Name: In Situ Mapowanie właściwości mechanicznych biofilmów za pomocą mikroreologii śledzącej cząstki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Poznaj mikroreologię śledzącą cząstki do badania właściwości lepkosprężystych biofilmów bakteryjnych. Ta nieniszcząca metoda pozwala mierzyć podatność pełzania i rolę składników macierzy w strukturze biofilmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane przez Narodową Fundację Badawczą i Ministerstwo Edukacji Singapuru w ramach programu Centrum Doskonałości Badawczej, Start-up Grants (M4330002. C70) z Uniwersytetu Technologicznego Nanyang oraz AcRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) z Ministerstwa Edukacji w Singapurze. Autorzy dziękują Joeyowi Yamowi Kuok Hoongowi za udział w demonstracji tego protokołu.

1. Hodowla biofilmu
<ol>
	<li>Przygotowanie szczepów bakteryjnych
	<ol>
		<li>Na 1 dzień przed hodowlą biofilmu przygotować planktoniczne kultury bakteryjne poprzez zaszczepienie 2 ml odpowiedniej pożywki z zamrożonej kultury bakterii. Dla śluzowatego P. aeruginosa oraz jego mutantów z defektem Δpel i Δpsl należy użyć pożywki Luria-Broth (10 g L-1 NaCl, 10 g L-1 ekstraktu drożdżowego i 10 g L-1 tryptony). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm. Rozcieńczyć nocne kultury do wartości OD600 wynoszącej 0,40, korzystając ze spektrofotometru.</li>
		<li>Złożyć układ komory przepływowej (flow cell), który został opisany wcześniej 14, najlepiej na stacji mobilnej lub wózku, który można przetransportować do pomieszczenia z mikroskopem w celu obrazowania komory przepływowej bez konieczności jej demontażu.</li>
		<li>Przygotować sterylną pożywkę w butelkach o pojemności 2 L lub 5 L dla każdej komory przepływowej. Dla biofilmów P. aeruginosa w komorach przepływowych należy użyć minimalnej pożywki M9 (48 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 19 mM NH4Cl, 9 mM NaCl, 2 mM MgSO4 i 0,1 mM CaCl2) uzupełnionej o 0,04% glukozy (masowy/objętościowy) i 0,2% (masowy/objętościowy) kwasów kasamino.</li>
		<li>Odmierzyć alikwoty fluorescencyjnych mikrosfer do probówek do mikrocentryfugi i wirować w sterylnym H2O przez 5 min w wirówce przy 9 391,2 g. Usunąć nadsącz i resuspenderować w 1 ml pożywki w celu usunięcia azotku sodu (środka dezynfekcyjnego) przed dodaniem do pożywki w butelkach 2 L lub 5 L. 
		UWAGA: Mikrosfery o różnych rozmiarach występują w różnych stężeniach i powinny być rozcieńczane zgodnie z instrukcjami. Na przykład: zdyspergować 120 µl mikrosfer o średnicy 1,0 µm, 15 µl mikrosfer o średnicy 0,5 µm i 0,96 µl mikrosfer o średnicy 0,2 µm w 2 L pożywki, aby uzyskać stężenie 2,18 × 106 mikrosfer ml-1 dla każdego rozmiaru cząsteczek.</li>
		<li>Podłączyć butelkę z pożywką przed komorą przepływową i pozwolić pożywce przepłynąć przez cały układ. Zatrzymać przepływ i wstrzyknąć rozcieńczone nocne kultury do komór przepływowych. Pozostawić bakterie do przytwierdzenia się do podłoża ze szkiełka nakrywkowego na 1 h przed wznowieniem przepływu pożywki z prędkością około 5,5 x 10-3 m sec-1, lub 8 rpm przy użyciu pompy perystaltycznej. 
		UWAGA: Biofilmy są zazwyczaj hodowane w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 3-7 dni.</li>
		<li>Alternatywnie, w przypadku układu do hodowli statycznej, rozcieńczyć nocne kultury 100-krotnie w probówkach do mikrocentryfugi, dodając 10 µl nocnej kultury do 1 ml pożywki z cząsteczkami. Zwiększyć stężenie cząsteczek w pożywce do hodowli statycznej około 500-krotnie w porównaniu do stężenia stosowanego dla biofilmów przepływowych (np. przemyć i resuspenderować 600 µl sfer o średnicy 1,0 µm w 10 ml pożywki), ponieważ biofilmy w komorach przepływowych są stale uzupełniane cząsteczkami, a hodowle statyczne nie.
		<ol>
			<li>Dodać 200 µl rozcieńczonej nocnej kultury z cząsteczkami do komór szkiełek 8-dołkowych. Inkubować w 37 °C w warunkach statycznych. Biofilmy są zazwyczaj hodowane przez 1 dzień. Codziennie wymieniać zużytą pożywkę na świeżą pożywkę z cząsteczkami, jeśli biofilm jest hodowany dłużej niż 1 dzień.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mikroskopia
<ol>
	<li>W 3. i 5. dniu wyłączyć przepływ z pompy perystaltycznej i przenieść układ komory przepływowej do pomieszczenia z mikroskopem. Zapiąć wężyki w pobliżu wlotu i wylotu komór przepływowych, aby zapobiec dryftowi (błędowi systematycznemu spowodowanemu zmianami w otoczeniu) wynikającemu z przepływu. Umieścić komorę przepływową na stoliku mikroskopu biologicznego (pionowego). 
	UWAGA: Do obrazowania mikrowyżyn należy używać mikroskopu odwróconego.</li>
	<li>Wykorzystać mikroskopię fluorescencyjną z obiektywem olejowym 40X do nagrania filmów obrazujących ruch mikrosfer osadzonych w biofilmie w różnych miejscach (mikrokolonie i płaskie warstwy niezróżnicowane) oraz w różnych dniach (dzień 3. i 5.) w celu przeprowadzenia badań czasowych i przestrzennych. Nagrywać krótsze filmy z wyższą częstotliwością klatek, aby badać zdarzenia występujące w krótkich skalach czasowych (np. filmy trwające 1,5-3 min przy częstotliwości 25-50 klatek na sekundę dla szybkiej dynamiki) oraz dłuższe filmy z niższą częstotliwością klatek, aby badać zdarzenia w dłuższych skalach czasowych (np. filmy trwające 15-30 min przy częstotliwości 2,5-5 klatek/sek dla wolniejszej dynamiki). 
	UWAGA: Film zazwyczaj zawiera 5-10 cząsteczek i ma zazwyczaj rozmiar pliku od 1,0-2,5 GB. Większe mikrokolonie mogą zawierać więcej cząsteczek. Nagrać 5-10 filmów dla każdej kategorii (np. 5-10 filmów różnych mikrokolonii oraz różnych miejsc w płaskich warstwach niezróżnicowanych). Biofilm posiada heterogenną architekturę, która może składać się z mikrokolonii, kanałów, pustek i płaskich warstw niezróżnicowanych.</li>
	<li>Zapisywać filmy w odpowiednim formacie możliwym do odczytu przez Fiji/ImageJ (np. czi, tif).</li>
	<li>Sprawdzić filmy pod kątem dryftu, przewijając gotowy materiał i obserwując, czy cząsteczki nie poruszają się jednocześnie w tym samym kierunku. Dryft może być spowodowany ruchem stolika w osi z, prądami w komorze przepływowej, niezrównoważeniem stołu antywibracyjnego, zmianami ciśnienia powietrza lub temperatury. Niewielki dryft korygować za pomocą technik postprocesingu zazwyczaj dostępnych w oprogramowaniu mikroskopu. Odrzucić wszystkie filmy, w których dryftu nie można skorygować. Zapisać następujące parametry, które są wymagane podczas analizy śledzenia cząsteczek (Particle Tracking Analysis): rozdzielczość (px/um), liczbę klatek oraz czas trwania.</li>
	<li>Zdjąć komorę przepływową ze stolika mikroskopu i ponownie uruchomić pompę perystaltyczną, aby kontynuować hodowlę biofilmu.</li>
</ol>
3. Analiza śledzenia cząstek
<ol>
	<li>Wyznacz trajektorie cząstek za pomocą wtyczki TrackMate w oprogramowaniu o otwartym kodzie źródłowym (ImageJ). Pobierz program Fiji ze strony  <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a>Otwórz film w programie Fiji, a następnie w menu Plugins wybierz Tracking, a potem TrackMate.</li>
	<li>Sprawdź lub dostosuj ustawienia w oknie z sugerowanymi wstępnymi parametrami kalibracji, aby były one zgodne z parametrami wideo zarejestrowanymi w kroku 2.4.</li>
	<li>Wykrywanie cząstek w TrackMate przy użyciu ImageJ.
	<ol>
		<li>Wybierz „detektor LoG”, wprowadź średnicę cząstek oraz wartość progu (np. 1 000). Przewijaj wideo, klikając przycisk „Preview”, aby sprawdzić, czy fioletowe okręgi podążają za cząstkami w całym materiale. W razie potrzeby dostosuj średnicę oraz wartości progu: zwiększ wartość progu, jeśli fioletowe okręgi pojawiają się w pustej przestrzeni. Zmniejsz wartość progu, jeśli wykryto zbyt mało cząstek. Kliknij przycisk „Next”, aby zakończyć detekcję cząstek.</li>
		<li>Kliknij przycisk „Next”, gdy pojawi się opcja dodawania lub usuwania cząsteczek wykrytych w oknach „Initial thresholding”, „Select a view” oraz „Select a filter”, aby kontynuować bez wprowadzania zmian, jeśli wstępne wykrywanie cząsteczek było satysfakcjonujące.</li>
		<li>W pasku opcji okna „Select a tracker method” wybierz „Simple LAP tracker”, ponieważ cząsteczki w biofilmie rzadko wypadają z ogniska i są łatwe do śledzenia. Użyj sugerowanych lub niskich wartości dla parametrów „linking” oraz „gap-closing max distance”, a następnie kliknij „next”.</li>
		<li>Należy sprawdzić, czy śledzenie cząstek jest prawidłowe, przewijając wideo w celu weryfikacji, czy cząstki podążają za ścieżkami wyznaczonymi przez program TrackMate oraz czy nie występują niepożądane lub pominięte ścieżki. Pomiń poszczególne etapy filtrowania. Przejdź do końcowego okna „Select an action”. Z menu rozwijanego wybierz opcję „Export tracks to xml file”, a następnie kliknij „Execute”. Wybierz folder, w którym zostaną zapisane ścieżki. 
		UWAGA: W domenie publicznej dostępnych jest wiele programów do analizy trajektorii cząstek i zastosowań mikrorheologii. msdanalyzer oraz TrackArt są przykładami programów do analizy śledzenia cząstek, które działają w środowisku Matlab.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj program Matlab do importu trajektorii cząstek z plików xml, wybierając odpowiednią opcję w menu programu Matlab Plik&gt;Ustaw ścieżkę... i dodać skrypty folder dostępny w pakiecie Fiji.</li>
	<li>Aby przeanalizować trajektorie cząsteczek za pomocą msdanalyzer, należy pobrać plik zip lub plik tar.gz z poziomu łącza dostępnego pod adresem <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories
Analiza średniokwadratowego przemieszczenia trajektorii cząstek</a>.
	<ol>
		<li>Wypakuj folder @msdanalyzer15 i umieść go w folderze znajdującym się na ścieżce Matlab (np. C:\Dokumenty i Ustawienia\&lt;Nazwa użytkownika&gt;\Moje dokumenty\Matlab). Uruchom program Matlab i zainicjuj analizator, wpisując: 
		ma = msdanalyzer(2, 'um', 'sec') 
		gdzie μm i sek są jednostkami przestrzeni fizycznej i czasu w filmie.
		<ol>
			<li>Zaimportuj trajektorie cząstek, wpisując: 
			[tracks, md] = importTrackMateTracks('FileName.xml', 'clipZ', 'scaleT') 
			ma = ma.addAll(tracks); 
			gdzie „clipZ” usuwa wymiar z dla wideo 2D, a „scaleT”.</li>
			<li>Nanieś trajektorie na wykres, używając: 
			ma.plotTracks; 
			ma.etykietyŚcieżekWykresu;</li>
			<li>Oblicz wartości MSD cząstek, korzystając z: 
			ma = ma.computeMSD; 
			ma.msd</li>
			<li>Narysuj wykresy MSD dla każdej cząstki: 
			rycina 
			ma.plotMSD</li>
			<li>Połącz trajektorie cząstek z innych filmów z tej samej kategorii (np. cząsteczki osadzone w mikrokoloniach typu dzikiego w 3. dniu) poprzez powtórzenie kroków od 3.5.1.1 do 3.5.1.4).</li>
			<li>Narysuj średnią zespołu lub średnią ze wszystkich krzywych: 
			ma.plotMeanMSD 
			Zmień skalę osi y i x z liniowej na logarytmiczną. Przy długich czasach opóźnienia krzywe MSD stają się zaszumione ze względu na niewystarczającą statystykę w dłuższych skalach czasowych. Krzywe MSD mogą również gwałtownie rosnąć z powodu błędu dynamicznego. Obszary te można usunąć, używając narzędzia pędzla (brush tool) do zaznaczenia końcówki krzywej, a następnie wybierając opcję „Brushing”. &gt; „Usuń niezamalowane” w menu Narzędzia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pobierz Ezyfit z <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> i dodaj Ezyfit do folderu znajdującego się na ścieżce Matlab (np. C:\Documents and Settings\&lt;Nazwa użytkownika&gt;(\Dokumenty\Matlab). Zainstaluj menu Ezyfit, wpisując w obszarze roboczym programu Matlab polecenie efmenu install. Uruchom ponownie program MATLAB z menu Ezyfit w oknie rysunku. Dopasuj krzywe MSD do prawa potęgowej, wybierając w menu Ezyfit opcję „Show Fit”. &gt; Moc &gt; „a*x^n”, gdzie n jest szacowanym wykładnikiem dyfuzyjnym α. 
		UWAGA: msdanalyzer wymaga narzędzia Curve Fitting Toolbox w programie Matlab do dopasowywania krzywych MSD. Ezyfit jest alternatywnym, bezpłatnym oprogramowaniem, które umożliwia dopasowanie krzywych.</li>
		<li>Wyczyść aktualne trajektorie cząstek oraz wartości MSD, aby obliczyć nowe wartości MSD cząstek w innych lokalizacjach lub w innym czasie: 
		czysty</li>
		<li>Po obliczeniu różnych krzywych średniego kwadratu przesunięcia (MSD) cząstek w medium (kontrola) oraz mikrokolonii i obszarów nieróżnicowanych różnych szczepów, należy skopiować i wkleić krzywe na jeden wykres w celu porównania. Sztywność próbki i stopień usieciowania wzrastają wraz z niższymi wartościami MSD. Krzywe płaskie wykazują niższe α a próbka jest bardziej elastyczna niż w przypadku krzywych o większym nachyleniu z wyższymi α.</li>
		<li>Wybierz krzywą, a następnie przejdź do sekcji „Tools”, aby zapoznać się ze statystykami danych, takimi jak mediana i zakres. MSD kuleczki jest proporcjonalne do podatności pełzania, J(t) materiału, w którym zatopiony jest koralik, zgodnie z relacją, 
		<img alt="Diffusion coefficient formula J(t)=3πd/4kBT*MSD(t), mathematical equation." src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"> 
		gdzie J podatność na pełzanie, d = średnica cząstek, kB = stała Boltzmanna, T temperatura i t = czas.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+extracellular+polymeric+substances+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).</li>
<li>Chew, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Remodeling+of+Microbial+Biofilms+by+Functionally+Distinct+Exopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides.</a> mBio. 5 (4), (2014).</li>
<li>Irie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-produced+exopolysaccharide+is+a+signal+that+stimulates+biofilm+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).</li>
<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psl+trails+guide+exploration+and+microcolony+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Nature. 497, 388-391 (2013).</li>
<li>Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+and+PQS+mediated+subpopulation+interactions+involved+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+differentiation+in+co-culture+biofilms+formed+by+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).</li>
<li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).</li>
<li>Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+cellulose+and+curli+fimbriae+by+Escherichia+coli+isolated+from+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract.</a> J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).</li>
<li>Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+methods+for+characterisation+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microchim+Acta%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical methods for characterisation of biofilms.</a> Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).</li>
<li>Waigh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrheology+of+complex+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">Microrheology of complex fluids.</a> Rep Prog Phys. 68, 685-742 (2005).</li>
<li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-Tracking+Microrheology+of+Living+Cells%3A+Principles+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li>
<li>Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa.+and+Saccharomyces+cerevisiae.+Biofilm+in+Flow+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells.</a> J Vis Exp. , e2383(2011).</li>
<li>Tarantino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+and+IL-1+exhibit+distinct+ubiquitin+requirements+for+inducing+NEMO-IKK+supramolecular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures.</a> Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).</li>
<li>Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+starvation-induced+dispersion+in+Pseudomonas+putida+biofilms%3A+genetic+elements+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms.</a> Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).</li>
<li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li>
<li>Stoodley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+fluid+shear+and+AlCl3+on+the+material+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa.+PAO1+and+Desulfovibrio+sp.+EX265+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms.</a> Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).</li>
<li>Jäger-Zürn, I., Grubert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podostemaceae+depend+on+sticky+biofilms+with+respect+to+attachment+to+rocks+in+waterfalls%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls.</a> International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).</li>
<li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackArt%3A+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mikroreologia jest użytecznym narzędziem do lokalnych pomiarów reologicznych w układach heterogenicznych, takich jak biofilmy mikrobiologiczne. Jest to technika nieniszcząca, umożliwiająca monitorowanie w czasie rzeczywistym zmian reologicznych w tej samej próbce biologicznej w wielu punktach czasowych. W tym protokole zastosowano mikroreologię śledzenia cząstek do mutantów egzopolisacharydów Pel i Psl w celu zbadania, w jaki sposób wpływają one na elastyczność i skuteczne sieciowanie matrycy biofilmu. Psl sprzyja rozwoj...

Większość komórek bakteryjnych jest w stanie wykorzystać zarówno planktonowy (wolno żyjący), jak i powierzchniowy (siedzący) tryb wzrostu 1. W trybie wzrostu przyczepionego do powierzchni komórki bakteryjne wydzielają i otaczają się dużymi ilościami zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS), tworząc biofilmy. EPS składa się głównie z białek, egzopolisacharydu, zewnątrzkomórkowego DNA i jest niezbędny do tworzenia biofilmu 2. Służy jako fizyczne rusztowanie, za pomocą którego bakterie mogą różnicować się przestrzennie i chroni bakterie przed szkodliwymi warunkami środowiskowymi i reakcjami gospodarza. Różne składniki EPS odgrywają różne role w tworzeniu biofilmu 3, a zmiany w ekspresji składników EPS mogą radykalnie przemodelować struktury biofilmu 4. Składniki EPS mogą również funkcjonować jako cząsteczki sygnałowe 5, a ostatnie badania wykazały, że niektóre składniki EPS wchodzą w interakcje z komórkami drobnoustrojów, kierując ich migracją i różnicowaniem biofilmu 6-8.
Badania nad EPS znacznie posunęły się naprzód w oparciu o analizy morfologiczne biofilmów wytwarzanych przez mutanty wadliwe w określonym składniku EPS 9,10. Ponadto EPS jest zwykle charakteryzowany w skali makro (charakterystyka masowa) 11. W analizach morfologicznych może jednak brakować szczegółów ilościowych, a charakterystyka masowa, która zwraca wartości średnie, gubi szczegóły, które istnieją w niejednorodności biofilmu. Obecnie obserwuje się rosnącą tendencję do przechodzenia do charakterystyki właściwości mechanicznych EPS w czasie rzeczywistym w skali mikro. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób mikroreologia śledząca cząstki jest w stanie określić czasoprzestrzenny wpływ egzopolisacharydów składników matrycy Pel i Psl na lepkosprężystość i skuteczne sieciowanie biofilmów Pseudomonas aeruginosa 4.
Pasywna mikroreologia to prosta i tania metoda reologii, która zapewnia najwyższą do tej pory przepustowość przestrzennego pobierania próbek mikroreologicznych materiału 12,13. W mikroreologii pasywnej kulki sondy umieszcza się w próbce, a ich ruch Browna, napędzany energią cieplną (k, B, T), jest śledzony przez mikroskopię wideo. Kilka cząstek może być śledzonych jednocześnie, a współrzędne zależne od czasu cząstek podążają za konwencjonalnym losowym spacerem. Dlatego średnio cząstki pozostają w tej samej pozycji. Jednak odchylenie standardowe przemieszczeń lub średnie przemieszczenie kwadratowe (MSD) cząstek nie jest równe zeru. Ponieważ płyny lepkie płyną, cząstka MSD w lepkim płynie rośnie liniowo w miarę upływu czasu. W przeciwieństwie do tego, usieciowanie polimerowe znajdujące się w substancjach lepkosprężystych lub elastycznych pomaga im opierać się przepływowi, a cząstki stają się ograniczone w swoim przemieszczeniu, co prowadzi do plateau na krzywej MSD (rysunek 1A). Obserwacja ta jest zgodna z zależnością MSD∝tα , gdzie α jest wykładnikiem dyfuzyjnym, czyli powiązanym stosunkiem sprężystych i lepkich wkładów substancji. Dla cząstek poruszających się w lepkich cieczach α = 1, w substancjach lepkosprężystych 0 < α < 1, a w substancjach elastycznych α = 0. MSD może być również wykorzystany do obliczenia podatności na pełzanie, czyli tendencji materiału do trwałego odkształcania się w czasie i oszacowania, jak łatwo materiał się rozprzestrzenia.
Wielkość, gęstość i chemia powierzchni cząstki są kluczowe dla prawidłowego przeprowadzenia eksperymentu mikroreologicznego i są wybierane w odniesieniu do badanego systemu (w tym przypadku polimery matrycy biofilmu, patrz Rysunek 1B). Po pierwsze, cząstka mierzy reologię substancji o strukturach, które są znacznie mniejsze niż sama cząstka. Jeśli struktury substancji mają podobną skalę do cząstki, ruch cząstki jest zaburzony przez kształt i orientację poszczególnych struktur. Jeśli jednak struktury otaczające cząstkę są znacznie mniejsze, efekt ten jest niewielki i uśredniony, co daje jednorodne środowisko dla cząstki (rysunek 1B). Po drugie, gęstość cząstki powinna być zbliżona do podłoża (1,05 g ml-1 dla pożywki na bazie wody), tak aby uniknąć sedymentacji, a siły bezwładności były znikome. Większość cząstek z kratami polistyrenowymi spełnia powyższe kryteria. W idealnej sytuacji cząstka nie oddziałuje z polimerami matrycy biofilmu, ponieważ reologiczna interpretacja MSD cząstki jest ważna tylko wtedy, gdy ruch jest losowy, napędzany energią cieplną i zderzeniem ze strukturami substancji. Można to zaobserwować, sprawdzając, czy cząstka sondy ma tendencję do wiązania się lub odbijania od powierzchni wcześniej wyhodowanego biofilmu. Jednak pomimo braku przyciągania do biofilmu, cząstki muszą być w stanie zostać włączone do matrycy. Ponadto niejednorodność fizykochemiczna biofilmu może spowodować, że różne cząstki będą bardziej odpowiednie jako sondy w różnych regionach biofilmu. W związku z tym do biofilmu należy nanieść cząstki o różnych rozmiarach i chemii powierzchniowej.
Jako takie, MSD cząsteczek jest w stanie dostarczyć użytecznych informacji na temat tego, jak różne składniki przyczyniają się do reologii i rozprzestrzeniania się biofilmu. Co więcej, zastosowanie różnych sond pozwala na uzyskanie informacji na temat przestrzennej niejednorodności fizykochemicznej biofilmu. Metodę tę można zastosować do zbadania wpływu leczenia przeciwdrobnoustrojowego na właściwości mechaniczne biofilmu lub zastosować do biofilmów mieszanych gatunków w celu zbadania, w jaki sposób właściwości mechaniczne biofilmu zmieniają się po wprowadzeniu innego gatunku. Zaburzenia układu mięśniowo-szkieletowego mogą być również przydatne do charakteryzowania dyspersji biofilmu. Takie badania byłyby pomocne w naszym zrozumieniu biofilmów, potencjalnie poprawiając metody leczenia biofilmów i inżynierii biofilmów w celu uzyskania użytecznych działań.

<table><tbody><tr><td>Fluorkule</td><td>Invitrogen</td><td>F-8821</td><td>1.0 &#956; M Czerwone fluorescencyjne (580/605) mikrosfery z modyfikacją karboksylową</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager M1</td><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Napęd cyfrowy Masterflex L/S 07523-80</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td>Pompa perystaltyczna</td></tr><tr><td>Komory komory przepływowe</td><td>Duński Uniwersytet Techniczny Pułapka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bąbelkowa</td><td>Duński</td><td></td><td></td> Uniwersytet Techniczny</tr><tr><td>Rurka silikonowa</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>3 mm średnica zewnętrzna, 1&nbsp; mm średnica wewnętrzna</td></tr><tr><td>Przezroczyste łączniki z tworzywa sztucznego z polipropylenu&nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06365-83</td><td>1/16 cala (1.588 mm)</td></tr><tr><td>Klipsy do segregatorów</td><td></td><td></td><td>Do zaciskania węży</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermo Scientific&trade; Nunc&handel;</td><td>50 x 24 mm</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 3 ml</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 &nbsp; G Igła</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &nbsp; L Butelki do przechowywania/mediów VWR</td><td>&reg;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wózek</td><td></td><td></td><td>do przechowywania zestawu biofilmu</td></tr></tbody></table>

in situ mapowanie właściwości mechanicznych biofilmów za pomocą mikroreologii śledzącej cząstki

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Komórki bakteryjne są w stanie tworzyć powierzchniowo przyczepione biofilmy znane jako biofilmy, poprzez otaczanie się zewnątrzkomórkowymi substancjami polimerowymi (EPS). EPS służy jako fizyczne i ochronne rusztowanie, w którym mieszczą się komórki bakteryjne i składa się z różnych materiałów, w tym białek, egzopolisacharydów i DNA. Skład EPS może ulec zmianie, co spowoduje przemodelowanie właściwości mechanicznych biofilmu w celu dalszego rozwoju lub wspierania alternatywnych struktur biofilmu, takich jak wstęgi, w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Mimo to istnieje niewiele ilościowych opisów tego, w jaki sposób składniki EPS przyczyniają się do właściwości mechanicznych i funkcji biofilmów. Reologia, nauka zajmująca się przepływem materii, ma szczególne znaczenie dla biofilmów, ponieważ wiele biofilmów rośnie w warunkach przepływu i jest stale narażonych na naprężenia ścinające. Zapewnia również pomiar i wgląd w rozprzestrzenianie się biofilmu na powierzchni. W tym przypadku mikroreologia śledzenia cząstek jest wykorzystywana do badania lepkosprężystości i skutecznych ról sieciowania różnych składników matrycy w różnych częściach biofilmu podczas rozwoju. Takie podejście pozwala naukowcom mierzyć właściwości mechaniczne biofilmów w mikroskali, co może dostarczyć przydatnych informacji do kontrolowania i inżynierii biofilmów.

Zbadano lokalne właściwości lepko sprężyste biofilmu w różnych jego obszarach, obejmujących pustki (pożywka nad biofilmem), obszary płaskie (niezróżnicowana płaska warstwa komórek) oraz mikrokolonie (patrz etykiety na Ryc. 2A). Określono również zmiany czasowe właściwości lepko sprężystych biofilmu podczas dojrzewania od 3. do 5. dnia. MSD cząsteczek w pustkach posłużyło jako kontrola i było porównywalne z MSD cząsteczek w czystej pożywce. W przeciwieństwie do nich, cząsteczki uwięzione w biofilmie drgał...

Mikroreologia śledząca cząstki bada lepkosprężystość materiałów. W tym przypadku technika ta jest wykorzystywana do określania lepkosprężystości, podatności pełzania i efektywnych ról sieciowania różnych składników matrycy biofilmu bakteryjnego. Matryca składa się z substancji polimerowych wydzielanych przez bakterie, a jej składniki decydują o budowie biofilmu i właściwościach mechanicznych.

In Situ Mapowanie właściwości mechanicznych biofilmów za pomocą mikroreologii śledzącej cząstki

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest pokazanie, jak mierzyć rzeczywiste właściwości logiczne w obrębie mikrodomen heterogenicznych biofilmu w komorze przepływowej oraz biofilmu statycznego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii biofilmu, takie jak wpływ konkretnych komponentów metrycznych, różnych gatunków lub związków na neurologię biofilmu oraz testowanie jego reakcji na siły fizyczne, takie jak ścinanie. Jest to technika nieniszcząca o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, którą można przeprowadzić przy użyciu standardowego wyposażenia laboratoriów biologicznych.Po przygotowaniu nocnych kultur bakteryjnych, materiałów oraz pożywki do konfiguracji komory przepływowej zgodnie z protokołem tekstowym, należy przenieść mikrosfery fluorescencyjne w wodzie sterylnej do probówek do mikrowirówki w celu usunięcia azotku sodu, wirować probówki przez pięć minut w warunkach sterylnych, np. w komorze z laminarnym przepływem powietrza, usunąć nadsącz i użyć jednego mililitra pożywki wzrostowej do ponownego zawieszenia mikrosfer. Następnie dodać mikrosfery do pozostałej części pożywki wzrostowej przeznaczonej do hodowli w komorze przepływowej.

in-situ-mapping-mechanical-properties-biofilms-particle-tracking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Kurz, D. L. i in. Platforma mikrofluidyczna do badania biozatkania w porowatych ośrodkach. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do badania powstawania biofilmu. Do mikrokanału wprowadzana jest zawiesina bakteryjna, po której następuje inkubacja, umożliwiająca rozwój biofilmu. Następnie wznawia się przepływ, a monitorowanie ciśnienia wraz z obrazowaniem wykorzystuje się do wykrywania powstawania biofilmu i zatkania porów w czasie.

Urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania w czasie rzeczywistym i śledzenia ciśnienia podczas tworzenia biofilmu

Ten artykuł pokazuje oryginalną metodologię opartą na zdalnym uruchamianiu cząstek magnetycznych osadzonych w biofilmie bakteryjnym oraz rozwoju dedykowanych pęset magnetycznych do pomiaru in situ lokalnych właściwości mechanicznych złożonego żywego materiału zbudowanego przez mikroorganizmy na granicy faz.

Zdalne uruchamianie magnetyczne sond mikrometrycznych do mapowania 3D in situ właściwości fizycznych biofilmu bakteryjnego

Mikroreologia śledząca cząstki może być wykorzystana do nieniszczącego ilościowego i przestrzennego mapowania zmian właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D nowotworów.

Podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Ten artykuł przedstawia metodę hodowli biofilmu do spektrometrii mas jonów wtórnych in situ w czasie przelotu do mapowania chemicznego w stanie uwodnionym, możliwa dzięki reaktorowi mikroprzepływowemu, System do analizy na granicy faz ciekłej próżni. Jako model wykorzystano Shewanella oneidensis MR-1 z białkiem zielonej fluorescencji.

In Situ Charakterystyka biofilmów Shewanella oneidensis MR1 za pomocą SALVI i ToF-SIMS

Brak narzędzi do pomiaru właściwości materiału i parametrów rozciągania in vivo uniemożliwia walidację ich ról podczas rozwoju. Zastosowaliśmy mikroskopię sił atomowych (AFM) i śledzenie nanocząstek, aby określić ilościowo cechy mechaniczne nienaruszonej komórki żółtka zarodka danio pręgowanego podczas epibolii. Metody te są niezawodne i mają szerokie zastosowanie, unikając inwazyjnych interwencji.

AFM i mikroreologia w komórkach żółtka zarodka danio pręgowanego

Biofilmy mikrobiologiczne tworzą złożone architektury na skrzyżowaniach i rozwijają się w wysoce zależne od skali wzorce przestrzenne. W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalny system (sprzętowy i programowy) do automatycznego pozyskiwania zestawów danych optycznej tomografii koherentnej (OCT) 3D. Ten zestaw narzędzi pozwala na nieinwazyjną i wieloskalową charakterystykę morfogenezy biofilmu w przestrzeni i czasie.

Zautomatyzowana optyczna tomografia koherentna 3D w celu wyjaśnienia morfogenezy biofilmu w dużych skalach przestrzennych

Protokół przedstawia kompletny przebieg eksperymentów z nanoindentacją miękkiego materiału, w tym hydrożeli i komórek. Po pierwsze, szczegółowo opisano etapy eksperymentalne mające na celu pozyskanie danych ze spektroskopii sił; następnie analiza takich danych jest szczegółowo opisana za pomocą nowo opracowanego oprogramowania Python o otwartym kodzie źródłowym, które można pobrać bezpłatnie z GitHub.

Proces eksperymentowania i analizy danych dla nanotwardości miękkiej materii

Ten artykuł podkreśla skuteczność techniki optycznej elastografii koherentnej (OCE) w szybkim i nieniszczącym charakteryzowaniu elastycznych właściwości biofilmu. Wyjaśniamy krytyczne procedury wdrażania OCE w celu uzyskania dokładnych pomiarów i przedstawiamy wartości modułu Younga dla dwóch ziarnistych biofilmów.

Kwantyfikacja właściwości elastycznych biofilmów środowiskowych za pomocą optycznej elastografii koherentnej

Niniejszy artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu obrazowania oraz podwójnej modalności obrazowania (napięciowego i wapniowego).

Multiparametryczne mapowanie optyczne serca królika perfundowanego metodą Langendorffa

Poznaj mikroreologię śledzącą cząstki do badania właściwości lepkosprężystych biofilmów bakteryjnych. Ta nieniszcząca metoda pozwala mierzyć podatność pełzania i rolę składników macierzy w strukturze biofilmu.

In Situ Mapowanie właściwości mechanicznych biofilmów za pomocą mikroreologii śledzącej cząstki

Przeglądaj więcej filmów