Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest wizualizacja sekrecji i dyfuzji ligandów znakowanych fluorescencyjnie w nienaruszonym nabłonku przy użyciu ekspresji w xip pos lavis. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tworzenia się gradientów morpho, które są znane jako niezbędne w specyfikacji linii komórkowych podczas wczesnego rozwoju zarodkowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona prostą metodę wizualizacji rozkładu ligandów w nienaruszonym nabłonku.

Kluczowym elementem protokołu jest generowanie biologicznie aktywnych ligandów, które są normalnie przetwarzane i wydzielane oraz zdolne do wywołania odpowiedzi w komórkach odbiorczych mimo dołączonego znacznika fluorescencyjnego. Mikroskopia konfokalna jest idealną metodą badania lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie w tkankach trójwymiarowych; zastosowanie niezależnych laserów i detektorów umożliwia precyzyjną analizę w tych złożonych typach tkanek oraz pozwala na gromadzenie wiarygodnych danych. Po przygotowaniu mRNA kodującego ligandy znakowane fluorescencyjnie i pozyskaniu embrionów XUS lavis zgodnie z opisanym protokołem, wstrzyknij mRNA wraz ze znacznikiem linii komórkowej, takim jak RFP błonowe, do pojedynczej komórki w stadium od 16 do 32 komórek; w razie potrzeby wraz z ligandem fluorescencyjnym i markerem linii można wstrzyknąć modulator, aby przeanalizować jego efekty.

Czasami przydatne jest również wstrzyknięcie do sąsiedniej komórki. W tym przypadku druga komórka zostaje wstrzyknięta obok komórki wstrzykniętej wcześniej. Do jednej komórki wstrzyknięto mRNA kodujące ligand z markerem GFP oraz marker linii komórkowej, taki jak RFP błonowy, natomiast do drugiej komórki wstrzyknięto mRNA kodujące modulator i inny marker linii komórkowej, taki jak cerulean błonowy. Przenieś embriony do inkubatora ustawionego na 12,5 °C i inkubuj do etapu now kup. W stadium eight według Fabera, następnego dnia, gdy embriony osiągną stadium eight, napełnij szalki pokryte 1% agarozy NAM 2 i przenieś embriony za pomocą szklanej pipety uciętej pod kątem, używając igieł wolframowych.

Wyciąć okrągłe eksplanty z bieguna zwierzęcego embrionów wstrzykniętych oraz kontrolnych, dbając o to, aby nie objąć nimi mezodermy. Przenieść eksplanty zwierzęce do szalek Petriego o średnicy 55 mm, pokrytych 1% agarozy, i inkubować embriony przez cztery godziny, aby umożliwić dojrzewanie białek fluorescencyjnych w celu uzyskania reliefu. Na szkiełka przedmiotowe nałożyć dwie warstwy izolacyjnej taśmy PVC, całkowicie je dociskając.

Wytnij z taśmy prostokąt o wymiarach 14 na 10 milimetrów do montażu nasadek zwierzęcych. Następnie nanieś pipetą dwie oddzielne krople NM two na szkiełko z wgłębieniem. Następnie, używając ściętej końcówki do pipety P 20, przenieś do każdego szkiełka do 15 eksplantów zwierzęcych i za pomocą pęsety ustaw eksplanty X tak, aby strona apikalna była skierowana do góry.

Używając rysika diamentowego, nacinamy szkiełko nakrywkowe, a następnie je łamiemy, aby uzyskać mniejszą nakrywkę. Aby dopasować ją do szkiełka z wgłębieniem, należy ostrożnie opuścić szkiełko nakrywkowe na szkiełko z wgłębieniem za pomocą zgiętej igły o rozmiarze 19 G, kompresując warstwę apikalną komórek czapki zwierzęcej.

Użyć lakieru do paznokci, aby uszczelnić preparat, a następnie pozostawić go do wyschnięcia w ciemności przez 20 minut i wykonać obrazowanie w ciągu czterech do sześciu godzin. Aby zapewnić prawidłowy stan czapków zwierzęcych, muszą one być odpowiednio zorientowane na dedykowanych szkiełkach, a następnie przykryte szkiełkami nakrywkowymi. Należy nanosić je na szkiełka ostrożnie.

Kluczowe jest, aby nie używać zbyt wielu lakierów do paznokci do uszczelniania szkiełek, ponieważ spowoduje to pomarszczenie taśmy, a w konsekwencji późniejsze przerwanie szczelności szkiełka. Po opanowaniu techniki należy wstrzyknąć około 25 embrionów, aby pobrać 20 wysokiej jakości czepek zwierzęcych na każdy badany warunek. Następnie można je poddać analizie za pomocą mikroskopii konfokalnej następnego dnia.

Aby przeprowadzić obrazowanie, należy użyć obiektywu o niskim powiększeniu w celu zlokalizowania X explan. Następnie należy przełączyć na obiektyw olejowy 63 x 1.4 dla uzyskania obrazowania o wyższej rozdzielczości. Włącz wymagane lasery, w tym 405 dla MIAN, 488 dla GFP oraz 561.

W przypadku MRFP należy zoptymalizować moc lasera tak, aby możliwe było wykrycie wszystkich fluoroforów. Należy użyć macierzy 32 detektorów, minimalizując przy tym wymagane napięcie i wzmocnienie, a następnie wybrać tryb Lambda oraz lasery 405 nanometrów, 488 i 561 nanometrów. Aby uzyskać szersze pole widzenia, należy pomniejszyć obraz do powiększenia 0.6 x.

Następnie ustaw rozmiar ramki na pożądany rozmiar obrazu. Zapewnia to wystarczającą rozdzielczość dla analizy przy ustawieniu uśredniania od czterech do ośmiu powtórzeń w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu oraz optymalizacji otworu pinhole dla tego zestawu danych. Użyto jednej jednostki obszaru w odniesieniu do lasera 561 nanometrów, wykorzystując 405, 488 oraz 561.

Lustra dichroiczne zbierają światło emitowane przez membranowy Saru, GFP oraz membranowy RFP. W tym eksperymencie światło zbierano w odstępach około 10 nm w zakresie od 415 do 720 nm. Przeprowadź analizę obrazu zgodnie z protokołem tekstowym; tutaj przedstawiono rozkład sonic hedgehog znakowanego GFP w wyjaśnionej komorze zwierzęcia w warunkach kontrolnych; sonic hedgehog GFP jest wydzielany i dyfunduje poza region wykazujący ekspresję wstrzykniętych mRNA.

Jednak w obecności modulatora SULF1, Sonic Hedgehog GFP wykazuje bardziej ograniczony rozkład. W tej próbce w niewielkiej odległości od klonu komórek go produkujących widocznych jest tylko kilka ognisk Sonic Hedgehog GFP. Ten rysunek przedstawia charakterystykę dwóch ligandów Wnt znakowanych fluorescencyjnie i wstrzykniętych do komórek, zgodnie z oznaczeniami; zarówno Wnt8A i Wnt11B-HAE-GFP gromadzą się na błonie komórek czapki zwierzęcej, przy czym Wnt8A-HAE-GFP gromadzi się wydajniej niż Wnt11B. Ten rysunek pokazuje rozkład Wnt8A-HAE-GFP wyrażanego w klonie komórek znakowanych przymocowanym do błony Cerulean.

Widoczna jest dyfuzja znakowanego fluorescencyjnie liganda z komórek źródłowych do otaczających komórek nabłonka. Oprogramowanie do analizy obrazu jest wykorzystywane do ekstrakcji danych dotyczących rozkładu znakowanych fluorescencyjnie ligandów wind w wielu próbkach doświadczalnych, jak pokazano tutaj. Pomiar odległości od klonu wykazującego ekspresję mem Saru oraz poziomu fluorescencji GFP pozwala określić zasięg dyfuzji wind oraz kształt gradientu.

Po zmierzeniu rozkładu liganda, wynik szlaku sygnalizacyjnego można również ocenić, łącząc niniejszy protokół z innym testem w celu monitorowania odpowiedzi komórek odbiorczych. W ten sposób można podjąć próbę określenia zakresu progowego morfogenu.