Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

Ogólnym celem tej procedury jest określenie działania przeciwwirusniczego badanych związków w odniesieniu do konkretnych etapów wczesnej wnikania wirusa. Jest to realizowane poprzez uprzednie wysianie komórek gospodarza w celu infekcji wirusowej. Drugim krokiem jest przeprowadzenie infekcji wirusowej oraz traktowanie badanymi związkami w różnych punktach czasowych i temperaturach.

Następnie zmywa się inokulum poddane działaniu leku, a komórki pokrywa się podłożem podstawowym. Ostatnim krokiem jest inkubacja komórek. W końcowej fazie analizuje się zakaźność wirusa, aby określić wpływ testowanych związków na wczesne etapy wnikania wirusa podczas infekcji.

Na przykład luminometru używa się do oceny aktywności lucyferazy w komórkach po zakażeniu wirusem reporterowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona zastosowanie podejścia bardziej opartego na mechanizmie w identyfikacji czynników przeciwwirusowych, szczególnie tych celujących w wniknięcie wirusa. Aby rozpocząć, należy najpierw przygotować roztwory zapasowe badanych związków, kwasu trilogy lub CHLA oraz kolagenu PUNIC lub PUG w DMSO; heparynę jako kontrolę pozytywną rozpuścić w sterylnej wodzie dwukrotnie destylowanej, a następnie przygotować hodowlę komórek gospodarza do analizy.

Komórki ludzkiego raka wątroby HUH 7.5 inkubowano przez noc w świeżej pożywce DMAM uzupełnionej o FBS i antybiotyki. Pamiętaj o przestrzeganiu procedur poziomu bezpieczeństwa biologicznego dwa (BSL-2) przez cały czas trwania eksperymentu w celu przetestowania cytotoksyczności badanych związków. Komórki potraktowano zwiększającymi się stężeniami CHLA lub PUG, od 0 do 500 µM rozpuszczonych w pożywce podstawowej, lub 1% DMSO jako kontrolą negatywną, a następnie inkubowano komórki przez 72 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Usunąć medium i dwukrotnie przemyć komórki 200 µL PBS. Następnie dodać 100 µL odczynnika do testu XT T i inkubować w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. Potem, za pomocą czytnika mikropłytek, wyznaczyć absorbancję przy 492 nm z długością fali referencyjnej 690 nm.

Oblicz procent żywotności za pomocą podanego wzoru na podstawie tych wartości. Wyznacz stężenia cytotoksyczności komórkowej 50% dla każdego związku. Aby rozpocząć test inaktywacji wirusowej.

Pierwsza płytka, 1 × 10⁴ komórek na dołek. W płytce 96-dołkowej inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez noc, aby umożliwić ich przytwierdzenie przed infekcją. Przygotować cząsteczki wirusa zapalenia wątroby C (HCV) z reporterem Gaia luciferase, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

W sterylnej probówce wymieszaj 100 µL 100 µM CHLA lub PUG z 100 µL 10⁴ jednostek tworzących ogniska (FFU) HCV, aby przygotować mieszaninę kontrolną pozytywną. HCV z heparyną o końcowym stężeniu 1000 µg/mL.

Inkubować w temperaturze 37°C przez trzy godziny. Po trzech godzinach rozcieńczyć mieszaninę związku wirusowego 50-krotnie, dodając 9,8 ml pożywki podstawowej w temperaturze pokojowej. Następnie przygotować nową mieszaninę związku wirusowego i niezwłocznie rozcieńczyć ją w pożywce podstawowej dla próbki z inkubacji w czasie zero.

Po usunięciu pożywki inkubacyjnej z komórek, do każdego otworu należy dodać 100 µL rozcieńczonego roztworu leku przeciwwirusowego w trzech powtórzeniach. Roztwór zawiera obecnie 10² FFU na otwór; inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez trzy godziny, aby umożliwić infekcję wirusową komórek. Po inkubacji usunąć zawiesinę wirusową z otworów i delikatnie przemyć komórki 200 µL PBS-u dwukrotnie.

Inkubować komórki w 100 µL pożywki podstawowej przez 72 godziny w celu replikacji wirusa i uwolnienia lucyferazy reporterowej do supernatantu. Następnie zebrać supernatnat z kultur i mikroprobówek i odwirować przy 17 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Aby usunąć szczątki komórkowe, zmieszać 20 µL każdego supernatantu z 50 µL odczynnika do testu lucyferazy Gaussi i zmierzyć luminescencję wynikającą z aktywności lucyferazy reporterowej w luminometrze.

Zgodnie z instrukcjami producenta dla płytki do testu przyczepiania wirusów, należy wysiać 1×10⁴ komórek na dołek w płytce 96-dołkowej i inkubować przez noc w celu przyczepienia się komórek. Następnego ranka należy schłodzić płytkę 96-dołkową zawierającą monowarstwę komórek w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę.

Przygotować związki testowe i mieszaninę wirusa na lodzie. Na przykład roztwory H-C-V-C-H-L-A-H-C-V w 1% DMSO lub roztwory kontroli pozytywnej HCV Heparin z wirusem w stężeniu 10² FFU. W przypadku każdego wariantu traktowania należy ostrożnie odessać medium z dołków z kulturą komórkową.

Następnie niezwłocznie dodaj 100 µL mieszaniny związku testowego z wirusem do trzech powtórznych studni, uważając, aby nie podnieść temperatury. Inkubuj płytkę w lodówce utrzymywanej w temperaturze 4 °C przez trzy godziny. Cząsteczki wirusa przyłączą się do powierzchni komórek w temperaturze 4 °C, ale nie zostaną wchłonięte do wnętrza komórek.

Następnie odessać supernatanty. Komórki delikatnie przemyć dwukrotnie 200 µL lodowatego PBS. Do każdej studzienki dodać 100 µL pożywki podstawowej, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.

Na koniec, w celu ilościowego oznaczenia uwalnianego reportera lucyferazy z zainfekowanych komórek, należy zebrać nadsącz z każdej studni z próbką i przeprowadzić test Gaussian Luciferase w celu oceny fuzji i wniknięcia wirusa. Płytkę do hodowli komórek należy schłodzić do temperatury 4 °C przez jedną godzinę.

Po inkubacji przez noc w celu przyczepienia komórek, usunąć obecną pożywkę z dołków i zainfekować komórki dawką 10² FFU HCV w temperaturze 0°C. Inkubować płytkę w temperaturze 4°C przez trzy godziny. Delikatnie przemyć komórki dwukrotnie 200 µL lodowatego PBS, aby usunąć wirusy, które nie przyczepiły się do komórek.

Następnie, w warunkach chłodzenia na lodzie, potraktuj komórki związkami testowymi rozpuszczonymi w medium podstawowym lub medium podstawowym z 1% DMSO jako kontrolą, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez trzy godziny. Pozwala to na ocenę wpływu związków testowych na wniknięcie wirusa, które zachodzi w temperaturze 37°C. Odessaj medium i dwukrotnie przemyj niezinternalizowane wirusy 200 µL buforu cytrynianowego lub PBS.

Dodaj 100 µL pożywki podstawowej do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 °C przez kolejne 72 godziny. Zbierz supernat i przeprowadź analizę lucyferazy metodą Gaussa, zgodnie z wcześniejszą instrukcją, w celu wykrycia uwolnionego reportera lucyferazy. Przedstawiono tutaj wpływ badanych związków na HCV. W procesie aktywacji wirusa inkubowano ze związkami testowymi przez zero lub trzy godziny przed zakażeniem.

Wykres przedstawia procent hamowania infekcji wirusowej dla każdego z zastosowanych działań. Negatywna kontrola DMSO nie wykazuje hamowania. CHLA wykazuje wysokie hamowanie przy kontakcie, po inkubacji przez zero godzin, a także po dłuższej inkubacji trwającej trzy godziny.

Dodatkowe wyniki z innego testu. W przypadku związku PUG, przy zastosowaniu tego ogólnego schematu doświadczalnego, wykazano, że CHLA i PUG dodatkowo hamują zakaźność ludzkiego cytomegalowirusa (HCMV) w embrionalnych fibroblastach płucnych. Przedstawiono tutaj wpływ CHLA i PUG na przywieranie HCV.

Należy pamiętać, że komórki inkubowano z wirusem w obecności lub absence badanych związków w temperaturze 4°C, a następnie, po usunięciu niezwiązanego wirusa, inkubowano je w temperaturze 37°C w celu zainfekowania przez wirusa. Zacieniowane słupki przedstawiają wpływ C-H-L-A-P-U-G lub heparyny na wniknięcie HCV do komórek. Należy zauważyć, że w tym przypadku adhezja wirusa była najpierw przeprowadzana w temperaturze 4°C.

Następnie, po usunięciu niewiązanego wirusa, komórki inkubowano z badanymi związkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu umożliwienia wejścia wirusa do komórek. Podobnie w przypadku HCMV, w zarodkowych fibroblastach płuc zakażonych wirusem, zastosowanie CHLA lub PUG wykazuje silne hamowanie przyłączania i wnikania wirusa. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o realizacji poszczególnych kroków w wskazanej temperaturze, co będzie miało wpływ na dokładność wyników.