Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar wydzielania białek z poszczególnych komórek z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Osiąga się to poprzez litograficzne wytwarzanie złotych nanoczujników plazmonicznych na szklanych szkiełkach nakrywkowych w celu obrazowania wydzielin pojedynczych komórek bez etykietowania. W drugim etapie chip czujnika jest czyszczony i powlekany samoorganizującą się monowarstwą, a następnie funkcjonalizowany ligandami, które mają wysokie powinowactwo do wydzielanych białek analitowych.

Następnie komórki są integrowane ze sfunkcjonalizowanymi chipami czujników w celu zmierzenia ich wydzieliny w przestrzeni i czasie. Wyniki pokazują, że wydzieliny białkowe z poszczególnych komórek mogą być mapowane zarówno przestrzennie, jak i czasowo bez konieczności znakowania. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komunikacji międzykomórkowej, takie jak to, w jaki sposób parakrynne i autokrynne szlaki sygnałowe regulują ruchliwość komórek.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy nałożyć cienką warstwę chromu o grubości 10 nanometrów na wcześniej oczyszczone szkiełka nakrywkowe poprzez odparowanie wiązki elektronów, aby uniknąć efektów ładunku podczas modelowania i obrazowania nanostruktur. Po tym wirowaniu pierwsza warstwa dwuwarstwowego oporu składającego się z mleczanu etylu, kopolimeru metakrylanu metylu przy 2000 obr./min przez 45 sekund. Następnie piecz podłoże w temperaturze 150 stopni Celsjusza po pozostawieniu podłoża do ostygnięcia do temperatury pokojowej.

Wirować drugą warstwę polimetakrylanu metylu z prędkością 3000 obr./min przez 45 sekund i wypalić podłoże w temperaturze 150 stopni Celsjusza. Dwuwarstwowa odporność przy użyciu litografii wiązką elektronów lub EBL. Wytworzyć alkohol izopropylowy lub keton metylowo-izobutylowy IPA lub MIBK w stosunku dwa do jednego i spłukać w IPA.

Usunąć chrom z rozwiniętego obszaru nanostruktur za pomocą wytrawiania na mokro za pomocą wytrawiania CR siedem przez 10 sekund w temperaturze pokojowej, a następnie spłukać w dejonizowanej, destylowanej wodzie destylowanej Osadzać warstwę tytanu złota na podłożu za pomocą parownika wiązki elektronów po osadzaniu złota. Zdejmij dwuwarstwę kopolimeru. Oprzyj się, mocząc podłoże w acetonie przez cztery godziny.

Następnie należy sprawdzić podłoże za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, aby potwierdzić kształt i rozmiar nanostruktury. Powstałe nanostruktury są zwykle oddzielone od siebie podziałką 300 nanometrów. Układy nanostruktur o wymiarach 20 na 20 są rozmieszczone w odstępach 30 mikronów od środka do środka.

Pozostawiając dużo miejsca na obrazowanie komórek, typowy chip będzie zawierał 300 tablic. Usuń pozostały chrom z podłoża za pomocą mokrej krawędzi za pomocą wytrawiania CR seven przez 60 sekund w temperaturze pokojowej. Następnie przepłucz podłoże w dejonizowanej wodzie destylowanej.

Następnie zbadaj podzbiór macierzy za pomocą mikroskopu sił atomowych w celu weryfikacji rozmiaru i jednorodności. Ta wzorzysta szklana szkiełko nakrywkowe może być używana wielokrotnie, o ile przestrzegane są odpowiednie procedury czyszczenia w celu czyszczenia i regeneracji zlokalizowanej powierzchni plazmy i rezonansu lub wiórów LSPR. Popiół plazmowy o mocy 40 watów w mieszaninie 300 mili do mieszaniny 5% wodoru i 95% argonu przez 45 sekund.

Funkcjonalizuj powierzchnię złota i nanostruktury natychmiast po spopielaniu plazmowym. Zanurzając chip w dwuskładnikowym roztworze etanolu i tiolu składającym się ze stosunku SPO i SPC do jednego do jednego. Po pozostawieniu chipa na noc w roztworze tiolu w celu utworzenia samoorganizującej się monowarstwy, przepłucz go etanolem i wysusz gazowym azotem, załaduj chip LSPR do specjalnie wykonanego uchwytu mikroprzepływowego, umieszczając chip na aluminiowym spodzie.

Następnie umieść chip między tą dolną częścią a silikonową uszczelką i przezroczystą plastikową górną częścią za pomocą czterech, aby zacisnąć zespół. W przypadku typowej aplikacji tiolu na bazie SPC należy nasypać kroplą 300 mikrolitrów mieszaniny 133 milimolowych EDC i 33 milimolowych NHS w dejonizowanej wodzie destylowanej, aby aktywować grupy karboksylowe składnika tiolowego SPC. Po odczekaniu 10 minut ręcznie spłucz powierzchnię 10-milimolowym PBS, a następnie sprzęgnij aktywowaną grupę karboksylową z interesującym ligandem, pokrywając kroplami 300 mikrolitrów roztworu liganda.

Po odczekaniu jednej godziny i spłukaniu powierzchni za pomocą 10-milimolowego kodu kropli PBS, 300 mikrolitrów 0,1 molowej etanoloaminy w PBS na chipie, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie. Po odczekaniu 10 minut przemyć etanoloaminę PBS zawierającym 0,005% między 20 a PBST 20. Następnie umieść kawałek kwarcu nad chipem, aby zmniejszyć wahania danych związanych ze zmieniającą się łąkotką.

Utrzymuj chip mokry buforem PBST 20 podczas montażu na mikroskopie. Podłącz rurkę mikroprzepływową do zespołu i bufora przepływu, aż do osiągnięcia stanu ustalonego. Następnie mocno umieść zespół chipa LSPR w podgrzewanym uchwycie próbki stage.

Konfiguracja optyczna dla tej metody jest pokazana tutaj. Światło z lampy halogenowej jest przepuszczane przez filtr przepustowy o długości 593 nanometrów w celu wyeliminowania długości fal, które nie przyczyniają się do odpowiedzi nanoplazmonicznej. Światło jest następnie polaryzowane liniowo, a próbka jest oświetlana za pomocą obiektywu o aperturze numerycznej 40 x 1,4 w celu wzbudzenia plazmonicznych nanostruktur złota.

Rozproszone światło jest zbierane przez obiektyw i przepuszczane przez skrzyżowany polaryzator w celu zmniejszenia sygnału tła ze szklanego podłoża. Rozdzielacz wiązki 50 50 jest umieszczany w zebranej ścieżce światła w celu jednoczesnej analizy spektroskopowej i obrazowej. Po pozostawieniu zespołu i mikroskopu do zrównoważenia przez co najmniej dwie godziny, ustaw chip za pomocą joysticka tak, aby centralny układ był wyrównany ze światłowodem do spektroskopii.

Po wyhodowaniu i granulowaniu hybrydowych komórek DOMA przez odwirowanie, należy je zebrać, a następnie przetestować pod kątem żywotności przed wprowadzeniem ich do chipów LSPR. Następnie należy ręcznie wprowadzić 50 mikrolitrów roztworu komórkowego na chipy LSPR za pomocą mikropipety. Na koniec zmyj pozostałe komórki w roztworze świeżą pożywką wolną od surowicy za pomocą mikroprzepływowego systemu fuzyjnego, aby przygotować chipy LSPR do obrazowania.

Nakładka obrazu obrazowania LSPR, która podkreśla kwadratowe tablice, oraz obrazu oświetlonego światłem przechodzącym, który podkreśla komórkę w lewym dolnym rogu, jest pokazana tutaj. Komórka wybarwiona fluorescencyjnym prętem barwnikowym Domine, DHPE wykazuje przedłużenia podobne do filopodiów. Gdyby takie rozszerzenia nakładały się na matryce, dałyby fałszywie dodatnie dane spektrometrii wydzielania białek przed i po wprowadzeniu nasyconego roztworu przeciwciał antys cmic do funkcjonalizowanych matryc CMIC jest tutaj wyświetlany.

Ta metoda jest stosowana w celu kalibracji macierzy. Kalibracja matryc pomaga w normalizacji odpowiedzi czujników i określeniu ułamkowego zajętości na podstawie profilu biofunkcjonalizacji każdego przebiegu. Komercyjny instrument SPR jest używany do określania stałej dysocjacji, a także do badania odporności na niespecyficzne wiązanie przy użyciu tego samego protokołu, który opisano dla układu LSPR.

W tym miejscu przedstawiono znormalizowane wartości z dwóch tablic. Jedna matryca znajdowała się w odległości nie większej niż 10 mikrometrów od komórki, podczas gdy grupa kontrolna znajdowała się w odległości 130 mikrometrów od komórki. Nagły wzrost znormalizowanej odpowiedzi macierzy znajdującej się najbliżej komórki w stosunku do płaskiej odpowiedzi macierzy kontrolnej wskazuje na zlokalizowany wybuch wydzielanych przeciwciał.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć wydzielanie białek z poszczególnych komórek z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.