Name: Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj metodę oceny związków przeciwwirusowych poprzez testy wczesnego wnikania wirusa z użyciem komórek HUH 7.5 i analizy lucyferazy. Protokół umożliwia identyfikację inhibitorów wnikania wirusów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane przez fundusze ze Szpitala Uniwersytetu Medycznego w Tajpej (102TMU-TMUH-19) oraz Ministerstwa Nauki i Technologii Tajwanu (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

Uwaga: Upewnij się, że wszystkie procedury związane z hodowlą komórkową i infekcją wirusową są przeprowadzane w certyfikowanych kapturach bezpieczeństwa biologicznego, które są odpowiednie dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego przetwarzanych próbek. Do celów opisu protokołów, jako wirus modelowy stosuje się HCV znakowany reporterem lucyferazy Gaussia32. W kontekście reprezentatywnych wyników, związki kwasu chebulagowego () i punikalagininy (PUG) są stosowane jako potencjalne leki przeciwwirusowe, które są ukierunkowane na interakcje glikoprotein wirusa z glikozaminoglikanami na powierzchni komórki na wczesnych etapach wnikania wirusa31. Heparyna, o której wiadomo, że przeszkadza w wnikaniu wielu wirusów30,31,33,34, jest stosowana w takim kontekście jako leczenie kontrolą pozytywną. Aby uzyskać podstawowe informacje na temat technik wirusologicznych, namnażania się wirusów, oznaczania miana wirusa i ekspresji dawki zakaźnej w jednostkach tworzących płytkę nazębną (PFU), jednostkach tworzących ognisko (FFU) lub wielokrotności infekcji (MOI), czytelnik jest odsyłany do pozycji35. W celu zapoznania się z wcześniejszymi przykładami i zoptymalizowanymi warunkami stosowanymi dla wirusów pokazanych w reprezentatywnych wynikach, czytelnik jest odsyłany do pozycji bibliograficznych30-32,36-39, a także do szczegółów wymienionych w Tabeli 1, Rysunku 1A i Rysunku 2A.
1. Hodowla komórkowa, preparat złożony i cytotoksyczność związków
<ol>
	<li>Wyhoduj odpowiednią linię komórkową dla systemu infekcji wirusem, który ma być analizowany (Tabela 1). W przypadku HCV hoduj komórki Huh-7,5 w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 200 U/ml penicyliny G, 200 μg/ml streptomycyny i 0,5 μg/ml amfoterycyny B.</li>
	<li>Przygotować badane związki i kontrole, używając ich odpowiednich rozpuszczalników: na przykład rozpuścić i PUG w dimetylosulfotlenku (DMSO); przygotować heparynę w sterylnej, podwójnie destylowanej wodzie. Do wszystkich kolejnych rozcieńczeń należy użyć pożywek hodowlanych. 
	Uwaga: Końcowe stężenie DMSO w działaniu badanego związku jest mniejsze niż 1% w doświadczeniach; 1% DMSO jest uwzględniony jako leczenie kontrolą ujemną w testach dla porównania.</li>
	<li>Oznaczyć cytotoksyczność badanych związków (np. i PUG) na komórkach w przypadku zakażenia wirusowego przy użyciu odczynnika określającego żywotność komórek, takiego jak XTT (2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-5-fenylo)-karbonylo]-2H-wodorotlenek tetrazolu):
	<ol>
		<li>W przypadku HCV wysiewać komórki Huh-7,5 na 96-dołkowej płytce (1 ×10 4 komórki na studzienkę) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze O/N o stężeniu 5% CO2 w celu uzyskania monowarstwy.</li>
		<li>Zastosować kontrolę DMSO (1%) lub zwiększające stężenia badanych związków i PUG (np. 0, 10, 50, 100 i 500 μM) do dołków hodowlanych w trzech egzemplarzach.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 72 godziny, następnie wyrzucić pożywkę z płytki i dwukrotnie przemyć komórki 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
		<li>Dodać 100 μl roztworu do oznaczania z zestawu do testów toksykologicznych in vitro na bazie XTT do każdego dołka i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez kolejne 3 godziny, aby umożliwić produkcję formazanu XTT.</li>
		<li>Oznaczyć absorbancję za pomocą czytnika mikropłytek przy badanej długości fali 492 nm i referencyjnej długości fali 690 nm.</li>
		<li>Obliczyć odsetek komórek, które przeżyły, stosując następujący wzór: żywotność komórek (%) = At / As × 100%, gdzie "At" i "As" odnoszą się odpowiednio do absorbancji badanych związków i kontroli rozpuszczalnika (np. 1% DMSO). Określić stężenie 50% cytotoksyczności komórkowej (CC50) badanych związków za pomocą oprogramowania analitycznego, takiego jak GraphPad Prism, zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Odczyt infekcji wirusowej
Uwaga: Odczyt infekcji wirusowej zależy od używanego systemu wirusowego i może obejmować takie metody jak testy płytki nazębnej lub pomiar sygnałów reporterowych od wirusów oznaczonych jako reporter. Metoda wykrywania zakażenia reporter-HCV na podstawie aktywności reporterowej lucyferazy została opisana poniżej.
<ol>
	<li>Zebrać supernatanty z zainfekowanych studzienek i sklarować w temperaturze 17 000 x g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zmieszać 20 μl testowego supernatantu z 50 μl substratu lucyferazy z zestawu do oznaczania lucyferazy Gaussia i bezpośrednio zmierzyć za pomocą luminometru zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wyraź zakaźność HCV jako log10 względnych jednostek światła (RLU) w celu określenia zahamowania wirusa (%) i oblicz 50% skuteczne stężenie (EC50) badanych związków przeciwko zakażeniu HCV za pomocą algorytmów z oprogramowania GraphPad Prism zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
3. Test inaktywacji wirusów
Uwaga: Przykłady okresu inkubacji i dawki wirusa dla różnych wirusów są wymienione na rysunku 1A. Wyższe stężenia wirusa można również badać poprzez zwiększenie MOI/PFU.
<ol>
	<li>Wysiewać komórki Huh-7,5 na 96-dołkowej płytce (1 ×10 4 komórki na studzienkę) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 O/N w celu uzyskania monowarstwy.</li>
	<li>Inkubować badane związki lub próby kontrolne (końcowe stężenia to: = 50 μM; PUG = 50 μM; heparyna = 1 000 μg/ml; DMSO = 1%) z cząstkami HCV w temperaturze 37 °C (rysunek 1A, "Długoterminowe") w stosunku 1:1. Na przykład do inokulum wirusa o objętości 100 μl zawierającego 1 x 104 FFU dodać 100 μl rozcieńczenia roboczego o stężeniu 100 μM; w ten sposób uzyskuje się obróbkę w końcowym stężeniu 50 μM.</li>
	<li>Rozcieńczyć mieszaninę wirus-lek do "subterapeutycznego" (nieskutecznego) stężenia badanych związków. Na przykład nieskuteczne stężenie i PUG przeciwko HCV wynosi 1 μM31; w związku z tym wymaga to 50-krotnego rozcieńczenia mieszaniny wirus-lek, co można osiągnąć za pomocą 9,8 ml pożywki podstawowej (pożywka do hodowli komórek z 2% FBS). 
	Uwaga: Rozcieńczenie do stężenia subterapeutycznego zapobiega znaczącej interakcji między badanymi związkami a powierzchnią komórki gospodarza i umożliwia zbadanie wpływu leczenia na wiriony bezkomórkowe. Należy zauważyć, że rozcieńczenie to zależy od odpowiedzi badanych związków na dawkę przeciwwirusową przeciwko danej infekcji wirusowej i jest określane przed wykonaniem tego konkretnego testu31.</li>
	<li>Dla porównania, wirusa należy zmieszać z badanymi związkami i natychmiast rozcieńczyć (bez okresu inkubacji) do stężenia subterapeutycznego przed zakażeniem (ryc. 1A, "Krótkoterminowe").</li>
	<li>Dodać 100 μl rozcieńczonej mieszaniny HCV z lekiem na monowarstwę komórek Huh-7,5 (ilość wirusa wynosi teraz 1 x 102 FFU; końcowy MOI = 0,01) i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, aby umożliwić adsorpcję wirusa.</li>
	<li>Po zakażeniu należy usunąć rozcieńczoną inokulankę i delikatnie umyć studzienki dwukrotnie 200 μl PBS. 
	Uwaga: Pranie wykonuj delikatnie, aby uniknąć podnoszenia komórek.</li>
	<li>Nałożyć 100 μl podłoża podstawowego do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.</li>
	<li>Przeanalizuj wynikową infekcję, oznaczając supernatant pod kątem aktywności lucyferazy, jak opisano w "2. Odczyt infekcji wirusowej".</li>
</ol>
4. Test przyczepiania wirusów
Uwaga: Przykłady okresu inkubacji i dawki wirusa dla różnych wirusów są wymienione na rysunku 2A, 'Załącznik'. Wyższe stężenia wirusa można również badać poprzez zwiększenie MOI/PFU.
<ol>
	<li>Wysiewać komórki Huh-7,5 na 96-dołkowej płytce (1 ×10 4 komórki na studzienkę) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 O/N w celu uzyskania monowarstwy.</li>
	<li>Wstępnie schłodzić monowarstwy komórek w płytkach w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Współtraktować komórki inokulum HCV (MOI = 0,01) i związkami testowymi lub kontrolnymi (końcowe stężenia to: = 50 μM; PUG = 50 μM; heparyna = 1 000 μg/ml; DMSO = 1%) w temperaturze 4 °C przez 3 godziny. Na przykład do inokulum wirusa o objętości 90 μl zawierającego 1 x 102 FFU dodać 10 μl roboczego rozcieńczenia o objętości 500 μM; daje to leczenie w końcowym stężeniu 50 μM i zakażenie HCV przy MOI = 0,01 na monowarstwie komórki. 
	Uwaga: Ważne jest, aby przeprowadzić doświadczenie w temperaturze 4 °C, ponieważ pozwala to na wiązanie wirusa, ale uniemożliwia jego przedostanie się, co najskuteczniej następuje w temperaturze 37 °C. Przeprowadzić dodawanie wirusa i związków testowych na lodzie i następującą po tym inkubację w lodówce o temperaturze 4 °C, aby upewnić się, że temperatura jest utrzymywana na poziomie 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie przemyć monowarstwę komórek dwukrotnie 200 μl lodowatego PBS. 
	Uwaga: Pranie wykonuj delikatnie, aby uniknąć podnoszenia komórek.</li>
	<li>Nałożyć 100 μl podłoża podstawowego do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.</li>
	<li>Przeanalizuj wynikową infekcję, oznaczając supernatant pod kątem aktywności lucyferazy, jak opisano w "2. Odczyt infekcji wirusowej".</li>
</ol>
5. Test wnikania wirusa/fuzji
Uwaga: Przykłady okresów inkubacji i dawki wirusa dla różnych wirusów są wymienione na rysunku 2A 'Wejście/Fuzja'. Wyższe stężenia wirusa można również badać poprzez zwiększenie MOI/PFU.
<ol>
	<li>Wysiewać komórki Huh-7,5 na 96-dołkowej płytce (1 ×10 4 komórki na studzienkę) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 O/N w celu uzyskania monowarstwy.</li>
	<li>Wstępnie schłodzić monowarstwy komórek w płytkach w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zakażone komórki wirusem HCV (MOI = 0,01) w temperaturze 4 °C przez 3 godziny. Na przykład należy użyć inokulum wirusa o pojemności 100 μl zawierającego 1 x 102 FFU. 
	Uwaga: Przeprowadzić dodawanie inokulum wirusa na lodzie i następującą po nim inkubację w lodówce o temperaturze 4 °C w celu utrzymania temperatury na poziomie 4 °C, co pozwala na wiązanie wirusa, ale nie na jego wnikanie.</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie przemyć monowarstwy komórek dwukrotnie 200 μl lodowatego PBS. 
	Uwaga: Pranie wykonuj delikatnie, aby uniknąć podnoszenia komórek.</li>
	<li>Poddać studzienki działaniu badanych związków lub próbek kontrolnych (końcowe stężenia to: = 50 μM; PUG = 50 μM; heparyna = 1 000 μg/ml; DMSO = 1%) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Na przykład dodać 10 μl roboczego rozcieńczenia 500 μM do 90 μl pożywki, wymieszać i poddać metamorfozę dodzieniom; pozwala to na obróbkę w końcowym stężeniu 50 μM. 
	Uwaga: Przesunięcie z 4 °C do 37 °C ułatwia teraz wnikanie wirusa/fuzję, a tym samym umożliwia ocenę wpływu badanych związków na ten konkretny etap.</li>
	<li>Odessać supernatant zawierający lek i usunąć niezinternalizowane wirusy zewnątrzkomórkowe przez przemycie 200 μl buforu cytrynianowego (50 mM cytrynian sodu, 4 mM chlorek potasu, pH 3,0) lub PBS. Nałożyć 100 μl podłoża podstawowego przed inkubacją w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.</li>
	<li>Przeanalizuj wynikową infekcję, oznaczając supernatant pod kątem aktywności lucyferazy, jak opisano w "2. Odczyt infekcji wirusowej".</li>
</ol>

<ol><li>Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+vaccines%3A+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">HIV vaccines: progress to date.</a> Drugs. 71, 387-414 (2011).</li>
<li>Rothman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+to+dengue+virus%3A+a+tale+of+original+antigenic+sin+and+tropical+cytokine+storms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms.</a> Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).</li>
<li>Sung, H., Schleiss, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+current+status+of+cytomegalovirus+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Update on the current status of cytomegalovirus vaccines.</a> Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).</li>
<li>Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+development+of+preventive+and+therapeutic+vaccines+for+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).</li>
<li>Wright, M., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+prevention+and+therapy%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future.</a> Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).</li>
<li>Christou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+bacterial+and+viral+zoonotic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">The global burden of bacterial and viral zoonotic infections.</a> Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).</li>
<li>Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+socio-ecology+of+zoonotic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">The socio-ecology of zoonotic infections.</a> Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).</li>
<li>Grais, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measles+vaccination+in+humanitarian+emergencies%3A+a+review+of+recent+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Confl+Health%22%5BJournal%5D)">Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice.</a> Confl Health. 5, 21(2011).</li>
<li>Gautret, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+viral+respiratory+tract+infections-environmental+risk+factors+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission.</a> Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+East+respiratory+syndrome%3A+what+clinicians+need+to+know%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know.</a> Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).</li>
<li>Burd, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+Virus%3A+a+Clear+and+Present+Danger%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ebola Virus: a Clear and Present Danger.</a> J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).</li>
<li>Bishop, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+Emerging+Treatment+Options+for+Ebola+Virus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease.</a> Ann Pharmacother. , (2014).</li>
<li>Arduino, P. G., Porter, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+and+perioral+herpes+simplex+virus+type+1+%28HSV-1%29+infection%3A+review+of+its+management%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management.</a> Oral Dis. 12, 254-270 (2006).</li>
<li>Mitrasinovic, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+structure-based+design+of+the+influenza+A+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors.</a> Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).</li>
<li>Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+acting+antivirals+against+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Directly acting antivirals against hepatitis C virus.</a> J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).</li>
<li>Haqqani, A. A., Tilton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+inhibitors+and+their+use+in+the+treatment+of+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection.</a> Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).</li>
<li>Melby, T., Westby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Exp+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of viral entry.</a> Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).</li>
<li>Vanderlinden, E., Naesens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+antiviral+strategies+to+interfere+with+influenza+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry.</a> Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).</li>
<li>Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+targeted+therapeutics%3A+a+new+era+of+anti-herpes+simplex+virus-1+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics.</a> Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).</li>
<li>Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatitis+C+virus+life+cycle+as+a+target+for+new+antiviral+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies.</a> Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).</li>
<li>Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New-generation+screening+assays+for+the+detection+of+anti-influenza+compounds+targeting+viral+and+host+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions.</a> Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).</li>
<li>Kilianski, A., Baker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+antiviral+screening+against+coronaviruses%3A+developing+virus-specific+and+broad-spectrum+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors.</a> Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).</li>
<li>Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerases+of+hepatitis+C+viruses+and+flaviviruses%3A+structural+and+mechanistic+insights+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development.</a> Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).</li>
<li>Frey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+cell-cell+fusion+induced+by+the+envelope+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 69, 1462-1472 (1995).</li>
<li>Tscherne, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-+and+temperature-dependent+activation+of+hepatitis+C+virus+for+low-pH-triggered+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry.</a> J Virol. 80, 1734-1741 (2006).</li>
<li>Madan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+umbrellas%3A+a+novel+class+of+candidate+topical+microbicides+to+prevent+human+immunodeficiency+virus+and+herpes+simplex+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections.</a> J Virol. 81, 7636-7646 (2007).</li>
<li>Haywood, A. M., Boyer, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+and+temperature+dependence+of+influenza+virus+membrane+fusion+at+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH.</a> J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).</li>
<li>Haywood, A. M., Boyer, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sendai+virus+membrane+fusion%3A+time+course+and+effect+of+temperature%2C+pH%2C+calcium%2C+and+receptor+concentration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration).</a> Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).</li>
<li>Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+cells+by+Sindbis+virus+at+low+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Infection of cells by Sindbis virus at low temperature.</a> Virology. 362, 461-467 (2007).</li>
<li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolyzable+tannins+%28chebulagic+acid+and+punicalagin%29+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> J Virol. 85, 4386-4398 (2011).</li>
<li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiol. 13, 187(2013).</li>
<li>Marukian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-produced+hepatitis+C+virus+does+not+infect+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells.</a> Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).</li>
<li>Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfated+polysaccharides+are+potent+and+selective+inhibitors+of+various+enveloped+viruses%2C+including+herpes+simplex+virus%2C+cytomegalovirus%2C+vesicular+stomatitis+virus%2C+and+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+ChemotheR%22%5BJournal%5D)">Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus.</a> Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).</li>
<li>Barth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+binding+of+hepatitis+C+virus+envelope+glycoprotein+E2+requires+cell+surface+heparan+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+CheM%22%5BJournal%5D)">Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate.</a> J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+Virology%22">Principles of Virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Brown, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+caspase-dependent+apoptosis+in+antibody-enhanced+dengue+virus+infection+of+human+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells.</a> J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+host+responses+to+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+following+intranasal+administration+of+a+Protollin-adjuvanted%2C+epitope-enhanced+recombinant+G+protein+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine.</a> J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).</li>
<li>Isaacson, M. K., Compton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+glycoprotein+B+is+required+for+virus+entry+and+cell-to-cell+spread+but+not+for+virion+attachment%2C+assembly%2C+or+egress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress.</a> J Virol. 83, 3891-3903 (2009).</li>
<li>Leonard, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measles+virus+blind+to+its+epithelial+cell+receptor+remains+virulent+in+rhesus+monkeys+but+cannot+cross+the+airway+epithelium+and+is+not+shed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed.</a> J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).</li>
<li>Ciesek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+tea+polyphenol%2C+epigallocatechin-3-gallate%2C+inhibits+hepatitis+C+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry.</a> Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).</li>
<li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saikosaponin+b2+is+a+naturally+occurring+terpenoid+that+efficiently+inhibits+hepatitis+C+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry.</a> J Hepatol. 62, 541-548 (2015).</li>
<li>Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+methods+for+influenza+antiviral+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Screening methods for influenza antiviral drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+virus+inhibitors+by+influenza+A+virus+specific+reporter+cell+based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening.</a> Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

W niniejszym raporcie opisano metody identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych oparte na mechanistycznym podejściu do analizy wczesnych zdarzeń wnikania wirusa. W szczególności testy pozwoliły nam zbadać wpływ badanych związków na wolne cząsteczki wirusa, przyczepienie wirusa oraz wnikanie/fuzję wirusa. Wdrożono kluczowe etapy, aby jednoznacznie ocenić wpływ leku na określony etap wczesnego wnikania wirusa. Na przykład w "teście inaktywacji wirusa" rozcieńczenie mieszaniny wirus-lek do stężenia subterapeutycznego zapobiega znaczącej interakcji między badanym związkiem a powierzchnią komórki gospodarza poprzez "miareczkowanie" leku. Gwarantuje to, że efekt hamujący obserwowany przy późniejszym zakażeniu komórki gospodarza jest spowodowany bezpośrednią interakcją między badanym związkiem a wirionami bezkomórkowymi, a nie wpływem badanego związku na błonę komórkową gospodarza lub cząsteczki związane z błoną, w tym receptory wirusowe30. Podobnie, zmiana temperatury między 4 °C (która pozwala na wiązanie wirusa, ale nie wnikanie) do 37 °C (co ułatwia wnikanie/fuzję wirusa) w "teście przyczepiania wirusa" i "teście wnikania/fuzji wirusa" ma kluczowe znaczenie dla określenia wpływu badanego związku na każde z tych konkretnych zdarzeń. Jest to możliwe ze względu na wrażliwość na temperaturę wirusów otoczkowych podczas tych etapów infekcji24-29. Dlatego ważne jest, aby testy były wykonywane we wskazanej temperaturze, aby zapewnić dokładność wyników; na przykład przeprowadzając doświadczenie na lodzie w celu utrzymania temperatury 4 °C i umieszczając próbkę bezpośrednio w inkubatorze o temperaturze 37 °C w celu zmiany temperatury. Ponadto zastosowanie negatywnych (np. rozpuszczalnik DMSO do przygotowania leków) i pozytywnych (np. leczenie heparyną) kontroli również pomaga w dalszym ustaleniu dokładności testów. Użyteczność i możliwość zastosowania takich metod wykazano w wielu badaniach przeciwwirusowych26,30,31,40,41. Należy zauważyć, że chociaż heparyna jest uwzględniona jako kontrola dla wszystkich trzech testów w kontekście reprezentatywnych wyników, zazwyczaj blokuje ona początkowe wiązanie wirusa, a nie następujący po nim etap fuzji/wejścia (co odzwierciedlają dane na rysunku 2). Można również zastosować dodatkowe kontrole, takie jak przeciwciała neutralizujące skierowane przeciwko wirusowi (do testu inaktywacji wirusa), przeciwciała maskujące receptory na powierzchni komórki dla wirusa (dla testu przyczepiania wirusa) oraz inhibitory fuzji błonowej (dla testu fuzji/wejścia wirusa). 
Testy opisane w niniejszym raporcie, które są specyficzne dla wczesnych stadiów infekcji wirusowej, są przydatne pod względem zastosowania jako testy wtórne do scharakteryzowania mechanizmu działania leków kandydujących z pierwotnych badań przesiewowych, które zazwyczaj są szerzej ukierunkowane na infekcję wirusową. Alternatywnie, mogą być również włączone do podstawowych badań przesiewowych, jeśli ktoś szuka inhibitorów wczesnego wnikania wirusa, w tym środków inaktywujących wirusa, antagonistów przyłączania wirusa i inhibitorów wnikania/fuzji wirusa. W tym przypadku ich zastosowanie pozwala na bardziej ukierunkowaną i precyzyjną analizę przesiewową w celu identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe specyficznych dla danego mechanizmu, co z kolei przyspieszyłoby dalszy rozwój leków. 
Zastosowanie testów komórkowych do identyfikacji środków przeciwwirusowych zapewnia kilka ważnych korzyści w porównaniu z testami biochemicznymi, w tym ujawnianie potencjalnych skutków niedocelowych (takich jak cytotoksyczność) i dodawanie fizjologicznego znaczenia do bioaktywności badanych czynników42. Kwestie te są ważnymi czynnikami przy podejmowaniu decyzji, czy potencjalny czynnik ma wartość dla kontynuacji w kolejnych fazach opracowywania leku. Podobnie, wczesne testy specyficzne dla wniknięcia wirusa opisane w niniejszym raporcie pozwalają na zbadanie wpływu leku na odrębne stadium wnikania wirusa na poziomie komórkowym, a dokładniej w kontekście autentycznej infekcji wirusowej in vitro. Wyniki uzyskane z takich testów pomogłyby zatem lepiej przewidywać skuteczność przeciwwirusową badanych związków, a także identyfikować potencjalnie niepożądane efekty niepożądane w stosunku do komórki gospodarza. Jednym z potencjalnych ograniczeń jest jednak to, że test komórkowy in vitro może nie odzwierciedlać w pełni faktycznego etapu wejścia in vivo w kontekście naturalnej infekcji wirusowej. Niemniej jednak testy przedstawione w tym protokole służą jako platforma analityczna do opartej na mechanizmach identyfikacji i oceny nowych leków przeciwwirusowych.
Opracowanie wirusów reporterowych lub systemów komórek reporterowych w celu ilościowego określenia ilości infekcji wirusowej znacznie ułatwiło badania przesiewowe na komórkach i ocenę związków przeciwwirusowych. Przykłady obejmują stosowanie rekombinowanych wirusów zawierających gen reporterowy lub za pomocą rekombinowanych ludzkich linii komórkowych zawierających gen reporterowy napędzany przez specyficzny promotor wirusa31,43. W tym raporcie infekcja HCV znakowana lucyferazą może być łatwo monitorowana poprzez ilościowe określenie sygnału reporterowego, ułatwiając w ten sposób analizę danych. Dzięki zastosowaniu tych użytecznych narzędzi opartych na reporterach, opisane tutaj wczesne testy wnikania wirusa można zasadniczo zaadaptować do formatu o wysokiej przepustowości do opartych na mechanizmach badań przesiewowych bibliotek małych cząsteczek.
Podsumowując, opisano protokół testów analizujących wczesne wnikanie wirusa jako sposób identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych specyficznych dla danego mechanizmu. Takie testy byłyby przydatne do odkrywania nowych antagonistów/inhibitorów wnikania wirusa i pomogłyby rozszerzyć zakres środków przeciwwirusowych do opracowania jako leczenia profilaktycznego i/lub terapeutycznego.

Infekcje wirusowe są stałym zagrożeniem dla zdrowia publicznego i istotną przyczyną chorób epidemicznych, zachorowalności i zgonów na całym świecie. Specyficzne sposoby kontroli infekcji wirusowych obejmują opracowywanie szczepionek i terapii przeciwwirusowych. Chociaż wysiłki związane ze szczepionkami okazały się skuteczne w uodparnianiu przeciwko kilku wirusom, wiele patogenów wirusowych pozostaje bez szczepionki ochronnej, w tym wirus dengi (DENV), ludzki wirus cytomegalii (HCMV), wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) i syncytialny wirus oddechowy (RSV)1-5. Z drugiej strony leki przeciwwirusowe odgrywają ważną rolę w leczeniu tych infekcji wirusowych, gdy szczepionki profilaktyczne są niedostępne. Jednak do tej pory dostępnych jest tylko kilka licencjonowanych i opłacalnych leków przeciwwirusowych w porównaniu z liczbą patogenów wirusowych, które zagrażają zdrowiu publicznemu. Co ważniejsze, ze względu na wzrost liczby podróży na całym świecie i szybką urbanizację, sytuację pogarsza ryzyko wybuchu epidemii spowodowanych pojawiającymi się/ponownie pojawiającymi się infekcjami wirusowymi, które są wprowadzane na obszary nierdzenne6. Niedawne epidemie wywołane przez wirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (SARS), wirusy grypy (H1N1, H5N1, H3N2 i H7N9), DENV, wirus Zachodniego Nilu (WNV), wirus odry (MV), wirus zespołu oddechowego Bliskiego Wschodu (MERS) i wirus Ebola6-12 to jedne z przykładów odzwierciedlających potrzebę opracowania leków przeciwwirusowych, gdy immunizacja i/lub terapia są niedostępne. Ponadto zawsze istnieje potencjalne ryzyko wytworzenia zakażeń lekoopornych obecnie stosowanymi lekami przeciwwirusowymi. W związku z tym ciągły rozwój i rozszerzanie zakresu leków przeciwwirusowych w odniesieniu do tych pojawiających się/ponownie pojawiających się zakażeń wirusowych jest konieczne, aby zapewnić lepsze strategie zarządzania i chronić zdrowie publiczne.
Większość terapii przeciwwirusowych składa się z leków przeciwwirusowych o bezpośrednim działaniu (DAA), które celują w określone białko wirusowe lub kofaktor, który pośredniczy w ważnych krokach w cyklu życia wirusa. Na przykład analog nukleozydu Acyklowir hamuje polimerazę DNA herpeswirusa, inhibitory proteazy Boceprewir i Telaprewir antagonizują HCV NS3, a Oseltamiwir i Zanamiwir są inhibitorami neuraminidazy, które blokują uwalnianie cząstek wirusa grypy z zakażonych komórek13-15. Istnieje jednak bardzo niewiele licencjonowanych inhibitorów wnikania wirusa, w tym enfuwirtyd, który jest ukierunkowany na HIV gp41, aby zapobiec fuzji, oraz marawirok, który blokuje koreceptor HIV CCR5, zapobiegając w ten sposób przedostawaniu się wirusa16. Badanie nowych antagonistów/inhibitorów wnikania wirusa może pomóc w zapewnieniu dodatkowych środków terapeutycznych do użytku profilaktycznego lub terapeutycznego, na przykład w połączeniu z innymi lekami przeciwwirusowymi o innym mechanizmie działania, aby lepiej radzić sobie z infekcjami wirusowymi17-19. 
Identyfikacja leków przeciwwirusowych może obejmować projektowanie leków kierowanych strukturą i strategię opartą na badaniach przesiewowych leków. Metody oceny aktywności przeciwwirusowej badanych czynników obejmują biochemiczne testy aktywności enzymatycznej i ocenę za pomocą systemów komórkowych20-23. W systemach komórkowych cykl życiowy wirusa można podzielić na różne etapy infekcji, takie jak zdarzenia wejścia (przyczepienie, fuzja, odpowlekanie), faza replikacji (replikacja genomu wirusa i translacja białek) oraz wyjście wirionu (składanie, dojrzewanie i uwalnianie). Ponieważ testy można dostosować do badania każdego konkretnego etapu przy użyciu różnych narzędzi i metod, podejście to pozwala na identyfikację/badanie potencjalnych leków przeciwwirusowych o określonym mechanizmie działania ukierunkowanym na odrębny analizowany etap. Na przykład, aby przeanalizować wpływ leku na wolne cząsteczki wirusa przed związaniem się z komórką gospodarza, można przeprowadzić "test inaktywacji wirusa". W tym teście wirus może inkubować z badanym lekiem, a następnie rozcieńcza się go w celu miareczkowania leku przed zakażeniem monowarstwy komórki. Dodatkowe etapy, takie jak przyłączanie się wirusa i etapy wchodzenia/fuzji, mogą być również analizowane indywidualnie, poprzez zmianę temperatury podczas infekcji. W przypadku wielu wirusów otoczkowych wnikanie/fuzja wirusa przez błonę komórkową gospodarza jest znacznie ułatwiona w temperaturze 37 °C, ale zwykle jest wykluczona w temperaturze 4 °C, co nie wpływa na wiązanie wirusa24-29. Wreszcie, zastosowanie wirusów reporterowych lub systemów komórkowych może ułatwić te badania i umożliwić analizę o wysokiej przepustowości.
Wcześniej stosowaliśmy podejście oparte na komórkach i analizowaliśmy wczesne przenikanie różnych wirusów otoczkowych w celu zbadania związków przeciwwirusowych, które potencjalnie antagonizują wejście wirusa30,31. W niniejszym artykule opisano różne stosowane metody, w tym inaktywację wirusa, przyłączanie wirusa oraz testy wnikania/fuzji wirusa.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testów toksykologicznych in vitro,</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr> <tr><td>na bazie XTTPBS pH 7,4&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Thermo Scientific</td><td>89087-320</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td></td></tr><tr><td>BioLux Zestaw do oznaczania lucyferazy Gaussia</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300L&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Luminometr</td><td>Promega</td><td>GloMax-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu, dwuwodny</td><td>Sigma</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr></tbody></table>

testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Systemy oparte na komórkach są przydatne do odkrywania środków przeciwwirusowych. Analiza cyklu życiowego wirusa, w szczególności jego wczesnych etapów, pozwala na mechanistyczne podejście do identyfikacji i oceny środków przeciwwirusowych, które są ukierunkowane na określone etapy wnikania wirusa. W niniejszym raporcie opisano metody badania inaktywacji wirusa, przyłączania się wirusa oraz wnikania/fuzji wirusa jako testów przeciwwirusowych do takich celów, wykorzystując wirusa zapalenia wątroby typu C jako model. Testy te powinny być przydatne do odkrywania nowych antagonistów/inhibitorów wczesnego wnikania wirusa i pomóc w rozszerzeniu zakresu potencjalnych środków przeciwwirusowych do dalszego opracowywania leków.

Na Rysunku 1 przedstawiono „test inaktywacji wirusa”, który przeprowadzono w celu zbadania, czy dwie konkretne związki naturalne, CHLA i PUG, mogą inaktywować różne wirusy otoczkowe w stanie bezkomórkowym i zapobiegać późniejszej infekcji. Cytotoksyczność i odpowiedź przeciwwirusowa na dawkę tych związków zostały określone przed przeprowadzeniem badania mechanistycznego31. Wirusy poddano wstępnej obróbce związkami testowymi, a następnie mieszaniny wirus-lek rozcieńczono do stężeń subterapeutycznych przed inokulacją na odpowiednią monowarstwę komórek dla każdego systemu wirusowego. Jak pokazano na Rysunku 1, zarówno CHLA, jak i PUG wykazały interakcję z wirionami w stanie bezkomórkowym, co doprowadziło do nieodwracalnych efektów chroniących monowarstwę komórek przed późniejszą infekcją. Oba związki testowe osiągnęły niemal 100% inhibicji w stosunku do HCMV, HCV i DENV-2, podczas gdy w przypadku MV i RSV zaobserwowano blokadę na poziomie 60 – 80%. Wyniki te sugerują, że CHLA i PUG wywierają bezpośredni wpływ na te wolne cząsteczki wirusa poprzez ich inaktywację i neutralizację zakaźności.
Na Rysunku 2 przedstawiono analizy przyłączania i wnikania/fuzji, które przeprowadzono w celu zbadania wpływu CHLA i PUG na te wczesne etapy wnikania wirusów HCMV, HCV, DENV-2, MV i RSV. Zarówno CHLA, jak i PUG skutecznie zapobiegały wiązaniu badanych wirusów do odpowiednich komórek gospodarza, co potwierdziło zahamowanie wynikającej z tego infekcji wirusowej (Rysunek 2, „Attachment”: jasnoszare słupki). Hamujący wpływ obu związków na przyłączanie wirusów był podobny w przypadku HCMV (Rysunek 2B), HCV (Rysunek 2C), DENV-2 (Rysunek 2D) i RSV (Rysunek 2F) i wynosił od 90 do 100%. Z kolei PUG wydawał się być bardziej skuteczny niż CHLA w hamowaniu wiązania MV (Rysunek 2E), przy czym stopień inhibicji dla obu związków wahał się między 50 a 80%. Heparyna, zastosowana w celu kontrolnym i znana z blokowania wnikania wielu wirusów, również hamowała przyłączanie HCMV, DENV-2, RSV i MV, jednak była mniej skuteczna przeciwko HCV. Kolejna „analiza wnikania/fuzji wirusowej” miała na celu sprawdzenie, czy CHLA i PUG zachowują swoją aktywność podczas fazy wnikania/fuzji wirusa (Rysunek 2, „Entry/Fusion”: ciemnoszare słupki). Ponownie zaobserwowano, że zarówno CHLA, jak i PUG skutecznie upośledzają etap wnikania/fuzji badanych wirusów (Rysunek 2B–F), wykazując od 50 do 90% efektu ochronnego w odpowiednich monowarstwach komórek. Heparyna również silnie hamowała wnikanie/fuzję w infekcjach DENV-2 i RSV, ale była mniej skuteczna przeciwko HCMV, HCV i MV (średnio &lt; 40% inhibicji).
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Wirus</td>
			<td >Typ komórek</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >HCMV</td>
			<td >HEL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >HCV</td>
			<td >Huh-7.5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >DENV-2</td>
			<td >Vero</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >MV</td>
			<td >CHO-SLAM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >RSV</td>
			<td >HEp-2</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Typ komórek gospodarza dla infekcji wirusowej. Wskazano typ komórek użytych w każdym systemie infekcji wirusowej opisanym w reprezentatywnych wynikach. Dodatkowe szczegóły dotyczące komórek znajdują się w materiale źródłowym31.
<img alt="Schemat eksperymentu inhibicji wirusowej; metody inaktywacji i analiza z wykresami skuteczności leków." src="/files/ftp_upload/53124/53124fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Inaktywacja infekcji wirusowych przez badane związki CHLA i PUG. Różne wirusy były traktowane badanymi związkami przez długi czas (inkubacja przez 1,5 – 3 hr przed mianowaniem; jasnoszare słupki) lub krótki czas (rozcieńczenie natychmiastowe; ciemnoszare słupki) w temperaturze 37 °C przed rozcieńczeniem do stężenia poniżej terapeutycznego i późniejszą analizą infekcji na odpowiednich komórkach gospodarza. (A) Schematy eksperymentu (po lewej) z końcowym stężeniem wirusa (PFU/well lub MOI), długotrwałym okresem inkubacji wirusa z lekiem (i) oraz późniejszym czasem inkubacji (ii) wskazanymi dla każdego wirusa w tabeli po prawej. Analizy dla (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV oraz (F) RSV są wskazane na poszczególnych dodatkowych panelach. Wyniki przedstawiono w stosunku do negatywnej kontroli z DMSO dla infekcji wirusowej, a przedstawione dane to średnie ± standardowe błędy średniej (SEM) z trzech niezależnych eksperymentów. Rycina została zmodyfikowana na podstawie referencji31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki testu hamowania wirusów i harmonogram doświadczalny dla HCMV, HCV, DENV-2, MV, RSV." src="/files/ftp_upload/53124/53124fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ocena aktywności przeciwwirusniczej badanych związków CHLA i PUG przeciwko przyłączaniu oraz wnikaniu/fuzji wirusów. (A) Procedura doświadczalna, stężenie wirusa (PFU/well lub MOI) oraz czas dodania i traktowania badanymi związkami (i, ii, iii) są przedstawione dla każdego wirusa na schematach i w powiązanych tabelach. W analizie przyłączania wirusa (jasnoszare słupki) monowarstwy różnych typów komórek schłodzono wcześniej do 4 °C przez 1 hr, a następnie poddano wspólnej inkubacji z odpowiednimi wirusami i badanymi związkami w 4 °C (1,5 – 3 hr; i) przed wypłukaniem inokulum i badanych związków w celu późniejszej inkubacji (37 °C; ii) i oceny infekcji wirusowej. W analizie wnikania/fuzji wirusa (ciemnoszare słupki) wysiane monowarstwy komórek schłodzono wcześniej do 4 °C przez 1 hr, a następnie poddano działaniu odpowiednich wirusów w 4 °C przez 1,5 – 3 hr (i). Komórki następnie przemyto i traktowano badanymi związkami przez dodatkowy okres inkubacji (ii), podczas którego temperaturę zmieniono na 37 °C, aby ułatwić proces wnikania/fuzji wirusa. Po zakończeniu inkubacji wirusy pozakomórkowe usunięto za pomocą buforu cytrynianowego (pH 3,0) lub przemywania PBS, a komórki inkubowano dalej (iii) w celu analizy infekcji wirusowej. Wyniki dla (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV oraz (F) RSV są wskazane na poszczególnych dodatkowych panelach. Dane są przedstawione w stosunku do negatywnej kontroli DMSO dla infekcji wirusowej i podano je jako średnie ± SEM z trzech niezależnych doświadczeń. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie referencji31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół, który bada konkretne etapy wejścia wirusa w celu identyfikacji i oceny nowych środków przeciwwirusowych.

Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Ogólnym celem tej procedury jest określenie działania przeciwwirusniczego badanych związków w odniesieniu do konkretnych etapów wczesnej wnikania wirusa. Jest to realizowane poprzez uprzednie wysianie komórek gospodarza w celu infekcji wirusowej. Drugim krokiem jest przeprowadzenie infekcji wirusowej oraz traktowanie badanymi związkami w różnych punktach czasowych i temperaturach.Następnie zmywa się inokulum poddane działaniu leku, a komórki pokrywa się podłożem podstawowym. Ostatnim krokiem jest inkubacja komórek. W końcowej fazie analizuje się zakaźność wirusa, aby określić wpływ testowanych związków na wczesne etapy wnikania wirusa podczas infekcji.Na przykład luminometru używa się do oceny aktywności lucyferazy w komórkach po zakażeniu wirusem reporterowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona zastosowanie podejścia bardziej opartego na mechanizmie w identyfikacji czynników przeciwwirusowych, szczególnie tych celujących w wniknięcie wirusa. Aby rozpocząć, należy najpierw przygotować roztwory zapasowe badanych związków, kwasu trilogy lub CHLA oraz kolagenu PUNIC lub PUG w DMSO; heparynę jako kontrolę pozytywną rozpuścić w sterylnej wodzie dwukrotnie destylowanej, a następnie przygotować hodowlę komórek gospodarza do analizy.Komórki ludzkiego raka wątroby HUH 7.5 inkubowano przez noc w świeżej pożywce DMAM uzupełnionej o FBS i antybiotyki. Pamiętaj o przestrzeganiu procedur poziomu bezpieczeństwa biologicznego dwa (BSL-2) przez cały czas trwania eksperymentu w celu przetestowania cytotoksyczności badanych związków. Komórki potraktowano zwiększającymi się stężeniami CHLA lub PUG, od 0 do 500 µM rozpuszczonych w pożywce podstawowej, lub 1% DMSO jako kontrolą negatywną, a następnie inkubowano komórki przez 72 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.Usunąć medium i dwukrotnie przemyć komórki 200 µL PBS. Następnie dodać 100 µL odczynnika do testu XT T i inkubować w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. Potem, za pomocą czytnika mikropłytek, wyznaczyć absorbancję przy 492 nm z długością fali referencyjnej 690 nm.Oblicz procent żywotności za pomocą podanego wzoru na podstawie tych wartości. Wyznacz stężenia cytotoksyczności komórkowej 50% dla każdego związku. Aby rozpocząć test inaktywacji wirusowej.Pierwsza płytka, 1 × 10⁴ komórek na dołek. W płytce 96-dołkowej inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez noc, aby umożliwić ich przytwierdzenie przed infekcją. Przygotować cząsteczki wirusa zapalenia wątroby C (HCV) z reporterem Gaia luciferase, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W sterylnej probówce wymieszaj 100 µL 100 µM CHLA lub PUG z 100 µL 10⁴ jednostek tworzących ogniska (FFU) HCV, aby przygotować mieszaninę kontrolną pozytywną. HCV z heparyną o końcowym stężeniu 1000 µg/mL.Inkubować w temperaturze 37°C przez trzy godziny. Po trzech godzinach rozcieńczyć mieszaninę związku wirusowego 50-krotnie, dodając 9,8 ml pożywki podstawowej w temperaturze pokojowej. Następnie przygotować nową mieszaninę związku wirusowego i niezwłocznie rozcieńczyć ją w pożywce podstawowej dla próbki z inkubacji w czasie zero.Po usunięciu pożywki inkubacyjnej z komórek, do każdego otworu należy dodać 100 µL rozcieńczonego roztworu leku przeciwwirusowego w trzech powtórzeniach. Roztwór zawiera obecnie 10² FFU na otwór; inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez trzy godziny, aby umożliwić infekcję wirusową komórek. Po inkubacji usunąć zawiesinę wirusową z otworów i delikatnie przemyć komórki 200 µL PBS-u dwukrotnie.Inkubować komórki w 100 µL pożywki podstawowej przez 72 godziny w celu replikacji wirusa i uwolnienia lucyferazy reporterowej do supernatantu. Następnie zebrać supernatnat z kultur i mikroprobówek i odwirować przy 17 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Aby usunąć szczątki komórkowe, zmieszać 20 µL każdego supernatantu z 50 µL odczynnika do testu lucyferazy Gaussi i zmierzyć luminescencję wynikającą z aktywności lucyferazy reporterowej w luminometrze.Zgodnie z instrukcjami producenta dla płytki do testu przyczepiania wirusów, należy wysiać 1×10⁴ komórek na dołek w płytce 96-dołkowej i inkubować przez noc w celu przyczepienia się komórek. Następnego ranka należy schłodzić płytkę 96-dołkową zawierającą monowarstwę komórek w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę.Przygotować związki testowe i mieszaninę wirusa na lodzie. Na przykład roztwory H-C-V-C-H-L-A-H-C-V w 1% DMSO lub roztwory kontroli pozytywnej HCV Heparin z wirusem w stężeniu 10² FFU. W przypadku każdego wariantu traktowania należy ostrożnie odessać medium z dołków z kulturą komórkową.Następnie niezwłocznie dodaj 100 µL mieszaniny związku testowego z wirusem do trzech powtórznych studni, uważając, aby nie podnieść temperatury. Inkubuj płytkę w lodówce utrzymywanej w temperaturze 4 °C przez trzy godziny. Cząsteczki wirusa przyłączą się do powierzchni komórek w temperaturze 4 °C, ale nie zostaną wchłonięte do wnętrza komórek.Następnie odessać supernatanty. Komórki delikatnie przemyć dwukrotnie 200 µL lodowatego PBS. Do każdej studzienki dodać 100 µL pożywki podstawowej, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.Na koniec, w celu ilościowego oznaczenia uwalnianego reportera lucyferazy z zainfekowanych komórek, należy zebrać nadsącz z każdej studni z próbką i przeprowadzić test Gaussian Luciferase w celu oceny fuzji i wniknięcia wirusa. Płytkę do hodowli komórek należy schłodzić do temperatury 4 °C przez jedną godzinę.Po inkubacji przez noc w celu przyczepienia komórek, usunąć obecną pożywkę z dołków i zainfekować komórki dawką 10² FFU HCV w temperaturze 0°C. Inkubować płytkę w temperaturze 4°C przez trzy godziny. Delikatnie przemyć komórki dwukrotnie 200 µL lodowatego PBS, aby usunąć wirusy, które nie przyczepiły się do komórek.Następnie, w warunkach chłodzenia na lodzie, potraktuj komórki związkami testowymi rozpuszczonymi w medium podstawowym lub medium podstawowym z 1% DMSO jako kontrolą, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez trzy godziny. Pozwala to na ocenę wpływu związków testowych na wniknięcie wirusa, które zachodzi w temperaturze 37°C. Odessaj medium i dwukrotnie przemyj niezinternalizowane wirusy 200 µL buforu cytrynianowego lub PBS.Dodaj 100 µL pożywki podstawowej do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 °C przez kolejne 72 godziny. Zbierz supernat i przeprowadź analizę lucyferazy metodą Gaussa, zgodnie z wcześniejszą instrukcją, w celu wykrycia uwolnionego reportera lucyferazy. Przedstawiono tutaj wpływ badanych związków na HCV. W procesie aktywacji wirusa inkubowano ze związkami testowymi przez zero lub trzy godziny przed zakażeniem.Wykres przedstawia procent hamowania infekcji wirusowej dla każdego z zastosowanych działań. Negatywna kontrola DMSO nie wykazuje hamowania. CHLA wykazuje wysokie hamowanie przy kontakcie, po inkubacji przez zero godzin, a także po dłuższej inkubacji trwającej trzy godziny.Dodatkowe wyniki z innego testu. W przypadku związku PUG, przy zastosowaniu tego ogólnego schematu doświadczalnego, wykazano, że CHLA i PUG dodatkowo hamują zakaźność ludzkiego cytomegalowirusa (HCMV) w embrionalnych fibroblastach płucnych. Przedstawiono tutaj wpływ CHLA i PUG na przywieranie HCV.Należy pamiętać, że komórki inkubowano z wirusem w obecności lub absence badanych związków w temperaturze 4°C, a następnie, po usunięciu niezwiązanego wirusa, inkubowano je w temperaturze 37°C w celu zainfekowania przez wirusa. Zacieniowane słupki przedstawiają wpływ C-H-L-A-P-U-G lub heparyny na wniknięcie HCV do komórek. Należy zauważyć, że w tym przypadku adhezja wirusa była najpierw przeprowadzana w temperaturze 4°C.Następnie, po usunięciu niewiązanego wirusa, komórki inkubowano z badanymi związkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu umożliwienia wejścia wirusa do komórek. Podobnie w przypadku HCMV, w zarodkowych fibroblastach płuc zakażonych wirusem, zastosowanie CHLA lub PUG wykazuje silne hamowanie przyłączania i wnikania wirusa. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o realizacji poszczególnych kroków w wskazanej temperaturze, co będzie miało wpływ na dokładność wyników.

early-viral-entry-assays-for-identification-evaluation-antiviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test inaktywacji wirusa, prezentując ocenę wpływu środków przeciwwirusowych na cząsteczki wirusa.

Ocena skuteczności przeciwwirusowego związku testowego za pomocą testu inaktywacji wirusa

Ten film demonstruje test przyczepiania wirusów do badania przesiewowego związków przeciwwirusowych. Wykorzystując genetycznie zmodyfikowany wirus zapalenia wątroby typu C i lucyferazy, ocenia hamujący wpływ na przyłączanie się wirusa, na co wskazuje niższe natężenie światła w studzienkach poddanych działaniu kooperacji w porównaniu ze studzienkami leczonymi samym wirusem.

Test przyłączania wirusa do badań przesiewowych związków przeciwwirusowych

Ten film demonstruje test do oceny środków przeciwwirusowych, które są ukierunkowane na określone etapy wnikania wirusa do komórek gospodarza i fuzji z endosomem. Komórki są inkubowane w niskiej temperaturze, a następnie zakażone HCV. Niska temperatura umożliwia wiązanie wirusa z komórkami gospodarza, ale hamuje internalizację poprzez endocytozę. Dodaje się testowy związek przeciwwirusowy, a komórki inkubuje się w temperaturze fizjologicznej. To przejście do wyższej temperatury ułatwia wnikanie...

Test do oceny wpływu badanych związków na wnikanie wirusa i fuzję w komórkach gospodarza

Ten film demonstruje metodę przeprowadzania testu płytki nazębnej przy użyciu wirusa uzyskanego z zakażonej rogówki świni. Rogówka świni służy do testowania skuteczności przeciwwirusowej leków eksperymentalnych.

Określanie skuteczności przeciwwirusowej leków eksperymentalnych za pomocą testu płytki nazębnej

Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

Tutaj opisujemy cytotoksyczność komórkową i testy zakaźności w pojedynczej rundzie, które pozwalają na szybkie i dokładne badanie przesiewowe związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej (CC50) i wartości IC50 przeciwko WT i lekoopornemu HIV-1.

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Pierwszym krokiem w cyklu życia arenawirusa jest dołączenie cząsteczek wirusa do komórek gospodarza. Przedstawiamy ilościowy test oparty na (q)RT-PCR do ultraczułego wykrywania i ilościowego oznaczania zdarzeń związanych z przyłączeniem arenawirusa.

Bardzo czuły test do pomiaru przyłączenia komórki arenawirusa

Celem protokołu jest zilustrowanie różnych testów związanych z wnikaniem wirusa, które mogą być użyte do identyfikacji potencjalnych inhibitorów wnikania wirusa.

Wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi Coxsackie A16

W tej pracy opisujemy protokoły używane w testach opartych na replikonie i enzymach wirusowych do badań przesiewowych na obecność inhibitorów replikacji wirusa Zika w formacie wysokoprzepustowych.

Wysokoprzepustowe testy przeciwwirusowe do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów replikacji wirusa Zika

Niniejszy artykuł opisuje metodologię generowania cząstek pseudotypowanych przez SARS-CoV-2 przy użyciu systemu raportującego lucyferazę oraz jej zastosowanie do identyfikacji inhibitorów wejścia. Protokoły te zostały zademonstrowane przy użyciu dwóch różnych inhibitorów wejścia: rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego ACE2-Fc oraz małopąsteczkowego związku arbidolu.

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

Poznaj metodę oceny związków przeciwwirusowych poprzez testy wczesnego wnikania wirusa z użyciem komórek HUH 7.5 i analizy lucyferazy. Protokół umożliwia identyfikację inhibitorów wnikania wirusów.

Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

Przeglądaj więcej filmów