itp.) poprzez ekspozycję na promieniowanie UV przez 30 minut.</li>
		<li>Pokryj podłoże brzuszne i grzbietowe fibronektyną w celu kierowania specyficzną adhezją komórkowo-białkową. W tym celu należy inkubować próbki w 20 μg/ml fibronektyny rozpuszczonej w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco zawierającym Ca2+ i Mg2+ (200 μl / próbkę) przez 1 godz. 
		Uwaga: Ze względu na proces wytwarzania, podłoża grzbietowe mają wyznaczoną górną i dolną stronę, ponieważ folia odlewana rozpuszczalnikiem i włókna elektroprzędzone są przymocowane do jednej ze stron podkładki. Ta strona jest zatem tą, która jest skierowana w stronę komórek (rysunek 3).
		<ol>
			<li>Po pokryciu powłoką białkową należy dwukrotnie przemyć próbki DPBS w celu usunięcia nadmiaru białka. Następnie inkubuj próbki w DPBS aż do ich użycia, aby zapobiec wyschnięciu próbek, ponieważ powoduje to denaturalizację białek. Stosować DPBS zawierający Ca2+ i Mg2+, ponieważ kationy dwuwartościowe regulują fałdowanie białek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych13, 
		Uwaga: Ponieważ kultura przypominająca kanapkę jest oparta na podłożach 2D, wysiew komórek zostanie przeprowadzony podobnie jak na próbce 2D. Na przykład mioblasty C2C12 wysiewa się w 17 500 komórkach cm-1 w celu eksperymentów różnicowania, a fibroblasty NIH3T3 wysiewa się w 7 000 komórek cm-1 w izolowanych kulturach w celu zbadania morfologii i adhezji komórek.</li>
		<li>Umieścić próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i pozostawić komórkom przyleganie do podłoża brzusznego przez 3 godziny.</li>
		<li>Umieść brzuszne podłoże wysiewane w nowej studzience z 12-dołkową płytką wielodołkową (gdzie pasują podkładki). 
		Uwaga: Złożenie kultury przypominającej kanapkę w nowej studzience jest jednym ze sposobów na pozbycie się komórek, które przylgnęły do dna studzienki po wysianiu, ponieważ będą one zużywać składniki odżywcze i wydzielać czynniki wzrostu i odpady, które wpływają na komórki hodowane w systemie przypominającym kanapkę. Jest to również konieczne w przypadku ekstrakcji komórkowych w celu lizy tylko komórek hodowanych w środowisku przypominającym kanapkę.</li>
		<li>Ostrożnie i za pomocą pęsety nałóż podłoże grzbietowe na komórki. Uzupełnić pożywką (1 ml) i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
		Uwaga: Ciężar podkładki zapobiegnie unoszeniu się podłoża grzbietowego.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu, tak jak w standardowych kulturach 2D. Nie przesuwaj podłoża grzbietowego, ponieważ może to spowodować uszkodzenie komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Złóż kulturę przypominającą kanapkę zaraz po wysianiu komórek.
	<ol>
		<li>Pracuj w kapturze hodowlanym, aby zapewnić sterylne warunki i wysterylizuj wszystkie materiały (szkiełka nakrywkowe, podłoża grzbietowe, pęsety itp.) poprzez ekspozycję na promieniowanie UV przez 30 minut.</li>
		<li>Pokryj podłoże brzuszne i grzbietowe fibronektyną w celu kierowania specyficzną adhezją komórkowo-białkową. W tym celu należy inkubować próbki w 20 μg/ml fibronektyny rozpuszczonej w DPBS zawierającej Ca2+ i Mg2+ (200 μl/próbkę) przez 1 godzinę.
		<ol>
			<li>Po pokryciu powłoką białkową należy dwukrotnie przemyć próbki DPBS w celu usunięcia nadmiaru białka. Następnie inkubuj próbki w DPBS aż do ich użycia, aby zapobiec wyschnięciu próbek, ponieważ powoduje to denaturalizację białek. Stosować DPBS zawierający Ca2+ i Mg2+, ponieważ kationy dwuwartościowe regulują fałdowanie białek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Komórki nasienne na szklanych szkiełkach nakrywkowych w studzience z 12-dołkową płytką (gdzie mieszczą się podkładki). Aby to zrobić, użyj wysoce skoncentrowanej zawiesiny komórkowej, aby uniknąć utraty komórek po ułożeniu podłoża grzbietowego.</li>
		<li>Ostrożnie i za pomocą pęsety nałóż podłoże grzbietowe na komórki. Uzupełnić pożywką (1 ml) i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
		Uwaga: Ciężar podkładki zapobiegnie unoszeniu się podłoża grzbietowego.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu, jak w standardowych kulturach 2D. 
		Uwaga: Nie przesuwaj podłoża grzbietowego, ponieważ może to spowodować uszkodzenie komórek. </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza
Uwaga: Kultury kanapkowe są oparte na substratach 2D, więc mogą być często analizowane przez procedury już opracowane dla standardowych kultur 2D. Na przykład, ponieważ PLLA jest przezroczysta, a komórki są ograniczone do poruszania się w płaszczyźnie x-y, mikroskopia jest wykonywana jak na podłożach 2D. Migracja komórek może być zatem analizowana jak w przypadku kultur 2D, bez konieczności śledzenia komórek w osi z, jak w przypadku kultur 3D, co upraszcza eksperyment i analizę obrazu. Aby zbadać test gojenia się ran za pomocą testu zadrapania, postępuj zgodnie z tym protokołem:

<ol>
	<li>Zbadaj migrację komórek (test gojenia się ran) w kulturze przypominającej kanapkę.
	<ol>
		<li>Pracuj w kapturze hodowlanym, aby zapewnić sterylne warunki i wysterylizuj wszystkie materiały (szkiełka nakrywkowe, podłoża grzbietowe, pęsety itp.) poprzez ekspozycję na promieniowanie UV przez 30 minut.</li>
		<li>Pokryj podłoże brzuszne i grzbietowe fibronektyną w celu kierowania specyficzną adhezją komórkowo-białkową. W tym celu należy inkubować próbki w 20 μg/ml fibronektyny rozpuszczonej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco zawierającej Ca2+ i Mg2+ przez 1 godzinę.
		<ol>
			<li>Po pokryciu powłoką białkową należy dwukrotnie przemyć próbki DPBS w celu usunięcia nadmiaru białka. Następnie inkubuj próbki w DPBS do czasu ich użycia, aby zapobiec wyschnięciu próbek, ponieważ może to spowodować denaturalizację białek. Stosować DPBS zawierający Ca2+ i Mg2+, ponieważ kationy dwuwartościowe regulują fałdowanie białek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Komórki nasienne na szklanych szkiełkach nakrywkowych o dużej gęstości13.</li>
		<li>Umieścić próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i pozwolić komórkom osiągnąć zbieżność.</li>
		<li>Użyj końcówki pipety, aby zarysować monowarstwę komórek, aby uzyskać 2 populacje komórek oddzielone szczeliną.</li>
		<li>Umieść brzuszny substrat wysiewany w nowej studzience odpowiedniej do akwizycji poklatkowej i w miejscu, w którym mieszczą się podłoża grzbietowe (tj. 12-dołkowa płytka wielodołkowa).</li>
		<li>Ostrożnie i za pomocą pęsety nałożyć podłoże grzbietowe na komórki, a następnie ponownie napełnić pożywką (1 ml na płytkę 12-dołkową). 
		Uwaga: Ciężar podkładki zapobiegnie unoszeniu się podłoża grzbietowego.</li>
		<li>Umieścić próbkę w mikroskopie poklatkowym (ustawionym na 37 °C i 5% CO2 ) i wykonywać zdjęcia zamknięcia szczeliny co 20 minut.</li>
		<li>Przeanalizuj zamknięcie luki za pomocą specjalnego oprogramowania, takiego jak wtyczka MiToBo firmy ImageJ. 14</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Uwaga: Ekstrakcja białek i kwasów nukleinowych odbywa się podobnie jak na podłożach 2D. Jest tylko jeden dodatkowy krok, który polega na rozebraniu kultury przypominającej kanapkę w celu dodania buforu do lizy bezpośrednio na komórki w celu zwiększenia wydajności ekstrakcji. Na przykład w przypadku ekstrakcji mRNA:
<ol start="2">
	<li>Ekstrakcja mRNA z kultur podobnych do kanapek
	<ol>
		<li>Przygotuj wszystkie z zestawu komercyjnego zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Wyjmij kulturę przypominającą kanapkę z inkubatora.</li>
		<li>Usunąć pożywki hodowlane z próbek.</li>
		<li>Przemyć próbki raz DPBS zawierającym Ca2+ i Mg2+ (1 ml) i usunąć cały roztwór.</li>
		<li>Za pomocą pęsety usuń podłoże grzbietowe i dodaj bufor do lizy (350 μl) do podłoża brzusznego. Ponownie nałożyć substrat grzbietowy na substrat brzuszny w celu lizy również komórek przylegających do podłoża grzbietowego.</li>
		<li>Usuń podłoże grzbietowe, aby wyizolować roztwór do lizy.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać mRNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Uwaga: Immunodetekcja białek może być również przeprowadzona jak na podłożach 2D. Ponieważ kultury przypominające kanapki mogą utrudniać prawidłową dyfuzję przeciwciał i, należy wydłużyć czas inkubacji. Kanapkę można również zdemontować przed rozpoczęciem protokołu barwienia, ale w tym ostatnim przypadku niektóre komórki pozostaną przyczepione do podłoża grzbietowego, a niektóre do podłoża brzusznego.
<ol start="3">
	<li>Immunodetekcja białek w kulturze przypominającej kanapkę
	<ol>
		<li>Przemyć próbkę raz za pomocą DPBS i utrwalić 4% formaldehydem w PBS przez 20 minut w temperaturze 4 °C. 
		Uwaga: Podłoże grzbietowe można usunąć podczas procesu utrwalania, aby uniknąć problemów z dyfuzją.</li>
		<li>Płukać preparatem DPBS (1 ml), a następnie przepuszczać wodę 0,5% Triton X-100 w DPBS (1 ml) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania za pomocą 1% albuminy w DPBS (1 ml) przez 30 minut w RT.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (2 μg/ml; 1 ml) w roztworze blokującym przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj 3 razy przez 10 minut za pomocą DPBS/0,5% Tween 20 (1 ml).</li>
		<li>Inkubować przez 2 godziny z przeciwciałami drugorzędowymi (2 μg/ml) i 1 μg/ml DAPI w roztworze blokującym (1 ml) w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Prać 3 razy przez 10 minut w DPBS/0,5% Tween 20 (1 ml).</li>
		<li>Prać w DPBS. 
		Uwaga: Próbki można zamontować na szkiełku z Vectashield i uszczelnić lakierem do paznokci, gdy podłoża grzbietowe zostaną usunięte przed wykryciem immunologicznym.</li>
		<li>Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym jak dla standardowych podłoży 2D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension%3A+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).</li>
<li>Ruffner, H., Lichtenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems--towards+primary+drug+discovery+platforms%3A+an+interview+with+Heinz+Ruffner+%28Novartis%29+and+Jan+Lichtenberg+%28InSphero%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero).</a> Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).</li>
<li>Horning, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+tumor+model+for+in+vitro+evaluation+of+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs.</a> Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration%3A+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).</li>
<li>Schor, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+%27sandwich%27+assay+for+quantifying+chemo-regulated+cell+migration+within+3-dimensional+matrices%3A+wound+healing+cytokines+exhibit+distinct+motogenic+activities+compared+to+the+transmembrane+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).</li>
<li>Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+system+for+the+assessment+of+cell+migration+on+3D+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).</li>
<li>Zaman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li>
<li>Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+and+ventral+stimuli+in+sandwich-like+microenvironments.+Effect+on+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation.</a> Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).</li>
<li>Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-matrix+sandwich-like+microenvironments+to+manipulate+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate.</a> Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).</li>
<li>Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+and+ventral+stimuli+in+cell-material+interactions%3A+effect+on+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology.</a> Biointerphases. 7 (1-4), 39(2012).</li>
<li>Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+within+confined+sandwich-like+nanoenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments.</a> Nanomedicine. , (2015).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. J. Vis. Exp. , (2015).</li>
<li>Glaß, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Migration+Analysis%3A+Segmenting+Scratch+Assay+Images+with+Level+Sets+and+Support+Vector+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recogn%22%5BJournal%5D)">Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines.</a> Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
<li>Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+traction-mediated+manipulation+of+the+cell%2Fmatrix+interface+to+control+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate.</a> Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li>
<li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulatory+effects+of+a+three-dimensional+microenvironment+on+cell-mediated+fibronectin+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W dzisiejszych czasach hodowla 3D jest ważnym tematem dla przemysłu farmaceutycznego i biotechnologicznego, a także badań w zakresie biologii komórki, w tym nowotworów i komórek macierzystych. W związku z tym opracowano kilka systemów hodowli 3D. Niestety, różnice między systemami 3D zwykle skutkują różnym zachowaniem komórek, co utrudnia zrozumienie ich losu. Poza tym procedury eksperymentalne zwykle nie są tak proste, jak w przypadku systemów hodowli 2D. Dlatego bardzo ważne jest opracowywanie nowych systemów kulturowy...

Tradycyjnie, hodowla komórkowa była przeprowadzana na dwuwymiarowych (2D) podłożach, chociaż większość mikrośrodowisk komórkowych in vivo ma charakter trójwymiarowy (3D). To nienaturalne środowisko 2D wywołuje zmiany w zachowaniu komórek jako sposób na samoadaptację do płaskiego świata, co bezpośrednio wpływa na los komórki1,2. W związku z tym wyniki uzyskane na hodowlach komórkowych 2D nie zawsze są odtwarzalne in vivo. Zachęciło to do opracowania nowych odpowiednich systemów hodowli, mających na celu zapewnienie warunków bardziej zbliżonych do fizjologicznych, aby uzyskać dalszy wgląd w dowolny mechanizm biologiczny zależny od wymiaru3,4.
Jedną z głównych różnic między hodowlą 2D a środowiskiem 3D in vivo jest rozmieszczenie receptorów komórkowych zakotwiczonych w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM): podczas gdy na podłożach 2D komórki przylegają brzusznie, większość komórek in vivo jest całkowicie otoczona przez ECM, a zatem adhezja komórek następuje poprzez dystrybucję receptorów 3D. Uruchamia to różne szlaki sygnałowe adhezji komórek, modulując w ten sposób ważne procesy, takie jak wzrost komórek, różnicowanie komórek i ekspresja genów. W ciągu ostatnich dziesięcioleci powstało wiele różnych systemów hodowli 3D5-8, chociaż ich zmienność i złożoność utrudniają ich standaryzację w typowych procedurach hodowli komórkowych. Co więcej, systemy 3D zwykle nie są łatwe w obsłudze, a obecne procedury eksperymentalne na podłożach 2D nie mogą być łatwo ustalone dla kultur 3D. Ponadto literatura rzadko porównuje hodowle 3D z równoważnymi warunkami 2D lub innymi systemami 3D, co utrudnia właściwe zrozumienie zachowania komórek w tych modelach.
Po przyklejeniu komórek do podłoża 2D, wzbudzenie receptorów grzbietowych — poprzez nałożenie warstwy nowego materiału (kultura typu sandwich) — może wywołać reakcje komórek podobne do środowisk 3D. Powodem tego jest jednoczesna aktywacja zarówno receptorów grzbietowych, jak i brzusznych w celu przylegania i rozprzestrzeniania się w środowisku kanapkowym (ryc. 1)9,10. W konsekwencji w komórkach zachodzą ważne zmiany w stosunku do kultur 2D11,12. W ten sposób los komórki jest determinowany podczas składania z powodu kultury kanapkowej, ponieważ stymulacja grzbietowa wyzwala zmiany w kluczowych szlakach komórkowych. Dlatego los komórki jest wysoce zdeterminowany przez czas kiedy składa się kultura przypominająca kanapkę11.
Ze względu na charakter systemu, kultura przypominająca kanapkę jest prostym i wszechstronnym narzędziem, które pozwala na badanie różnych parametrów interakcji komórka/materiał, takich jak chemia, topografia, sztywność i powłoki białkowe zarówno po stronie brzusznej, jak i grzbietowej. Zapewnia to wyższy stopień wszechstronności w porównaniu z innymi systemami 3D (ilustracja 2) ze względu na niezależną kombinację grzbietową i brzuszną w szerokim zakresie warunków powierzchni. Dodatkowo można badać różne linie komórkowe i różne czasy składania kultury przypominającej kanapkę, co zwiększa szerokie spektrum możliwości.
Standardowy protokół hodowli kanapkowej jest szczegółowo opisany poniżej, używając albo elektroprzędzonych włókien lub folii z poli-L-kwasu mlekowego (PLLA) jako substratów grzbietowych, szklanego szkiełka nakrywkowego jako substratu brzusznego i fibronektyny jako powłoki białkowej. Kultury przypominające kanapki montowano tuż po wysianiu komórek lub po 3 godzinach hodowli 2D. Należy jednak pamiętać, że można użyć innych systemów materiałowych i białek; Podobnie kultura przypominająca kanapkę może być montowana w różnych punktach czasowych.

<table><tbody><tr><td>Ploy(kwas mlekowy)</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe (12 mm&Oslash;)</td><td>Marienfeld</td><td>631-0666</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Scharlab</td><td>CL0200</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Sigma</td><td>105228</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Strzykawka (1 ml)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010-200V0</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>New Era Systemy pompowe</td><td>NE1000</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Zasilacz wysokiego napięcia DC</td><td>Inkubator sprzętu wysokonapięciowego</td><td>Glassman serii FC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hucoa-Herl&ouml; s</td><td>3111</td><td>Sprzęt Przepływ</td></tr><tr><td>laminarny&nbsp; kaptur</td><td>Telstar</td><td>AV30/70</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Ludzka fibronektyna</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Mikroskop odwrócony</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI 6000</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Odczynnik</td></tr></tbody></table>

mikrośrodowiska przypominające kanapki w celu wykorzystania interakcji między komórkami a materiałami

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Hodowla komórkowa była tradycyjnie przeprowadzana na dwuwymiarowych (2D) podłożach, gdzie komórki przylegają za pomocą receptorów brzusznych do powierzchni biomateriału. Jednak in vivo większość komórek jest całkowicie otoczona macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), co powoduje trójwymiarową (3D) dystrybucję receptorów. Może to wywołać różnice w szlakach sygnałowych na zewnątrz-wewnątrz, a tym samym w zachowaniu komórek.
Ten artykuł pokazuje, że stymulacja receptorów grzbietowych komórek już przyklejonych do podłoża 2D poprzez nałożenie warstwy nowego materiału (kultura przypominająca kanapkę) powoduje ważne zmiany w stosunku do standardowych kultur 2D. Co więcej, jednoczesne wzbudzenie receptorów brzusznych i grzbietowych przesuwa zachowanie komórki bliżej tego, które można znaleźć w środowiskach 3D. Dodatkowo, ze względu na charakter systemu, kultura przypominająca kanapkę jest wszechstronnym narzędziem, które pozwala na badanie różnych parametrów interakcji komórka/materiał, np. topografii, sztywności i różnych powłok białkowych zarówno po stronie brzusznej, jak i grzbietowej. Wreszcie, ponieważ kultury typu sandwich są oparte na podłożach 2D, kilka procedur analitycznych opracowanych już dla standardowych kultur 2D może być normalnie stosowanych, pokonując bardziej złożone procedury potrzebne w systemach 3D.

Stymulacja receptorów grzbietowych w hodowli typu kanapkowego wywołuje zmiany w morfologii komórek, adhezji komórkowej i wewnątrzkomórkowych szlakach sygnalizacyjnych (np. kinaza adhezji ogniskowej, FAK)10-12. Przykładowo, fibroblasty hodowane w systemie typu kanapkowego wykazywały nadekspresję podjednostki integryny α5 w porównaniu do hodowli 2D, co obserwowano również w przypadku innych hodowli 3D15,16.
Los komórek jest w dużym stopniu zależny od mo...

Poniższy protokół opisuje procedurę składania kultur podobnych do kanapek, które mają być używane jako etap pośredni między dwuwymiarowymi (2D) i trójwymiarowymi (3D) środowiskami komórkowymi. Opracowane systemy mogą znaleźć zastosowanie w badaniach mikroskopii, biomechaniki, biochemii i biologii komórki.

Mikrośrodowiska przypominające kanapki w celu wykorzystania interakcji między komórkami a materiałami

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie kultur typu kanapkowego w celu zbadania zachowania komórek w bardziej fizjologicznie istotnym środowisku 3D. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie i powlekanie podłoży brzusznego oraz grzbietowego białkami, takimi jak fibronektyna. Następnie komórki są wysiewane w sposób podobny do standardowej hodowli 2D.Następnie nakłada się podłoże grzbietowe, aby komórki były stymulowane od strony brzusznej i grzbietowej. Na koniec można przeprowadzić eksperymenty, takie jak test gojenia ran. Ostatecznie kultury typu kanapkowego analizuje się za pomocą procedur opracowanych już dla standardowych kultur 2D, takich jak obrazowanie żywych komórek, immunofluorescencja lub ekstrakcja komórkowa.Do dalszych analiz. Główną zaletą tej techniki hodowli w porównaniu z istniejącymi systemami trójwymiarowymi jest możliwość badania różnych parametrów oddziaływań materiałowych, takich jak topografia, chemia, sztywność i zawartość białek zarówno w miejscach brzusznych, jak i grzbietowych, co zapewnia wysoki stopień wszechstronności. Ponadto procedury eksperymentalne, które w przypadku niektórych systemów trójwymiarowych mogłyby być utrudnione, takie jak barwienie lipidów, immunofluorescencja i ekstrakcje komórkowe, są łatwo wykonywalne. Aby wytworzyć płaski film z kwasu polimlekowego lub PLLA metodą odlewania z roztworu, pracując w dygestorium, należy dodać dwa gramy PLLA do 100 mililitrów chloroformu i mieszać w temperaturze pokojowej przez około trzy godziny lub do całkowitego rozpuszczenia.Umieść stalowe podkładki na szklanej płytce Petriego. Następnie dodaj 200 µL roztworu PLLA do podkładek. Przykryj płytkę folią aluminiową z kilkoma otworami i pozostaw PLLA do powolnego odparowania w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie podgrzej próbki w temperaturze 120°C przez pięć minut, aby odparować wszelkie ślady rozpuszczalnika. Po schłodzeniu próbek w temperaturze pokojowej przez około 30 minut, zalej próbki w szalce wodą o oporności 18,2 MΩ·cm i inkubuj w temperaturze pokojowej przez osiem minut. Po inkubacji za pomocą żyletki oddziel podkładki od szalki Petriego.Następnie za pomocą pęsety należy usunąć wszelkie niedoskonałości z krawędzi podkładek i pozostawić próbki do wyschnięcia na powietrzu. Ponieważ PLLA ulega degradacji w wyniku hydrolizy, próbki należy przechowywać w eksykatore próżniowym do dnia przeprowadzenia eksperymentów. Dodatkowo włókna ELLA mogą zostać wytworzone zgodnie z protokołem tekstowym i wykorzystane jako podłoże grzbietowe pod sterylną dygestorem.Do próbek dodać 20 µg/mL fibronektyny w PBS lub DPBS z wapniem i magnezem i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę po powleczeniu białkiem. Próbki przemyć dwukrotnie DPBS i przechowywać w DPBS z wapniem i magnezem do momentu użycia. Następnie wysiać komórki na szkiełka przedmiotowe i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez trzy godziny, aby umożliwić adhezję komórek do podłoża. Następnie przenieść próbki do nowych studni płytki 12-dołkowej.Za pomocą pęsety ostrożnie nałóż podłoże grzbietowe na komórki. Następnie dodaj 1 ml pożywki. Ciężar podkładki zapobiegnie wypływaniu podłoża grzbietowego na powierzchnię.Przenieść próbki do temperatury 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide, wymieniając medium dwa razy w tygodniu w celu zbadania migracji komórek w hodowli typu kanapkowego. Po pokryciu podłoży brzusznego i grzbietowego fibronektyną, zgodnie z wcześniejszą procedurą, zasiać komórki na szkiełkach nakrywkowych o wysokiej gęstości, inkubować próbki i poczekać, aż komórki osiągną konfluencję. Następnie, za pomocą końcówki pipety, zadrapać monowarstwę komórek, aby stworzyć dwie populacje komórek oddzielone przerwą.Umieść podłoże z komórkami osadzonymi w pozycji brzusznej w nowym dołku odpowiednim do akwizycji time-lapse i wystarczająco dużym, aby pomieścić podłoża grzbietowe. Następnie, używając pęsety w sposób zaprezentowany wcześniej, nałóż podłoże grzbietowe na komórki i uzupełnij pożywkę. Umieść próbkę pod mikroskopem do obrazowania time-lapse i rejestruj obrazy zamykania się szczeliny co 20 minut.Należy użyć oprogramowania, takiego jak mito BO z programu Image J, aby przeanalizować zamykanie przerwy w hodowli typu „sandwich”. Stopień domknięcia jest silnie zależny od czasu stymulacji receptorów grzbietowych oraz właściwości oddziaływań grzbietowych.Podobnie jak w innych systemach 3D, na przykład w hydrożelach, co pokazano tutaj, elektroprzędzone włókna PLLA ułożone grzbietowo kierują wyrównaniem komórek po pokryciu fibronektyną, ale nie dzieje się tak w przypadku pokrycia białkiem nieadhezyjnym, takim jak BSA. Ponadto hodowle typu kanapkowego z samym PLLA ułożonym grzbietowo wywołały wzrost poziomu miogenezy z użyciem komórek C2C12. Zależy to również od grzbietowych bodźców biologicznych.Ponieważ interakcja z różnymi białkami grzbietowymi skutkuje odmiennymi tempami różnicowania, jak pokazano w tym filmie, fibroblasty migrujące w kulturze typu kanapkowego w teście gojenia ran przyjmują wydłużoną morfologię i pokonują krótsze dystanse w porównaniu do komórek hodowanych na podłożach 2D, podobnie jak w przypadku 3D żeli z fibronektyny i kolagenu. Hodowla typu kanapkowego zwiększa komórkową reorganizację ECM w porównaniu do warunków 2D.Proces ten opiera się na grzbietowych bodźcach mechanicznych oraz stabilności cytoszkieletu. Ponieważ zastosowanie inhibitorów kurczliwości, takich jak BLEs czy statyny, utrudniło ten proces S Dobrze, po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak przygotować hodowle typu kanapkowego. Metoda ta pozwala na stworzenie 3D-podobnego mikrośrodowiska dla medycyny regeneracyjnej i onkologii, w tym w zastosowaniach w modelach chorób, badaniach rozwojowych oraz testach leków.

sandwich-like-microenvironments-to-harness-cellmaterial-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy artykuł opisuje podejście eksperymentalne do dynamicznej regulacji oddziaływań międzykomórkowych między komórkami adherentnymi w skali mikrometrycznej. Zademonstrowano manipulację komunikacją międzykomórkową pomiędzy hepatocytami a komórkami zrębowymi. Opracowana platforma umożliwia badanie oddziaływań komórka-komórka w różnorodnych procesach biologicznych, w tym w rozwoju i patogenezie.

Krzemowe mikroczipy do manipulowania oddziaływaniami międzykomórkowymi

Przedstawiamy prostą metodę rozmieszczania komórek w wybranych miejscach na podłożu. Metoda ta polega na tworzeniu wzorów komórkowych poprzez odwrócenie krzemowego chipa zawierającego wypełnione komórkami mikrownęki i dociśnięcie go do podłoża. Metoda ta stanowi nowy sposób modulowania sygnalizacji dyfuzyjnej oraz jukstakrynnej między komórkami.

Wzorowanie embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem Bio Flip Chip

Zgłaszamy urządzenie i nową metodę badania komórek i embrionów. Pojedyncze komórki są precyzyjnie uporządkowane w układach mikrownękowych. Ich uwięzienie w 3D jest krokiem w kierunku środowisk 3D spotykanych w warunkach fizjologicznych i umożliwia orientację organelli. Kontrolując kształt komórki, ta konfiguracja minimalizuje zmienność zgłaszaną w standardowych testach.

Porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3D: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości

Mikro-prefabrykowane urządzenia zintegrowane z komponentami fluidycznymi stanowią platformę in vitro do badań komórkowych naśladujących mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy mikroprzepływowe chipy na bazie polimetakrylanu metylu do badania reakcji komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających.

Projektowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania odpowiedzi komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Ten raport opisuje metodę opartą na chipie mikroprzepływowym, która pozwala na przeprowadzenie eksperymentu z pojedynczą hodowlą komórkową, w którym można uzyskać wysokowydajne parowanie i mikroskopową analizę wielu pojedynczych komórek.

Ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj metodę montażu mikrośrodowisk przypominających kanapki do badania zachowań komórkowych w fizjologicznie trafnym środowisku 3D. Technika umożliwia dwustronną stymulację komórek i adaptację metod analizy 2D.

Mikrośrodowiska przypominające kanapki w celu wykorzystania interakcji między komórkami a materiałami

Przeglądaj więcej filmów