Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie funkcjonalnej regeneracji połączeń wewnątrzrdzeniowych w organotypowych hodowlach rdzenia kręgowego z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych, tzw. pomiarów. Osiąga się to poprzez wyhodowanie dwóch poprzecznych wycinków rdzenia kręgowego obok siebie na pomiarach, aby naśladować połączenia wewnątrzrdzeniowe między różnymi segmentami rdzenia kręgowego. In vitro plastry rosną i w ciągu kilku dni in vitro łączą się wzdłuż boków zwróconych do siebie.

Jako drugi krok. Zmiany chorobowe są wykonywane w różnych ramach czasowych w hodowli, co prowadzi do całkowitego oddzielenia plastrów. Następnie kultury pozostawia się w inkubatorze na co najmniej dwa tygodnie.

Aby dać sieciom rdzeniowym czas na regenerację, wybuch aktywności między dwoma warstwami pokazuje, że kultury uszkodzone w młodym wieku wykazują wysoki potencjał regeneracji funkcjonalnej, podczas gdy zdolność ta jest wyraźnie zmniejszona w kulturach uszkodzonych w późniejszym wieku. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak plastry, hodowle na błonach, kultury zdysocjowane lub w BSA, jest to, że połączenie typowych kultur Ergon z matrycami wieloelektrodowymi pozwala nam ocenić funkcjonalne aspekty regeneracji w mikrośrodowisku rdzenia kręgowego z bezpośrednim dostępem eksperymentalnym Aby rozpocząć produkcję lub zakup gotowych matryc wieloelektrodowych, takich jak ta pokazana tutaj, Wysterylizuj układy wieloelektrodowe, płucząc je przez 30 sekund, dwa razy w 100% etanolu, raz w 70% etanolu, a następnie dwukrotnie w wodzie destylowanej. Po wyschnięciu umieść od 10 do 12 tablic na szklanej szalce Petriego i zamknij pokrywę po autoklawie matryc przez 20 minut w temperaturze 120 stopni Celsjusza.

Umieść każdy układ wieloelektrodowy na osobnej sterylnej szalce Petriego o średnicy 35 milimetrów. Wyjmij schłodzoną pipetę z zamrażarki. Użyj go, aby umieścić 150 mikrolitrów schłodzonego roztworu powlekającego macierz zewnątrzkomórkową na elektrodzie.

Zamknąć pokrywę płytki Petriego i inkubować układ przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po około 10 minutach sprawdź, czy na elektrodach nie ma pęcherzyków powietrza i delikatnie usuń je gumową szpatułką. W razie potrzeby sprawdź, czy wszystkie pęcherzyki zniknęły.

Następnie odessać roztwór powlekający. Umyj gumkę pożywką, zoptymalizowaną dla neuronów prenatalnych i embrionalnych, a następnie spłucz je dwukrotnie destylowaną sterylną wodą. Po spłukaniu pozostaw je w temperaturze pokojowej do wyschnięcia.

Bezpośrednio po ekstrakcji od matki przenieść pozbawione głowy zarodki szczura E 14 na szalkę Petriego wypełnioną sterylnym, schłodzonym roztworem do mycia. Wykonaj jedno pełne cięcie poprzeczne skalpelem nad tylnymi kończynami, a drugie nad czterema kończynami i usuń kończyny z ciała. Następnie wykonaj nacięcie w płaszczyźnie czołowej, aby oddzielić wnętrzności od tylnej części zawierającej rdzeń kręgowy.

Następnie przenieś tylne części zawierające rdzeń kręgowy, pojedynczo na dysk montażowy. Przetnij sznur o grubości od 225 do 250 mikronów za pomocą rozdrabniacza do tkanek. Następnie nałóż kroplę roztworu myjącego na posiekaną tkankę i przenieś plastry na szalki Petriego o wymiarach 35 milimetrów na 10 milimetrów wypełnione sterylnym schłodzonym roztworem do mycia.

Wypreparuj rdzeń kręgowy z dala od pozostałej tkanki na każdym z plasterków. Uważając, aby pozostawić przyczepione zwoje korzenia grzbietowego. Przenieś plastry na szalkę Petriego o wymiarach 35 milimetrów na 10 milimetrów wypełnioną sterylnym schłodzonym roztworem do mycia.

Następnie odstaw plastry na godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść szalkę Petriego z pokrytym układem mikroelektrod w środku pod mikroskopem stereoskopowym. Ustaw tablicę w pozycji wyostrzonej i wyśrodkowanej.

Sześciolitrowa kropla osocza kurzego na matrycy elektrod. Za pomocą małej szpatułki ostrożnie wsuń dwa odcinki rdzenia kręgowego o rozmiarze brzusznym skierowane do siebie do kropli osocza. Następnie w ośmiu mikrolitrach trombiny wokół kropli osocza kurczaka.

Następnie za pomocą końcówki pipety ostrożnie wymieszaj i rozprowadź mieszaninę kurczaka, osocza i trombiny. Tuż przed tym, jak mieszanina osocza i trombiny kurczaka stanie się zbyt żylasta i zacznie krzepnąć, odessaj nadmiar płynu, a następnie zakryj szalkę Petriego i umieść ją w wilgotnej komorze. Umieść komorę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na około godzinę Po inkubacji ostrożnie dodaj do próbki 10 mikrolitrów pożywki.

Zakryj szalkę Petriego i umieść ją z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 45 minut. Następnie umieść każdy z zestawów kultur wieloelektrodowych w rurze rolkowej i dodaj trzy mililitry pożywki. Zamknij szczelnie pokrywę i umieść rurkę rolkową w bębnie rolkowym.

Obróć bęben o wartości od jednej do dwóch RRP M w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą sterylnych kleszczyków z gumową końcówką. Wyjmij zespoły hodowli wieloelektrodowych z rurki rolkowej i umieść je na szalce Petriego pod mikroskopem stereoskopowym. Ustaw ostrość tkanki i sprawdź, czy dwie plastry są połączone.

Następnie przytrzymaj zespół stabilnie i umieść ostrze skalpela w rowku układu wieloelektrodowego. Blisko plasterków tkanki. Trzymaj skalpel raczej poziomo, a następnie podnieś uchwyt skalpela do góry.

Niech jednak ostrze skalpela pozostanie w rowku matrycy w taki sposób, aby ostrze toczyło się od podstawy do czubka, przecinając tkankę, zakrywając rowek. W razie potrzeby odciąć wszelkie pozostałe połączenia tkankowe końcówką igły o rozmiarze 25, pracować tylko w obszarze w rowku i nie dotykać delikatnych krawędzi. Umieść zespoły hodowli wieloelektrodowych z powrotem w rurze rolkowej i dodaj trzy mililitry świeżej pożywki do kultur.

Następnie umieść rurkę rolkową z powrotem na bębnie rolkowym w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zamontuj zespół kultur z matrycą wieloelektrodową w komorze rejestracyjnej i nałóż około 500 mikrolitrów roztworu zewnątrzkomórkowego na matrycę. Następnie zamontuj zespół na mikroskopie.

Odczekaj 10 minut, aż system się ustabilizuje, a następnie rejestruj podstawową spontaniczną aktywność z każdej z elektrod wykrywających aktywność przez 10 minut. Powtórz nagrania w sumie dwa razy, aby zapewnić stabilne warunki zewnątrzkomórkowe. W razie potrzeby wymieniaj roztwór zewnątrzkomórkowy po każdej sesji nagraniowej.

Odhamować sieć, stosując roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający jeden mikromol o ścisłej 9 i 10 mikromolach gazyny i odczekać co najmniej dwie minuty przed zarejestrowaniem aktywności elektrycznej w celu zbadania potencjału funkcjonalnego odzyskiwania kultur CO pochodzących z rdzenia kręgowego zarodków szczurów E 14. Zmiany chorobowe wykonywano w oknie czasowym od ośmiu do 28 dni in vitro. Dwa do trzech tygodni później zarejestrowano spontaniczną aktywność neuronalną.

Korzystając z układu wieloelektrodowego, surowe dane są następnie przekształcane w wykresy rastrowe, a następnie wykresy aktywności sieciowej w celu wizualizacji całkowitej aktywności oddzielnie dla każdej strony w każdym wycinku. Spontaniczna aktywność jest zwykle zorganizowana w zrywach pokazanych tutaj pod warstwami odhamowania, które zostały oddzielone w młodym wieku, pojawiają się tutaj jako funkcjonalnie połączone. Jednak osoby rozdzielone w starszym wieku wydają się asynchroniczne.

Korzystając z tych informacji, można określić i zwizualizować liczbę zsynchronizowanych serii między wycinkami w różnym wieku, jak pokazano poniżej Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak barwienie immunohistochemiczne, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie typy komórek przyczyniają się do funkcjonalnego połączenia między dwoma wycinkami kwarty rdzenia.