Name: Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę analizy konfokalnej do wizualizacji dyfuzji ligandów w nabłonku Xenopus laevis. Technika ta pozwala badać modulatory gradientów morfogenicznych Wnt i Shh w rozwoju zarodkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu BBSRC dla MEP (BB/H010297/1), stypendium BBSRC dla SAR oraz stypendium MRC dla SWF.

<ol><li>Shen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling%3A+developmental+roles+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling: developmental roles and regulation.</a> Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).</li>
<li>Shimmi, O., Newfeld, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+extracellular+and+post-translational+regulation+of+TGF-beta+family+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways.</a> J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Pownall, M. E., Isaacs, H. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPownall%2C+ME+%22FGF+Signalling+in+Vertebrate+Development%22">FGF Signalling in Vertebrate Development</a>. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127 (3), 469-480 (2006).</li>
<li>Ingham, P. W., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+in+animal+development%3A+paradigms+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles.</a> Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).</li>
<li>Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+hundred+years+of+positional+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">One hundred years of positional information.</a> Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).</li>
<li>Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics%2C+spatial+range%2C+and+transcriptional+interpretation+of+the+Dorsal+morphogen+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).</li>
<li>Erickson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+morphogen+gradients%3A+an+essential+role+for+the+endomembrane+system+in+Drosophila+melanogaster+wing+development%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development.</a> Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).</li>
<li>Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+signalling+in+the+developing+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gradients of signalling in the developing limb.</a> Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).</li>
<li>Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+vertebrate+neural+tube%3A+a+sonic+hedgehog+morphogen-regulated+transcriptional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network.</a> Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).</li>
<li>Briscoe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx2.2+and+specification+of+neuronal+identity+by+graded+Sonic+hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling.</a> Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).</li>
<li>Ribes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sonic+Hedgehog+signaling+dynamics+specify+floor+plate+and+ventral+neuronal+progenitors+in+the+vertebrate+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube.</a> Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).</li>
<li>Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+regulation+of+developmental+cell+signaling+by+XtSulf1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1.</a> Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).</li>
<li>Tao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+wnt11+activates+the+canonical+wnt+signaling+pathway+required+for+axis+formation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos.</a> Cell. 120 (6), 857-871 (2005).</li>
<li>Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notochord-derived+Shh+concentrates+in+close+association+with+the+apically+positioned+basal+body+in+neural+target+cells+and+forms+a+dynamic+gradient+during+neural+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning.</a> Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).</li>
<li>Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulf1+influences+the+Shh+morphogen+gradient+during+the+dorsal+ventral+patterning+of+the+neural+tube+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis.</a> Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).</li>
<li>Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulf1+has+ligand+dependent+effects+on+canonical+and+non-canonical+WNT+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling.</a> Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).</li>
<li>Dytham, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDytham%2C+C+%22Choosing+and+using+statistics+%3A+A+biologist%27s+guide%22">Choosing and using statistics : A biologist's guide</a>. , Blackwell publishing. Oxford. (2005).</li>
<li>Fay, M. P., Proschan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wilcoxon-Mann-Whitney+or+t-test%3F+On+assumptions+for+hypothesis+tests+and+multiple+interpretations+of+decision+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Surveys%22%5BJournal%5D)">Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules.</a> Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).</li>
<li>Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xwnt-8%2C+a+Xenopus+Wnt-1+%2Fint-1-related+gene+responsive+to+mesoderm-inducing+growth+factors%2C+may+play+a+role+in+ventral+mesodermal+patterning+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis.</a> Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).</li>
<li>Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+classes+and+functional+domains+of+Wnts+through+expression+of+wild-type+and+chimeric+proteins+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).</li>
<li>Tada, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xwnt11+is+a+target+of+Xenopus+Brachyury%3A+regulation+of+gastrulation+movements+via+Dishevelled%2C+but+not+through+the+canonical+Wnt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway.</a> Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).</li>
<li>Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+long-range+movement+of+the+morphogen+Xnr2+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo.</a> Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).</li>
<li>McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+has+direct+long-range+signalling+activity+and+can+form+a+concentration+gradient+by+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion.</a> Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).</li>
<li>Chen, Y., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+Nodal+signal+Squint+functions+as+a+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen.</a> Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).</li>
<li>Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos+coincides+with+the+dorsal+enrichment+of+dishevelled+that+is+dependent+on+cortical+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation.</a> Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).</li>
<li>Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+and+Smad+signaling+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MAPK and Smad signaling during early Xenopus development.</a> Development. 129 (1), 37-52 (2002).</li>
<li>Muller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336, 721-724 (2012).</li>
<li>Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+morphogen+gradient+forms+by+a+source-sink+mechanism+with+freely+diffusing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules.</a> Nature. 461, 533-536 (2009).</li>
<li>Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+Wnt+recognition+by+Frizzled%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of Wnt recognition by Frizzled.</a> Science. 337, 59-64 (2012).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Istotną częścią tego protokołu jest generowanie biologicznie aktywnych ligandów, które są normalnie przetwarzane, wydzielane i zdolne do wywołania odpowiedzi w komórce odbiorczej, pomimo dołączonej części fluorescencyjnej. Bardzo ważne jest ustalenie, że produkt genu znakowany fluorescencyjnie jest biologicznie aktywny przy użyciu odpowiedniego testu. W przypadku Shh-GFP potwierdzono zdolność do aktywacji ekspresji ptc1 16. Wnt8a ma niezwykle silną zdolność do indukowania osi drugorzędowej, gdy ulega ...

Podczas wczesnego rozwoju embrionalnego, komórki są stopniowo zobowiązane do podążania za określonymi liniami różnicowania: oznacza to, że grupa komórek totipotencjalnych (lub pluripotencjalnych) stopniowo ogranicza się do tworzenia populacji komórek progenitorowych zdeterminowanych, aby dać początek jednemu typowi komórek. Sygnalizacja komórka-komórka ma kluczowe znaczenie dla regulacji specyfikacji linii podczas rozwoju embrionalnego. Manipulacja tymi sygnałami będzie konieczna, aby skierować komórki macierzyste w stronę określonego losu, aby wspierać nowatorskie terapie medyczne.
Stosunkowo niewielka liczba ścieżek sygnalizacyjnych jest powtarzana podczas rozwoju, w tym ścieżki reagujące na nadrodzinę TGF (węzły i BMP)1-2, FGFy3, Wnts4 i Jeże5. Te wydzielane białka wiążą receptory obecne na błonie komórkowej, aby aktywować transdukcję sygnału, zmieniając w ten sposób ekspresję genów i/lub zachowanie komórki. Ścisła regulacja sygnalizacji komórkowej jest niezbędna do specyfikacji linii komórkowej i prawidłowego rozwoju. Podczas gdy wzajemne oddziaływanie między tymi szlakami jest ważne w określaniu losu komórki, pojedynczy ligand może sam w sobie wywoływać różne odpowiedzi w różnych stężeniach. Gradienty morfogenów zostały opisane ponad 100 lat temu jako teoria wyjaśniająca, w jaki sposób różne typy komórek mogą wywodzić się z pola komórek6. Cząsteczki sygnałowe wytwarzane przez jedną grupę komórek mogą dyfundować w pewnym zakresie, zmniejszając stężenie wraz z większą odległością od źródła. Komórki wystawione na sygnał będą reagować na lokalne stężenie w swoim położeniu w polu komórek, przy czym komórki w różnych pozycjach będą reagować inaczej na różne poziomy sygnału. Dowody na istnienie morfogenów pochodzą z badań wczesnego zarodka Drosophila7 i dysku skrzydła8, a także kończyny kręgowca9 i cewy nerwowej10.
Potrzebne są metody do zbadania, w jaki sposób powstają gradienty morfogenu i zidentyfikowania innych cząsteczek ważnych w regulacji tych gradientów. Eleganckie eksperymenty wykorzystujące immunohistochemię do wizualizacji endogennych białek in vivo w kontekście różnych środowisk genetycznych zostały wykorzystane do zbadania gradientów morfogenu11-12. Jednak dobre przeciwciała i specyficzne mutanty nie zawsze są dostępne, dlatego opisujemy tutaj protokół wykorzystujący nadekspresję ligandów fluorescencyjnych w Xenopus, aby zapewnić alternatywną, prostą metodę analizy, w jaki sposób produkty genów egzogennych mogą wpływać na dystrybucję ligandów w polu komórek. Xenopus laevis stanowi doskonały system do przeprowadzania tego typu eksperymentów, ponieważ ich zarodki rozwijają się zewnętrznie, dzięki czemu są dostępne na jak najwcześniejszych etapach. Ich duży rozmiar (1-1,5 mm średnicy) upraszcza mikroiniekcję i manipulację chirurgiczną, a w stadiach blastuli komórki są łatwe do zobrazowania, ponieważ są nadal stosunkowo duże (około 20 μm średnicy). Badania nadekspresji u Xenopus są proste do przeprowadzenia: mRNA wstrzyknięte do wczesnego zarodka może być ukierunkowane na określone komórki i jest skutecznie translowane.
Fluorescencyjnie oznaczone konstrukcje Wnt8a/Wnt11b-HA-eGFP zostały wygenerowane przy użyciu pCS2 Wnt8a-HA13, pCS2 Wnt11b-HA14 i eGFP. Peptyd HA jest ważny nie tylko w celu zapewnienia dodatkowego znacznika molekularnego, ale także dlatego, że uważa się, że działa on jako przekładka oddzielająca białka Wnt i eGFP, umożliwiając funkcjonowanie obu produktów genu. Konstrukt wykorzystany do wizualizacji Shh został wcześniej wykorzystany do wygenerowania transgenicznej myszy wykazującej ekspresję białka fuzyjnego Shh-eGFP15; zostało to uprzejmie dostarczone przez Andy'ego McMahona. Co ważne, znacznik GFP dla wszystkich konstrukcji jest klonowany 3' do sekwencji sygnału, tak aby był zachowywany po przetworzeniu. Istotne jest również zapewnienie, że końcowe białko zawiera sekwencje wymagane do modyfikacji, takich jak dodanie lipidów, jak ma to miejsce w przypadku ligandów Shh i Wnt. CDNA poddano subklonowaniu do wektora ekspresyjnego pCS2+, który jest zoptymalizowany pod kątem produkcji syntetycznego mRNA; zawiera promotor SP6 i sygnał poliadenylacji (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).
Opisana tutaj praca dostarcza prostego protokołu do porównywania wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów Wnt i Shh. Poprzez wstrzykiwanie określonych ilości syntetycznego mRNA, protokół omija wszelkie problemy związane z ekspresją zmiennych z różnych wektorów przy użyciu różnych promotorów. Metody te zostały ostatnio zastosowane do zbadania wpływu endosulfatazy siarczanowej heparanu Sulf1 na wydzielanie i dyfuzję Shh-eGFP i Wnt8a/Wnt11b-HA-eGFP w Xenopus16-17.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Melford</td><td>MB 1200</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Ambion</td><td>z zestawu Megascript SP6 Zestaw AM 1330</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan</td><td>VWR International</td><td>RC-091</td><td></td></tr><tr><td>Azotan wapnia</td><td>Sigma</td><td>C13961</td><td></td></tr><tr><td>Analog kapsla (m7G(5'))</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM 8050</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C 2432</td><td></td></tr><tr><td>Jednowodny chlorowodorek L-cysteiny</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427-013</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR International</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma</td><td>F 4375</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi obraz J oprogramowanie</td><td></td><td></td><td>Darmowe pobieranie http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Melford</td><td>G 0124</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, nr 1.5&nbsp;</td><td>Materiały do laboratoriów naukowych</td><td>22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do igieł do szkła</td><td>Narishige</td><td>Narishige PC -10</td><td></td></tr><tr><td>Igły do ciągnięcia szkła</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka przewlekła gonadotropina (HCG)</td><td>Intervet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/7500/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek litu (LiCl)</td><td>Sigma</td><td>L-7026</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 i Oprogramowanie Zen (2008-2010)</td><td>Oprogramowanie Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>http://uk.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Woda klasy molekularnej&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 2819-10</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci&nbsp;</td><td>Buty</td><td>Kod kreskowy 3600530 373048</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Lab.tech International</td><td>ND-1000 / ND8000</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego (55 mm)</td><td>VWR International</td><td>391-0865</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform fenolowy</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>http://www.photoshop.com/products</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności i &nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>M0530S&nbsp; Bufor - M0531S</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>Taśma izolacyjna PVC</td><td>Onecall</td><td>SH5006MPK</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>S28704</td><td></td></tr><tr><td>enzymów restrykcyjnych</td><td>Roche</td><td>SuRE/CUT Zestaw 11082 035 001</td><td></td></tr><tr><td>DNAzyda bez RNAzowe</td><td>Promega</td><td>ME10A</td><td></td></tr><tr><td>Stalowe tylne ostrza jednokrawędziowe</td><td>Personna</td><td>66-0403-0000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji SP6</td><td>Ambion</td><td>AM1330</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Thermo Fisher</td><td>SHE 2505</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Igły</td><td></td><td></td> wolframowe <td>domowej roboty</td></tr><tr><td>oprogramowanie Zen lite</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Darmowe pobieranie&nbsp; http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie analizy konfokalnej xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych wnt i shh

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Ten protokół opisuje metodę wizualizacji ligandów rozmieszczonych w polu komórek. Łatwość ekspresji białek egzogennych, wraz z dużym rozmiarem ich komórek we wczesnych zarodkach, sprawiają, że Xenopus laevis użytecznym modelem do wizualizacji ligandów oznaczonych GFP. Syntetyczne mRNA są efektywnie przekształcane po wstrzyknięciu we wczesnym stadium Xenopus embriony, a zastrzyki mogą być ukierunkowane na pojedynczą komórkę. W połączeniu ze znacznikiem linii, takim jak RFP na uwięzi błonowej, wstrzyknięta komórka (i jej potomkowie), która wytwarza nadekspresję białka, może być łatwo śledzona. Protokół ten opisuje metodę wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie ligandów Wnt i Shh z wstrzykniętego mRNA. Metody te obejmują mikropreparację eksplantatów ektodermalnych (czapek zwierzęcych) oraz analizę dyfuzji ligandów w wielu próbkach. Za pomocą obrazowania konfokalnego można uzyskać informacje o wydzielaniu i dyfuzji ligandów w polu komórek. Analizy statystyczne obrazów konfokalnych dostarczają danych ilościowych na temat kształtu gradientów ligandów. Metody te mogą być przydatne dla badaczy, którzy chcą przetestować wpływ czynników, które mogą regulować kształt gradientów morfogenu.

Analiza konfokalna eksplantów czapy zwierzęcej zwierząt wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie stanowi skuteczny system wizualizacji rozkładu ligandów w różnych warunkach eksperymentalnych. W jednym z przykładów przedstawiono rozkład Shh znakowanego GFP (Rysunek 1). Na etapie 2 komórek do obu komórek embrionów Xenopus wstrzyknięto mRNA kontrolne lub mRNA kodujące Sulf1 – enzym modyfikujący heparan siarczan na powierzchni komórek i wpływający na gradient morfogenu Shh16</...

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest wizualizacja sekrecji i dyfuzji ligandów znakowanych fluorescencyjnie w nienaruszonym nabłonku przy użyciu ekspresji w xip pos lavis. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tworzenia się gradientów morpho, które są znane jako niezbędne w specyfikacji linii komórkowych podczas wczesnego rozwoju zarodkowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona prostą metodę wizualizacji rozkładu ligandów w nienaruszonym nabłonku.Kluczowym elementem protokołu jest generowanie biologicznie aktywnych ligandów, które są normalnie przetwarzane i wydzielane oraz zdolne do wywołania odpowiedzi w komórkach odbiorczych mimo dołączonego znacznika fluorescencyjnego. Mikroskopia konfokalna jest idealną metodą badania lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie w tkankach trójwymiarowych; zastosowanie niezależnych laserów i detektorów umożliwia precyzyjną analizę w tych złożonych typach tkanek oraz pozwala na gromadzenie wiarygodnych danych. Po przygotowaniu mRNA kodującego ligandy znakowane fluorescencyjnie i pozyskaniu embrionów XUS lavis zgodnie z opisanym protokołem, wstrzyknij mRNA wraz ze znacznikiem linii komórkowej, takim jak RFP błonowe, do pojedynczej komórki w stadium od 16 do 32 komórek; w razie potrzeby wraz z ligandem fluorescencyjnym i markerem linii można wstrzyknąć modulator, aby przeanalizować jego efekty.Czasami przydatne jest również wstrzyknięcie do sąsiedniej komórki. W tym przypadku druga komórka zostaje wstrzyknięta obok komórki wstrzykniętej wcześniej. Do jednej komórki wstrzyknięto mRNA kodujące ligand z markerem GFP oraz marker linii komórkowej, taki jak RFP błonowy, natomiast do drugiej komórki wstrzyknięto mRNA kodujące modulator i inny marker linii komórkowej, taki jak cerulean błonowy. Przenieś embriony do inkubatora ustawionego na 12,5 °C i inkubuj do etapu now kup. W stadium eight według Fabera, następnego dnia, gdy embriony osiągną stadium eight, napełnij szalki pokryte 1% agarozy NAM 2 i przenieś embriony za pomocą szklanej pipety uciętej pod kątem, używając igieł wolframowych.Wyciąć okrągłe eksplanty z bieguna zwierzęcego embrionów wstrzykniętych oraz kontrolnych, dbając o to, aby nie objąć nimi mezodermy. Przenieść eksplanty zwierzęce do szalek Petriego o średnicy 55 mm, pokrytych 1% agarozy, i inkubować embriony przez cztery godziny, aby umożliwić dojrzewanie białek fluorescencyjnych w celu uzyskania reliefu. Na szkiełka przedmiotowe nałożyć dwie warstwy izolacyjnej taśmy PVC, całkowicie je dociskając.Wytnij z taśmy prostokąt o wymiarach 14 na 10 milimetrów do montażu nasadek zwierzęcych. Następnie nanieś pipetą dwie oddzielne krople NM two na szkiełko z wgłębieniem. Następnie, używając ściętej końcówki do pipety P 20, przenieś do każdego szkiełka do 15 eksplantów zwierzęcych i za pomocą pęsety ustaw eksplanty X tak, aby strona apikalna była skierowana do góry.Używając rysika diamentowego, nacinamy szkiełko nakrywkowe, a następnie je łamiemy, aby uzyskać mniejszą nakrywkę. Aby dopasować ją do szkiełka z wgłębieniem, należy ostrożnie opuścić szkiełko nakrywkowe na szkiełko z wgłębieniem za pomocą zgiętej igły o rozmiarze 19 G, kompresując warstwę apikalną komórek czapki zwierzęcej.Użyć lakieru do paznokci, aby uszczelnić preparat, a następnie pozostawić go do wyschnięcia w ciemności przez 20 minut i wykonać obrazowanie w ciągu czterech do sześciu godzin. Aby zapewnić prawidłowy stan czapków zwierzęcych, muszą one być odpowiednio zorientowane na dedykowanych szkiełkach, a następnie przykryte szkiełkami nakrywkowymi. Należy nanosić je na szkiełka ostrożnie.Kluczowe jest, aby nie używać zbyt wielu lakierów do paznokci do uszczelniania szkiełek, ponieważ spowoduje to pomarszczenie taśmy, a w konsekwencji późniejsze przerwanie szczelności szkiełka. Po opanowaniu techniki należy wstrzyknąć około 25 embrionów, aby pobrać 20 wysokiej jakości czepek zwierzęcych na każdy badany warunek. Następnie można je poddać analizie za pomocą mikroskopii konfokalnej następnego dnia.Aby przeprowadzić obrazowanie, należy użyć obiektywu o niskim powiększeniu w celu zlokalizowania X explan. Następnie należy przełączyć na obiektyw olejowy 63 x 1.4 dla uzyskania obrazowania o wyższej rozdzielczości. Włącz wymagane lasery, w tym 405 dla MIAN, 488 dla GFP oraz 561.W przypadku MRFP należy zoptymalizować moc lasera tak, aby możliwe było wykrycie wszystkich fluoroforów. Należy użyć macierzy 32 detektorów, minimalizując przy tym wymagane napięcie i wzmocnienie, a następnie wybrać tryb Lambda oraz lasery 405 nanometrów, 488 i 561 nanometrów. Aby uzyskać szersze pole widzenia, należy pomniejszyć obraz do powiększenia 0.6 x.Następnie ustaw rozmiar ramki na pożądany rozmiar obrazu. Zapewnia to wystarczającą rozdzielczość dla analizy przy ustawieniu uśredniania od czterech do ośmiu powtórzeń w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu oraz optymalizacji otworu pinhole dla tego zestawu danych. Użyto jednej jednostki obszaru w odniesieniu do lasera 561 nanometrów, wykorzystując 405, 488 oraz 561.Lustra dichroiczne zbierają światło emitowane przez membranowy Saru, GFP oraz membranowy RFP. W tym eksperymencie światło zbierano w odstępach około 10 nm w zakresie od 415 do 720 nm. Przeprowadź analizę obrazu zgodnie z protokołem tekstowym; tutaj przedstawiono rozkład sonic hedgehog znakowanego GFP w wyjaśnionej komorze zwierzęcia w warunkach kontrolnych; sonic hedgehog GFP jest wydzielany i dyfunduje poza region wykazujący ekspresję wstrzykniętych mRNA.Jednak w obecności modulatora SULF1, Sonic Hedgehog GFP wykazuje bardziej ograniczony rozkład. W tej próbce w niewielkiej odległości od klonu komórek go produkujących widocznych jest tylko kilka ognisk Sonic Hedgehog GFP. Ten rysunek przedstawia charakterystykę dwóch ligandów Wnt znakowanych fluorescencyjnie i wstrzykniętych do komórek, zgodnie z oznaczeniami; zarówno Wnt8A i Wnt11B-HAE-GFP gromadzą się na błonie komórek czapki zwierzęcej, przy czym Wnt8A-HAE-GFP gromadzi się wydajniej niż Wnt11B. Ten rysunek pokazuje rozkład Wnt8A-HAE-GFP wyrażanego w klonie komórek znakowanych przymocowanym do błony Cerulean.Widoczna jest dyfuzja znakowanego fluorescencyjnie liganda z komórek źródłowych do otaczających komórek nabłonka. Oprogramowanie do analizy obrazu jest wykorzystywane do ekstrakcji danych dotyczących rozkładu znakowanych fluorescencyjnie ligandów wind w wielu próbkach doświadczalnych, jak pokazano tutaj. Pomiar odległości od klonu wykazującego ekspresję mem Saru oraz poziomu fluorescencji GFP pozwala określić zasięg dyfuzji wind oraz kształt gradientu.Po zmierzeniu rozkładu liganda, wynik szlaku sygnalizacyjnego można również ocenić, łącząc niniejszy protokół z innym testem w celu monitorowania odpowiedzi komórek odbiorczych. W ten sposób można podjąć próbę określenia zakresu progowego morfogenu.

using-confocal-analysis-xenopus-laevis-to-investigate-modulators-wnt

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Zewnętrzna warstwa ektodermy embrionalnej Xenopus stała się atrakcyjnym modelem do badań polaryzacji komórkowej. Opisano analizę, w której ocenia się subkomórkową dystrybucję białek fluorescencyjnych w komórkach ektodermy. Niniejszy protokół pomoże w odpowiedzi na pytania dotyczące przestrzennej kontroli sygnalizacji.

Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Ten artykuł wideo szczegółowo opisuje prostą metodologię in vivo, która może być używana do systematycznego i efektywnego charakteryzowania składników złożonych szlaków sygnałowych i sieci regulacyjnych w wielu zarodkach bezkręgowców.

Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Tutaj dostępny jest zoptymalizowany protokół krok po kroku do utrwalania, barwienia immunologicznego i sekcji zarodków w celu wykrycia wyspecjalizowanych filopodiów sygnałowych zwanych cytonemami w rozwijających się tkankach myszy.

Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu

Poznaj metodę analizy konfokalnej do wizualizacji dyfuzji ligandów w nabłonku Xenopus laevis. Technika ta pozwala badać modulatory gradientów morfogenicznych Wnt i Shh w rozwoju zarodkowym.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Przeglądaj więcej filmów