Name: Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Poznaj technikę BiFC-PALM do wizualizacji interakcji białkowych Ras-Raf w komórkach U2OS z rozdzielczością nanometryczną. Ta metoda pozwala badać szlaki sygnałowe związane z nowotworami na poziomie pojedynczych cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują doktorom Stevenowi Chu i Joe W. Grayowi za pomocne dyskusje, Henry'emu Marrowi za jego początkową pracę nad projektem BiFC-PALM oraz Alexis Shoemaker za pomoc techniczną. Prace te są wspierane przez fundusze startowe dla X.N. z OHSU. Badania w laboratorium Nan były również wspierane przez NIH 5U54CA143836-05, Fundację Badań nad Rakiem Damona Runyona, M. J. Murdock Charitable Trust oraz firmę FEI.

<ol><li>Braun, P., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+protein-protein+interactions%3A+From+egg-white+to+complex+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).</li>
<li>Lasserre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raft+nanodomains+contribute+to+Akt%2FPKB+plasma+membrane+recruitment+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation.</a> Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li>
<li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29%3A+a+5-year+update+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53, 285-298 (2012).</li>
<li>Lingwood, D., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Rafts+As+a+Membrane-Organizing+Principle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle.</a> Science. 327 (5961), 46-50 (2009).</li>
<li>Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+nanoswitches+generate+high-fidelity+Ras+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivated+Localization+Microscopy+with+Bimolecular+Fluorescence+Complementation+%28BiFC-PALM%29+for+Nanoscale+Imaging+of+Protein-Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells.</a> PloS one. 9 (6), e100589(2014).</li>
<li>Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking+photoactivated+localization+microscopy+for+mapping+single-molecule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics.</a> Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).</li>
<li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+complementation%3A+an+emerging+tool+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).</li>
<li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+human+cell+lines+with+Tetracycline-inducible+%28Tet-on%29+shRNA+or+cDNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+March%22%5BJournal%5D)">Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression.</a> J. Vis. Exp. March. (73), e50171(2013).</li>
<li>Robida, A. M., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+of+inducible+protein+interactions%3A+effects+of+factors+affecting+protein+folding+on+fluorescent+protein+fragment+association%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association.</a> J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+biosensors+based+on+dimerization-dependent+fluorescent+protein+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange.</a> Nat. Methods. 12 (3), (2015).</li>
<li>Seidman, C. E., Struhl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D(2001).</li>
<li>Morrison, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+frozen+bacterial+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preparing frozen bacterial stocks.</a> Curr. Protoc. Immunol. Coligan, J. E., et al. Appendix 3, Appendix 3M(2001).</li>
<li>Campeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+viral+system+for+expression+and+depletion+of+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells.</a> PloS One. 4 (8), e6529(2009).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).</li>
<li>Deschout, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precisely+and+accurately+localizing+single+emitters+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).</li>
<li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li>
<li>Chenouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+comparison+of+particle+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).</li>
<li>Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+intracellular+diffusive+states+and+transition+rates+from+single-molecule+tracking+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data.</a> Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+and+tracking+of+protein%E2%80%93protein+interactions+in+sub-diffraction+cellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space.</a> Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).</li>
<li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+reveals+structural+features+of+EB1+in+microtubule+plus-end+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking.</a> Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

BiFC jest powszechnie stosowaną techniką wykrywania i wizualizacji IPP w komórkach, podczas gdy PALM jest najnowszą techniką mikroskopii superrozdzielczej pojedynczej cząsteczki, która umożliwia obrazowanie w nanoskali nienaruszonych próbek biologicznych. Połączenie BiFC z PALM pozwoliło na uzyskanie selektywnego obrazowania IPP wewnątrz komórki z nanometrową rozdzielczością przestrzenną i czułością pojedynczej cząsteczki. BiFC-PALM rozszerza użyteczność obu technik i, jak wykazano w niniejszej pracy, jest bardzo obiecuj...

Interakcje białko-białko (PPI) są fundamentalne dla biologii1 i są ściśle regulowane przez mechanizmy czasoprzestrzenne w wielu skalach czasowych i długotrwałych. Na przykład badania nad sygnalizacją komórkową na błonie komórkowej ujawniły dynamiczne, przestrzenne przedziały w nanoskali, które ułatwiają tworzenie określonych IPP i procesów komórkowych2. W związku z tym zdolność do sondowania IPP w systemach biologicznych z wystarczającą rozdzielczością przestrzenną i czasową, wysoką specyficznością i wysoką czułością jest kluczem do osiągnięcia mechanistycznego zrozumienia biologii.
Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencyjna (BiFC) jest jednym z niewielu istniejących narzędzi do wizualizacji IPP w komórce o rozdzielczości subkomórkowej i kompatybilności z żywymi komórkami3–5. Technika jest stosunkowo prosta i polega na rozszczepieniu białka fluorescencyjnego na dwa niefluorescencyjne fragmenty; Po genetycznym przyznaczeniu do dwóch oddziałujących białek i zbliżeniu się do siebie, fragmenty mogą się odtworzyć, tworząc kompletne białko fluorescencyjne, dając sygnał fluorescencyjny. Prawidłowo zaprojektowane sondy BiFC nie powinny samoistnie odtwarzać się w przypadku braku IPP. W związku z tym sygnał fluorescencyjny w teście BiFC pojawi się tylko w obecności IPP, co umożliwia bezpośrednią wizualizację IPP o wysokiej swoistości. Dodatkowe korzyści płynące z zastosowania fluorescencji jako odczytu to między innymi wysoka czułość, rozdzielczość subkomórkowa oraz kompatybilność z testami przesiewowymi o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości. Aby uzyskać te korzyści, opracowano szereg sond BiFC opartych na różnych macierzystych białkach fluorescencyjnych. Podobnie jak w przypadku wszystkich innych technik detekcji opartych na konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, rozdzielczość przestrzenna BiFC jest ograniczona do ~250 nm przez dyfrakcję światła. To sprawia, że wyzwaniem jest badanie regulacji IPP w nanoskali, która, jak wspomniano wcześniej i czego przykładem są tratwy lipidowe6 i nanoklastry Ras7, jest krytyczną skalą długości dla zrozumienia wielu procesów komórkowych, takich jak sygnalizacja.
BiFC został połączony z mikroskopią lokalizacyjną aktywowaną fotoaktywowaną (PALM)8,9, aby pokonać to ograniczenie w rozdzielczości przestrzennej dla obrazowania PPI10. PALM to najnowsza technika mikroskopii superrozdzielczej, która omija granicę dyfrakcji w obrazowaniu fluorescencyjnym poprzez stochastyczną aktywację i subdyfrakcyjną lokalizację pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych. W każdym cyklu aktywacji cząsteczka fluorescencyjna emituje od kilkuset do kilku tysięcy fotonów i powoduje powstanie obrazu pojedynczej cząsteczki na detektorze. Chociaż obraz jest ograniczony dyfrakcją (~250 nm szerokości), jego środek ciężkości można określić ze znacznie większą precyzją, zwykle rzędu 10-50 nm w zależności od liczby wykrytych fotonów. Poprzez aktywację i lokalizację każdej cząsteczki fluorescencyjnej w próbce, można zrekonstruować obraz o wysokiej rozdzielczości. Prowadzony na żywych komórkach system śledzenia pojedynczych cząsteczek (smt-) PALM pozwala ponadto na uzyskanie tysięcy trajektorii dyfuzji białek z pojedynczej komórki11. Co ważne, PALM wykorzystuje specjalistyczne sondy fluorescencyjne, takie jak fotoaktywowane białka fluorescencyjne (PA-FP), aby osiągnąć aktywację stochastyczną. Ponieważ zarówno BiFC, jak i PALM wykorzystują białka fluorescencyjne, połączono je poprzez rozszczepienie PAmCherry1, powszechnie stosowanego PA-FP dla PALM, na dwa fragmenty między aminokwasami 159 i 160.
System BiFC oparty na podzielonym PAmCherry1 pokazuje niski sygnał tła z spontanicznej rekonstytucji dwóch fragmentów. Po genetycznym przypisaniu do pary oddziałujących białek, dwa fragmenty (RN = reszty 1-159; RC = Met + reszty 160-236) skutecznie odtworzone w celu wytworzenia kompletnych białek PAmCherry1 nawet w temperaturze 37 °C i bez inkubacji w niższych temperaturach, co nie ma miejsca w przypadku innych par BiFC12, takich jak macierzysty mCherry13. Co więcej, odtworzone białko PAmCherry1 zachowało właściwości fotofizyczne macierzystego białka PAmCherry1, takie jak między innymi wysoki współczynnik kontrastu, średnia wydajność fotonów i szybka fotoaktywacja, które mają kluczowe znaczenie dla dokładnej lokalizacji pojedynczej cząsteczki i obrazowania PALM w wysokiej rozdzielczości.
W tym protokole opisane jest użycie BiFC-PALM do obrazowania interakcji Ras-Raf w komórkach U2OS za pomocą podzielonego PAmCherry1 (Rysunek 1A). Pierwszym krokiem jest zaprojektowanie konstruktów do ekspresji białek fuzyjnych między fragmentami PAmCherry1 (tj. RN i RC) a białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Teoretycznie dla każdej pary białek kandydujących (A i B) do zbadania przypada osiem par białek fuzyjnych: RN-A/RC-B; RN-A/B-RC; RC-A/RN-B; RC-A/B-RN; A-RN/RC-B; A-RN/B-RC; A-RC/RN-B; oraz A-RC/B-RN. Proces ten można często uprościć, biorąc pod uwagę właściwości strukturalne lub biochemiczne białek kandydujących. W przypadku Ras białko jest modyfikowane potranslacyjnie w C-końcowym pudełku CAAX (C=Cys; A=alifatyczny; X=dowolny), po czym motyw AAX jest odcinany. W związku z tym RN lub RC mogą być połączone tylko z N-końcem Ras; zmniejsza to liczbę par białek fuzyjnych do czterech (ryc. 1B). W przypadku Raf używana jest domena wiążąca Ras (RBD; reszty 51-131), która może być oznaczona na obu końcach. Wygenerowano te cztery konfiguracje fuzji: RN-KRas/RC-Raf RBD; RN-KRas/Raf RBD-RC; RC-KRas/RN-Raf RBD; oraz RC-KRas/Raf RBD-RN.
Dodatkowo, konieczne będzie rozważenie łącznika między fragmentami a białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Często stosuje się elastyczny łącznik składający się z około dziesięciu aminokwasów, ponieważ zapewnia on wystarczającą swobodę do wystąpienia komplementacji. Jednym z takich linkerów jest (GGGGS)x2, chociaż istnieje wiele innych, które zostały z powodzeniem zastosowane, w tym losowe sekwencje generowane z wielu miejsc klonowania (MCS)14. Długość łączników może wymagać optymalizacji w zależności od wielkości badanych białek i ich orientacji podczas interakcji.
Fragmenty PAmCherry1 są zawarte w małym szkielecie klonowania z flankującymi MCS-ami (zobacz Lista materiałów). Interesujące geny można wprowadzać za pośrednictwem miejsc restrykcyjnych lub metodą niezależną od podwiązania. Po sklonowaniu i weryfikacji sekwencji, kaseta ekspresji jest przenoszona do wektora ekspresji za pomocą reakcji rekombinazy, procesu klonowania o wysokiej wierności i wysokiej wydajności.
Następnie, wynikowe konstrukcje wyrażeń są transfekowane do docelowej linii komórkowej lub, jeśli pożądana jest stabilna linia komórkowa, pakowane w lentiwirusa w celu zainfekowania docelowej linii komórkowej. Transfekcja przejściowa pozwala na szybką walidację konfiguracji BiFC, ale należy zwrócić uwagę na potencjalne problemy. Transfekcja przy użyciu chemikaliów często obciąża komórki, powodując wysoką autofluorescencję; podczas gdy zastosowanie mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) może złagodzić ten sygnał tła poprzez ograniczenie objętości oświetlenia, TIRF jest idealny, gdy IPP zachodzą na błonie komórkowej. Dodatkowo, przejściowe transfekcje często prowadzą do wysokich poziomów ekspresji białek, znacznie przekraczających poziomy białek endogennych, co może powodować artefakty w wykrywaniu IPP. W związku z tym zaleca się ustanowienie stabilnych linii komórkowych po ustaleniu odpowiedniej konfiguracji BiFC w wyniku wstępnych testów. Stabilne linie komórkowe mają również potencjał do przestrajalnej ekspresji poprzez indukcję doksycykliny15.
Po infekcji, komórki są selekcjonowane antybiotykami, zazwyczaj puromycyną i neomycyną, po jednym dla każdego konstruktu. Kolejne etapy przygotowania próbki, akwizycji obrazu i analizy danych zostaną szczegółowo opisane w protokołach.
Dzięki takiemu podejściu, rutynowo obserwuje się tworzenie nanoskalowych klastrów na obrazach BiFC-PALM RBD Ras-Raf (Rysunek 2A). Konsekwentnie, trajektorie smt-PALM RBD Ras-Raf wykazują niejednorodny rozkład w stanach dyfuzji (Rysunek 2B-D). Wyniki te sugerują, że kompleksy Ras-Raf istnieją w wielu stanach na błonie komórkowej, prawdopodobnie jako monomery i klastry, z potencjalnymi implikacjami biologicznymi. Praca ta demonstruje moc BiFC-PALM w selektywnym obrazowaniu IPP w komórkach o nanometrowej rozdzielczości przestrzennej i czułości pojedynczej cząsteczki, co byłoby trudne do uzyskania przy użyciu konwencjonalnego BiFC, kolokalizacji fluorescencji lub transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET).
Podczas projektowania eksperymentów BiFC i interpretacji wyników, ważne jest, aby pamiętać, że proces BiFC jest nieodwracalny w większości przypadków, w tym w podziale PAmCherry1. Gdy te dwa fragmenty połączą się i utworzą kompletne białko PAmCherry1, połączenie między dwoma fragmentami, a tym samym PPI, staje się trwałe. Ogranicza to stosowanie BiFC i BiFC-PALM do monitorowania dynamiki IPP (tj. kinetyki wiązania, a nie dynamiki dyfuzji kompleksu białkowego po jego utworzeniu), a czasami może nawet prowadzić do nieprawidłowej lokalizacji kompleksów IPP.
Dodatkowym czynnikiem do rozważenia przy projektowaniu eksperymentów BiFC-PALM jest opóźnienie w dojrzewaniu chromoforu, które jest nieodłącznym elementem białek fluorescencyjnych. Gdy dwa białka wchodzą w interakcję i fragmenty FP łączą się, zazwyczaj ponownie się składają w ciągu kilku sekund (czas połowicznego zaniku 60 sekund dla EYFP3). Jednak późniejsze dojrzewanie chromoforu i sygnał fluorescencyjny rozwijają się rzędu minut. Podczas gdy fluorescencja może być wykrywalna w ciągu 10 minut po odtworzeniu rozszczepionej Wenus, szybko składającego się wariantu YFP, czas połowicznego dojrzewania wynosi często około 60 minut16. Zaobserwowano, że Split-PAmCherry1 ma podobne wskaźniki. W związku z tym BiFC i BiFC-PALM są obecnie złym wyborem do monitorowania kinetyki PPI w czasie rzeczywistym; inne metody, takie jak FRET i niedawno opracowane białko fluorescencyjne17 zależne od dimeryzacji, mogą być bardziej odpowiednie do tego celu.

<table><tbody><tr><td>Ramka mikroskopu</td><td>Nikon</td><td>Ti-U 60X</td><td></td></tr><tr><td>zanurzeniowy w oleju Obiektyw TIRF z 1,49 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo TIRF 60x H</td><td></td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Laser Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>561 nm</td><td>Opto Engine</td><td>MGL-FN-561</td><td></td></tr><tr><td>405 nm laser</td><td>Coherent</td><td>CUBE-405 50mW</td><td></td></tr><tr><td>561 nm lustro</td> <td>dichroiczneSemrock</td><td>&nbsp; Di01-R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 561 nm</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/45-25</td><td></td></tr><tr><td>405/561 nm filtr wycinający</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/568-25</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura i CO2 stopień kontrolowany</td><td>Tokai Hit</td><td>INUBG2ATW-PLAM</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS</td><td>Addgene</td><td>60545</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS</td><td>Addgene</td><td>60546</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.2-DEST</td><td>Life Technologies</td><td>12489-019</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-DEST</td><td>Addgene</td><td></td><td>http://www.addgene.org/Eric_Campeau/</td></tr> <tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-531</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD Klonowanie</td><td>Clontech</td><td>639649</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase</td><td>Life Technologies</td><td>11791</td><td></td></tr><tr><td>Vira Power Lentivirus Packaging</td><td>Life Technologies</td><td>K497500</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji X-tremeGENE</td><td>Roche</td><td>13873800</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Komorowe szkło nakrywkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409</td><td>#1,5 szklane dno</td></tr><tr><td>Ogniwa U2OS Ogniwa</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>293T/17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM z czerwienią fenolową</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Life Technologies</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Leibovit's L-15, bez czerwieni fenolowej</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowana surowica</td><td>Technologie życia</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td> Life <td>Technologies</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Koncentrator Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral</td><td>Clontech</td><td>631231</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator retrowirusowy</td><td>Clontech</td><td>631455</td><td></td></tr><tr><td>10 cm kultura danie</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>hodowlana BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>Calbiochem</td><td>345812</td><td>Neomycyna</td></tr><tr><td>Doksycylina</td><td>Fisher</td><td>BP2653</td><td></td></tr><tr><td>Baza</td> <td>TrisFisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>100 nm cząsteczki złota</td><td>BBI Solutions</td><td>EM. GC100</td><td></td></tr><tr><td>Woda molekularna</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Midiprep</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>0,6 ml probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Probówki okrągłodenne z polipropylenu o pojemności 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>14 ml probówki okrągłodenne z polipropylenu</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Probówka PCR</td><td>GeneMate</td><td>C-3328-1</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Fisher</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Kompetentne komórki</td><td>Life Technologies</td><td>C4040</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (bifc-palm)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Interakcje białko-białko (PPI) są kluczowymi zdarzeniami molekularnymi dla biologii. Wyzwaniem pozostaje jednak wizualizacja IPP z wystarczającą rozdzielczością i czułością w komórkach, ponieważ rozdzielczość konwencjonalnej mikroskopii świetlnej jest ograniczona dyfrakcją do ~250 nm. Łącząc dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną (BiFC) z mikroskopią lokalizacji aktywowanej fotoaktywem (PALM), można wizualizować IPP w komórkach z czułością pojedynczej cząsteczki i nanometrową rozdzielczością przestrzenną. BiFC jest powszechnie stosowaną techniką wizualizacji IPP z kontrastem fluorescencyjnym, która polega na rozszczepieniu białka fluorescencyjnego na dwa niefluorescencyjne fragmenty. PALM to najnowsza technika mikroskopii superrozdzielczej do obrazowania próbek biologicznych w skali nanometrowej i pojedynczej cząsteczki, która wykorzystuje fototransformowalne sondy fluorescencyjne, takie jak fotoaktywowane białka fluorescencyjne (PA-FP). BiFC-PALM został zademonstrowany przez rozszczepienie PAmCherry1, PA-FP kompatybilnego z PALM, ze względu na jego monomeryczną naturę, dobrą jasność pojedynczej cząsteczki, wysoki współczynnik kontrastu i użyteczność do pomiarów stechiometrycznych. Po rozdzieleniu na aminokwasy 159 i 160, PAmCherry1 można przekształcić w sondę BiFC, która skutecznie odtwarza się w temperaturze 37 °C z wysoką swoistością dla IPP i niską rekonstytucją nieswoistą. Oddziaływanie Ras-Raf jest używane jako przykład, aby pokazać, w jaki sposób BiFC-PALM pomaga badać interakcje w skali nanometrowej i z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki. Ich dyfuzję można również śledzić w żywych komórkach za pomocą śledzenia pojedynczych cząsteczek (smt-) PALM. W tym protokole omówiono czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania białek fuzyjnych dla BiFC-PALM, wyjaśniono etapy przygotowania próbki, akwizycji obrazu i analizy danych, a także przedstawiono kilka przykładowych wyników. Zapewniając wysoką rozdzielczość przestrzenną, swoistość i czułość, BiFC-PALM jest użytecznym narzędziem do badania IPP w nienaruszonych próbkach biologicznych.

Przedstawiony przykład BiFC-PALM obejmuje oddziaływanie mutantu KRas G12D z domeną wiążącą Ras (RBD) białka CRaf (Rycina 1A). Jak omówiono wcześniej, fragmenty RN lub RC nie zostały przyłączone do końca C Ras, ponieważ mogłoby to zakłócić lokalizację błonową, a tym samym aktywność biologiczną Ras. Ograniczyło to liczbę możliwych kombinacji z ośmiu do czterech (Rycina 1B). Każda z tych czterech kombinacji została wprowadzona do komórek U2OS za pomocą infekcji lentiwirusowej. Komórki utrwa...

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Ogólnym celem tej techniki mikroskopowej jest wizualizacja białek oraz oddziaływań białkowych w skali pojedynczych cząsteczek i nanometrów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii, takie jak analiza oddziaływań molekularnych w procesach sygnalizacji onkogennej. Główną zaletą tej techniki jest jej czułość, swoistość oraz oferowana rozdzielczość w skali nanometrowej i pojedynczych cząsteczek.Procedury zaprezentuje dr Tahan, starszy asystent badawczy w moim laboratorium. Po sklonowaniu fragmentów RAs i RAF R-B-D-P-A-M Cherry oraz ich opakowaniu w cząsteczki wirusowe i zainfekowaniu komórek U2 OS zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować próbkę do obrazowania. Do każdej studni ośmiostudziennego szkiełka przedmiotowego z dnem szklanym należy nanieść około 5,5 × 10⁴ komórek ze stabilną ekspresją w 350 µL DMEM bez czerwieni fenolowej. Do utrwalenia komórek należy użyć świeżego paraldehydu z glutaraldehydem, a po zastąpieniu utrwalacza buforem PBS lub buforem do obrazowania, należy zawirrować 100 nm cząsteczki złota i dodać 35 µL na studnię w celu śledzenia dryfu stolika podczas obrazowania.Podejdź do mikroskopu i włącz lasery o długoś

photoactivated-localization-microscopy-with-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Subkomórkowa lokalizacja białek jest kluczowa dla określenia czasowo-przestrzennej regulacji sygnalizacji komórkowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) jako prostą metodę monitorowania przestrzennych oddziaływań białek w komórce.

Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Opisujemy metodę lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie na mikrografiach elektronowych. Najpierw lokalizacja fluorescencji odbywa się przy użyciu mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej foto-indukcyjnie na ultracienkich przekrojach. Następnie obrazy te są dopasowywane do mikrografii elektronowych tego samego przekroju.

Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Ten film opisuje BiFC-PALM ― połączenie fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej i dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji ― do oceny interakcji białko-białko. BiFC polega na fuzji dwóch fluorescencyjnych fragmentów białek z dwoma oddziałującymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, fragmenty są zbliżane do siebie, co pozwala obu częściom połączyć się i odtworzyć funkcjonalne białko fluorescencyjne. Fluorescencja pojedynczego fluoroforu...

Mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej sprzężona z fluorescencją fluorescencji bimolekularnej

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Przedstawiamy protokół zastosowania interferometrycznej mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (iPALM), 3-wymiarowej metody mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w super rozdzielczości, do obrazowania cytoszkieletu aktynowego w przylegających komórkach ssaków. Takie podejście umożliwia opartą na świetle wizualizację cech strukturalnych w nanoskali, które w przeciwnym razie pozostałyby nierozwiązane przez konwencjonalną mikroskopię optyczną z ograniczoną dyfrakcją.

Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM)

Konwencjonalne koniugaty BODIPY mogą być używane do mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek żywych komórek (SMLM) poprzez wykorzystanie ich przejściowo tworzących, przesuniętych ku czerwieni dimerów stanu podstawowego. Przedstawiamy zoptymalizowany protokół SMLM do śledzenia i rozpoznawania subkomórkowych obojętnych lipidów i kwasów tłuszczowych w żywych komórkach ssaków i drożdży w nanoskopowej skali długości.

Konwencjonalne koniugaty BODIPY do mikroskopii superrozdzielczej żywych komórek i śledzenia pojedynczych cząsteczek

Tworzenie właściwej sieci sarkomerowej jest ważne dla dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Przedstawiamy podejście oparte na super rozdzielczości, które pozwala na ilościową ocenę strukturalnego dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, w celu poprawy warunków hodowli sprzyjających rozwojowi serca.

Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek

Poznaj technikę BiFC-PALM do wizualizacji interakcji białkowych Ras-Raf w komórkach U2OS z rozdzielczością nanometryczną. Ta metoda pozwala badać szlaki sygnałowe związane z nowotworami na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Przeglądaj więcej filmów