Ferromagnetyczny stent z gołego metalu do wychwytywania i zatrzymywania komórek śródbłonka

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest opracowanie ferromagnetycznego stentu metalicznego, zdolnego do wychwytywania i zatrzymywania komórek śródbłonka znakowanych nanocząsteczkami magnetycznymi. Osiągnięto to poprzez zaprojektowanie stentu ze stali nierdzewnej 2205 z wykorzystaniem oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) oraz analizy elementów końcowych (FEA), aby właściwie zrozumieć zachowanie mechaniczne materiału i struktury stentu podczas zaciskania i rozszerzania. Następnie wykonany stent zostaje mechanicznie zaciśnięty i rozszerzony w celu wykazania jego integralności mechanicznej, a następnie badana jest retencja pola magnetycznego stentu, co pozwala zwalidować jego właściwości magnetyczne.

Następnie stenty są implantowane u świń, a następnie dostarczane są znakowane magnetycznymi nanocząsteczkami komórki śródbłonka w celu weryfikacji wychwytu i retencji komórek w krążeniu wieńcowym. Wyniki analizy histologicznej eksplantowanych naczyń krwionośnych z eksperymentów in vivo wykazują, że opracowany w niniejszym badaniu stent ferromagnetyczny jest w stanie wychwycić i zatrzymać magnetycznie znakowane komórki śródbłonka. Znaczenie tej techniki rozciąga się na rozwój różnych urządzeń sercowo-naczyniowych, ponieważ szybka endotelizacja może promować gojenie i poprawić kompatybilność z krwią.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na złożoność procedur CAD i FEA wykorzystywanych w projektowaniu stentów; wyzwaniem dla początkujących może być również hodowla komórkowa. Ze względu na konieczność utrzymania rygorystycznego środowiska aseptycznego, dążyliśmy do poprawy procesu osadzania komórek na stentach i opracowaliśmy koncepcję wykorzystania sił magnetycznych do przytwierdzania żywych komórek do stentów. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy opracowywania stentu i osadzania komórek są trudne do opanowania ze względu na złożone zachowanie materiału podczas zaciskania i rozszerzania oraz nowatorski charakter magnetycznego przechwytywania komórek przez stent.

Aby zacząć, należy użyć oprogramowania CAD do stworzenia ekstrudowanego pustego cylindra, wybierając funkcję wypukłości (extruded boss base) z grubością ścianki równą grubości rozpórki stentu. Zaprojektuj wzór stentu na innej płaszczyźnie szkicu, stycznej do ekstrudowanego cylindra. Szerokość płaskiego wzoru powinna odpowiadać obwodowi ekstrudowanego pustego cylindra.

Używając funkcji owijania (wrap), przenieś projekt płaski na pusty w środku cylinder. Zapisz część w formacie natywnym, a także w formacie ACEs w celu eksportu do analizy FEA. Aby przeprowadzić analizę elementów skończonych, zaimportuj geometrię bryłową zapisaną w formacie ACEs do modułu części oprogramowania FEA w celu dalszej analizy w modelerze części oprogramowania. Stwórz dwa cylindry analityczne współosiowo do stentu. Kliknij dwukrotnie element drzewa instancji w modelerze zestawień, aby złożyć części w odpowiednich pozycjach za pomocą modułu siatki oprogramowania FEA.

Zdefiniuj element jako element sześciościenny z 20 węzłami i zredukowaną całkowaniem. Określ rozmiar elementu i wykonaj siatkowanie stentu w ustawieniach właściwości interakcji w drzewie modelu. Zdefiniuj bezstarcowe pary kontaktu sztywnych ciał pomiędzy stentem a każdym z dwóch cylindrów.

Przypisz zachowanie naprężenia i odkształcenia dla opl stress strain z ELAs do modelu stentu. Zdefiniuj warunki brzegowe, aby w pierwszej kolejności ścisnąć zewnętrzny cylinder do jednego milimetra, co symuluje proces zaciskania. Usuń zewnętrzny cylinder, aby zasymulować rozprężenie zacisniętego stentu.

Rozszerz wewnętrzny cylinder do trzech milimetrów, aby zasymulować ekspansję, a na koniec usuń wewnętrzny cylinder, aby zasymulować cofnięcie stentu. Po zakończeniu symulacji otwórz plik z wynikami i przeprowadź postprocessing, aby przeanalizować odkształcenia główne oraz iteracyjnie ulepszyć projekt stentu w celu osiągnięcia odkształcenia głównego na poziomie 20%, co jest wartością mniejszą niż granica uszkodzenia materiału.

Po otrzymaniu rurek ze stali nierdzewnej 2205 i wycięciu stentów zgodnie z protokołem tekstowym pod wyciągiem, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego, przeprowadź trawienie kwasem w celu pasywacji powierzchni stentów polerowanych elektrochemicznie poprzez zanurzenie ich w 50% kwasie solnym na 10 minut, a następnie w 10% wodorowęglanie sodu przez kolejne 10 minut, aby zakończyć proces trawienia. Do przemycia stentów użyj etanolu, a następnie wody dejonizowanej. Następnie, aby przetestować stenty pod kątem zaciskania, chwyć stent i balon trójskładniowy.

W ręcznym narzędziu do zaciskania naciśnij uchwyt, aby zdeformować stent, który ma zostać zacisnięty na balonie. Po sprawdzeniu zacisniętego stentu pod mikroskopem w celu oceny jednorodności zacisku oraz ewentualnych oznak uszkodzeń, rozszerz stent do projektowanej średnicy trzech milimetrów, wykorzystując wodę do wytworzenia ciśnienia w balonie potrójnym. Zbadaj rozszerzone stenty pod kątem mikropęknięć i jednorodności rozszerzenia, używając silnego magnesu neodymowego.

Znamagnesuj stenty wzdłuż średnicy, trzymając stent na jednej z płaskich powierzchni tak, aby jego średnica była równoległa do linii pola magnetycznego. Alternatywnie, namagnesuj stenty osiowo, trzymając stent przy powierzchni cylindrycznej tak, aby jego oś biegła wzdłuż linii pola magnetycznego. Trzymaj stent blisko silnego magnesu przez około jedną minutę.

W celu namagnesowania, zamocuj stenty pojedynczo na szklanych trzpieniach, a następnie umieść trzpienie w precyzyjnym uchwycie uchwytu do badania magnetycznego. Za pomocą stopni X, Y, Z zestawu uchwytu do badania magnetycznego, precyzyjnie ustaw sondę mikroczujnika magnetycznego blisko stentu, tak aby nie dotykała jego powierzchni. Zmierz wartość bazową mikroczujnika magnetycznego w znacznej odległości od stentu, a następnie użyj stopni X, Y, Z, aby ustawić sondę i zmierzyć rezydualne pole magnetyczne na powierzchni stentu.

Po wyizolowaniu komórek wzrostu śródbłonka lub EOCs z obwodowej krwi świńskiej zgodnie z opisanym w protokole tekstem hodowli, hodować komórki w kolbie T 75 aż osiągną około 80% konfluencji. Po syntezie superparamagnetycznych nanocząsteczek tlenku żelaza lub pyon, dodać pyon do EOCs w medium hodowlanym w stężeniu 200 µg/mL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.

Delikatnie odessaj pożywkę hodowlaną i dodaj do kolby 10 ml PBS. Następnie delikatnie potrząśnij i odessaj PBS. Do 10 ml pożywki dodaj 5 µg/ml barwnika fluorescencyjnego, takiego jak CM DAI, aby zabarwić komórki zgodnie z instrukcją producenta, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

Użyj PBS, aby delikatnie wypłukać komórki tak jak poprzednio, następnie dodaj 0,25% roztwór trypsyny z EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez pięć minut, aby odłączyć komórki od ścianek kolby. Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml. Uzupełnij objętość za pomocą PBS i wiruj przy 500 ×g przez pięć minut, aby po zlaniu nadsączu uzyskać osad komórkowy.

Użyj PBS do resuspensji komórek do stężenia od 1 do 2 milionów komórek na mililitr. Do badań komórkowych in vitro zaprojektuj i wykonaj prosty uchwyt do utrzymania stentu tuż nad powierzchnią szkiełka podstawowego. Użyj demagnetyzera elektromagnetycznego, aby rozmagnesować stent, lub silnego magnesu neodymowego, aby namagnesować stent średnicowo lub osiowo. Pipetuj oznakowane komórki e ooc zawieszone w PBS do naczynia zawierającego stenty namagnesowane osiowo, namagnesowane średnicowo lub nienamagnesowane stenty kontrolne.

Następnie, korzystając z obrazu z odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, przygotowano stenty z zawieszonymi w PBS komórkami EOC. Aby przeprowadzić implantację stentów, podano leki przeciwpłytkowe czterem zdrowym świniom rasy Yorkshire i zanozowano je zgodnie z protokołem tekstowym. Wykorzystując standardową technikę cewnikowania serca, wszczepiono jeden stent magnetyczny i jeden niemagnetyczny do prawej tętnicy wieńcowej (RCA). Po przesunięciu balonu i stentu za pomocą drutu prowadzącego przy użyciu balonu typu over-the-wire, zablokowano przepływ krwi w RCA proksymalnie względem wszczepionych stentów. Następnie, w ciągu dwóch minut, poprzez cewnik centralny podano około 2 milionów autologicznych komórek EOC znakowanych s scions w 4 ml PBS. Po dodatkowych dwóch minutach okluzji przywrócono przepływ krwi do RCA, pobrano stent i przeprowadzono badanie histologiczne. Zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano tutaj, iteracyjne projektowanie stentu w oparciu o FEA wskazało stent, który może być zaciskany i rozszerzany przy głównym odkształceniu wynoszącym 20%, co jest wartością niższą od maksymalnego odkształcenia wynoszącego 30%.

Stent wycinany laserowo i polerowany elektrochemicznie, zaciskany na cienkim cewniku balonowym i rozszerzony do trzech milimetrów za pomocą cienkiego balonu, nie wykazał oznak pęknięcia. Zdjęcia odkształconego stentu wykazały dobrą zgodność z odkształceniem obliczonym za pomocą FEA, a obrazy mikroskopowe również nie wykazały pęknięć, co było zgodne z oczekiwaniami wynikającymi z pomiarów pozostałego pola magnetycznego. SPY w oznakowanych komórkach były przyciągane preferencyjnie do segmentów zgiętych w stentach namagnesowanych osiowo oraz bardziej równomiernie do segmentów prostych.

W stentach o namagnesowaniu diametralnym obrazy histologiczne wykazały barwienie żelaza w pobliżu rozpórek stentu, co potwierdziło przyciąganie i retencję EOC do stentu podczas siedmiodniowego okresu implantacji. Podczas próby przeprowadzenia tej procedury ważne jest zrozumienie koncepcji FEA i CAD przy zastosowaniu niewłaściwych parametrów wejściowych. Może to doprowadzić do uzyskania błędnego projektu stentu, który będzie albo zbyt sztywny, albo wykaże tendencję do pękania.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak przyspieszone testy zmęczeniowe oraz testy toksyczności, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. jaka jest długoterminowa trwałość i biokompatybilność stentów? Po kilku latach rozwoju dysponujemy obecnie funkcjonalną technologią, która została zwalidowana w modelu świńskim.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, jak opracować stent ferromagnetyczny oraz jak testować wychwytywanie i zatrzymywanie komórek tętniczych oraz markerów magnetycznych.