Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

Ogólnym celem tej procedury jest określenie działania przeciwwirusowego badanych związków przeciwko określonym etapom wczesnego wnikania wirusa. Osiąga się to poprzez pierwsze wysiew komórek gospodarza dla infekcji wirusowej. Drugim krokiem jest przeprowadzenie infekcji wirusowej i leczenia związkiem testowym w różnych porach i temperaturach.

Następnie inokulum potraktowane lekiem jest wypłukiwane, a komórki są pokrywane podłożem podstawowym. Ostatnim krokiem jest inkubacja komórek. Ostatecznie zakaźność wirusa jest analizowana w celu określenia wpływu badanych związków na wczesne etapy wnikania wirusa w infekcję wirusową.

Na przykład luminometr służy do oceny aktywności lucyferazy w komórce pobranej w wyniku infekcji wirusem reporterowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona pozwolić na bardziej oparte na mechanizmach podejście do identyfikacji środków przeciwwirusowych, szczególnie tych ukierunkowanych na wnikanie wirusa. Aby rozpocząć, najpierw należy przygotować roztwory podstawowe badanych związków, kwasu trylogii lub i kolagenu PUNIC lub PUG w DMSO, rozpuścić heparynę do kontroli pozytywnej w sterylnej wodzie podwójnie destylowanej w celu przygotowania komórek gospodarza do hodowli testowej.

Ludzki rak wątroby, komórki HUH 7,5 przez noc w świeżym DMAM uzupełnionym FBS i antybiotykami. Należy pamiętać o przestrzeganiu procedur drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego przez cały czas trwania eksperymentu w celu zbadania cytotoksyczności badanych związków. Potraktuj komórki rosnącym stężeniem lub PUG od zera do 500 mikromolów rozcieńczonym w pożywce podstawowej lub 1% DMSO jako kontrola ujemna, a następnie inkubuj komórki przez 72 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Usuń pożywkę i dwukrotnie umyj komórki 200 mikrolitrami PBS. Następnie dodaj 100 mikrolitrów odczynnika do oznaczania XT T i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie za pomocą czytnika mikropłytek określ absorbancję przy 492 nanometrach przy referencyjnej długości fali przy 690 nanometrach.

Na podstawie tych wartości oblicz procent żywotności przy danym wzorze. Określ 50% stężenia cytotoksyczności komórkowej dla każdego związku. Aby rozpocząć test inaktywacji wirusa.

Pierwsza płytka, raz po 10 do czwartej komórki na studzienkę. W 96-dołkowej płytce inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez noc w celu przyłączenia do infekcji. Przygotuj reportera lucyferazy Gaia oznaczonego wirusem zapalenia wątroby typu C lub cząstkami HCV, jak wspomniano w protokole tekstowym.

W sterylnej probówce wymieszaj 100 mikrolitrów 100 mikromolowych lub PUG ze 100 mikrolitrami 10 do czwartego. Jednostki formujące ostrość lub FFU HCV dla pozytywnej mieszaniny kontrolnej. HCV z heparyną w końcowym stężeniu 1000 mikrogramów na mililitr.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po trzech godzinach rozcieńczyć mieszaninę związków wirusa 50-krotnie 9,8 mililitra podłoża podstawowego w temperaturze pokojowej. Następnie należy przygotować nową mieszaninę związków wirusowych i natychmiast rozcieńczyć tę mieszaninę w pożywce podstawowej do próbki inkubacji w godzinie zero.

Po usunięciu pożywki inkubacyjnej z komórek, dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu leku wirusowego do dołka w trzech egzemplarzach. Roztwór zawiera teraz od 10 do drugiego FFU na studzienkę, inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny, aby umożliwić infekcję wirusową komórek. Po inkubacji usuń zawiesinę wirusa ze studzienek i delikatnie umyj komórki 200 mikrolitrami PBS. Dwukrotnie.

Inkubować komórki w 100 mikrolitrach podłoża podstawowego przez 72 godziny w celu replikacji wirusa i uwolnienia reportera lucyferazy do supernatantu. Następnie zebrać supernat z kultur i mikroprobówek i odwirować w temperaturze 17 000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby usunąć resztki komórkowe, wymieszaj 20 mikrolitrów każdego supernatu z 50 mikrolitrami odczynnika do oznaczania lucyferazy Gaussiego i zmierz luminescencję od aktywności reporterowej lucyferazy w luminometrze.

Zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi płytki do oznaczania przyczepiania wirusa, jedna razy od 10 do czwartej komórki na studzienkę. Na 96-dołkowej płytce i inkubować przez noc w celu przyłączenia komórek następnego ranka. Najpierw schłodzenie, 96-dołkowa płytka zawierająca monowarstwę komórek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Przygotować badane związki i mieszaninę wirusów na lodzie. Na przykład H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1% DMSO lub roztwory heparyny HCV z kontrolą pozytywną z 10 do drugiego wirusa FFU. Do każdego zabiegu należy delikatnie odessać pożywkę z dołków hodowli komórkowej.

Następnie natychmiast dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny związków testowych wirusa do trzech dołków, uważając, aby nie podnieść temperatury. Inkubuj płytkę w lodówce utrzymywanej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny. Cząsteczki wirusa przyczepiają się do sieci komórkowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ale nie zostaną zinternalizowane.

Następnie odessać supernatanty. Delikatnie umyj komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami lodowatego lodu. PBS dodaj 100 mikrolitrów podłoża podstawowego do każdej studzienki, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 72 godziny.

Wreszcie, do ilościowego oznaczania uwalniania reportera lucyferazy z zainfekowanych komórek. Zbierz supernat z każdej próbki i wykonaj test lucyferazy Gaussa w celu sprawdzenia fuzji i wniknięcia wirusa. Wstępnie schłodzić płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę.

Po całonocnej inkubacji w celu przyłączenia komórek, usunąć istniejącą pożywkę z dołków i zainfekować komórki 10 do drugiego F-F-U-H-C-V na lodzie. Inkubuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny. Delikatnie umyj komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami lodowatego PBS, aby usunąć wirusa, który nie przylega do reklamy.

Następnie na lodzie potraktować komórki związkami testowymi rozpuszczonymi w pożywce podstawowej lub pożywce podstawowej z 1% DMSO jako kontroli i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Pozwala to na ocenę badanych związków przy wnikaniu wirusa, które następuje w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć niezinternalizowane wirusy 200 mikrolitrami buforu cytrynianowego lub PBS.

Dodaj 100 mikrolitrów podłoża podstawowego na studzienkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 72 godziny. Zbierz supernat i wykonaj test lucyferazy Gaussa, jak pokazano wcześniej, w celu wykrycia zwolnionego reportera lucyferazy pokazano Oto wpływ badanych związków na HCV. Podczas aktywacji wirus był inkubowany ze związkami testowymi przez zero lub trzy godziny przed zakażeniem.

Procent zahamowania infekcji wirusowej jest wykreślany dla każdego leczenia. Negatywnie kontrolowane DMSO nie wykazuje hamowania. wykazuje wysoką inhibicję po kontakcie, po inkubacji w godzinie zero, a także po dłuższej inkubacji przez trzy godziny.

Dodatkowe wyniki z innym testem. Pokazano tutaj złożone PUG, dostosowując ten ogólny projekt eksperymentalny, wykazano, że i PUG dodatkowo hamują zakaźność ludzkiego wirusa cytomegalii lub HCMV w zarodkowych fibroblastach płuc. Wpływ i PUG na przyczep HCV pokazano tutaj.

Przypomnijmy, że komórki inkubowano z wirusem w obecności lub bez związków testowych w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie usuwając niezwiązane komórki wirusa, inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu zakażenia wirusem. Zacienione paski pokazują wpływ C-H-L-A-P-U-G lub heparyny na wnikanie HCV do komórek. Należy zauważyć, że w tym przypadku przyczepienie wirusa zostało najpierw przeprowadzone w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie, po usunięciu niezwiązanego wirusa, komórki inkubowano ze związkami testowymi w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu wniknięcia wirusa. Podobnie w przypadku HCMV zakażenie embrionalnych fibroblastów płuc leczenie lub PUG wykazuje silne hamowanie przyłączania się wirusa i wnikania wirusa. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o wykonywaniu czynności we wskazanej temperaturze, co wpłynie na dokładność wyników.