Mikrośrodowiska przypominające kanapki w celu wykorzystania interakcji między komórkami a materiałami

Ogólnym celem tej procedury jest złożenie kultur przypominających kanapki w celu zbadania zachowania komórek w bardziej fizjologicznie odpowiednim środowisku 3D. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie i pokrycie substratów brzusznych i grzbietowych białkami, takimi jak fibronektyna. Następnie komórki są sadzane podobnie jak w standardowej hodowli 2D.

Następnie nakłada się na nie podłoże grzbietowe, tak aby komórki były stymulowane brzusznie i grzbietowo. Na koniec można przeprowadzić eksperymenty, takie jak test gojenia się ran. Ostatecznie kultury kanapkowe są analizowane za pomocą procedur już opracowanych dla standardowych kultur 2D, takich jak obrazowanie na żywo, immunofluorescencja lub ekstrakcja komórkowa.

Do dalszej analizy. Główną przewagą tej techniki kulturowej nad istniejącymi systemami trójwymiarowymi jest to, że umożliwiła ona badanie różnych parametrów interakcji materiałowych, takich jak topografia, chemia, sztywność i zawartość białka zarówno w miejscu brzusznym, jak i grzbietowym, oferując wysoki stopień wszechstronności. Oprócz procedur eksperymentalnych, które mogą być utrudnione w przypadku niektórych systemów trójwymiarowych, takich jak lipina, immunofluorescencja i ekstrakcje komórkowe, można łatwo wykonać Aby wytworzyć płaską warstwę kwasu polimlekowego lub PLLA przez odlewanie rozpuszczalnikowe pracujące w dygestoriach, dodaj dwa gramy PLLA do 100 mililitrów chloroformu i mieszaj w temperaturze pokojowej przez około trzy godziny lub do całkowitego rozpuszczenia.

Umieść podkładki ze stali nierdzewnej na szklanej szalce Petriego. Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu PLLA do myjek. Użyj folii aluminiowej z kilkoma otworami, aby przykryć naczynie i pozwól PLLA powoli odparowywać w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie podgrzewaj próbki w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby odparować wszelkie ślady rozpuszczalnika. Następnie, po pozostawieniu próbek do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez około 30 minut, użyj wody o średnicy 18,2 megaoma centymetra, aby przykryć próbki w naczyniu i inkubować w temperaturze pokojowej przez osiem minut. Po inkubacji użyj żyletki, aby oderwać podkładki od szalki Petriego.

Następnie użyj pęsety, aby usunąć wszelkie niedoskonałości z krawędzi podkładek i pozostaw próbki do wyschnięcia na powietrzu. Ponieważ PLLA ulega degradacji w procesie hydrolizy, próbki w próżni wysychają do dnia eksperymentów. Dodatkowo włókna ELLA mogą być produkowane zgodnie z protokołem tekstowym i mogą być używane jako podłoże grzbietowe pod sterylnym kapturem hodowlanym.

Dodać 20 mikrogramów na mililitr FI nin w docos PBS lub DPBS z wapniem i magnezem do próbek i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę po otoczce białkowej. Użyj DPBS do dwukrotnego przemycia próbek i przechowuj w DPBS z P, wapniem i magnezem, aż będą gotowe do użycia następne komórki nasienne na szkiełkach przykrywkowych i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy godziny, aby komórki mogły przylegać do podłoża brzusznego. Następnie przenieś próbki do nowych dołków na płytce 12-dołkowej.

Za pomocą pęsety ostrożnie nałóż podłoże grzbietowe na komórki. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki. Ciężar podkładki zapobiegnie unoszeniu się podłoża grzbietowego.

Przywróć próbki do 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, zmieniając pożywkę dwa razy w tygodniu, aby zbadać migrację komórek w kulturze przypominającej kanapkę. Po pokryciu substratów brzusznych i grzbietowych fibronektyną, jak wykazano wcześniej, komórki nasienne na szkle pokrywają szkiełka o dużej gęstości, inkubują próbki i pozwalają komórkom osiągnąć zbieżność. Następnie użyj końcówki pipety, aby zarysować monowarstwę komórek, aby utworzyć dwie populacje komórek oddzielone szczeliną.

Umieść brzuszne podłoże siedzące w nowej studzience odpowiedniej do akwizycji poklatkowej i wystarczająco dużej, aby zmieściły się w niej podłoża grzbietowe. Następnie za pomocą pęsety, jak pokazano wcześniej, nałóż podłoże grzbietowe na komórki i ponownie napełnij podłożem. Umieść próbkę pod mikroskopem poklatkowym i rób obrazy zamknięcia szczeliny co 20 minut.

Użyj oprogramowania, takiego jak mito BO firmy Image J, aby przeanalizować zamknięcie szczeliny w kanapce. Jak kultura. Siarczan jest silnie zależny od czasu, w którym stymulowane są receptory grzbietowe oraz od właściwości interakcji grzbietowej.

Podobnie jak w przypadku innych systemów 3D, takich jak na przykład hydrożele, jak widać tutaj, grzbietowe elektroprzędzone włókna PLLA kierują wyrównaniem komórek, gdy są pokryte fibronektyną, ale nie wtedy, gdy są pokryte nieadhezyjnym białkiem, takim jak BSA. Dodatkowo, hodowle kanapkowe ze zwykłym grzbietowym PLLA wywołały wzrost poziomu miogenezy przy użyciu komórek C 2 C 12. Zależy to również od bodźców biologicznych grzbietowych.

Ponieważ interakcja z różnymi białkami grzbietowymi powoduje wyraźne tempo różnicowania, jak pokazano w tym filmie, fibroblasty migrujące w obrębie kultury przypominającej kanapkę w teście gojenia się ran przyjmują wydłużoną morfologię i migrują na krótsze odległości w porównaniu z komórkami. Hodowane na podłożach 2D podobnych do fibronektyny 3D i żeli kolagenowych. Hodowla typu sandwich zwiększa reorganizację ECM za pośrednictwem komórek w porównaniu z warunkami 2D.

Proces ten opiera się na grzbietowych bodźcach mechanicznych i stabilności cytoszkieletu. Ponieważ stosowanie inhibitorów kurczliwości, takich jak BLE, statyny utrudniały ten proces W porządku, więc po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć jasne zrozumienie, jak składać kultury przypominające kanapki. Ta metoda może zaprojektować mikrośrodowisko podobne do 3D dla medycyny reakcji i raka, w tym zastosowań w modelach chorób, badaniach rozwojowych i testach leków.