Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Ogólnym celem tej techniki mikroskopowej jest wizualizacja białek, oddziaływań białkowych w skali pojedynczej cząsteczki i nanometrów. Tak więc ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kilka kluczowych pytań w dziedzinie biologii, takich jak interakcje molekularne w onkogennych procesach sygnalizacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest czuła, specyficzna i oferuje rozdzielczości pojedynczej cząsteczki i nanometrów.

Procedurę zademonstruje dr Tahan, starszy badacz związany z moim laboratorium Po sklonowaniu RZS i RAF R-B-D-P-A-M Cherry one fragmentuje pakowanie w cząsteczki wirusa i infekuje komórki U2 OS zgodnie z protokołem tekstowym. Aby przygotować próbkę do obrazowania, około 5,5 razy 10 do czwartej stabilnej komórki ekspresyjnej na studzienkę ośmiodołkowej szklanej komory dolnej, wsunąć 350 mikrolitrów DMEM wolnego od czerwieni fenolowej. Użyj świeżego paraldehydu z aldehydem glutarowym do utrwalenia komórek i po zastąpieniu utrwalacza PBS lub buforem obrazowania wiruj 100-nanometrowe cząsteczki złota i dodaj 35 mikrolitrów na studzienkę w celu śledzenia dryfu etapu podczas obrazowania.

Zbliż się do mikroskopu i włącz lasery 405 i 561 nanometrów, trzymając w tym momencie zamknięte migawki, upewnij się, że lustro dichroiczne 561 nm i filtr wycinający są na swoim miejscu. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów. Włącz aparat E-M-C-C-D i pozwól mu ostygnąć, a następnie ustaw czas ekspozycji na 100 milisekund, a wzmocnienie E-M-C-C-D na odpowiednią wartość.

Dodaj olejek immersyjny do obiektywu i zabezpiecz próbkę na stoliku mikroskopowym. Następnie, za pomocą jasnego pola lub lasera o długości fali 561 nanometrów, ustaw ostrość próbkę w celu obrazowania RZS i innych białek błonowych. Użyj obiektywu 60 x APO chromat do murawy z aperturą numeryczną 1,49 i ustaw mikroskop w konfiguracji murawy.

Wyreguluj laser wzbudzający tak, aby był wyśrodkowany po uderzeniu w tylny otwór obiektywu murawy, co spowoduje odchylenie lasera po dotarciu do bufora poślizgu nakrywkowego w twarz. Kontynuuj regulację pozycji padania lasera, aż zostanie osiągnięty krytyczny kąt, a laser zostanie odbity z powrotem. Wyszukaj komórkę do zobrazowania z kilkoma cząsteczkami złota w polu widzenia.

Następnie ustaw obszar zainteresowania, który otacza komórkę lub jej obszar i cząsteczki złota na wypadek, gdyby nastąpiła już wystarczająca aktywacja z powodu wysokiego poziomu ekspresji. Rozpocznij akwizycję z wyłączonym laserem 405 nm i włączonym laserem 561. W przeciwnym razie włącz laser 405 nm przy najniższym fabrycznym ustawieniu mocy i stopniowo zwiększaj, aż na klatkę przypadną dziesiątki cząsteczek lub tak, aby pojedyncze cząsteczki były dobrze oddzielone.

W miarę kontynuowania zbierania danych stopniowo zwiększaj moc lasera 405 nanometrów, aby utrzymać gęstość plamki na mniej więcej stałym poziomie. Kontynuuj akwizycję obrazu do osiągnięcia wysokiego poziomu 4 0 5. Moc już się nie inicjuje.

Zdarzenia aktywacji kończą się w celu przetworzenia obrazów. Pobierz oprogramowanie do przetwarzania obrazu. Otwórz MATLAB i załaduj oprogramowanie do odczytu WFI.

Wyświetl sekwencję surowego obrazu i określ obszar zainteresowania lub ROI, wybierz obszar stosu do przetworzenia, klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając ramkę wokół żądanego obszaru. Jeśli obszar zainteresowania nie został zmniejszony podczas akwizycji, wybierz mniejszy obszar, aby skrócić czas obliczeń, aby usunąć zaznaczenie obszaru i przetworzyć całą klatkę prawym przyciskiem myszy Kliknij w dowolnym miejscu obrazu obok, aby zdefiniować zestaw znaczników powierniczych, takich jak nanocząstki złota wchłonięte na szkiełku okładkowym, które są dobrze odizolowane, jednolite i mają kształt oraz są obecne w polu widzenia w całym stosie obrazów. Zacznij od wybrania potencjalnej cząsteczki złota, klikając lewym przyciskiem myszy na jej obrazie i przeciągając wokół niej małe pole.

W sekcji Śledzenie cząstek kliknij przycisk śledzenia. Pojawi się wykres pokazujący położenie wybranej cząstki złota w stosie obrazów przedstawiających zakres dryfu. Powtórz ten proces, aby śledzić jak najwięcej cząstek złota i określić cząstki, które podążają razem. Idealnie.

Całkowity dryf wynosi co najwyżej 0,1 magnitudo, pojedynczo. Wybierz cząsteczki złota, które śledziły razem i pod śledzeniem cząstek. Kliknij przycisk dodawania znacznika.

Pojawi się zielony krzyżyk oznaczający, że cząstka została dodana jako znacznik i zostanie użyta do skorygowania dryfu. W razie potrzeby dostosuj zakres wygładzania zakresu sigma i próg, nieznacznie zmieniając wartość. Kliknij przycisk znajdź cząstkę, aby przetestować ustawienia i wizualnie sprawdzić cząstki procesu, takie jak cząsteczki wiśni PAM, które są stosunkowo okrągłe i jasne, zostaną zapakowane, a te, które nie są, zostaną pominięte.

Aby rozpocząć przetwarzanie obrazów, kliknij przycisk Utwórz plik przewodu i zapisz plik pod żądaną nazwą, aby przetworzyć obrazy i wyrenderować obraz dłoni. Uruchom pakiet palm w MATLAB, załaduj właśnie utworzony plik z kropką. Naturalnie renderowany obraz pojawi się w polu obrazu obok przycisków sterujących.

Posortuj poszczególne współrzędne przy użyciu następujących typowych wartości. W przypadku PAM Cherry jeden, sumowanie klatki równa się osiem. Sumowanie odległości w nanometrach równa się 100, minimalna wartość RMS równa się cztery.

Minimalna wartość dopasowania wynosi 0,25, a maksymalna mimośrodowość wynosi 1,4. Kliknij przycisk sortowania, aby wygenerować nowy zestaw wyselekcjonowanych współrzędnych gotowych do renderowania obrazów w wysokiej rozdzielczości. Wprowadź wartości zapewniające prawidłowe renderowanie obrazu końcowego, takie jak rozmiar nieprzetworzonego piksela, ponieważ wcześniej określono żądany rozmiar elementu w renderowanym obrazie, który zwykle jest ustawiony na wartość nieco wyższą niż średnia lokalizacja i rozmiar piksela, taki jak 10 nanometrów.

W przypadku renderowanego obrazu kliknij przycisk renderowania, aby wygenerować obraz dłoni. Następnie użyj ikon powiększania plus i minus na pasku narzędzi okna rysunku, aby powiększać i pomniejszać, aby śledzić pojedyncze cząsteczki w żywych komórkach. Potraktuj powierzchnię hodowli tkankowej i płytki komórek zgodnie z opisem wcześniej w tym filmie.

Upewnij się, że szkło nakrywkowe ma odpowiednią grubość do mikroskopii ustawionej Po przecięciu komórek i wykonaniu wszelkich zabiegów i inkubacji potrzebnych do eksperymentu, umieść szalkę hodowlaną w inkubatorze na etapie eksperymentu. Pozostaw naczynie na scenie, aby osiadło na scenie przez kilka minut, aż temperatura i stężenie CO2 ustabilizują się na tym etapie. Zablokuj lasery.

Jeśli kontrola CO2 nie jest dostępna, zmień na medium niezależne od CO2 tuż przed obrazowaniem, takie jak L 15 firmy Leibovitz, aby obniżyć fluorescencję tła, w końcu uzyskaj obrazy, jak pokazano wcześniej, ustawiając odpowiedni czas ekspozycji, aby zapewnić dobry stosunek sygnału do szumu bez utraty rozdzielczości czasowej. Dłoń BFC na tym rysunku to mutant KRAS G 12 D oddziałujący z domeną wiążącą RA lub RBD CRAF. Każda z czterech pokazanych tutaj kombinacji została wprowadzona do komórek U2 OS przy użyciu komórek infekcji lentiwirusowej, przy czym dwie konfiguracje miały silne dodatnie sygnały BFC, co zidentyfikowano po nagłym wzroście fluorescencji, gdy laser 405 nm został włączony z powodu fotoaktywacji BFC odtworzonego PAM Cherry, jak wykazano tutaj, przy użyciu tych samych ustawień eksperymentalnych, co w przypadku rodzica PAM Cherry.

Silny sygnał BFC został wygenerowany po zakażeniu RN R i RAF RBD RC. Tutaj RN i RC oznaczają odpowiednio końcowy fragment n i C PAM Cherry po powiększeniu pojedynczych cząsteczek, a ich rozkład przestrzenny w nanoskali można wyraźnie zobaczyć w tym eksperymencie, w którym przeprowadzono śledzenie pojedynczej cząsteczki w celu uzyskania trajektorii dyfuzji poszczególnych RZS. Kompleksy RBD RAF pod ciągłym oświetleniem za pomocą laserów o długości 561 nanometrów i 405 nanometrów. Indywidualne cząsteczki PA m wiśni st.

Włącz i wytrzymaj kilka klatek, zanim wejdziesz w ciemne stany, w których okaże się, że są nieruchome lub mobilne. Ten wykres nagrań dla wielu molekuł wyraźnie ilustruje oba typy trajektorii. Ten sam niejednorodny rozkład stanów dyfuzji można wywnioskować z histogramu przemieszczenia cząsteczki pomiędzy kolejnymi ramkami Opanowana masa.

Technikę tę można wykonać w ciągu jednego do trzech tygodni, w zależności od tego, czy konstrukty są transcendentalne, transfekowane czy stabilnie uciskane, jeśli są wykonywane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przygotowaniu elementów sterujących, takich jak zmutowany Putin, w którym brakuje interakcji zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak analiza skupień, mogą być wykonane w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak: w jaki sposób interakcje białek są zorganizowane przestrzennie w komórce?

W przypadku śledzenia komórek laboratoryjnych, bazy ewaluacyjnej, śledzenia pojedynczych cząstek można przeprowadzić w celu określenia stanów dyfuzji i prawdopodobieństwa przejścia po ich rozwoju. Technika ta jest stosowana w naszym laboratorium w dziedzinie biologii nowotworów do badania interakcji popędu RZS, a także homo i izacji receptorów jej rodziny w ludzkich komórkach nowotworowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaprojektować i wdrożyć biopsję dłoni w celu zbadania interesującej interakcji białkowej.

Nie zapominaj, że praca z programem antywirusowym i komórkami nowotworowymi może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak standardowe protokoły bezpieczeństwa biologicznego, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.