Metody hamowania produkcji pyomelaniny bakteryjnej i określania odpowiedniego wzrostu wrażliwości na stres oksydacyjny

Ogólnym celem poniższych eksperymentów jest określenie wpływu NTBC na produkcję P mein oraz wrażliwość na stres oksydacyjny, a także na minimalne stężenia hamujące (MIC) antybiotyków. Osiąga się to poprzez dodanie NTBC do kultur bakteryjnych w celu określenia stężenia, które w drugim kroku redukuje produkcję p melaniny. Kultury bakteryjne są traktowane NTBC oraz antybiotykami, co pozwoli użytkownikowi ustalić, czy zastosowanie NTBC wpływa na wartości MIC antybiotyków.

Kultury potraktowane NTPC są następnie eksponowane na nadtlenek wodoru w celu określenia wrażliwości na stres oksydacyjny; wyniki traktowania bakterii genicznych NTPC wykazują, że prowadzi ono do zmniejszenia produkcji pigmentu i zwiększenia wrażliwości na stres oksydacyjny, nie wpływając jednocześnie na MIC antybiotyków, co ustalono odpowiednio na podstawie testów kropelkowych (spot plates) odpowiedzi na stres oksydacyjny oraz analiz MIC w mikropłytkach. Główną zaletą techniki testów kropelkowych stresu oksydacyjnego nad istniejącymi metodami, takimi jak liczenie jednostek tworzących kolonie (viable counts) i testy dyfuzyjne z krążkami, jest możliwość zastosowania niższych stężeń nadtlenku wodoru w porównaniu do wysokich stężeń stosowanych w innych analizach. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z naszą metodą wyznaczania MIC antybiotyków napotykają trudności, ponieważ brak precyzji w technice pipetowania wprowadza zmienność między powtórzeniami.

Ta zmienność może utrudniać dokładne określenie MIC antybiotyku. Na jeden dzień przed analizą MIC należy przygotować kultury badanych szczepów w LB z dodatkiem i bez dodatku.

2,4-dinitro-2',4'-trinitrotoluene etylowy benzoilocykloheksanodion, czyli NTBC. W tym pokazie zastosowano reprezentatywne stężenie NTBC wynoszące 300 µM. Metoda miareczkowania służąca do wyznaczenia odpowiedniego stężenia NTBC została opisana w tekście protokołu. Inkubować kultury przez noc w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem, a następnie kontynuować pracę następnego dnia.

Przygotuj roztwory matki LB z NTBC oraz LB z DMSO do testu MIC, aby przetestować jeden antybiotyk dla jednego szczepu; dodaj NTBC w stężeniu 600 µM do 2 mL LB i wymieszaj. Aby przygotować roztwór matki NTBC, należy zastosować stężenie 600 µM, ponieważ zostanie ono dwukrotnie rozcieńczone po dodaniu inokulum.

Aby uzyskać stężenie końcowe 300 micromolar, dodaj równą objętość rozpuszczalnika DMSO do dwóch mililitrów LB i wymieszaj, tworząc roztwór główny NO NTBC. Te dwa roztwory główne zostaną wykorzystane do przygotowania roztworów zapasowych antybiotyków, a także do sporządzenia serii rozcieńczeń na płytkach 96-dołkowych. Następnie przygotuj roztwory antybiotyków w roztworach głównych LB z dodatkiem NTBC lub LB z dodatkiem DMSO.

Przygotować roztwór zapasowy gentamycyny z NTBC lub bez NTBC w stężeniu 64 µg/ml. Przygotować roztwór zapasowy kanamycyny z NTBC lub bez NTBC w stężeniu 256 µg/ml. Przygotować roztwór zapasowy tobramycyny z NTB lub bez NTB w stężeniu 8 µg/ml.

Po przygotowaniu roztworów antybiotyków 2x, do czterech studzienek w rzędzie A płytki 96-dołkowej należy nanieść po 100 µL każdego roztworu antybiotyku. Na przykład: gentamycynę do studzienek od 1 do 4, kanamycynę od 5 do 8, a tobramycynę od 9 do 12. Do rzędów od B do H płytki 96-dołkowej należy dodać po 50 µL roztworu głównego LB plus NTBC lub LB plus DMSO, dbając o to, aby jedna płytka zawierała LB plus NTBC, a druga LB plus DMSO. Za pomocą mikropipety należy przeprowadzić dwukrotne rozcieńczenia seryjne antybiotyków, przenosząc 50 µL roztworu z rzędu A do rzędu B. Po wymieszaniu roztworu należy zmienić końcówki pipety i przenieść 50 µL roztworu z rzędu B do rzędu C. Czynność tę należy powtórzyć dla pozostałych rzędów aż do rozcieńczenia rzędu G. Następnie należy odpiąć 50 µL roztworu z tego rzędu i go usunąć.

Rząd H należy wykorzystać jako kontrolę bez antybiotyku dla wzrostu bakterii. Po wypłukaniu wszystkich kultur w celu usunięcia laniny obecnej w pożywce, należy pobrać hodowle nocne, zmierzyć wartość OD 600 kultur, a następnie rozcieńczyć hodowle nocne w lb, używając wielokanałowej mikropipety.

Do odpowiednich dołków dodaj 50 µL rozcieńczonej hodowli bakteryjnej. Bakterie dodaj do trzech dołków dla każdego szczepu i stężenia antybiotyku. Do czwartego dołka dodaj 50 µL LB, który będzie służył jako kontrola zanieczyszczenia bakteryjnego.

Przykryć płytki 96-dołkowe folią i inkubować przez około 24 godziny w temperaturze 37°C do następnego dnia. Płytki należy zbadać wizualnie pod kątem wzrostu bakterii w dołkach. MIC to najniższe stężenie antybiotyku, przy którym nie stwierdzono wzrostu bakterii we wszystkich trzech powtórzeniach dla każdego szczepu.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować nocne hodowle badanych szczepów w podłożu LB z dodatkiem NTBC oraz bez niego, zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnego dnia przygotować LB APLs zawierające nadtlenek wodoru jako czynnik stresu oksydacyjnego. Najpierw należy roztopić kolby z podłożem LB agro i schłodzić medium do temperatury około 50 °C w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj nadtlenek wodoru bezpośrednio do schłodzonych mediów w pożądanych stężeniach. Zamieszaj kolbę ruchem obrotowym, aby uzyskać zakres stężeń nadtlenku wodoru od zera do jednego. Dobrym punktem wyjścia jest stężenie milimolarne.

Niezwłocznie rozlej pożywkę na płytki i opal powierzchnię płomieniem w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Wydajność wynosi cztery płytki na 100 mililitrów agaru LB. Oznacz płytki stężeniem nadtlenku wodoru.

Umieść nieprzykryte płytki w biologicznej komorze z laminarnym przepływem powietrza przy włączonym wentylatorze na 30 minut, aby usunąć z płytek nadmiar wilgoci. Płytki należy wykorzystać tego samego dnia. Podczas gdy płytki schną, należy przeprowadzić mycie i pomiary.

Wartość OD 600 kultur nocnych służy do normalizacji OD 600 wszystkich kultur nocnych do najniższej wartości spośród zestawu badanych szczepów. Aby to zrobić, należy wyznaczyć objętość kultury niezbędną do jej rozcieńczenia do najniższej wartości OD 600 w całkowitej objętości jednego mililitra. Na przykład, jeśli kultura ma OD 600 równą 3, a najniższa wartość OD 600 dla zestawu szczepów wynosi 2,5, należy wykonać następujące obliczenie, z którego wyniknie, że objętość kultury wynosząca 0,833 mililitra jest niezbędna; następnie należy przenieść 0,833 mililitra kultury do probówki do wirówki.

Następnie oblicz ilość LB z dodatkiem NTBC lub LB z dodatkiem DMSO niezbędną do doprowadzenia objętości hodowli do jednego mililitra. W tym przykładzie ilość ta wyniosłaby 0,167 mililitra; wymieszaj za pomocą wortexa. Aby utrzymać hodowle w stałym stężeniu NTBC lub DMSO, wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne znormalizowanych hodowli nocnych w PBS z dodatkiem NTBC lub PBS z dodatkiem DMSO. Przygotuj roztwory zapasowe PBS z NTBC oraz PBS z DMSO, dostosowując ich objętość w zależności od liczby testowanych szczepów. Dla jednego zestawu rozcieńczeń dla jednego szczepu wymieszaj 300 micromolar NTBC lub równoważną objętość DMSO z PBS, tak aby uzyskać objętość całkowitą 720 microliters. Dodaj 90 microliters PBS z NTBC lub PBS z DMSO do odpowiednich probówek do wirówki mikrocentryfużowej, oznakowanych dla rozcieńczeń seryjnych od 10⁻¹ do 10⁻⁷.

Dodaj 10 µL kultury do odpowiedniej probówki z rozcieńczeniem 10⁻¹ i wymieszaj za pomocą wortexa, a następnie przenieś 10 µL rozcieńczenia 10⁻¹ do probówki z rozcieńczeniem 10⁻². Zmieniając końcówki pipety między poszczególnymi rozcieńczeniami, powtarzaj czynność, aż zostaną wykonane wszystkie rozcieńczenia. Nanieś po 5 µL rozcieńczeń od 10⁻³ do 10⁻⁷ na płytki LV z nadtlenkiem wodoru w dwóch powtórzeniach.

Dla każdego szczepu należy użyć osobnego końcówki do pipety. Jeśli plamki są nanoszone od najbardziej do najmniej rozcieńczonych, nie należy przechylać ani potrząsać płytką, dopóki ciecz nie wyschnie na podłożu. Płytki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 do 48 godzin, w zależności od szczepu.

Po pojawieniu się kolonii o odpowiedniej wielkości, należy sfotografować szalki za pomocą kamery CCD umieszczonej nad transluminatorem. Miareczkowania NTBC zostały wykorzystane do ustalenia, czy NTBC jest w stanie zredukować produkcję p-melaniny w p. aerogen oraz do zidentyfikowania stężenia NTBC, które eliminuje lub redukuje produkcję p-melaniny, w celu zastosowania w dodatkowych testach przedstawionych w niniejszym materiale. NTBC zredukowało produkcję PY-melaniny w sposób zależny od dawki u producentów p-melaniny, jednak nie miało wpływu na produkcję pigmentu w szczepach, które nie wytwarzają p-melaniny.

Tabela ta przedstawia wyniki oznaczeń MIC dla różnych szczepów p aerogen traktowanych z użyciem NTBC oraz bez niego, a także z różnymi antybiotykami; wartości MIC zapisano jako najniższe stężenie antybiotyku, które zahamowało wzrost bakterii. Traktowanie NDBC nie miało wpływu na wartości MIC antybiotyków dla badanych szczepów. W celu oceny odpowiedzi na stres oksydacyjny przeprowadzono test spot plate dla szczepów PIO produkujących melaninę oraz nieprodukujących melaniny, traktowanych z użyciem NDBC oraz bez niego.

Płytka z zerową stężeniem nadtlenku wodoru (0 mM) wykazała, że wszystkie szczepy zostały odpowiednio rozcieńczone, a zwiększoną wrażliwość na stres oksydacyjny zaobserwowano, gdy bakterie produkujące melaninę PIO zostały poddane działaniu NTBC; szczepy nieprodukujące melaniny PIO były bardziej wrażliwe na stres oksydacyjny niż szczepy produkujące melaninę PIO. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak określić wpływ leczenia NTBC na produkcję melaniny PIO poprzez badanie wrażliwości na stres oksydacyjny oraz wyznaczanie MIC antybiotyków.