Przygotowanie frakcji wzbogaconych w mitochondria do analizy metabolicznej u Drosophila

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest uzyskanie wzbogaconych frakcji mitochondrialnych, które dostarczą wystarczającej ilości metabolitów mitochondrialnych do badań metabolomicznych z wykorzystaniem drosophila melanogaster. Osiąga się to najpierw poprzez hodowlę odpowiedniej liczby much, aby wygenerować wystarczającą ilość metabolitów dla wzbogaconych frakcji mitochondrialnych. W drugim kroku muchy są homogenizowane w szklanym homogenizatorze z teflonowym tłokiem, co prowadzi do rozpadu błon komórkowych bez naruszania integralności mitochondriów.

Następnie homogenaty poddaje się wirowaniu różnicowemu w celu uzyskania wzbogaconych próbek mitochondrialnych. Wyniki wskazują, że dzięki zastosowaniu tego protokołu wykryto wyraźne zmiany metaboliczne w mitochondriach, których nie zaobserwowano podczas analizy metabolomicznej opartej wyłącznie na frakcjach wzbogaconych w mitochondria oraz ekstraktach z całych zwierząt. Główną zaletą tej procedury w porównaniu z analizą metabolomiczną całej muchy jest fakt, że izolacja mitochondriów przed analizą metabolomiczną pozwala na zwiększenie czułości oraz wykrycie przesunięć w metabolitach mitochondrialnych.

Aby rozpocząć eksperyment, podgrzej składniki pożywki dla much na płycie grzejnej do 90 °C. Regularnie mieszaj mieszaninę, aż stanie się jednorodna i lekko gęsta. Zdejmij pożywkę z źródła ciepła i mieszaj ją okazjonalnie, gdy ostygnie do 80 °C, a następnie dodaj 0,2% TE decept methyl four hydroxy benzoate rozpuszczony w 95% Ethanol. Następnie podziel pożywkę na dwie równe objętości.

Upewnij się, że temperatura pożywki spadła do 50 °C, a następnie wmieszaj 1,1 ml 50 mM rapamycyny rozpuszczonej w etanolu do pierwszej objętości oraz 1,1 ml nietraktowanego etanolu do drugiej objętości. Do zbierania osobników dorosłych użyj jednostopniowego regulatora do podawania czystego dwutlenku węgla z wysokociśnieniowego zbiornika. Przy stałym przepływie 5 PSI unikam elektryczności statycznej, używając plastikowej rurki do doprowadzania dwutlenku węgla do kolby filtrowej o pojemności 500 ml z rurką do przepuszczania dwutlenku węgla przez wodę.

W tym celu należy użyć korka gumowego z jednym otworem, aby uszczelnić kolbę. Połączyć plastikowy wężyk z bocznym otworem kolby z poduszką dwutlenku węgla, aby kontrolować zagęszczenie larw podczas rozwoju. Umieścić 25 par rodziców w butelce hodowlanej i pozwolić im składać jaja przez 48 godzin.

Następnie należy usunąć rodziców, aby uregulować gęstość jaj, i powtórzyć te kroki z wyklutym potomstwem F1, aby przeprowadzić dwie generacje takiej kontroli gęstości. Po dwóch generacjach w warunkach kontrolowanej gęstości należy rozdzielić muchy według płci, umieszczając je na podkładce nie dłużej niż przez 10 do 15 minut. Pozostawić muchy na 24 godziny w celu regeneracji po znieczuleniu przed umieszczeniem ich w warunkach eksperymentalnych.

Wyznaczyć 300 much na próbkę, aby uzyskać wystarczającą ilość metabolitów do frakcji wzbogaconych w mitochondria. Przenieść 150 much do własnoręcznie wykonanej klatki o pojemności jednego litra. Następnie przenieść pozostałe 150 much do oddzielnej klatki o pojemności jednego litra; nie należy przekraczać liczby 150 much w jednej klatce.

Użyj sześciu próbek powtórzonych dla każdego warunku eksperymentalnego i umieść klatki w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności, aby dokończyć hodowlę drosophila. Co dwa lub trzy dni dostarczaj muchom świeżą pożywkę w fiolce zawierającej 5 mL pożywki, aby utrzymać jej jakość przez łącznie 10 dni. Rozpocznij izolację, przelewając muchy z jednej klatki do szklanego homogenizatora z teflonowym tłokiem wypełnionego 1 mL schłodzonego buforu do izolacji.

Następnie umieść moździerz w lodzie, aby zachować integralność mitochondriów, i zhomogenizuj muchy, wykonując 15 ruchów. Ostrożnie, nie obracając tłuczka, przenieś homogenat do probówki o pojemności 1,5 ml i wiruj ją z prędkością 300 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Przenieś nadsącz do innej probówki i wiruj go z prędkością 6 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu wzbogacenia frakcji mitochondriów.

Po wirowaniu odrzuć nadsącz zawierający frakcję cytozolową. Resuspenduj osad w 300 µL buforu piorącego, pipetując go w górę i w dół. Powtórz delikatnie poprzednie kroki dla drugiej partii.

Następnie połączyć resuspenderowane osady z obu klatek w kriogenicznej probówce do mikrocentryfugi i odwirować połączone osady z prędkością 6 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odlać nadsącz i błyskawicznie zamrozić osad w ciekłym azocie. Na koniec przechowywać frakcje wzbogacone w mitochondria w temperaturze -80 °C.

Ten western blot wykazuje wzbogacenie białka transportowego błony mitochondrialnej poin, które służy jako wskaźnik skutecznej separacji mitochondriów w frakcjach mitochondrialnych. Białko poin jest niewykrywalne w frakcjach cytozolowych, podczas gdy białko tubulina, cytozolowe białko mikrotubul, nie jest wykrywane w frakcji mitochondrialnej, co świadczy o minimalnym zanieczyszczeniu białkami cytozolowymi. Analizy głównych składowych (PCA) zostały wygenerowane z wartości uzyskanych z analizy spektrometrią mas, które zostały znormalizowane względem stężenia białka metodą Bradforda, poddane transformacji logarytmicznej oraz odcięciu minimalnych zaobserwowanych wartości dla każdego związku.

Wykresy PCA zostały wygenerowane z wykorzystaniem kompletnych profili metabolomicznych. Profile metabolitów mtDNA uzyskane z ekstraktów z całych much z linii natywnych i zmutowanych można porównać na wykresie PCA. Wykres PCA metabolitów z ekstraktów wzbogaconych w mitochondria wykazuje, że profile metaboliczne rozdzielają się wzdłuż osi PC2 i odzwierciedlają główne efekty działania rapamycyny. Między alternatywnymi genotypami mtDNA występują jedynie subtelne różnice.

W przeciwieństwie do tego, profile metabolitów z ekstraktów wzbogaconych w mitochondria wykazują oddzielenie natywnego genotypu M mt DNA na normalnej karmie od pozostałych trzech próbek: natywnego MTD NA na rapamycynie oraz alternatywnego MTD NA na karmie normalnej lub z rapamycyną. Sugeruje to, że wpływ alternatywnego MTD NA przesuwa profile metabolitów w sposób analogiczny do efektów leczenia rapamycyną. Podczas wykonywania tego protokołu zaleca się przeprowadzenie wszystkich ekstrakcji tego samego dnia, aby zmniejszyć zmienność między powtórzeniami.

Zalecam wcześniejsze przygotowanie planu oraz etykietowanie probówek, a także prowadzenie rejestru czasu oczekiwania między powtórzeniami, aby poprawić jakość przygotowania próbek.