Name: Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj metodę badania regeneracji funkcjonalnej połączeń wewnątrzrdzeniowych w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych. Technika umożliwia ocenę potencjału regeneracyjnego w kontrolowanych warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Szwajcarską Fundację Narodową (nr 3100AO-120327 i 31003A_140754/1)

Opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi zatwierdzonymi przez szwajcarskie władze lokalne (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, zatwierdzenie nr 52/11 i 35/14). Niniejsze wytyczne są zgodne z Dyrektywą Wspólnoty Europejskiej 2010/63/UE.
Uwaga: Pracuj w okapie z przepływem laminarnym ze sterylnymi narzędziami i roztworami dla wszystkich kroków 1 - 5, w tym podkroków.
1. Przygotowanie MEA
Uwaga: MEA składają się ze szklanego podłoża, mikro-prefabrykowanych metalowych elektrod i warstwy izolacyjnej z polimeru SU-8 (zobacz także Tscherter et al. 3). Na potrzeby tego badania zamówiono dostępne na rynku MEA z niestandardowym układem matrycy elektrod (Rysunek 1 A&B). 68 elektrod jest ułożonych w prostokątną siatkę, która jest podzielona na dwie strefy za pomocą rowka o szerokości 300 μm, wolnego od elektrod, przewodów elektrycznych i izolacji. Każda elektroda ma wymiary 40 x 40 μm i są one oddalone od siebie o 200 μm od środka do środka. Cztery duże elektrody uziemiające są umieszczone wokół miejsca rejestracji. Różnią się one od innych dostępnych na rynku standardowych MEA rozmiarem (21 mm x 21 mm) i nie posiadają stałej komory zapisu.
<ol>
	<li>W celu dezynfekcji płukać MEA w 100% etanolu (2x), 70% etanolu (1x) i wodzie destylowanej (2x) przez co najmniej 30 sekund każdy. Pozostaw do wyschnięcia. Umieść 10 - 12 MEA na czystej szklanej szalce Petriego (150 mm x 25 mm) i zamknij pokrywkę.</li>
	<li>Autoklaw MEA przez 20 minut w temperaturze 120 °C. Przechowywać w temperaturze RT.</li>
	<li>Przygotować roztwór powlekający (patrz wykaz materiałów) dla MEA i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Umieść każdy MEA na indywidualnej sterylnej szalce Petriego (35 mm x 10 mm).</li>
	<li>Za pomocą schłodzonej pipety nałożyć 150 μl schłodzonego roztworu powlekającego na elektrody i zamknąć pokrywę szalki Petriego. Po około 10 minutach sprawdź, czy na elektrodach nie ma pęcherzyków powietrza i w razie potrzeby delikatnie usuń je gumową szpatułką. Odstaw na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać pozostałości roztworu powlekającego, przemyć 1x pożywką zoptymalizowaną dla neuronów prenatalnych i embrionalnych oraz 2x destylowaną, sterylną wodą. Jeśli MEA nie zostaną użyte do następnego dnia, należy je przechowywać w destylowanej, sterylnej wodzie o temperaturze 37 °C w inkubatorze O/N. W przeciwnym razie pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Składniki niezbędne do przygotowania i wzrostu kultur organotypowych
<ol>
	<li>Przygotować bezwapniowy roztwór myjący (patrz lista materiałów).</li>
	<li>Rozpuść osocze kurczaka w roztworze do przemywania (1:1, delikatnie wstrząsnąć, unikać tworzenia się pęcherzyków), odwirować przy 3 000 x g przez około 20 minut i zdekantować klarowną zawartość do sterylnej probówki. Podać 200 μl do krioprobówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozpuść odpowiednio trombinę z osocza bydlęcego (200 j./ml) i sterylnego filtra (filtr porowy 0,2 μm). Podwielokrotność 200 μl do krioprobówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Na 30 kultur przygotuj 100 ml pożywki (patrz lista materiałów).</li>
</ol>
3. Wycięcie tkanki rdzenia kręgowego
Uwaga: Procedura daje, w zależności od liczby zarodków, plastry rdzenia kręgowego dla około 25 - 35 kokultur i jest przygotowywana w kapturze z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Nałożyć śmiertelną dawkę pentobarbitalu (0,4 ml) na matkę zwierzęcia we wstrzyknięciu domięśniowym. Potwierdź głębokie znieczulenie, sprawdzając odruch wycofania pedału. Dostarczyć zarodki szczurów E14 przez cesarskie cięcie i złożyć w ofierze przez ścięcie.</li>
	<li>Przenieś ciała zarodków na szalkę Petriego wypełnioną sterylnym, schłodzonym roztworem do mycia.</li>
	<li>Wykonaj jedno pełne cięcie poprzeczne skalpelem nad kończynami tylnymi, a drugie nad kończynami przednimi i usuń kończyny z ciała. Następnie wykonaj nacięcie w płaszczyźnie czołowej, aby oddzielić wnętrzności od tylnej części zawierającej rdzeń kręgowy.</li>
	<li>W celu pokrojenia należy przenieść tylne części zawierające rdzeń kręgowy pojedynczo na dysk montażowy i przyciąć na grubość 225 - 250 μm za pomocą rozdrabniacza do tkanek. Nałóż kroplę roztworu myjącego na posiekaną tkankę i przenieś plastry szpatułką na szalki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm wypełnione sterylnym, schłodzonym roztworem do mycia.</li>
	<li>Dla każdego plastra osobno wypreparuj rdzeń kręgowy z pozostałej tkanki. Pozostaw przyczepione zwoje korzenia grzbietowego.</li>
	<li>Odstaw plastry na 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Montaż wycinków tkanki rdzenia kręgowego na MEA
<ol>
	<li>Podgrzać sterylną pożywkę w inkubatorze (37 °C, lekko odkręcona pokrywka do natlenienia).</li>
	<li>Umieść MEA za pomocą sterylnej pęsety z gumowymi końcówkami w punkcie RT na szalce Petriego pod mikroskopem stereoskopowym z ustawioną ostrością na matrycy elektrod. Wyśrodkuj kroplę 6 μl osocza kurzego na czystym, wolnym od kurzu i sterylnym układzie elektrod. Za pomocą małej szpatułki ostrożnie wsuń dwa odcinki rdzenia kręgowego z brzusznymi bokami skierowanymi do siebie do kropli osocza. Nie dotykaj elektrod szpatułką.</li>
	<li>Dodać 8 μl trombiny wokół kropelki osocza kurczaka. Używając końcówki pipety trombinowej, ostrożnie wymieszaj i rozprowadź mieszaninę osocza kurczaka/trombiny wokół dwóch plasterków. Również w tym przypadku nie należy dotykać bezpośrednio kruchego układu elektrod. Tuż przed krzepnięciem odessać nadmiar osocza kurczaka/trombiny.</li>
	<li>Zakryj szalkę Petriego, aby utrzymać wysoką wilgotność, podczas gdy zespół MEA/kultura siedzi przez około 1 godzinę w wilgotnej komorze wewnątrz inkubatora w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 10 μl pożywki do komory hodowlanej, zakryć szalkę Petriego i włożyć z powrotem do inkubatora na około 30 minut.</li>
	<li>Umieść każdy zestaw MEA/hodowli ze sterylnymi, pokrytymi gumą końcówkami w rurce rolkowej, dodaj 3 ml pożywki i szczelnie zamknij pokrywkę. Umieścić rurkę rolkową w bębnie rolkowym obracającym się z prędkością 1-2 obr./min w inkubatorze w atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zmienić połowę pożywki po 7 dniach in vitro (DIV), a następnie 1-2 razy w tygodniu.</li>
</ol>
5. Uszkodzenia mechaniczne
<ol>
	<li>Wyjmij zestaw MEA/kultura ze sterylnymi, pokrytymi gumą końcówkami z rurki rolkowej i umieść na szalce Petriego bez pożywki pod mikroskopem stereoskopowym z tkanką w ostrości. Sprawdź wzrokowo, czy dwa plasterki są połączone.</li>
	<li>Trzymaj zespół MEA/kultura stabilnie, umieszczając pęsetę z gumowymi końcówkami na MEA.</li>
	<li>Umieść ostrze skalpela w rowku MEA w pobliżu plastrów tkanki. Trzymaj skalpel raczej poziomo.</li>
	<li>Podnieś rękojeść skalpela do góry, ale pozwól ostrzu skalpela pozostać w rowku MEA w taki sposób, aby ostrze "toczyło się" od podstawy do czubka, a tym samym przecinało tkankę pokrywającą rowek.</li>
	<li>W razie potrzeby należy utwardzić wszelkie resztki połączeń tkankowych za pomocą końcówki igły 25 G. Pracuj tylko w obszarze w rowku i nie dotykaj delikatnych krawędzi.</li>
	<li>Włóż zestaw MEA/kulturę z powrotem do rury rolkowej. Dostarczyć 3 ml świeżej pożywki do kultur i umieścić je z powrotem w bębnie rolkowym w inkubatorze.</li>
</ol>
6. Elektrofizjologiczne zapisy spontanicznej aktywności
<ol>
	<li>Aby zbadać funkcjonalną regenerację między dwoma wycinkami rdzenia kręgowego po wybranej liczbie DIV, zamontuj zespół MEA/hodowla w komorze rejestracyjnej pod mikroskopem i nałóż około 500 μl roztworu zewnątrzkomórkowego (patrz lista materiałów).</li>
	<li>Odczekaj 10 minut przed pierwszym nagraniem, aby system się ustabilizował.</li>
	<li>Rejestruj podstawową spontaniczną aktywność 2x przez około 10 minut z każdej elektrody wykrywającej aktywność MEA w RT.</li>
	<li>Aby zapewnić stabilne warunki zewnątrzkomórkowe, wymieniaj się roztworem zewnątrzkomórkowym po każdej sesji nagraniowej.</li>
	<li>Aby odhamować sieć, należy zastosować roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający strychninę (1 μM) i gabazynę (10 μM). Odczekaj co najmniej 2 minuty przed rozpoczęciem nagrywania.</li>
</ol>
7. Analiza danych
Uwaga: Do wykrywania pozakomórkowych zarejestrowanych potencjałów czynnościowych użyj dla każdej elektrody detektora opartego na odchyleniach standardowych i późniejszym dyskryminatorze. Procedura ta została szczegółowo opisana w Tscherter i wsp. Rozdział 3.
<ol>
	<li>Wyświetlanie wykrytej aktywności neuronalnej każdej elektrody na wykresie rastrowym zgodnie ze standardowymi procedurami 3 (rysunek 1F).</li>
	<li>Określ i wyświetl całkowitą aktywność sieciową dla każdego wycinka, sumując liczbę zdarzeń w odpowiednich kanałach w przesuwanym oknie o 10 ms, przesuniętym o krok co 1 ms (rysunek 1G i patrz Tscherter i in. 3).</li>
	<li>Wykryj w każdym wycinku pojedyncze impulsy (skupiska aktywności, które pojawiają się na kilku elektrodach). W związku z tym należy ustawić minimalny próg szczytowej aktywności w odpowiedniej całkowitej aktywności sieci i zdefiniować każdy początek i koniec serii. Na przykład, odpowiednim progiem jest 25% średniej amplitudy impulsu, a początek serii może być zdefiniowany jako pierwsze zdarzenie w oknie czasowym wynoszącym co najmniej 5 ms, a koniec serii jako ostatnie zdarzenie w oknie czasowym wynoszącym co najmniej 25 ms (patrz Heidemann i wsp. Rozdział 10).</li>
	<li>Aby określić ilościowo regenerację funkcjonalną, oblicz procent zsynchronizowanych serii między dwoma wycinkami. Aby to zrobić, oblicz opóźnienie między serią w jednym wycinku a następną serią w drugim wycinku. 
	Uwaga: Para serii jest określana jako "zsynchronizowana", gdy opóźnienie jest mniejsze niż średnia długość serii. Szczególnie w kokulturach o dużej aktywności istnieje możliwość, że obie strony przypadkowo zainicjują impuls w wybranym oknie opóźnienia. Fakt ten musi być brany pod uwagę przy określaniu procentu zsynchronizowanych impulsów. Szczegółowy opis obliczeń znajduje się w Heidemann et al. Rozdział 10.</li>
</ol>
8. Utrwalenie kultur i immunohistochemia
<ol>
	<li>W przypadku wszystkich etapów, które obejmują mycie lub inkubację, należy umieścić kultury na uchylnym stole, aby zapewnić prawidłową dyfuzję roztworu przez tkankę.</li>
	<li>Bezpośrednio po zakończeniu sesji nagraniowej wyjmij zestaw MEA/kultura z zestawu, umieść go na szalce Petriego (35 mm x 10 mm) i dodaj około 2 ml roztworu zewnątrzkomórkowego.</li>
	<li>Aby oddzielić plastry od otaczających warstw komórek, które utworzyły się podczas in vitro, weź końcówkę pipety o pojemności 10 μl i zakreśl plasterki. Uważaj, aby nie uszkodzić kultur. Możliwe jest pominięcie tego kroku, ale późniejsze osadzanie jest łatwiejsze, gdy jest wykonywane.</li>
	<li>Użyj cienkiej niemetalowej igły strzykawkowej (patrz lista materiałów) w połączeniu ze strzykawką o pojemności 1 ml wypełnioną roztworem zewnątrzkomórkowym, aby delikatnie zdmuchnąć kulturę z MEA.</li>
	<li>Zdejmij końcówkę pipety Pasteura i umieść gumową gruszkę na odciętym końcu. Użyj tylnego końca, aby przenieść kulturę do utrwalacza (4% paraformaldehydu z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, 0,1 M)). Nie należy używać standardowej końcówki pipety Pasteura do przenoszenia, ponieważ jest ona zbyt mała, a kultury zostałyby złożone i prawdopodobnie uszkodzone. Utrwalaj przez 1 - 2 godziny w temperaturze 4 °C. Spłucz MEA wodą destylowaną i usuń pozostałości tkanek opuszkami palców, ale nie drap paznokciem. Przechowywać MEA w wodzie destylowanej o temperaturze 4°C.</li>
	<li>Myj kultury 3x w PBS przez co najmniej 10 minut każda. Przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C lub bezpośrednio rozpocząć procedurę barwienia.</li>
	<li>Inkubować kultury przez co najmniej 90 minut w roztworze blokującym (5% surowicy koziej, 1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,3% detergentu w PBS).</li>
	<li>Dodać pierwsze przeciwciało rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubować przez 3 noce w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Prać 3x w PBS przez co najmniej 30 min każdy.</li>
	<li>Dodać drugie przeciwciało rozcieńczone w PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Prać 3x w PBS przez co najmniej 30 min każdy.</li>
	<li>Przenieś plastry pipetą Pasteura z usuniętą końcówką na szkiełko podstawowe. Usuń nadmiar PBS i osadź go za pomocą nośnika montażowego.</li>
</ol>

<ol><li>Avossa, D., Rosato–Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+circuits+formation%3A+a+study+of+developmentally+regulated+markers+in+organotypic+cultures+of+embryonic+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord.</a> Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).</li>
<li>Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+developmental+profile+of+neurons+and+glia+in+motor+nuclei+of+the+brainstem+and+spinal+cord%2C+and+its+comparison+with+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures.</a> Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).</li>
<li>Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+characterization+of+rhythmic+activity+in+rat+spinal+cord+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).</li>
<li>Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+oscillations+of+spiking+activity+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).</li>
<li>Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+correlated+spontaneous+activity+in+the+assembly+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits.</a> Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).</li>
<li>Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rhythmic+patterns+of+activity+by+ventral+interneurones+in+rat+organotypic+spinal+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28Lond.%29%22%5BJournal%5D)">Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture.</a> J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).</li>
<li>Hanson, M. G., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+patterns+of+spontaneous+activity+are+required+for+correct+motor+axon+guidance+and+the+expression+of+specific+guidance+molecules%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules).</a> Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).</li>
<li>Courtine, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+supraspinal+control+of+stepping+via+indirect+propriospinal+relay+connections+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury.</a> Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).</li>
<li>Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+of+intraspinal+connections+in+a+new+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model.</a> Neuroscience. 262, 40-52 (2014).</li>
<li>Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+motor+neurons+corelease+glutamate+and+acetylcholine+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).</li>
<li>Tsuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+induces+selective+motor+neuron+death+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).</li>
<li>Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+activity+and+positive+feedback+in+motor+circuits+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).</li>
<li>Bahrami, F., Janahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+supplements+affect+electrophysiological+properties+and+excitability+of+rat+hippocampal+pyramidal+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Iran.+Biomed+J%22%5BJournal%5D)">Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture.</a> Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).</li>
<li>Mentis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncholinergic+excitatory+actions+of+motoneurons+in+the+neonatal+mammalian+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+U.S.A.%22%5BJournal%5D)">Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).</li>
<li>Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+are+rich+in+non%E2%80%93phosphorylated+neurofilaments%3A+Cross%E2%80%93+species+comparison+and+alterations+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Motor neurons are rich in non–phosphorylated neurofilaments: Cross– species comparison and alterations in ALS.</a> Brain Res. 861 (45–58), (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kilka elementów przedstawionej procedury ma zasadnicze znaczenie dla przeprowadzenia dokładnych i powtarzalnych eksperymentów. Wszystkie etapy przygotowania MEA, roztworów i produkcji kultur plastrów są wykonywane w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym. Antybiotyki nie są stosowane do pożywki, ponieważ mogą wpływać na spontaniczną aktywność 14. Podczas powlekania MEA najważniejszą częścią jest upewnienie się, że roztwór żelu macierzy zewnątrzkomórkowej pozostaje zimny przez cały czas. Rozmrozić go w lodówce i przechowywać na lodzie przez całą procedurę, aby zapewnić maksymalną temperaturę bliską 0 °C. Podczas przygotowania plastrów szybkie izolowanie i krojenie, a także zwracanie uwagi na niską temperaturę poprzez stosowanie lodowatych preparacyjnych zwiększa odsetek zdrowych kultur. Co więcej, krzepnięcie osocza/trombiny jest jednym z najbardziej krytycznych etapów. Najpierw upewnij się, że osocze jest odpowiednio wymieszane z trombiną. Po drugie, należy zwrócić szczególną uwagę na usunięcie jak największej ilości pozostałości, aby zapewnić prawidłowe przyleganie plastrów do MEA. Ten krok jest niezwykle wrażliwy na czas; Jeśli ramy czasowe są zbyt krótkie, usuwa się zbyt dużo mieszaniny osocza i trombiny. Jeśli ramy czasowe są zbyt długie, koagulacja już nastąpiła, co zwiększa ryzyko usunięcia plastrów wraz z resztkowym osoczem/trombiną.
Jeśli planowane są zmiany mechaniczne, ważne jest, aby stosować MEA o dokładnym projekcie. Obszar, w którym ma być zmieniona skóra, musi być wolny od elektrod, przewodów i izolacji. W przeciwnym razie elektryka MEA zostanie uszkodzona i w związku z tym nie będzie można już wykonywać żadnych nagrań.
Kolejnym kluczowym krokiem jest wielkość zmiany. Wykazano wcześniej, że ponowne połączenie dwóch młodych plastrów po zmianie zajmuje około dwóch dni 10. We wszystkich eksperymentach stosowano zasadę, że przestrzeń między plastrami po zmianie nie powinna być większa niż szerokość rowka MEA (300 μm). Większy rozmiar zmiany może skutkować dłuższym czasem na ponowne połączenie lub, jeśli zmiana jest zbyt duża, brakiem ponownego połączenia. Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że początkowe umieszczenie dwóch plasterków w odległości większej niż 1 mm skutkuje bardzo niską szybkością połączenia.
Przed rozpoczęciem zapisów zaleca się co najmniej 10 minut dostosowań do temperatury względnej (RT) zamiast 37 °C w inkubatorze i do roztworu zewnątrzkomórkowego zamiast pożywki. Ścisła obserwacja wzorca aktywności w tych początkowych minutach zapewnia, że zmierzone dane odpowiednio reprezentują wzór pękania kultury po rozpoczęciu rejestrowania.
Do wykrywania aktywności, pozyskiwania danych i dalszego przetwarzania używany jest sprzęt domowej roboty (komora nagrywająca, połączenia ze wzmacniaczami i wzmacniaczami), programy w LabVIEW, C++ i IgorPro. Komercyjne konfiguracje MEA i inne pakiety oprogramowania są również odpowiednie do tych operacji. W tym przypadku sygnały widziane przez elektrody są wzmacniane 1001 razy, a następnie digitalizowane z częstotliwością 6 kHz.
Prezentowany model może być pomocnym narzędziem do badania połączeń propriordzeniowych, ponieważ in vivo są one trudne do zbadania bez ingerencji wstępujących i opadających dróg włóknistych. Wspólna hodowla dwóch wycinków rdzenia kręgowego może elegancko obejść ten problem. Kultury zapewniają mikrośrodowisko, które można ściśle kontrolować i łatwo nim manipulować. Z drugiej strony oczywiście brakuje bodźców nadrdzeniowych i sensorycznych. Dodatkowo proces przygotowania kultury reprezentuje sytuację uszkodzenia OUN. Wiadomo, że komórki glejowe, takie jak astrocyty i mikroglej, reagują na zmiany chorobowe zwiększoną proliferacją, a zatem tkanka jest do pewnego stopnia zreorganizowana. W odniesieniu do przedstawionego modelu nie zaobserwowano powstawania blizny glejowej po wykonaniu zmian mechanicznych. Jednym z wyjaśnień może być to, że mechanizmy adaptacyjne astrocytów zostały uruchomione już w trakcie procesu przygotowania, a zmiany w kulturach nie powodowały dalszej odpowiedzi. Nie ma również dowodów na udział inhibitorów związanych z mieliną, np. Nogo-A, w niskim potencjale regeneracyjnym kultur uszkodzonych w starszym wieku. Wykazano jednak, że leczenie inhibitorem fosfodiesterazy 4 Rolipram, rozpoczynające się bezpośrednio po wykonaniu zmian w 23 DIV, zwiększa regenerację funkcjonalną między plastrami 10. Wyniki te pokazują, że regeneracja funkcjonalna może być zwiększona w starych kulturach. Zauważalnie, że podczas liczenia liczby aksonów przechodzących przez miejsce zmiany nie stwierdzono różnicy między kulturami uszkodzonymi w młodym wieku a kulturami uszkodzonymi w starszym wieku. Wyniki te sugerują, że brak regeneracji aksonów nie jest główną przyczyną utraty regeneracji po późnych zmianach w hodowli, a zatem podkreślają potrzebę stworzenia modelu, który umożliwia funkcjonalną analizę regeneracji. Powstawanie synaps i plastyczność synaptyczna mogą odgrywać ważną rolę w procesie rekonwalescencji 10. Mechanizmy te zyskały wiele uwagi w ostatnich latach i obecnie powszechnie przyjmuje się, że mają one duży wpływ na wynik po urazie rdzenia kręgowego. Dlatego model, który zapewnia stabilne warunki do badania tych procesów w izolacji i bardzo szczegółowo, może z pewnością pomóc w uzyskaniu wglądu w funkcjonalną regenerację rdzenia kręgowego.

Organotypowe kultury warstwowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) były szeroko wykorzystywane do badania różnych zjawisk fizjologicznych i patologicznych, począwszy od rozwoju neuronów, a skończywszy na neurodegeneracji. W porównaniu z zdysocjowanymi kulturami komórkowymi, plastry organotypowe mają tę zaletę, że są bardziej złożone z nienaruszoną cytoarchitekturą i lokalnymi obwodami synaptycznymi. Jednocześnie tkanka może być analizowana w sposób wyizolowany, bez konieczności implikowania zawiłości całości w kontekście in vivo. Ponadto gwarantowany jest łatwy i wielokrotny dostęp do wybranych komórek, środowisko zewnątrzkomórkowe może być precyzyjnie kontrolowane, a modele in vitro są zazwyczaj tańsze niż ich odpowiedniki in vivo. W ostatnich latach różne badania wykazały uderzające podobieństwa między profilami rozwojowymi kultur długoterminowych w porównaniu z odpowiadającymi im żywymi zwierzętami 1,2. Wykazano, że obwody neuronalne różnych regionów OUN wyrażają spontaniczną aktywność sieci podczas rozwoju, a warstwy organotypowe częściowo podtrzymują to zjawisko 3–7. Izolowane preparaty rdzenia kręgowego są szczególnie wykorzystywane do badania generowania rytmu6 i tworzenia obwodów neuronalnych 1.
Sposobem na zarejestrowanie spontanicznej aktywności wycinków organotypowych jest hodowla ich na matrycach wieloelektrodowych (MEA). Urządzenia te zawierają wiele elektrod, które mogą monitorować potencjały zewnątrzkomórkowe generowane przez potencjały czynnościowe z wielu komórek jednocześnie (zapis wielojednostkowy). Wysoka rozdzielczość czasowa zapisów MEA może być wykorzystana do rekonstrukcji precyzyjnej dynamiki aktywności w danym obwodzie neuronalnym. Dodatkowo, w przeciwieństwie do zaciskania plastrów, technika ta jest nieinwazyjna, co pozwala na długoterminowe pomiary i skutkuje tym, że neurony nie są zaburzone w swoim zachowaniu.
Na potrzeby tego badania, kombinacja organotypowych kokultur rdzenia kręgowego i wielomiejscowych zapisów została wykorzystana do zbadania funkcjonalnej regeneracji w obrębie rdzenia kręgowego. Ponieważ dorosłe kręgowce mają ograniczony potencjał powrotu do zdrowia po uszkodzeniu rdzenia kręgowego, badano różne strategie wspierania regeneracji po urazie rdzenia kręgowego. Do tej pory układ korowo-rdzeniowy był zwykle układem modelowym z wyboru dla takich badań. Eksperymenty te są zazwyczaj czasochłonne, kosztowne i wymagają dużych kohort zwierząt ze względu na dużą zmienność w obrębie pojedynczych grup. Co więcej, dowody sugerują, że połączenia propriordzeniowe (neurony, które są całkowicie zamknięte w rdzeniu kręgowym) mogą odgrywać kluczową rolę w procesie powrotu do zdrowia po uszkodzeniach rdzenia kręgowego 8. Włókna te są trudne do zbadania in vivo bez ingerencji wstępujących i opadających odcinków włókien. Bonnici i Kapfhammer 9 wykorzystali podłużne hodowle warstw rdzenia kręgowego myszy po urodzeniu jako alternatywne podejście. Po wykonaniu zmian mechanicznych przeanalizowali półilościowo regenerację morfologiczną aksonów między segmentami rdzenia kręgowego. Zaobserwowali mniej, ale nie żadną liczbę aksonów przecinających miejsce zmiany w kulturach wyciętych w dojrzałym wieku. Natomiast posiewy, które zostały uszkodzone w młodszym stadium, wykazywały wysoki stopień regeneracji aksonów 5-7 dni po uszkodzeniu. Nie przedstawiono jednak dowodu na funkcjonalne powiązania.
Dlatego opracowanie reprezentatywnego modelu in vitro włókien propriordzeniowych, który pozwala na badanie funkcjonalnej regeneracji, może być cennym narzędziem do poszerzenia naszej wiedzy na temat procesów regeneracyjnych w rdzeniu kręgowym.

<table><tbody><tr><td>Planarna matryca wieloelektrodowa</td><td>Qwane Biosciences</td><td></td><td>wykonana na zamówienie według projektu naszego laboratorium</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td><td>Na 100 ml</td></tr><tr><td>Dulbeccos modyfikowana pożywka Eagle's</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>80 ml</td></tr><tr><td>Serum końskie</td><td>Gibco</td><td>26050-070</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>destylowana, sterylna woda</td><td></td><td></td><td>10 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu nerwów-7S [5 ng/ml]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0513</td><td>200 &mikro; l</td></tr><tr><td colspan="4">rozpuszczony w roztworze do płukania z 1% roztworem powlekającym BSA</td></tr> Żel do <tr><td>macierzy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>zewnątrzkomórkowej</td><td>BD Biosciences</td><td>356230</td><td>Musi pozostać zimny przez cały czas; rozcieńczyć 1:50 z pożywką zoptymalizowaną dla neuronów prenatalnych i embrionalnych</td></tr><tr><td>pożywka zoptymalizowana dla neuronów prenatalnych i embrionalnych</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td> <td>do mycia</td><td>[mg/L]</td></tr><tr><td>MgCl2-6H2O</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>400</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>60</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>8 000</td></tr><tr><td>Na2HPO4 bezwodny</td><td></td><td></td><td>48</td></tr><tr><td>D-glukoza (dekstroza)</td><td></td><td></td><td>1,000</td></tr><tr><td colspan="4">Zgodnie z protokołem http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html</td></tr><tr><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy (pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>[mM]</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>4</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td></td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>Na-pirogronian</td><td></td><td></td><td>2</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td><td></td>blokujący</tr><tr><td>Detergent: Triton X-100</td><td></td><td></td><td>0,3%, szkodliwe w przypadku połknięcia</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td>1%</td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td>5%</td></tr><tr><td>Osocze kurczaka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2366</td><td>Liofilizowane, rozpuścić w roztworze myjącym</td></tr><tr><td>Gabazine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SR-95531</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek mekamylaminy</td><td>Tocris</td><td>2843</td><td>działa toksycznie po połknięciu</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>Szkodliwy paraformaldehyd</td><td></td><td></td><td>, 4%</td></tr> <tr><td>SMI-31</td><td>Covance</td><td>SMI-31P</td><td></td></tr><tr><td>SMI-32</td><td>Covance</td><td>SMI-32R-500</td><td></td></tr><tr><td>Strychnina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td>toksyczna</td></tr><tr><td>trombina</td><td>Merck Millipore</td><td>1123740001</td><td>drażniące, uczulające, rozpuszcza się w roztworze</td></tr> <tr><td>myjącymPłaska rurka do hodowli tkankowej 10 (= rura rolkowa)</td><td>Techno Plastic Products AG</td><td>91243</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Dorosłe wyższe kręgowce mają ograniczony potencjał do powrotu do zdrowia po urazie rdzenia kręgowego. Niedawno pojawiły się dowody na to, że połączenia propriordzeniowe są obiecującym celem interwencji w celu poprawy regeneracji funkcjonalnej. Do tej pory nie istnieje model in vitro, który dawałby możliwość zbadania funkcjonalnej odbudowy włókien propriordzeniowych. W związku z tym opracowano reprezentatywny model, który opiera się na dwóch organotypowych odcinkach rdzenia kręgowego zarodka szczura, hodowanych obok siebie na matrycach wieloelektrodowych (MEA). Plastry te rosną i w ciągu kilku dni in vitro łączą się wzdłuż boków zwróconych do siebie. Konstrukcja zastosowanych MEA pozwala na wykonanie zmian chorobowych za pomocą ostrza skalpela przez to miejsce fuzji bez powodowania uszkodzeń MEA. Wycinki pokazują spontaniczną aktywność, zwykle zorganizowaną w wybuchy aktywności sieciowej, a parametry aktywności przestrzennej i czasowej, takie jak lokalizacja początków impulsów, prędkość i kierunek ich propagacji oraz opóźnienia między impulsami, mogą być scharakteryzowane. Korzystając z tych cech, możliwa jest również ocena funkcjonalnego połączenia warstw poprzez obliczenie ilości zsynchronizowanych serii między dwiema stronami. Ponadto wycinki mogą być analizowane morfologicznie, wykonując barwienia immunohistochemiczne po nagraniach. 
W tym modelu łączy się kilka zalet zastosowanych technik: wycinki w dużej mierze zachowują oryginalną architekturę tkanki z nienaruszonymi lokalnymi obwodami synaptycznymi, tkanka jest łatwo i wielokrotnie dostępna, a aktywność neuronalna może być wykrywana jednocześnie i nieinwazyjnie w dużej liczbie miejsc w wysokiej rozdzielczości czasowej. Cechy te pozwalają w wyrafinowany i skuteczny sposób badać funkcjonalną regenerację połączeń wewnątrzrdzeniowych w izolacji in vitro.

Aby zbadać potencjał do regeneracji funkcjonalnej kokultur pochodzących z rdzenia kręgowego embrionów szczura w stadium E14, wykonano uszkodzenia w przedziale czasowym od 8 do 28 DIV. Po 2 do 3 tygodniach zarejestrowano spontaniczną aktywność neuronalną za pomocą MEA (Rycina 1 C&amp;D). Potencjały czynnościowe rejestrowane z przestrzeni zewnątrzkomórkowej zidentyfikowano w analizie offline dla każdej pojedynczej elektrody (Rycina 1E). Na podstawie tych danych wygenerowano wykresy rasterowe (Rycina 1F), a następnie wykresy aktywności sieci, aby zwizualizować całkowitą aktywność oddzielnie dla każdej strony (Rycina 1G). W każdym przekroju aktywność spontaniczna jest zazwyczaj zorganizowana w postaci serii impulsów (burstów). Jeśli przekroje są połączone funkcjonalnie, serie te mogą propagować z jednego przekroju do drugiego. Dlatego obliczono liczbę zsynchronizowanych serii impulsów między dwoma przekrojami, aby ilościowo zmierzyć regenerację funkcjonalną. Szczegółowy opis sposobu przekształcania danych w poszczególne wykresy oraz sposób wyprowadzenia wzoru do obliczania procentu aktywności zsynchronizowanej znajduje się w pracy Heidemann et al. 10.
We wszystkich eksperymentach aktywność rejestrowano najpierw w warunkach standardowych. W drugim kroku hamowanie synaptyczne blokowano poprzez dodanie strychniny (1 µM) i gabazyny (10 µM) do pozakomórkowego roztworu kąpieli. Taka dysinhibicja prowadzi zazwyczaj do bardziej regularnego wzorca aktywności z wydłużonymi serie impulsów oraz odstępami między nimi, co ułatwia definiowanie serii, a tym samym określenie synchronizacji serii impulsów pomiędzy plastrami.
Kultury uszkodzone w młodym wieku (7 - 9 DIV) wykazywały wysoką ilość zsynchronizowanej aktywności 2-3 tygodnie po uszkodzeniu, podczas gdy kultury uszkodzone w późniejszych etapach (&gt;19 DIV) wykazywały wyraźny spadek zdolności do regeneracji (Rysunek 2 A - F). Wyniki te wskazują, że zdolność do regeneracji funkcjonalnych połączeń w kulturach warstwowych rdzenia kręgowego spada z poziomu wysokiego, reprezentującego stan embrionalny in vivo, do poziomu niskiego, reprezentującego bardziej rozwinięty stan in vivo, w ciągu trzech tygodni hodowli.
Jakie rodzaje połączeń są w rzeczywistości zaangażowane w synchronizację wybuchową między dwiema warstwami? Poza połączeniami propriospinalnymi, włókna mogą pochodzić również z motoneuronów lub neuronów zwojów korzeni tylnych. Wykazano wcześniej, że neurony zwojów korzeni tylnych nie są istotne dla łączności funkcjonalnej między warstwami rdzenia kręgowego 10. Jednak zaangażowanie motoneuronów pozostawało możliwością. Ponieważ wiadomo, że motoneurony tworzą połączenia cholinergiczne z neuronami rdzenia kręgowego poprzez receptory nikotynowe 13, aktywność kokultur rdzenia kręgowego zarejestrowano w 8 DIV, w czasie, gdy kultury wykazują wysoce zsynchronizowaną aktywność 10, i dodano do zewnątrzkomórkowego roztworu kąpielowego antagonistę nikotynowy mekamylaminę (MEC, 100 µM). Udział motoneuronów w połączeniu między dwiema warstwami skutkowałby zmniejszeniem odsetka zsynchronizowanej aktywności. Jednak tak nie było (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7; kontrola: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p &gt;0,05, test Wilcoxona dla par zależnych). Wyniki te sugerują, że synapsy cholinergiczne nie przyczyniają się do funkcjonalnego połączenia między warstwami. Jednak ponieważ wykazano również, że motoneurony uwalniają glutaminian w synapsach w obrębie OUN 11, 15, doświadczenia te nie wykluczają całkowicie ich udziału.
W celu identyfikacji motoneuronów wykonano barwienia immunohistochemiczne przeciwko nieufosforylowanemu neurofilamentowi H z użyciem przeciwciała SMI-32. Wykazały one obecność kilku oznakowanych dużych ciał komórkowych typowych dla motoneuronów, rozproszonych w obrębie skrawków (Rycyna 3A). Zgłaszano, że przeciwciało SMI-32 znakuje ciała komórkowe motoneuronów 12, co potwierdziło się również w zastosowanych kulturach 13. Ponadto barwienia ciał komórkowych neuronów w ogóle, np. przeciwko β-III-tubulinie lub NeuN, a także ciał komórkowych gleju, np. astrocytów przeciwciałem GFAP, są zgodne z innymi doniesieniami i odpowiadają opisom morfologicznym tych typów komórek (Rycina 3 B - D). Niemniej jednak, znakowanie aksonów przeciwciałem SMI-32 budzi wątpliwości (Rycina 3E). Wbrew oczekiwaniom, po zastosowaniu tego przeciwciała pojawia się rozbudowana sieć włókien, która wygląda podobnie do barwienia SMI-31 znakującego ufosforylowany neurofilament H (Rycina 3F). Jedna z interpretacji tego wyniku sugeruje, że regulacja rozwojowa fosforylacji/defosforylacji neurofilamentów w użytych kulturach nie jest tak ścisła jak w warunkach in vivo. Współwystępowanie neurofilamentów ufosforylowanych i nieufosforylowanych w tym samym aksonie mogłoby wyjaśnić ten wynik. Inną możliwością jest to, że aksony znakowane przez SMI-32 pochodzą z neuronów projekcyjnych. Tsang i współpracownicy 16 wykazali, że oprócz motoneuronów, SMI-32 barwi np. neurony kolumny Clarka oraz neuronów bocznej kolumny pośredniej. Wyraźna proliferacja neurytów takich neuronów mogłaby również wyjaśnić obfitość włókien pozytywnych pod kątem SMI-32.
<img alt="Badanie hodowli neuronalnych z użyciem macierzy mikroelektrod, schemat czasowy, wykresy danych; analiza aktywności mózgu." src="/files/ftp_upload/53121/53121fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Prezentacja i analiza aktywności spontanicznej. (A) Schemat MEA. Elektrody pokryte platyną przedstawiono na czarno, przezroczyste przewody na czerwono, a rowek w środku MEA na żółto. (B) Zbliżenie macierzy elektrod znajdującej się w centrum MEA. Schematy zostały udostępnione przez dr. M. Heuschkela. (C) Obraz w jasnym polu hodowli w 8 DIV. Przekroje urosły i zlały się wzdłuż sąsiadujących ze sobą boków. Żółty pasek reprezentuje wolną od elektrod i izolacji szczelinę MEA. Pasek skali = 400 µm (D) Harmonogram eksperymentów. Dwa przekroje rdzenia kręgowego embrionów szczura w stadium E14 umieszcza się obok siebie na MEA. W ciągu kilku dni przekroje rosną i zlewają się wzdłuż sąsiadujących boków. W przedziale czasowym od 8 do 28 DIV wykonuje się całkowite uszkodzenia w miejscu zrostu. Dwie do trzech tygodni później rejestruje się aktywność spontaniczną, a hodowle utrwala się do barwień immunohistochemicznych. (E) Ślady aktywności spontanicznej z każdej pojedynczej elektrody w hodowli w 23 DIV. Dla lepszej wizualizacji przedstawiono co drugi ślad. Pomarańczowe ślady obrazują aktywność zarejestrowaną z przekroju po prawej stronie, niebieskie z lewej strony. Większość serii impulsów (bursts) jest zsynchronizowana między obiema stronami. Strzałka wskazuje serię impulsów występującą w lewym przekroju, która jedynie częściowo rozprzestrzeniła się na przekrój prawy. Aktywność w prawym przekroju nie osiągnęła jednak wybranego progu wynoszącego co najmniej 25% uśrednionej maksymalnej aktywności szczytowej dla danej strony, w związku z czym nie została wykryta jako seria impulsów. Powiększenia po prawej stronie przedstawiają ostatnią zsynchronizowaną parę serii impulsów. (F) Wykres rastrowy aktywności pokazanej na (E). (G) Wykres aktywności sieci z zdefiniowanymi seriami impulsów (słupki poniżej linii bazowej) dla aktywności pokazanej na (E). Adaptacja z Heidemann et al. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat aktywności neuronalnej; czas uszkodzenia, wykres aktywności synchronicznej; wyniki badania neuronalnego in vitro." src="/files/ftp_upload/53121/53121fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2. Aktywność synchroniczna w porównaniu z niesynchroniczną. (A, B) Wykresy rastrowe kultur poddanych uszkodzeniu w młodym wieku (w 7 - 9 DIV), wykazujące aktywność synchroniczną w warunkach standardowych (A) oraz w warunkach odhamowania (B). (C, D) Wykresy rastrowe kultur poddanych uszkodzeniu w późnym wieku (w &gt;19 DIV), wykazujące aktywność niesynchroniczną w warunkach standardowych (C) oraz w warunkach odhamowania (D). (E, F) Średni procent aktywności synchronicznej wykreślony dla każdego pojedynczego dnia uszkodzenia, zarejestrowany w warunkach standardowych (E) oraz w warunkach odhamowania (F). Pomiary wykonano 2 - 3 tygodnie po dniu uszkodzenia. Adaptacja z Heidemann et al. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej markerów neuronalnych SMI-32, β-III, GFAP, NeuN; badanie struktury komórkowej." src="/files/ftp_upload/53121/53121fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Charakterystyka immunohistochemiczna. (A) Barwienie ciał komórek motoneuronów za pomocą SMI-32. (B) Markowanie ciał dojrzałych neuronów i ich wypustek za pomocą β-III tubuliny. (C) Identyfikacja astrocytów za pomocą GFAP. (D) Markowanie ciała dojrzałego neuronu za pomocą NeuN. (E) Barwienie niefosforylowanego neurofilamentu H za pomocą SMI-32. (F) Fosforylowany neurofilament H zidentyfikowany za pomocą SMI-31. Adaptacja z Heidemann et al. 10. Należy zauważyć, że zarówno w przypadku SMI-31, jak i SMI-32, w kulturach widoczna jest rozległa sieć włókien. Paski A-D = 20 µm, H&amp;F = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół, który opiera się na wycinkach rdzenia kręgowego hodowanych na układach wieloelektrodowych w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji połączeń propriordzeniowych in vitro.

Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest badanie funkcjonalnej regeneracji połączeń wewnątrzrdzeniowych w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego z wykorzystaniem macierzy wieloelektrodowych, tzw. MEA. Osiąga się to poprzez hodowlę dwóch poprzecznych skrawków rdzenia kręgowego obok siebie na MEA, aby naśladować połączenia wewnątrzrdzeniowe pomiędzy różnymi segmentami rdzenia kręgowego. In vitro skrawki rosną i w ciągu kilku dni in vitro zrastają się wzdłuż stykających się z sobą boków.W drugim kroku, po różnych odstępach czasu od rozpoczęcia hodowli, wykonuje się uszkodzenia, co prowadzi do całkowitego oddzielenia się plastrów. Następnie hodowle pozostawia się w inkubatorze na co najmniej dwa tygodnie.Aby zapewnić sieciom rdzeniowym czas na regenerację, impulsy aktywności między dwoma plastrami wykazują, że kultury uszkodzone w młodym wieku wykazują wysoki potencjał do regeneracji funkcjonalnej, podczas gdy zdolność ta jest wyraźnie ograniczona w kulturach uszkodzonych w późniejszym wieku. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak plastry hodowane na membranach, kultury dysocjowane lub w BSA, jest to, że połączenie kultur typowych dla Ergon z matrycami wieloelektrodowymi pozwala nam oceniać funkcjonalne aspekty regeneracji w mikrośrodowisku rdzenia kręgowego przy bezpośrednim dostępie eksperymentalnym. Aby rozpocząć, należy wykonać lub zakupić gotowe matryce wieloelektrodowe, takie jak ta pokazana tutaj; wysterylizuj matryce wieloelektrodowe, płucząc je przez 30 sekund dwukrotnie w 100% etanolu, raz w 70% etanolu, a następnie dwukrotnie w wodzie destylowanej. Po wyschnięciu umieść od 10 do 12 matryc w szklanej płytce Petriego i zamknij pokrywkę, a następnie poddaj matryce autoklawowaniu przez 20 minut w temperaturze 120 °C.Umieść każdą macierz wieloelektrodową w oddzielnej sterylnej szalce Petriego o średnicy 35 milimetrów. Wyjmij schłodzoną pipetę z zamrażarki. Użyj jej, aby nanieść 150 µL schłodzonego roztworu powlekającego z macierzy zewnątrzkomórkowej na elektrodę.Zamknąć pokrywkę szalki Petriego i inkubować macierz przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po około 10 minutach sprawdzić, czy na powierzchni elektrod znajdują się pęcherzyki powietrza, a następnie delikatnie usunąć je za pomocą szpatułki z gumową końcówką. W razie potrzeby upewnić się, że wszystkie pęcherzyki zniknęły.Następnie odessaj roztwór powlekający. Przemyj płytkę pożywką zoptymalizowaną dla neuronów prenatalnych i embrionalnych, a następnie dwukrotnie opłucz je sterylną wodą destylowaną. Po opłukaniu pozostaw je w temperaturze pokojowej do całkowitego wyschnięcia.Bezpośrednio po wyjęciu z matki należy przenieść zdekapitowane zarodki szczura w 14. dniu embrionalnym (E 14) do szalki Petriego wypełnionej sterylnym, schłodzonym roztworem płuczącym. Wykonać skalpelem jedno pełne cięcie poprzeczne powyżej kończyn tylnych oraz kolejne powyżej wszystkich czterech kończyn, a następnie oddzielić kończyny od tułowia. Następnie wykonać cięcie w płaszczyźnie czołowej, aby oddzielić organy wewnętrzne od części grzbietowej zawierającej rdzeń kręgowy.Następnie przenosimy poszczególne fragmenty grzbietowe zawierające rdzeń kręgowy pojedynczo na dysk montażowy. Za pomocą siekacza do tkanek wycinamy rdzeń na plastry o grubości od 225 do 250 mikronów. Następnie nakładamy kroplę roztworu płuczącego na posiekaną tkankę i przenosimy plastry do szalek Petriego o wymiarach 35 mm na 10 mm wypełnionych schłodzonym sterylnym roztworem płuczącym.Odseparuj rdzeń kręgowy od pozostałych tkanek na każdym z przekrojów. Należy uważać, aby zgrzbietowe zwoje korzeniowe pozostały przytwierdzone. Przenieś przekroje do szalki Petriego o wymiarach 35 mm na 10 mm wypełnionej sterylnym, schłodzonym roztworem płuczącym.Następnie pozostawić plastry na jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieścić szalkę Petriego z pokrytą macierzą mikroelektrod pod mikroskopem stereoskopowym. Ustawić ostrość i wycentrować macierz.Kropla 6 µL osocza kurczego na matrycy elektrod. Używając małej szpatułki, ostrożnie wsuń dwa przekroje rdzenia kręgowego do kropli osocza, tak aby ich powierzchnie brzuszne były skierowane ku sobie. Następnie dodaj 8 µL trombiny wokół kropli osocza kurczego.Następnie za pomocą końcówki pipety należy ostrożnie wymieszać i rozprowadzić mieszaninę z kurczaka, plazmy i trombiny. Tuż przed tym, jak mieszanina plazmy z kurczaka i trombiny stanie się zbyt ciągliwa i zacznie krzepnąć, należy odessać nadmiar cieczy, a następnie przykryć szalkę Petriego i umieścić ją w komorze nawilżającej. Komorę należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37°C na około godzinę. Po inkubacji do próbki należy ostrożnie dodać 10 µL pożywki.Przykryj szalkę Petriego i umieść ją z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 45 minut. Następnie umieść każdy z zestawów hodowli na matrycy wieloelektrodowej w probówce do rotora i dodaj trzy mililitry pożywki. Szczelnie zamknij pokrywkę i umieść probówkę w bębnie rotacyjnym.Obracać bęben z prędkością od jednej do dwóch obr./min w inkubatorze w temperaturze 37 °C, używając sterylnej pęsety z gumowymi końcówkami. Wyjąć zestawy hodowlane z wielood elektrodowej macierzy z rurki obrotowej i umieścić je w szalce Petriego pod stereomikroskopem. Ustawić ostrość na tkankę i zweryfikować, czy dwa skrawki zrosły się.Następnie należy stabilnie przytrzymać zespół i umieścić ostrze skalpela w rowku macierzy wieloelektrodowej, blisko plastrów tkanki. Trzymając skalpel raczej poziomo, należy unieść jego rękojeść do góry.Należy jednak pozostawić ostrze skalpela w rowku matrycy w taki sposób, aby ostrze przesuwało się od podstawy do czubka, przecinając tkankę i pokrywając rowek. W razie potrzeby należy przeciąć wszelkie pozostałe połączenia tkankowe końcem igły 25G; należy pracować wyłącznie w obrębie rowka i nie dotykać delikatnych krawędzi. Zestawy kultur na matrycach wieloelektrodowych należy umieścić z powrotem w probówce z rolkami i dodać trzy mililitry świeżej pożywki do kultur.Następnie umieść rurkę z wałkiem z powrotem na bębnie obrotowym w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Zamontuj zestaw kultury z wieloelektrodową macierzą w komorze rejestracyjnej i nanieś około 500 µL roztworu zewnątrzkomórkowego na macierz. Następnie zamontuj cały zestaw na mikroskopie.Odczekać 10 minut aż system się ustabilizuje, a następnie rejestrować podstawową aktywność spontaniczną z każdej z elektrod wykrywających aktywność przez 10 minut. Powtórzyć rejestracje łącznie dwa razy, aby zapewnić stabilne warunki zewnątrzkomórkowe. W razie potrzeby wymieniać roztwór zewnątrzkomórkowy po każdej sesji rejestracyjnej.Odblokuj sieć, aplikując roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający 1 µM striktuniny oraz 10 µM gazin, a następnie odczekaj co najmniej dwie minuty przed rejestracją aktywności elektrycznej, aby zbadać potencjał do funkcjonalnej regeneracji kokultur pochodzących z rdzenia kręgowego embrionów szczura w 14. dniu rozwoju (E 14). Uszkodzenia wykonano w oknie czasowym od 8 do 28 dni in vitro. Spontaniczną aktywność neuronów zarejestrowano dwie do trzech tygodni później.Z wykorzystaniem wieloelektrodowej macierzy pomiarowej surowe dane przekształcane są następnie w wykresy rastrowe, a po nich w wykresy aktywności sieciowej, aby zwizualizować całkowitą aktywność oddzielnie dla każdej strony w każdym przekroju. Aktywność spontaniczna jest zazwyczaj zorganizowana w serie impulsów (bursts); w przypadku przekrojów z odhamowaniem, które zostały rozdzielone w młodym wieku, serie te pojawiają się tutaj jako funkcjonalnie połączone. Jednak w przypadku osobników rozdzielonych w późniejszym wieku aktywność ta wydaje się asynchroniczna.Wykorzystując te informacje, można określić i zwizualizować liczbę zsynchronizowanych wyładowań między plastrami w różnym wieku, zgodnie z przedstawioną tutaj procedurą. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie typy komórek przyczyniają się do funkcjonalnego połączenia między dwoma plastrami rdzenia kręgowego, można zastosować inne metody, takie jak barwienie immunohistochemiczne.

investigating-functional-regeneration-organotypic-spinal-cord-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Prezentacja sposobu wykonania i zastosowania zewnątrzkomórkowej elektrody ssącej używanej do pomiarów elektrofizjologicznych w rdzonach kręgowych noworodków gryzoni in...

Elektrofizjologia rdzenia kręgowego II: Wytwarzanie przyssawkowych elektrod zewnątrzkomórkowych

Demonstrujemy sposób wycinania i hodowli eksplantów zwoju statoakustycznego w dniu E4 oraz rdzenia kręgowego w dniu E6 zarodka kurczaka. Eksplanty są hodowane w warunkach bezsurowiczych w trójwymiarowych żelach kolagenowych przez 24 godziny. Reaktywność neurytów jest badana przy użyciu pożywki uzupełnionej o czynniki wzrostu oraz koralików pokrytych białkiem.

Disekcja i hodowla eksplantów zrazustatoakustycznego i rdzenia kręgowego kurczaka w żelach kolagenowych do testów wzrostu neurytów

Ten film demonstruje proces izolowania eksplantatów spiralnych zwojów z ucha wewnętrznego i ich wspólnej hodowli z organem Cortiego na matrycy wieloelektrodowej. Spiralne zwoje są ostrożnie ekstrahowane i dzielone na mniejsze skrawki tkanek lub eksplantaty. Te eksplantaty są hodowane w obszarze aktywnym matrycy wieloelektrodowej, aby promować wzrost procesów neuronalnych.

Hodowla eksplantatów neuronów spiralnych myszy na matrycach wieloelektrodowych

Film demonstruje funkcjonalną regenerację połączeń propriordzeniowych za pomocą testu opartego na matrycy wieloelektrodowej (MEA). Wycinki rdzenia kręgowego umieszcza się na MEA i pozostawia się do połączenia. Połączone plastry są mechanicznie oddzielane poprzez tworzenie zmiany, indukując neurony propriordzeniowe do wzrostu nad zmianą i łączenia plasterków. Aktywność elektryczna warstw jest oceniana w celu identyfikacji regeneracji połączeń funkcjonalnych.

Badanie regeneracji funkcjonalnych połączeń między wycinkami rdzenia kręgowego przy użyciu układu wieloelektrodowego

Ten film demonstruje metodę izolowania neuronów z przodomózgowia zarodka pisklęcia we wczesnym stadium i hodowli ich na matrycy mikroelektrod w celu utworzenia sieci neuronalnej.

Izolowanie i hodowla neuronów embrionalnych piskląt na matrycy wieloelektrodowej

Ten film prezentuje nagrania elektrofizjologiczne z organotypowych kokultur wycinków rdzenia kręgowego, uchwycone za pomocą matrycy wieloelektrodowej lub urządzenia MEA. Nagrania te oceniają regenerację neuronów między warstwami. Zaobserwowana zsynchronizowana aktywność elektryczna potwierdza udaną regenerację neuronów.

Zapisy elektrofizjologiczne do oceny regeneracji neuronów w współhodowanych wycinkach rdzenia kręgowego

Ten film demonstruje procedurę użycia matrycy wieloelektrodowej (MEA) do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D. Metoda ta pozwala zrozumieć dynamikę sieci neuronowych i aktywność impulsów sieci synaptycznych w sferach 3D.

Wykorzystanie matryc wieloelektrodowych do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D

Przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych eksplantatów neuronów spiralnych myszy na matrycach wieloelektrodowych w celu zbadania profili odpowiedzi neuronalnej i optymalizacji parametrów stymulacji. Takie badania mają na celu poprawę interfejsu neuron-elektroda implantów ślimakowych z korzyścią dla słuchu pacjentów, a także zużycia energii przez urządzenie.

Hodowla eksplantatów neuronów zwojów spiralnych i elektrofizjologia na układach wieloelektrodowych

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

W tym artykule przedstawiamy powtarzalną metodę generowania i utrzymywania długoterminowych wycinków organotypowych rdzenia kręgowego przeszczepionych z nerwowymi komórkami macierzystymi jako model ex vivo do testowania komórkowych terapii zastępczych.

Długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj metodę badania regeneracji funkcjonalnej połączeń wewnątrzrdzeniowych w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych. Technika umożliwia ocenę potencjału regeneracyjnego w kontrolowanych warunkach in vitro.

Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

Przeglądaj więcej filmów