Name: Metoda kriosekcji do mikrodysekcji mysiej błony śluzowej okrężnicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Poznaj metodę kriosekcji do mikrodysekcji błony śluzowej okrężnicy myszy, umożliwiającą izolację komórek nabłonkowych z różnych stref krypt. Technika ta jest szybka, tania i wydajna.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez National Institutes of Health (DK55679, oraz DK59888 do A.N.). Zintegrowany rdzeń mikroskopii obrazowania komórkowego Uniwersytetu Emory w ramach kompleksowego grantu centrum onkologicznego Winship Cancer Institute, P30CA138292, oraz nagroda Crohn's and Colitis Foundation of America Career Development dla CTC i nagroda stypendialna dla A.E.F.

W eksperymentach wykorzystano myszy C57BL/6 w wieku od 10 do 12 tygodni. Wszystkie procedury z wykorzystaniem zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Emory University Institutional Animal Care and Use Committee i zostały przeprowadzone zgodnie z kryteriami National Institutes of Health.
1. Konfiguracja eksperymentalna
<ol>
	<li>Konfiguracja kriostatu
	<ol>
		<li>Wyrównać temperaturę kriostatu do -20 °C, łącznie z ostrzem mikrotomu i uchwytami (należy zachować szczególną ostrożność wokół ostrza!).</li>
		<li>Napełnij pustą kriomoldę związkiem OCT (Optimal Temperature Temperature) i zrównoważ do -20 °C (~30 min). Wyjmij zamrożony OCT z formy i przymocuj go do uchwytu za pomocą płynnego OCT. Umieść blok/uchwyt w ramieniu mikrotomu i pozwól OCT zastygnąć przez 10 minut.</li>
		<li>Ustaw kriostat na 10 μm na sekcję i ogol blok OCT, aż będzie płaski. Cofnij ramię mikrotomu od ostrza o kilka centymetrów. W tym momencie nie reguluj ostrza ani uchwytu do końca eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj żyletki: Przygotuj 2 żyletki na próbkę. Za pomocą metalowego pilnika stępić ostrą krawędź ostrzy. Następnie zdejmij aluminiowy kołnierz za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Wstępnie schłodzić naczynie z Pyrexu lub inną płaską powierzchnię na suchym lodzie.</li>
	<li>Przygotuj naczynie preparacyjne z 10-15 szpilkami do rozwarstwienia. Wystarczy 10 cm naczynie do hodowli tkankowej wypełnione w 50% silikonem. Dodać 5 ml buforu Hanksa w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie tkanki dystalnej okrężnicy
<ol>
	<li>Umieść myszy w szczelnej komorze i poddaj je eutanazji przez wdychanie izofluranu i zwichnięcie szyjki macicy, a następnie spryskaj 70% etanolem brzuch i klatkę piersiową12.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie w skórze brzucha nożyczkami, a następnie wykonaj nacięcie, aby odsłonić jamę otrzewnej. Podobne procedury można znaleźć opisane tutaj12.</li>
	<li>Przetnij jelito grube na brzegu odbytu i rozsuń krezkę, aż okrężnica będzie wolna.</li>
	<li>Wytnij dystalny odcinek okrężnicy w odległości od 0 do 6 cm od odbytu. Tutaj głębokość krypty wynosi ~150 μm (patrz rysunek 1B). Rozetnij okrężnicę wzdłuż nożyczkami i usuń zawartość kału.</li>
	<li>Przypnij tkankę do naczynia preparacyjnego powierzchnią błony śluzowej skierowaną do góry. Rozciągnij tkankę za pomocą szpilek preparacyjnych na silikonowym naczyniu w buforze Hanksa i odstaw na 10 minut w temperaturze pokojowej (ryc. 1C). To usuwa fałdy z tkanki i pozwala warstwom mięśni się rozluźnić.</li>
</ol>
3. Zamontuj tkankę na kriostacie w celu przekroju
<ol>
	<li>Wsuń żyletkę pod żądaną część tkanki, a następnie wylej bufor Hanksa. Dodaj kolejną żyletkę na wierzch, robiąc kanapkę. Wytnij segment tkanki i usuń szpilki. Przenieś żyletkę/kanapkę z chusteczką do suchego lodu. Pozwól tkance zamarznąć (5-10 minut, ryc. 1D).</li>
	<li>Podnieś kanapkę z maszynką do golenia/chusteczką i pozwól jej lekko się rozgrzać, kładąc palec na górnym ostrzu (śluzówką do góry. To ustawia tkankę tak, że warstwy mięśni podstawnych są najpierw cięte.). Oddziel kanapkę i przetnij wokół krawędzi segmentu tkanki. Wytnij segment tkanki w przybliżeniu 0,5 cm x 1 cm. Obszary krawędzi mają tendencję do zwijania się, co powoduje, że odcinki szeregowe zawierają wiele warstw tkanki. Pamiętaj, że nadmierne cięcie jest lepsze niż podcinanie, więc zachowaj ostrożność.</li>
	<li>Pozwól chusteczce się rozgrzać, aż lód na wierzchu tkanki zacznie się topić. W tym momencie szybko i ostrożnie wciśnij tkankę w blok OCT w kriostacie.</li>
	<li>Wyjmij ostrze, kładąc palec na próbce. Wymiana ciepła pozwoli ci wyjąć ostrze bez naruszania tkanki.</li>
	<li>Pokryj tkankę OCT i zrównoważ przez 5 minut. Wytnij skrawki na 10 μm (Rysunek 1E, F). Przyjrzyj się wizualnie sekcjom, aż zobaczysz krypty. Umieść skrawki w probówkach o pojemności 1,5 ml lub na szkiełkach.</li>
	<li>W celu analizy mRNA lub białka umieść próbki w probówkach z 5 sekcjami kryptozasadowymi, 5 przejściowymi i 5 sekcjami powierzchniowymi na probówkę. Do zbierania RNA dodać 1 ml komercyjnego odczynnika izolacyjnego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wykonaj oczyszczanie RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj 5-10 μg całkowitego RNA do wytworzenia cDNA.</li>
	<li>W celu oczyszczenia białek dodać 0,5 ml zimnego buforu do lizy RIPA (plus inhibitory proteazy) na 5 sekcji. Sonikować 3 razy w cyklu 70%, na lodzie.
	<ol>
		<li>Dodać próbki do bufora ładującego SDS PAGE (bufor Laemmli) i inkubować w temperaturze 100 °C przez 10 minut. Poddać próbki SDS PAGE i przenieść, a następnie zablokować w 5% mleka/PBS przez 2 godziny. Przeprowadzić analizę western blot, a następnie inkubować z przeciwciałami KLF4 (1:500) O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).</li>
<li>Humphries, A., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+crypt+organization+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Colonic crypt organization and tumorigenesis.</a> Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).</li>
<li>Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+is+it+really+just+another+break+in+the+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall.</a> Gut. 56, 6-8 (2007).</li>
<li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Rand, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+depletion+dissociates+and+activates+heterodimeric+notch+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors.</a> Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).</li>
<li>Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+by+Transmission+of+Mechanical+Stress+through+Epithelial+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues.</a> Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).</li>
<li>Lechner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+pattern+of+laser+microdissected+colonic+crypts+of+adenomas+with+low+grade+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia.</a> Gut. 52, 1148-1153 (2003).</li>
<li>Reizel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+stem+cell+and+crypt+dynamics+exposed+by+cell+lineage+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction.</a> PLoS Genet. 7, e1002192(2011).</li>
<li>Kosinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+of+human+colon+tops+and+basal+crypts+and+BMP+antagonists+as+intestinal+stem+cell+niche+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).</li>
<li>Tamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pit+pattern+and+three-dimensional+configuration+of+isolated+crypts+from+the+patients+with+colorectal+neoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm.</a> J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+dendritic+cells+and+macrophages+from+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040(2012).</li>
<li>Laukoetter, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM-A+regulates+permeability+and+inflammation+in+the+intestine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo.</a> J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).</li>
<li>Neumann, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+commensal+bacteria+and+regional+Wnt+gene+expression+in+the+proximal+versus+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon.</a> Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).</li>
<li>Capaldo, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokine-induced+tight+junction+remodeling+through+dynamic+self-assembly+of+claudins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins.</a> Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).</li>
<li>Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+an+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make an intestine.</a> Development. 141, 752-760 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Mechanizmy molekularne biorące udział w proliferacji i różnicowaniu komórek nabłonka okrężnicy są słabo poznane. Obejmuje to luki w naszej wiedzy na temat środowiska sygnalizacji komórkowej przedziału komórek macierzystych u podstawy krypt nabłonka okrężnicy. Rośnie również zainteresowanie procesami leżącymi u podstaw różnicowania enterocytów. Na przykład pogłębienie wiedzy na temat różnicowania in vivo jest wymagane jako punkt odniesienia dla badań mających na celu wytworzenie pierwotnych układów jelitowych in vitro16.
Powyższa procedura składa się z kilku kroków, które wymagają dodatkowej uwagi. Po pierwsze, wymagane jest usunięcie krawędzi wokół zamrożonego segmentu tkanki (jak omówiono w sekcji 3.2), ponieważ krawędzie tkanki zwijają się podczas sekcji i zamrażania. Niepowodzenie w przesunięciu tych krawędzi powoduje mieszaną populację komórek bazowych powierzchni i krypty. Niezbędne jest również zamontowanie chusteczki na wstępnie schłodzonym, wypoziomowanym bloku OCT. Protokół ten można dostosować do innych obszarów dystalnej części okrężnicy, zmieniając liczbę sekcji w każdej puli. Na przykład, jak pokazano na rysunku 1B, długość krypty błony śluzowej waha się między 150-300 μm. Dlatego badając obszar między 4 cm-6 cm od odbytu, liczbę sekcji należy zwiększyć z 15 do 30. Co ważne, protokół ten nie jest zalecany dla bliższej części jelita grubego (7 cm-9 cm) ze względu na fałdy (plicae obliquae), które rozciągają się do światła, uniemożliwiając oddzielenie komórek powierzchniowych i kryptobazowych przez szeregowe cięcie.
Techniki cięcia seryjnego zostały wykorzystane do badania populacji komórek nabłonka podstawy krypty i powierzchni u ludzi. Jednak nasz protokół dodaje dodatkowe kroki, które są wymagane ze względu na mały rozmiar tkanki mysiej. Proponujemy, aby powyższy protokół pozwolił na badanie populacji komórek nabłonka podstawy krypty i powierzchni w genetycznie podatnych systemach mysich. Rzeczywiście, połączone sekcje dają wysokiej jakości białko i RNA, odpowiednią analizę dalszą. Przyszłe zastosowania mogą obejmować badanie komórkowych szlaków sygnałowych lub immunoprecypitacji chromatyny. Należy jednak zauważyć, że podobnie jak kilka alternatywnych metod opisanych powyżej, powstałe skrawki zawierają mieszaninę komórek nabłonka i śródmiąższowej blaszki właściwej. Podsumowując, opisany tutaj protokół zapewnia szybką, wysokowydajną metodę analizy procesów molekularnych w przestrzennie odrębnych regionach błony śluzowej mysiej okrężnicy.

Wyściółka nabłonka okrężnicy jest wysoce regenerującą tkanką, z rezydującymi komórkami macierzystymi uzupełniającymi tkankę co kilka dni1. Ten proces regeneracji wymaga utrzymania kompartmentu proliferacyjnych komórek macierzystych. Z biegiem czasu nowo wytworzone komórki potomne tracą swój potencjał proliferacyjny i migrują w kierunku powierzchni światła jelita. Równolegle z migracją komórki progenitorowe różnicują się w dojrzałe enterocyty tworzące barierę lub komórki kubkowe wytwarzające śluz. Uważa się, że niepowodzenie tego programu różnicowania przyczynia się do naruszenia bariery nabłonkowej, co obserwuje się w nieswoistych zapaleniach jelit i raku jelita grubego2,3.
Szczegółowe badanie powyższych procesów będzie wymagało metodologii izolowania populacji komórek bazowych i powierzchniowych. Istnieje wiele metod, z których każda ma unikalne zalety i wady. Obecne metody izolacji komórek nabłonka jelitowego obejmują czynniki chelatujące i dysocjację mechaniczną, w wyniku czego dochodzi do izolacji całych krypt, arkuszy nabłonka lub pojedynczych komórek, w zależności od warunków doświadczalnych4,5. Są to metody o wysokiej wydajności, jednak w tych warunkach odnotowano zmiany w sygnalizacji międzykomórkowej, które mogą nie reprezentować rodzimego środowiska6,7. Mikrodysekcja wychwytu laserowego pozwala na zbieranie przestrzennego odrębnego materiału, ale osiąga niską wydajność cząsteczkową8,9. W tkance jelita grubego człowieka opracowano metody szeregowej kriosekcji poziomej10. Jednak mysie tkanki błony śluzowej są zbyt małe, aby można je było bezpośrednio przywłaszczyć sobie tą techniką. U ludzi długość krypty jelitowej (odległość między podstawą krypty a komórkami powierzchniowymi) w okrężnicy waha się między ~100–1,000 μm 11. U myszy długości krypt wynoszą od ~50 do 300 μm (patrz rysunek 1A). Niewielki rozmiar mysich krypt stanowi wyzwanie dla izolacji tych dwóch populacji komórek przy użyciu istniejących protokołów.
Teraz opisujemy tanią, wysokowydajną metodę izolacji populacji komórek nabłonka podstawy krypty i powierzchni w tkance okrężnicy myszy. Tkanka pobrana w ten sposób może być następnie analizowana za pomocą wielu standardowych zastosowań końcowych, w tym barwienia immunofluorescencyjnego, RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction) lub western blotting.

<table><tbody><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems, Nussloch Niemcy</td><td>CM 1510-3</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ detektor PCR w czasie rzeczywistym</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510&nbsp;</td><td>Mikroskop konfokalny</td> <td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>cryo-mold</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4557</td><td>25mmx20mmx5mm</td></tr><tr><td>Wysokoprofilowe ostrze mikrotomu</td><td>Leica Biosystems, Nussloch niemcy</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>GEM ostrza przemysłowe</td><td>Amerykańskie maszynki do golenia</td><td>62-0314</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard silikonowa baza elastomerowa</td><td>Dow Corning, Midland MI</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>igła 27 1/2 g</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>305109</td><td>szpilki do preparacji</td></tr><tr><td>TRizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało ZO-1</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>187430</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało KLF4</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>Przeciwciało 4038S</td><td></td></tr><tr><td>mGAPDH</td><td>Sigma</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Wtórne koniugat Alexa</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>488 przeciwciało anty-królicze</td></tr><tr><td>Wtórny koniugat HRP</td><td>Jackson</td><td>111/115-001-003</td><td>królik / mysz&nbsp;</td></tr><tr><td>Topro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>HANKs Zrównoważony bufor soli</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> do lizy <td>RIPA 50mM Tris-HCl pH 7,4 150mM NaCl 1% NP40 0,25% Podkład Na-deoksycholanowy</td></tr><tr><td>TBP</td> 3'GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>podkład TBP 5'GATGACTGCAGCAAATCGCTT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> KLF4</td> <td>3'TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>podkład KLF4</td> 5'ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT <td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metoda kriosekcji do mikrodysekcji mysiej błony śluzowej okrężnicy

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Tkanka błony śluzowej jelita grubego stanowi istotną barierę dla antygenów świetlnych. Bariera ta składa się z monowarstwy prostych komórek nabłonka walcowatego. Nabłonek jelita grubego jest dynamicznie przewracany, a komórki nabłonkowe są generowane w komórce macierzystej zawierającej krypty Lieberkühna. Komórki progenitorowe wytwarzane w podstawach krypt migrują w kierunku powierzchni światła, przechodząc proces różnicowania komórkowego przed zrzuceniem do światła jelita. Aby zbadać te procesy na poziomie molekularnym, opracowaliśmy prostą metodę mikrodysekcji dwóch przestrzennie odrębnych regionów błony śluzowej okrężnicy; proliferacyjna strefa krypty i zróżnicowane powierzchniowe komórki nabłonkowe. Naszym celem jest wyizolowanie specyficznych populacji komórek nabłonka krypty i powierzchni z błony śluzowej okrężnicy myszy w celu wyizolowania RNA i białka.

Przekroje tkanki jelita grubego poddano obróbce w celu oceny histologicznej i barwienia H&amp;E13. Tradycyjny widok przekroju poprzecznego błony śluzowej przedstawiono na Rysunku 2A. Obszary podstawowe zawierają warstwę mięśniową zewnętrzną, składającą się głównie z warstwy mięśni okrężnych. Przesuwając się w stronę światła jelita, widoczna jest warstwa mięśniowa błony śluzowej sąsiadująca z komórkami nabłonkowymi podstawy krypt, komórki przejściowe znajdują się w środkowej części tkanki, a na końcu populacje komórek powierzchniowych przylegają do światła jelita. Opisana tutaj metoda seryjnego cięcia zachowuje orientację w taki sposób, że najpierw napotyka się warstwę mięśniową podłużną i okrężną (Rysunek 2B), a następnie warstwę mięśniową błony śluzowej (Rysunek 2C). Należy zwrócić uwagę na obecność nie mięśniowych komórek śródmiąższowych w lewym górnym rogu obrazu. W przypadku dalszej analizy opisanej poniżej, przekroje mięśniowe są odrzucane. Kolejne przekroje zawierają komórki nabłonkowe i tkankę śródmiąższową (blaszka własna), zaczynając od komórek podstawy krypt (Rysunek 2D). Należy zauważyć brak centralnego światła w większości krypt, które wydają się ciemniejsze ze względu na gęsto upakowane jądra. Warstwy te zawierają przedział proliferacyjny. Komórki przejściowe występują w postaci gęsto upakowanych gruczołów z wyraźnymi światłami centralnymi (Rysunek 2E). Na koniec, populacje komórek powierzchniowych mają nieregularną strukturę, z obszarami jednowarstwowego nabłonka widocznymi en face (Rysunek 2F).
Przekroje seryjne opisane powyżej mogą być również przetwarzane w celu znakowania immunofluorescencyjnego i mikroskopii konfokalnej (opisanej tutaj14). Rysunek 2G przedstawia wyizolowane krypty utrwalone i permeabilizowane w 100% metanolu, a następnie barwione na jądra komórkowe (niebieski) oraz białko połączeń międzykomórkowych Zonula Occludens 1 (ZO-1, zielony). W tradycyjnej orientacji przekroju można jednocześnie obserwować kryptę i komórkę powierzchniową (Rysunek 2G). Należy zauważyć, że barwienie połączeń ZO-1 wyściela światło krypty jelita grubego. To wyścielenie światła przez ZO-1 jest widoczne również w próbkach z przekrojów seryjnych populacji komórek przejściowych, w centrum kolistych gruczołów (Rysunek 2G). Wzmocnione barwienie ZO-1 obserwuje się w populacjach komórek powierzchniowych (Rysunek 2I oraz J).
Wiadomo, że kilka czynników różnicowania jest eksprymowanych w sposób spatiotemporalny wzdłuż osi krypta–powierzchnia. Należy do nich czynnik transkrypcyjny Kruppel-like factor 4 (KLF4), który wykazuje wzbogacenie w populacjach komórek powierzchniowych. Przy zastosowaniu tradycyjnych metod cięcia preparatów, KLF4 stwierdzono w jądrach populacji komórek powierzchniowych skierowanych w stronę światła (Ryc. 2K). Przypuszczaliśmy zatem, że mRNA KLF4 będzie eksprymowane głównie w populacjach komórek powierzchniowych. Aby to sprawdzić, pobrano seryjne skrawki i podzielono je na próbki z powierzchni, strefy przejściowej oraz podstawy krypt. Następnie RNA wyizolowano przy użyciu standardowej ekstrakcji Trizol, z dodatkowym oczyszczaniem kolumną RNeasy i traktowaniem DNAzą. RNA pobrano z 5 połączonych kolejnych skrawków, co dało od 5-10 µg całkowitego RNA na próbkę. Próbki te poddano następnie półilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla KLF4 oraz genu referencyjnego, białka TATA box binding protein 1 (TBP-1) (Ryc. 2L)14. Jak pokazano na Ryc. 2L, po normalizacji względem TBP-1 stwierdzono, że komórki powierzchniowe wykazują do 8-krotnie wyższą ekspresję mRNA KLF4 niż komórki krypt. Podobnie poziomy białka KLF4 wykazywały regulację przestrzenną wzdłuż osi krypta–powierzchnia. Seryjne skrawki połączono w opisany wyżej sposób, a następnie inkubowano w buforze lizującym przez 20 min w 4 °C. Uzyskano w ten sposób od 200-250 µg białka na próbkę. Próbki poddano następnie analizie metodą SDS-PAGE (Ryc. 2M)15. Jak pokazano na Ryc. 2M, poziomy białka KLF4 są znacznie wyższe w populacjach komórek powierzchniowych. Powyższe wyniki demonstrują zdolność niniejszego protokołu do izolowania dużych ilości komórek nabłonkowych powierzchniowych i krypt z błony śluzowej jelita grubego myszy.
<img alt="Schemat i wykres błony śluzowej okrężnicy; przekroje histologiczne i pomiary wysokości krypt." src="/files/ftp_upload/53112/53112fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: (A) Schemat przedstawiający błonę śluzową okrężnicy myszy oraz zewnętrzne warstwy mięśniowe. Nasza metoda ma na celu wyizolowanie oddzielnych populacji komórek powierzchniowych i komórek podstawy krypt poprzez seryjne mrożenie i krojenie (każdy przekrój 10 μm). Zewnętrzne warstwy mięśniowe są odrzucane. (B) Wysokość krypt zmienia się wzdłuż okrężnicy (odległość między podstawą krypty a warstwami powierzchniowymi). Punkty danych wskazują pomiary poszczególnych krypt, a symbole oznaczają powtórzenia biologiczne (n = 4). (C) Zebrane segmenty okrężnicy, przekrojone wzdłuż i przypięte do silikonowej szalki do sekcji. (D) Segment tkanki oddalony o około 3 cm od odbytu jest dociskany między dwiema żyletkami i mrożony na suchym lodzie. (E) Tkanka jest następnie montowana na upoziomowanym bloku OCT. (F) Przekroje mrożone są pobierane i poddawane inspekcji wizualnej.
<img alt="Histologia i immunofluorescencja przekrojów jelitowych; od krypty do powierzchni; analiza RNA i białka KLF4." src="/files/ftp_upload/53112/53112fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne dane. (A) Tkanka okrężnicy barwiona hematoksyliną i eozyną w przekroju poprzecznym, ukazująca okrągłą warstwę mięśniową (c.m.), błonę mięśniową śluzówki (m.m.), komórki podstawy krypty, komórki przejściowe oraz komórki powierzchniowe. (B-C) warstwy mięśniowe okrężnicy. (D) Komórki podstawy krypty. Zwrócić uwagę na brak centralnego światła. (E) Komórki przejściowe. (F) Komórki powierzchniowe. (G) Barwienie immunofluorescencyjne izolowanych krypt okrężnicy. ZO-1 (zielony) i jądra (niebieskie) obserwowane w przekroju poprzecznym. (H-I) Barwienie ZO-1 i jąder w komórkach przejściowych i powierzchniowych. (J) powiększony widok barwienia ZO-1. (K) KLF4 (zielony) jest wzbogacony w populacjach komórek powierzchniowych. (L) Ocena poziomu mRNA KLF4 w trzech przedziałach za pomocą RT-PCR. (M) Analiza poziomu białka KLF4 w tych populacjach komórek metodą Western blot.

Tutaj opisujemy prostą metodę izolacji przestrzennie odrębnych komórek powierzchni nabłonka mysiego okrężnicy od leżących poniżej komórek o kryptobazie.

Metoda kriosekcji do mikrodysekcji mysiej błony śluzowej okrężnicy

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Ogólnym celem tej procedury jest mikrodysekcja dwóch przestrzennie odrębnych regionów okrężnicy: strefy krypt K o charakterze proliferacyjnym oraz zróżnicowanych komórek nabłonka powierzchniowego. Jest to realizowane poprzez najpierw usunięcie okrężnicy myszy. Drugim krokiem jest zamrożenie tkanki pomiędzy dwiema metalowymi płytkami.Następnie tkankę montuje się na wcześniej wypoziomowanym bloku OCT. Ostatnim krokiem jest wykonanie seryjnych cięć tkanki w kriotomie z odstępem 10 micron. W końcowej fazie stosuje się analizę real-time PCR lub Western blot, aby wykazać zmiany w ekspresji genów i białek.Zaletą naszej techniki jest to, że jest ona szybka, niedroga i zapewnia wysoką wydajność. Nasza procedura została przeprowadzona przez Christiana Garnera Schmidta, technika w naszej grupie. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Emory oraz wykonane zgodnie z kryteriami Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH).Po przygotowaniu kriostatu należy, zgodnie z rutyną, wyrównać temperaturę noży i uchwytów kriostatu do -20 °C. Następnie należy wypełnić pustą formę do mrożenia medium OCT (optimal cutting temperature compound) i wyrównać jego temperaturę do -20 °C. Proces ten potrwa około 30 minut.Wyjmij zamrożone OCT z formy i przymocuj go do uchwytu za pomocą płynnego OCT. Umieść uchwyt w ramieniu mikrotomu i pozostaw OCT do zastygnięcia na 10 minut. Ustaw kriostat na 10 mikronów na sekcję i skrawaj blok OCT, aż będzie płaski, a następnie odsuń ramię mikrotomu od noża o kilka centymetrów.Następnie przygotować dwa ostrza żyletki na każdą próbkę, stępiając ich ostre krawędzie za pomocą metalnego pilnika. Następnie usunąć aluminiową obręcz pęsetą. Przygotować 10 centymetrową szalkę do hodowli tkankowej, wypełnioną w 50% silikonem, oraz 10 do 15 pinezek sekcyjnych.Po uśmierceniu myszy zgodnie z zatwierdzonymi metodami oraz wycięciu dystalnego odcinka okrężnicy o długości od 0 do 6 cm od odbytu, do szalki należy dodać 5 mL buforu Hanksa o temperaturze pokojowej. Do cięcia należy użyć nożyczek. Okrężnicę należy rozciąć wzdłużnie i usunąć treść kałową.Przypnij tkankę do silikonowej szalki sekcyjnej zawierającej bufor Hank'a, tak aby powierzchnia śluzówkowa była skierowana do góry. Rozciągnij tkankę za pomocą szpilek sekcyjnych. Następnie pozostaw ją na 10 minut w temperaturze pokojowej, aby wyprostować fałdy tkanki i pozwolić warstwom mięśniowym na rozluźnienie.Po odpoczynku tkanki usuń wszystkie piny poza tymi na końcach. Wsuń ostrze żyletki pod pożądany fragment tkanki, a następnie odlej bufor Hanksa. Dodaj kolejne ostrze żyletki na górze, tworząc strukturę kanapkową.Odetnij segment tkanki i usuń piny końcowe. Przenieś kanapkę tkankową z żyletkami na suchy lód. Pozostaw tkankę do zamrożenia na okres od 5 do 10 minut.Podnieś kanapkę tkankową z żyletkami i pozwól jej lekko się ogrzać, kładąc palec na górnym ostrzu. Rozdziel kanapkę i wytnij krawędzie segmentu tkanki. Wytnij segment tkanki o wymiarach około 0,5 cm na 1 cm.Pozostaw tkankę do ogrzania, aż lód na jej powierzchni zacznie topnieć. W tym momencie szybko i ostrożnie dociśnij tkankę do bloku OCT. W kriostacie przyłóż palec do próbki.Przewodzenie ciepła umożliwi usunięcie ostrza bez naruszania tkanki. Pokryj tkankę OCT i pozostaw ją na pięć minut w celu wyrównania temperatury. Następnie wykonaj przekroje o grubości 10 mikronów.Umieść skrawki na szkiełku i dokonaj inspekcji wizualnej, aż do momentu zauważenia krypt. Umieść skrawki w probówkach o pojemności 1.5 ml lub na szkiełkach. Na tym obrazie przedstawiono tkankę okrężnicy barwioną hematoksyliną i eozyną w tradycyjnym przekroju poprzecznym, gdzie warstwa mięśniowa okrężna jest oznaczona jako cm.Warstwa mięśniowa błony śluzowej (muscularis mucosa), oznaczona jako MM, komórki podstawy krypt, komórki przejściowe oraz komórki powierzchniowe są wyraźnie widoczne. Zdjęcie przedstawia okrężną warstwę mięśniową po wykonaniu seryjnych cięć. W miarę przemieszczania się w stronę komórek powierzchniowych widoczna jest warstwa mięśniowa błony śluzowej.Na tym obrazie przedstawiono przy większym powiększeniu komórki podstawy krypt zabarwione na h i D. Należy zwrócić uwagę na brak centralnego światła. Tutaj widoczne są komórki przejściowe, a obraz ten ukazuje komórki powierzchniowe.Poniższe obrazy przedstawiają barwienie immunofluorescencyjne wyizolowanych krypt jelita grubego w celu uwidocznienia białka połączeń międzykomórkowych. Białko okludyna-1 lub ZO-1 jest widoczne w kolorze zielonym, natomiast jądra komórkowe, widoczne w kolorze niebieskim, są obserwowane w przekroju poprzecznym. Komórki przejściowe i powierzchniowe są tutaj przedstawione po sekcjowaniu seryjnym.Wiele czynników różnicowania jest wyrażanych w sposób spatiotemporalny wzdłuż osi powierzchni krypty. Należą do nich czynnik transkrypcyjny KLF4, pokazany na zielono, który jest wzbogacony w populacjach komórek powierzchniowych w przekroju poprzecznym; seryjne cięcie pozwala na ocenę poziomu mRNA KLF4 w trzech przedziałach za pomocą czasu rzeczywistego PCR. Na koniec, ten western blot wykazuje poziomy białka KLF4 w tych populacjach komórek.Pamiętaj, że praca z nożami do mikrotomu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas wykonywania tej procedury.

cryosectioning-method-for-microdissection-of-murine-colonic-mucosa

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokazujemy technikę izolowania całych krypt z jelita cienkiego myszy. Wyizolowane całe krypty mogą być wykorzystywane do rozmnażania długowiecznych i samoodnawiających się organoidów 3D in vitro.

Izolacja krypt jelitowych: metoda izolowania całych krypt z jelita cienkiego modelu myszy

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem funkcji immunologicznych określonych subpopulacji komórek w łatach Peyera (PP), głównych miejscach indukcyjnych tkanek limfatycznych związanych z jelitami.  W tym miejscu przedstawiamy równoległe protokoły przygotowania preparatów pojedynczych komórek PP do analizy cytometrii przepływowej i kriosekcji PP do barwienia immunologicznego.

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

Miofibroblast jest wpływową komórką zrębu przewodu pokarmowego, która reguluje ważne procesy fizjologiczne zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym. Opisujemy technikę, która pozwala na izolację pierwotnych miofibroblastów zarówno z mysjej, jak i ludzkiej tkanki okrężnicy, którą można wykorzystać do eksperymentów in vitro.

Izolacja pierwotnych miofibroblastów z tkanki okrężnicy myszy i człowieka

Opisano użycie prostego urządzenia do cięcia i 'zwijania' mysich jelit w celu szybkiego przygotowania całych przygotowań do montażu.

Proste urządzenie do szybkiego przygotowania całych wierzchowców jelita myszy

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Celem tego protokołu jest uzyskanie próbek RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych wyizolowanych z nieutrwalonej, świeżo wyciętej tkanki jelita ludzkiego za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM). Protokół ten obejmuje przygotowanie błyskawicznie zamrożonych próbek ludzkiej tkanki jelitowej, kriosekcję, barwienie i odwodnienie etanolowe, LCM i ekstrakcję RNA.

Optymalizacja mikrodysekcji laserowej w celu izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej

Komórki enterochromafiniczne (EC) stanowią mały podzbiór komórek nabłonka przewodu pokarmowego. Komórki EC są elektrycznie pobudliwe i uwalniają serotoninę, jednak trudności w hodowli i identyfikacji komórek EC mają ograniczone badania fizjologiczne. Przedstawiona tutaj metoda ustanawia model hodowli pierwotnej, który można badać pojedyncze komórki EC za pomocą elektrofizjologii.

Elektrofizjologia całych komórek pierwotnych hodowanych mysich komórek enterochromafinowych

Brak standaryzacji przetwarzania tkanek mysich obniża jakość analizy histopatologicznej myszy w porównaniu do próbek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykonywania badania histopatologicznego mysich tkanek okrężnicy objętych stanem zapalnym i bez stanu zapalnego, aby wykazać wykonalność systemów robotycznych rutynowo stosowanych do przetwarzania i osadzania próbek ludzkich.

Wykorzystanie systemów robotycznych do przetwarzania i osadzania próbek myszy okrężnicy do analiz histologicznych

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek jednojądrzastych, które znajdują się w blaszce właściwej jelita grubego, poprzez enzymatyczne trawienie tkanki za pomocą kolagenazy. Protokół ten pozwala na efektywną izolację komórek jednojądrzastych, w wyniku której powstaje zawiesina pojedynczej komórki, która z kolei może być wykorzystana do solidnego immunofenotypowania.

Izolacja komórek jednojądrzastych blaszki właściwej z mysiej okrężnicy przy użyciu kolagenazy E

Tutaj podajemy szczegółowy opis procedury wywoływania biopsji szczypanych pod kontrolą kolonoskopii u myszy i śledzenia zamykania ran w czasie rzeczywistym. Dodatkowo przedstawiono metody przygotowania tkanek do analiz histologicznych, immunohistochemicznych i molekularnych łożyska rany.

Wykonywanie biopsji szczyptowych pod kontrolą kolonoskopową u myszy i ocena późniejszych zmian w tkankach

Obecny protokół opisuje ustanowienie systemu organoidów mysiego okrężnicy do badania aktywności i funkcjonowania komórek macierzystych okrężnicy w modelu nokautu klaudyny-7.

Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

Poznaj metodę kriosekcji do mikrodysekcji błony śluzowej okrężnicy myszy, umożliwiającą izolację komórek nabłonkowych z różnych stref krypt. Technika ta jest szybka, tania i wydajna.

Metoda kriosekcji do mikrodysekcji mysiej błony śluzowej okrężnicy

Przeglądaj więcej filmów