Name: Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Poznaj metodę tworzenia zakaźnych cząstek wirusa z klonowanego cDNA wirusa JEV przy użyciu sztucznych chromosomów bakteryjnych. Ta technika umożliwia badanie biologii wirusów RNA i rozwój szczepionek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować funduszowi Utah Science Technology and Research za wsparcie YML oraz grantom Korea National Research Foundation (2009-0069679 i 2010-0010154) za wsparcie SIY. Badania te były wspierane przez Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University i zatwierdzone jako artykuł numer czasopisma UAES #8753. Autorzy dziękują również dr Deborah McClellan za pomoc redakcyjną.

Autorzy oświadczyli, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Obecny protokół został z powodzeniem wykorzystany do wygenerowania pełnej długości zakaźnych klonów cDNA dla dwóch różnych szczepów (CNU/LP227 i SA 14-14-228) JEV, flawiwirusa, którego funkcjonalne cDNA okazało się z natury trudne do skonstruowania i namnażania ze względu na toksyczność komórek gospodarza i niestabilność genetyczną sklonowanego cDNA. 8,74-76 Protokół ten obejmuje trzy główne elementy: po pierwsze, maksymalizację syntezy/amplifikacji wiernej kopii cDNA wirusowego RNA przy użyciu wysokiej jakości odwrotnej transkryptazy/polimerazy DNA; po drugie, klonowanie wirusowego regionu kodującego prM-E zawierającego toksyczne sekwencje (dane niepublikowane)74,77,78 w wektorze BAC o bardzo niskiej liczbie kopii od początkowego subklonowania cDNA do końcowych etapów składania cDNA na pełnej długości; i po trzecie, wykorzystując wektor klonujący BAC, który może pomieścić obce DNA o średnim rozmiarze 120-350 kb,19-21, który najwyraźniej toleruje większe wstawki DNA niż inne wektory klonujące. To podejście do klonowania będzie ogólnie stosowane do wielu innych wirusów o dodatniej nici RNA, szczególnie tych z dużym genomem RNA od ~10 do 32 kb. Wygenerowanie zakaźnego klonu cDNA jest kluczowym krokiem w rozwoju systemu odwrotnej genetyki dla wirusów RNA, zwłaszcza dla wirusów o dodatniej nici RNA, ponieważ jego genom działa jak wirusowe mRNA, które jest tłumaczone na białka przez rybosomy komórek gospodarza. W ten sposób replikacja wirusa może zostać zainicjowana przez wprowadzenie cząsteczki RNA o długości genomu pochodzącej z cDNA do podatnej komórki gospodarza. Dostępność zakaźnego klonu cDNA JEV, w połączeniu z technologią rekombinacji DNA, zwiększyła naszą wiedzę na temat różnych aspektów cyklu życia wirusa na poziomie molekularnym, takich jak ekspresja genów73,79 i replikacja genomu. 63,64 Również pełnowymiarowy klon cDNA JEV okazał się cennym narzędziem do rozwoju szczepionek przeciwwirusowych28 i wektorów dostarczania genów. 80,81 zł
Podobnie jak w przypadku wszystkich wirusów o dodatniej nici RNA, istnieje wiele krytycznych etapów konstruowania niezawodnego funkcjonalnego cDNA dla JEV, z którego można zsyntetyzować wysoce zakaźne RNA in vitro. Idealnie byłoby, gdyby sekwencja syntetycznych RNA transkrybowanych z klonu cDNA o pełnej długości była identyczna z sekwencją genomowego RNA wirusa, w szczególności sekwencje 5'- i 3'-końcowe, które są wymagane do zainicjowania replikacji wirusowego RNA. 60-62 W obecnym protokole autentyczne końce 5' i 3' zapewniono poprzez umieszczenie sekwencji promotora SP6 przed pierwszym nukleotydem adeninowym genomu wirusa i umieszczenie unikalnego sztucznego miejsca restrykcyjnego Xba I za ostatnim nukleotydem tyminowym genomu wirusa, odpowiednio. Syntetyczne RNA z autentycznymi końcami 5' i 3' wyprodukowano przez spływową transkrypcję matrycy cDNA Xba I-linearyzowanej i poddanej działaniu MBN przy użyciu polimerazy SP6 RNA zagruntowanej analogiem kapu m7G (5') ppp (5') A. Protokół ten można modyfikować na kilka sposobów. Do transkrypcji in vitro można użyć innej polimerazy RNA bakteriofaga (np. T3 lub T7) w połączeniu z jej dobrze zdefiniowaną sekwencją promotorową. 27 Jako miejsce spływu, można wykorzystać inne miejsce restrykcyjne, jeśli nie jest ono obecne w genomie wirusa i jeśli syntetyczne RNA ze zlinearyzowanego cDNA kończy się autentycznym końcem 3'. Znaczenie sekwencji nukleotydowej końca 3' wykazano przez ~10-krotny spadek zakaźności RNA, gdy syntetyczny RNA zawiera trzy lub cztery nukleotydy niezwiązane z wirusem na końcu 3'. 27 W reakcji transkrypcji in vitro zarówno analog kapu m7G(5')ppp(5')A, jak i m7G(5')ppp(5')G cap analog, chociaż ten ostatni umieszcza niepowiązany dodatkowy nukleotyd G przed wirusowym końcem 5', ale ten dodatek nie zmienia zakaźności ani replikacji syntetycznego RNA. 27 Ponadto usunięcie matrycy cDNA z transkryptów RNA przez trawienie DNazą I nie jest konieczne do przeprowadzenia testów zakaźności RNA, ponieważ sama matryca cDNA nie jest zakaźna. 27 Rozdział 27
Technologia BAC została obecnie zastosowana do konstruowania zakaźnych klonów cDNA dla garstki wirusów o dodatniej nici RNA, a mianowicie dwóch JEV, CNU/LP227 i SA 14-14-228 (rozmiar genomu, ~11 kb); dwa wirusy dengi, BR/9026 i NGC29 (~11 kb); wirus wirusowej biegunki bydła, SD1 (~12 kb); 25 dwa wirusy klasycznego pomoru świń, C i Paderborn (~12 kb); 24 wirus choroby granicznej, Gifhorn (~12 kb); 24 wirus zespołu rozrodczo-oddechowego świń, PL97-1/LP1 (~15 kb); 30 wirus zakaźnego zapalenia żołądka i jelit, PUR46-MAD (~29 kb); 16 wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów, DF-2 (~29 kb); 32 koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, Urbani (~30 kb); 9 koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego, EMC/2012 (~30 kb); 17 i ludzki koronawirus, OC43 (~31 kb). 31 Główną zaletą stosowania BAC do budowy cDNA jest wysoka stabilność genetyczna dużych, 1- lub 2-kopijnych plazmidów BAC; jednak nieodłączny charakter jego wyjątkowo niskiej liczby kopii jest również wielką wadą ze względu na bardzo niską wydajność DNA BAC i wynikające z tego zmniejszenie czystości DNA BAC w odniesieniu do chromosomalnego DNA gospodarza. W obecnym protokole wydajność DNA BAC jest maksymalizowana poprzez hodowlę E. coli DH10B przekształconego za pomocą zakaźnego BAC pBAC/SA 14-14-2 w pożywce bogatej w składniki odżywcze, 2xYT. Mimo tego wysiłku średni plon to tylko ~15 μg DNA BAC z 500 ml bulionu 2xYT. Ponadto czystość DNA BAC najlepiej osiągnąć przy użyciu wirowania w gradicynie gęstości CsCl-EtBr do oczyszczania, a nie powszechnie stosowanej izolacji plazmidu opartego na kolumnie. Należy jednak pamiętać, że bakteria E. coli przekształcona przez BAC nie powinna przerastać, ponieważ może to zagrozić stabilności genetycznej sklonowanego cDNA, a wyższy wzrost niekoniecznie prowadzi do większych plonów lub wyższej czystości DNA BAC.
Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowaną, wydajną i usprawnioną metodą budowy i rozmnażania genetycznie stabilnego zakaźnego klonu cDNA o pełnej długości jako BAC dla JEV, procedura kiedyś uważana za praktycznie niemożliwą. Ta sama strategia klonowania może być również stosowana do wielu innych wirusów o dodatniej nici RNA. Ogólnie rzecz biorąc, zakaźne klony cDNA umożliwiają nam wprowadzenie różnych mutacji (np. delecji, insercji i mutacji punktowych) do genomu wirusowego RNA w celu zbadania ich funkcji biologicznych w replikacji i patogenezie wirusa. Ten oparty na cDNA system genetyki odwrotnej umożliwia opracowywanie i testowanie kandydatów na szczepionki i terapie ukierunkowanych na czynnik wirulencji określonego wirusa o dodatniej nici RNA. Ponadto ta zakaźna technologia cDNA może być również wykorzystywana jako wektor wirusowy, zdolny do ekspresji obcego genu (genów) będącego przedmiotem zainteresowania w wielu zastosowaniach w badaniach biomedycznych.

Dla wirusologów RNA, pojawienie się technologii rekombinacji DNA pod koniec lat siedemdziesiątych umożliwiło konwersję wirusowych genomów RNA na klony cDNA, które następnie mogły być rozmnażane jako plazmidy w bakteriach do genetycznej manipulacji wirusami RNA. 1 Pierwszym wirusem RNA, który został sklonowany molekularnie, był bakteriofag Qβ, wirus o dodatniej nici RNA, który infekuje Escherichia coli. Plazmid zawierający kompletną kopię cDNA genomowego RNA Qβ spowodował powstanie zakaźnych fagów Qβ po wprowadzeniu do E. coli. 2 Wkrótce potem technikę tę zastosowano do wirusa polio, wirusa o dodatniej nici RNA u ludzi i zwierząt. Plazmid zawierający cDNA genomowego RNA wirusa polio o pełnej długości był zakaźny po transfekacji do komórek ssaków i zdolny do wytwarzania zakaźnych wirionów. 3 W tym podejściu "wystrzelonym przez DNA" sklonowane cDNA powinny być transkrybowane wewnątrzkomórkowo w celu zainicjowania replikacji wirusowego RNA; Nie jest jednak jasne, w jaki sposób inicjowana jest transkrypcja i w jaki sposób transkrypty są przetwarzane do prawidłowej sekwencji wirusa. Obawy te doprowadziły do opracowania alternatywnego podejścia "uruchamianego przez RNA", w którym kompletna kopia cDNA genomu wirusowego RNA jest klonowana pod promotorem rozpoznawanym przez E. coli lub polimerazę RNA faga w celu produkcji syntetycznych RNA in vitro o zdefiniowanych końcach 5' i 3', które przechodzą pełny cykl replikacji wirusa po wprowadzeniu do komórek gospodarza. 4,5 Pierwszy sukces w zastosowaniu tego podejścia odnotowano w przypadku wirusa mozaiki bromu,6,7 wirusa o dodatniej nici RNA roślin. Od tego czasu podejście oparte na RNA zostało opracowane dla szerokiej gamy wirusów o dodatniej nici RNA, w tym kaliciwirusów, alfawirusów, flawiwirusów, arteriwirusów i koronawirusów. 1,4,5,8
Zarówno w systemach genetyki odwrotnej uruchamianych przez DNA, jak i RNA, budowa pełnowymiarowego klonu cDNA jest kluczem do generowania zakaźnego DNA lub RNA wirusów o dodatniej nici RNA, ale staje się poważnym wyzwaniem technicznym wraz ze wzrostem rozmiaru genomu wirusa. 9-17 W szczególności duży genom RNA o wielkości ~10-32 kb przedstawia trzy główne przeszkody w klonowaniu funkcjonalnego cDNA o pełnej długości. 18 Pierwszą trudnością jest synteza wiernej kopii cDNA, ponieważ wierność RT-PCR jest odwrotnie proporcjonalna do długości wirusowego RNA. Drugą przeszkodą jest obecność potencjalnie toksycznych sekwencji, ponieważ długie cząsteczki RNA z większym prawdopodobieństwem zawierają nieoczekiwane sekwencje, które mogą sprawić, że fragment cDNA w plazmidach stanie się niestabilny u E. coli. Trzecią i najważniejszą kwestią jest dostępność odpowiedniego wektora, ponieważ trudno jest znaleźć wektor klonujący, który może pomieścić wstawkę cDNA wirusa o wielkości >10 kb. W ciągu ostatnich trzech dekad bariery te zostały pokonane dzięki kilku postępom w enzymologii, metodologii i wektorologii. 1,4,5,8 Spośród nich najbardziej obiecującym i innowacyjnym osiągnięciem jest klonowanie wirusów o dużej dodatniej nici RNA jako zakaźnych sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC). Wektor BAC to plazmid klonujący o niskiej liczbie kopii (1-2 kopie / komórkę) oparty na czynniku płodności E. coli, o średnim rozmiarze wstawki DNA ~ 120-350 kb. 19-21 Fragment DNA jest wprowadzany do wektora BAC w podobny sposób, jak klonowanie do ogólnych wektorów klonowania; powstałe w ten sposób klony BAC są stabilne przez wiele pokoleń u E. coli.22,23 Do tej pory technologia BAC była wykorzystywana do tworzenia zakaźnych klonów cDNA dla >10 członków trzech rodzin wirusów o dodatniej nici RNA, tj. Flaviviridae,24-29 Arteriviridae,30 i Coronaviridae. 9,16,17,31,32
Na przykładzie wirusa japońskiego zapalenia mózgu (JEV), niniejsza praca przedstawia szczegółowe procedury, które mogą być użyte do skonstruowania genetycznie stabilnego zakaźnego BAC o pełnej długości dla różnych wirusów o dodatniej nici RNA. JEV to odzwierzęcy flawiwirus33, który jest przenoszony w naturze między ptakami, świniami i innymi kręgowcami przez wektory komarów. 34,35 U ludzi zakażenie JEV może powodować ciężką, często śmiertelną chorobę neurologiczną Japońskie Zapalenie Mózgu (JE),36 która występuje w Azji i częściach Zachodniego Pacyfiku,37,38 z szacowaną roczną częstością występowania ~50 000-175 000 przypadków klinicznych. 39,40 Genom JEV jest ~11-kb, jednoniciową cząsteczką RNA o dodatnim sensie i składa się z pojedynczej otwartej ramki odczytu (ORF) otoczonej dwoma regionami niekodującymi (NCR) na końcach 5' i 3'. 41,42 ORF koduje poliproteinę, która jest rozszczepiana przez proteazy gospodarza i wirusa w celu wytworzenia 10 pojedynczych białek, oznaczonych jako C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B i NS5 w kierunku N- do C-końcowym. 34,43,44 Również rozszerzona forma NS1 (NS1') jest wyrażana przez -1 rybosomalne przesunięcie ramki w kodonach 8-9 NS2A. 45,46 Spośród tych 11 białek, trzy białka strukturalne (C, prM i E) są niezbędne do tworzenia zakaźnych wirionów,47,48 a pozostałe osiem białek niestrukturalnych (NS1 do NS5 i NS1') ma kluczowe znaczenie dla replikacji wirusowego RNA,49-51 składania cząstek,52-56 i unikania odporności wrodzonej. 57-59 Zarówno 5', jak i 3' NCR zawierają konserwatywne sekwencje pierwszorzędowe i tworzą drugorzędowe / trzeciorzędowe struktury RNA,60-62, które są ważne dla modulacji replikacji wirusowego RNA. Pytanie 63,64 TGL
Ten protokół opisuje narzędzia, metody i strategie generowania pełnowymiarowego zakaźnego BAC JEV SA14-14-2. 28 Ten funkcjonalny klon BAC zawiera kompletną kopię cDNA genomowego RNA JEV,65 która jest objęta promotorem polimerazy RNA SP6 przed końcem wirusa 5' i unikalnym miejscem restrykcyjnym Xba I za końcem wirusa 3' do transkrypcji in vitro. Ta technologia BAC ma zastosowanie do konstruowania w pełni funkcjonalnego klonu molekularnego cDNA dla szeregu wirusów o dodatniej nici RNA.

<table><tbody><tr><td><silny>1. Klonowanie molekularne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT Rosół</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377[</td><td></td></tr><tr><td>3H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>Radioactive</td></tr><tr><td>50 ml Tubka</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Butelka</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza (niska temperatura topnienia)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>Nowa Anglia BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>Nowa Anglia BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Nowa Anglia BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>Nowa Anglia BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>Nowość Anglia BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek cezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Racerotwórczość</td></tr><tr><td>DE-81 Bibuła filtracyjna</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka dNTP</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH10B&nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>Toksyczna i wysoce mutagenna</td></tr><tr><td>kolumna filtrująca (zestaw Plasmid Maxiprep)</td> <td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Drażniąca</td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izoamylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>izopropanol&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>bulion LB Life</td><td>Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek litu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Technologie odwrotnej transkryptazy</td><td>życia (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza fasoli mung</td><td>Nowa Anglia BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>Igła (18G, 20G)</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>Niebezpieczne biologicznie (odpady ostrych narzędzi)</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Zintegrowane technologie oligonukleotydowe</td><td>DNA</td><td>Niestandardowa synteza</td><td></td>oligonukleotydów</tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Fenol (nasycony buforem)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>Toksyczny i silnie</td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td> Life <td>Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>Toksyczny i silnie</td></tr><tr><td>Fenol:Guanidine Isothiocyanate</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>Toksyczny, i drażniący</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw rNTP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniana rurka polipropylenowa (16 & razy; 76 mm)& nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>Nowa Anglia BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>Nowa Anglia BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 Polimeraza RNA</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S Kolumna</td><td></td></tr><tr><td>wirowa (zestaw do miniprzygotowania plazmidu)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td>Strzykawka <td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (drożdże)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>2. Hodowla komórkowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimal Essential</td><td>Medium Life Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa (50 ml)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet&nbsp;</td><td>Naczynie hodowlane Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>(150 mm)&nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta (odstęp 2 mm)</td><td>Aparat Harvarda</td><td>450125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Toksyczna i rakotwórcza</td></tr><tr><td>glutamina</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Płytka sześciodołkowa</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Technologie życia ( Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Witaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>3. Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza Żel Elektroforeza</td> System <td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołkowa&nbsp;</td><td>Electroporator</td><td>Thermo Scientific ST16R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aparatura Harvardu</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Długofalowe lampy ultrafioletowe (ręczne)</td><td>UVP</td><td>UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Life Technologies (Biosystemy stosowane)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Przemysł naukowy</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici rna

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Genetyka odwrócona, podejście do całkowitego ratowania zakaźnego wirusa ze sklonowanego cDNA, zrewolucjonizowała dziedzinę wirusów o dodatniej nici RNA, których genomy mają taką samą polaryzację jak mRNA komórkowe. System genetyki odwrotnej oparty na cDNA jest przełomową metodą, która umożliwia bezpośrednią manipulację genomowym RNA wirusa, generując w ten sposób rekombinowane wirusy do badań molekularnych i genetycznych zarówno elementów wirusowego RNA, jak i produktów genowych w replikacji i patogenezie wirusa. Stanowi również cenną platformę, która umożliwia opracowywanie genetycznie zdefiniowanych szczepionek i wektorów wirusowych do dostarczania obcych genów. Jednak w przypadku wielu wirusów o dodatniej nici RNA, takich jak wirus japońskiego zapalenia mózgu (JEV), sklonowane cDNA są niestabilne, co stanowi główną przeszkodę w budowie i rozmnażaniu funkcjonalnego cDNA. W niniejszym raporcie opisano strategiczne rozważania związane z tworzeniem i amplifikacją genetycznie stabilnego zakaźnego cDNA JEV o pełnej długości jako bakteryjnego sztucznego chromosomu (BAC) przy użyciu następujących ogólnych procedur eksperymentalnych: izolacja wirusowego RNA, synteza cDNA, subklonowanie i modyfikacja cDNA, składanie cDNA o pełnej długości, linearyzacja cDNA, in vitro Synteza RNA i odzyskiwanie wirusa. Protokół ten zapewnia ogólną metodologię mającą zastosowanie do klonowania pełnej długości cDNA dla szeregu wirusów o dodatniej nici RNA, w szczególności tych o genomie o długości >10 kb, do wektora BAC, z którego zakaźne RNA mogą być transkrybowane in vitro za pomocą polimerazy RNA bakteriofaga.

W przypadku wszystkich wirusów RNA o dodatnej polarności nici, niezawodność i wydajność systemu genetyki odwrotnej zależą od stabilności genetycznej sklonowanego pełnowymiarowego cDNA, którego sekwencja jest równoważna sekwencji konsensusowej wirusowego RNA genomowego.27 Rycina 1 przedstawia pięcioetapową strategię konstrukcji pełnowymiarowego infekcyjnego cDNA w formie BAC dla JEV SA14-14-228Krok 1, oczyszczanie wirusowego RNA z supernatantu hodowli komórek BHK-21 zakażonych JEV (Rycina 1A); Krok 2, synteza czterech nakładających się amplikonów cDNA (F1 do F4), obejmujących cały genom wirusa (Rycina 1B); Krok 3, subklonowanie każdego z czterech sąsiednich fragmentów cDNA do wektora BAC, w celu stworzenia pBAC/F1 do pBAC/F4 (Rycina 1C); Krok 4, modyfikacja sklonowanych cDNAs w celu in vitro transkrypcja run-off z użyciem polimerazy RNA SP6, t. j.umieszczając sekwencję promotora SP6 bezpośrednio przed końcem 5' wirusa (pBAC/F1SP6), eliminując istniejący wcześniej wewnętrzny XbaI Wprowadź miejsce restrykcyjne w nukleotydzie 9131 poprzez wprowadzenie cichej mutacji punktowej A9134→T (pBAC/F3Wyciszenie (knockout)), a następnie wprowadzenie nowej sztucznej XbaI Przebieg kończy się bezpośrednio za 3'-końcem wirusa (pBAC/F4RO) (Rysunek 1D); oraz Krok 5, montaż pełnowymiarowego SA14-14-2 cDNA BAC, pBAC/SA14-14-2 (Rycina 1E). Tabela 1 zawiera wykaz oligonukleotydów użytych w tej procedurze klonowania.28
W celu konstrukcji funkcjonalnego cDNA JEV pierwszym ważnym krokiem jest synteza czterech nakładających się fragmentów cDNA z wykorzystaniem oczyszczonego RNA wirusa jako matrycy dla RT-PCR. Rycina 2 przedstawia reprezentatywny wynik dla czterech produktów RT-PCR, które poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym. Żel ten wyraźnie pokazuje, że pełnowartościowe cDNA JEV zostało zamplifikowane do czterech nakładających się fragmentów cDNA. Sporadycznie reakcje RT-PCR mogą przynieść jeden lub więcej dodatkowych produktów specyficznych dla wirusa lub niespecyficznych, które są zazwyczaj mniejsze od oczekiwanego produktu, co wynika z niespecyficznego przyłączania starterów podczas syntezy/amplifikacji cDNA. Z drugiej strony, oczekiwany produkt RT-PCR może zostać zamplifikowany w niewielkiej ilości lub wcale z powodu przypadkowego zanieczyszczenia RNazą podczas izolacji RNA wirusa lub nieprawidłowego przeprowadzenia RT-PCR.
Kolejnym kluczowym krokiem jest klonowanie i modyfikacja częściowego lub pełnego cDNA JEV w BAC, co jest stosunkowo prostą procedurą z wykorzystaniem standardowych technik rekombinacji DNA.69 Rycina 3 przedstawia reprezentatywny wynik oczyszczania klonu BAC zawierającego pełnowymiarowy cDNA JEV SA14-14-2 poprzez frakcjonowanie w gradiencie CsCl-EtBr. W tym doświadczeniu, po wirowaniu przez 16 h przy 401 700 × g, dwa wyraźne prążki, t. j., the E. coli DNA chromosomalne powyżej oraz superzwinięte DNA plazmidowe BAC poniżej są widoczne w środkowej części probówki w świetle ultrafioletowym o długiej fali. Minimalna objętość (~400 µl) dolnego prążka DNA z BAC ostrożnie pobrano, przebijając ściankę probówki strzykawką. Następnie EtBr usunięto z DNA z BAC poprzez ekstrakcję butanolem, a wolne od EtBr DNA z BAC zagęszczono metodą precypitacji etanolem.
Ostatnim etapem jest oznaczenie swoistej zakaźności syntetycznych RNA transkrybowanych in vitro z pełnowymiarowego BAC SA14-14-2 (pBAC/SA14-14-2) po transfekcji RNA do komórek permisywnych (Rycyna 4). Etap ten składa się z trzech następujących po sobie kroków: Krok 1, linearyzacja pełnowymiarowego cDNA SA14-14-2 na końcu 3' genomu wirusa (Rycina 4A); Krok 2, produkcja syntetycznych RNA z linearyzowanego cDNA poprzez transkrypcję typu run-off (Rycina 4B); oraz Krok 3, odzyskanie rekombinowanych wirusów w komórkach BHK-21 transfekowanych syntetycznymi RNA (Rycina 4C). W warunkach eksperymentalnych dwa niezależne klony pBAC/SA14-14-2 zlinearyzowano za pomocą trawienia enzymem Xba I, a następnie poddano działaniu MBN w celu usunięcia czteronukleotydowego nawisu 5' powstałego w wyniku trawienia Xba I. Zlinearyzowane BAC-i oczyszczono metodą ekstrakcji fenol-chloroformowej, a następnie wytrącono etanolem. Linearyzację dwóch oczyszczonych BAC-ów wykazano na żelu agarozowym 0,8% (Rycina 5A). Ekstrakcję fenol-chloroformową należy przeprowadzić ostrożnie, aby upewnić się, że zlinearyzowane BAC-i są wolne od RNaz. Każdy z dwóch zlinearyzowanych BAC-ów posłużył jako matryca cDNA do transkrypcji typu run-off z użyciem polimerazy RNA SP6 w obecności analogu czapeczki m7G(5')ppp(5')A. Integralność syntetycznych RNA wykazano, nanosząc alikwoty z dwóch mieszanin reakcyjnych transkrypcji na żel agarozowy 0,6% wraz z referencyjną drabiną DNA 1 kb (Rycina 5B). W tym prostym teście główny, wyraźny prążek RNA zawsze migrował tuż poniżej referencyjnego prążka DNA 3 kb i był ostry. Natomiast zdegradowany RNA miałby postać rozmytej smug na tym samym żelu.
Test centrów infekcyjnych jest złotym standardem w określaniu swoistej zakaźności syntetycznych RNA. Analizę tę przeprowadzono poprzez elektroporację komórek BHK-21 próbkami RNA, wysianie równych alikwotów 10-krotnie rozcieńczanych seryjnie elektroporowanych komórek na płytki 6-dołkowe zawierające naiwne komórki BHK-21 (3 × 105 komórek/dołek) oraz nałożenie agarozy na monowarstwy komórkowe. Po 4-dniowej inkubacji przeżyłe komórki utrwalono formaldehydem i zabarwiono roztworem fioletu krystalicznego, aby określić liczbę centrów infekcyjnych (plaque), co odpowiada liczbie zakaźnych cząsteczek RNA wprowadzonych do komórek (Rysunek 6A). Ponieważ udowodniono, że matryca cDNA użyta do transkrypcji in vitro jest nieinfekcyjna,27 alikwot mieszaniny reakcyjnej transkrypcji wykorzystano bezpośrednio do elektroporacji. Elektroporacja jest preferowaną metodą transfekcji RNA; alternatywnie RNA można transfekować innymi metodami z użyciem DEAE-dekstranu i liposomów kationowych. Elektroporacja RNA jest bardzo skuteczna, jednak rzadko dochodzi do „przeskoku” (arcing) impulsu elektrycznego, jeśli w mieszaninie do elektroporacji znajdują się sole lub jeśli kuweta do elektroporacji jest używana ponownie. Ekspresję białek wirusowych w komórkach transfekowanych RNA badano za pomocą testów immunofluorescencji z użyciem przeciwciał króliczych przeciwko NS1 (Rysunek 6B). Produkcję cząstek wirusowych gromadzących się w supernatantach komórek transfekowanych RNA analizowano za pomocą testów plackowych (Rysunek 6C). Wyniki tych eksperymentów jasno pokazują, że syntetyczne RNA pochodzące z cDNA są zakaźne w podatnych komórkach BHK-21, generując wysoki miano wirusów rekombinowanych.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody >
		<tr>
			<td>Oligonukleotyd</td>
			<td>Sekwencjaa (5' do 3')</td>
			<td>Pozycjab</td>
			<td>Polarność</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1RT</td>
			<td>TAGGGATCTGGGCGTTTCTG 
			GCAAAT</td>
			<td>2578–2603</td>
			<td>Antysensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1F</td>
			<td>aatcccgggAGAAGTTTATC 
			TGTGTGAACTT</td>
			<td>1–22</td>
			<td>Sensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1R</td>
			<td>attgcggccgcCCACGTCGT 
			TGTGCACGAAGAT</td>
			<td>2532–2553</td>
			<td>Antysensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2RT</td>
			<td>TTCTGCCTACTCTGCCCCTC 
			CGTTGA</td>
			<td>5975–6000</td>
			<td>Antysensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2F</td>
			<td>aatcccgggTCAAGCTCAGT 
			GATGTTAACAT</td>
			<td>1800–1821</td>
			<td>Sensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2R</td>
			<td>attgcggccgcGATGGGTTT 
			CCGAGGATGACTC</td>
			<td>5929–5950</td>
			<td>Antysensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3RT</td>
			<td>ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC 
			AGGTCT</td>
			<td>9426–9451</td>
			<td>Antysensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3F</td>
			<td>aatcccgggGAGGATACATT 
			GCTACCAAGGT</td>
			<td>5500–5521</td>
			<td>Sensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3R</td>
			<td>attgcggccgcGTAAGTCAG 
			TTCAATTATGGCT</td>
			<td>9380–9401</td>
			<td>Antysensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4RT</td>
			<td>AGATCCTGTGTTCTTCCTCA 
			CCACCA</td>
			<td>10952–10977</td>
			<td>Antysensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4F</td>
			<td>aatcccgggAGTGGAAGGCT 
			CAGGCGTCCAA</td>
			<td>9200–9221</td>
			<td>Sensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4R</td>
			<td>attgcggccgcAGATCCTGT 
			GTTCTTCCTCACC</td>
			<td>10956–10977</td>
			<td>Antysensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6F</td>
			<td>cataccccgcgtattcccac 
			ta</td>
			<td></td>
			<td>Sensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6R</td>
			<td>ACAGATAAACTTCTctatag 
			tgtcccctaaa</td>
			<td>1–14</td>
			<td>Antysensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1F</td>
			<td>aggggacactatagAGAAGT 
			TTATCTGTGTG</td>
			<td>1–17</td>
			<td>Sensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1R</td>
			<td>TGGATCATTGCCCATGGTAA 
			GCTTA</td>
			<td>638–662</td>
			<td>Antysensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X1F</td>
			<td>CGAATGGATCGCACAGTGTG 
			GAGAG</td>
			<td>8403–8427</td>
			<td>Sensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X1R</td>
			<td>AAAGCTTCAAACTCAAGATA 
			CCGTGCTCC</td>
			<td>9120–9148</td>
			<td>Antysensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X2F</td>
			<td>GGAGCACGGTATCTTGAGTT 
			TGAAGCTTT</td>
			<td>9120–9148</td>
			<td>Sensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X2R</td>
			<td>cacgtggacgagggcatgcc 
			tgcag</td>
			<td></td>
			<td>Antysensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROF</td>
			<td>CCAGGAGGACTGGGTTACCA 
			AAGCC</td>
			<td>10670–10694</td>
			<td>Sensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROR</td>
			<td>agggcggccgctctagAGAT 
			CCTGTGTTCTTCCTCACCAC</td>
			<td>10954–10977</td>
			<td>Antysensowna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">aSekwencje JEV zapisano wielkimi literami, a sekwencje BAC małymi literami. 
			bPozycja nukleotydu odnosi się do pełnej sekwencji genomu JEV SA14-14-2 (numer dostępu Genbank JN604986).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Oligonukleotydy użyte do syntezy cDNA, amplifikacji PCR i mutogenezy BAC.
<img alt="Schemat izolacji viralnego RNA i asemblacji pełnowymiarowego cDNA, obejmujący syntezę cDNA, subklonowanie oraz procesy modyfikacji." src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Strategia konstrukcji pełnowymiarowego cDNA JEV SA14-14-2 w formie BAC. (A) Izolacja viralnego RNA z cząsteczek JEV. Przedstawiono schematyczną strukturę genomowego RNA JEV SA14-14-2. (B) Synteza czterech nakładających się fragmentów cDNA (F1 do F4) obejmujących cały genom wirusa. (C) Subklonowanie czterech nakładających się fragmentów cDNA do wektora BAC, z utworzeniem pBAC/F1 do pBAC/F4. (D) Modyfikacja sklonowanych cDNA w celu transkrypcji run-off in vitro. pBAC/F1SP6 jest pochodną pBAC/F1 zawierającą sekwencję promotora SP6 powyżej 5'-końca wirusowego. pBAC/F3KO jest pochodną pBAC/F3 zawierającą cichą mutację punktową (A9134→T, gwiazdka). pBAC/F4RO jest pochodną pBAC/F4 zawierającą sztuczne miejsce run-off Xba I poniżej 3'-końca wirusowego. (E) Asemblacja pełnowymiarowego BAC SA14-14-2 (pBAC/SA14-14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej; rozdział DNA według wielkości w kilobazach; pokazano markery masy cząsteczkowej." src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Synteza czterech nakładających się fragmentów cDNA (F1 do F4) obejmujących pełną długość genomowego RNA JEV SA14-14-2. Cztery produkty RT-PCR oceniono za pomocą elektroforezy w 0,8% żelu agarozowym. M, drabinka DNA 1 kb. Przewidywane rozmiary czterech fragmentów cDNA są zaznaczone na dole obrazu żelu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Centryfugacja w gradiencie gęstości chlorku cezu rozdzielająca DNA chromosomalne, DNA BAC oraz RNA; schemat." src="/files/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Oczyszczanie BAC zawierającego pełny cDNA JEV SA14-14-2. Plazmid BAC jest izolowany z E. coli DH10B metodą lizy alkalicznej z SDS, a następnie dodatkowo oczyszczany poprzez wycinanie pasma w gradiencie CsCl-EtBr. Przedstawiono przykład gradientu CsCl-EtBr z wykorzystaniem szczelnej probówki polipropylenowej o wymiarach 16 × 76 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat linearyzacji cDNA i syntezy RNA; odzyskiwanie wirusa poprzez transfekcję RNA; proces genetyczny." src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Przegląd odzyskiwania zakaźnych wirusów z pełnowymiarowego cDNA JEV SA14-14-2 zmontowanego w BAC. (A) Linearyzacja matrycy cDNA. Pełnowymiarowy BAC JEV jest cięty enzymem Xba I i traktowany MBN. (B) Synteza transkryptów RNA. Zlinearyzowane cDNA jest transkrybowane przez polimerazę RNA SP6 w obecności analogu czapeczki m7G(5')ppp(5')A. (C) Odzyskiwanie syntetycznych JEV. RNA transkrybowane in vitro jest transfekowane do komórek BHK-21 poprzez elektroporację, co generuje wysoki miano syntetycznego wirusa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy żelowej matrycy cDNA i transkryptów RNA; rozdział DNA według liczby par zasad." src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Synteza RNA poprzez transkrypcję in vitro z wykorzystaniem pełnowymiarowego BAC JEV jako matrycy cDNA. (A) Generowanie zlinearyzowanego pełnowymiarowego BAC JEV, pBAC/SA14-14-2. Dwa niezależne klony pBAC/SA14-14-2 (Cl.1 i Cl.2) są linearyzowane poprzez trawienie enzymem Xba I i następującą po nim obróbkę MBN. Zlinearyzowane BAC są analizowane za pomocą elektroforezy w 0,8% żelu agarozowym. (B) Produkcja syntetycznego RNA poprzez transkrypcję run-off. Każdy z dwóch zlinearyzowanych BAC jest używany jako matryca dla transkrypcji run-off przy użyciu polimerazy RNA SP6. Alikwoty z dwóch reakcji transkrypcji są rozdzielane w 0,6% żelu agarozowym. M, drabinka DNA 1 kb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza zakaźności RNA i wydajności wirusa; wykresy, plaki, mikroskopia fluorescencyjna w badaniu wirusowym." src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Specyficzna zakaźność syntetycznych RNA otrzymanych w wyniku transkrypcji pełnowymiarowego BAC JEV oraz odzyskiwanie syntetycznego wirusa. Komórki BHK-21 poddano pozornej elektroporacji (Mock) lub elektroporacji transkryptami RNA pochodzącymi z każdego z dwóch niezależnych klonów pełnowymiarowego BAC JEV (Cl.1 i Cl.2). (A) Zakaźność RNA. Komórki pokryto agarozą i zabarwiono fioletem krystalicznym 4 dni po transfekcji. Zakaźność RNA określono za pomocą testów centrów infekcyjnych w celu oszacowania ilości zakaźnego RNA wprowadzonego do komórek drogą elektroporacji (panel lewy). Przedstawiono również reprezentatywne obrazy centrów infekcyjnych (panel prawy). (B) Ekspresja białka. Komórki hodowano na szkiełkach komorowych z 4 studniami. Ekspresję białek wirusowych w komórkach po elektroporacji RNA w 20 hr po transfekcji (hpt) przeanalizowano za pomocą testów immunofluorescencyjnych z użyciem pierwszorzędowego przeciwciała króliczego anty-NS1 oraz drugorzędowego przeciwciała koziego anty-króliczego IgG sprzężonego z Cy3 (czerwony). Jądra komórkowe zabarwiono przeciwbarwionym 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (niebieski). Obrazy immunofluorescencyjne nałożono na odpowiadające im obrazy z kontrastu interferencyjnego (DIC). (C) Wydajność wirusa. Komórki hodowano w szalkach hodowlanych o średnicy 150 mm. Produkcję zakaźnych wirionów nagromadzonych w nadsączach hodowlanych komórek po elektroporacji RNA w 22 i 40 hpt zbadano za pomocą testów plackowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Ogólnym celem tej procedury jest odzyskanie zakaźnych cząsteczek wirusa wytworzonych w całości z klonowanego cDNA wirusów RNA o nici dodatniej, których genomy mają tę samą polarność co komórkowe mRNA, takich jak wirus zapalenia mózgu japońskiego. Ta oparta na cDNA genetyka odwrotna jest przełomową metodą umożliwiającą bezpośrednią manipulację wirusowym RNA genomicznym, co pozwala na generowanie wirusów rekombinowanych do badań molekularnych i genetycznych nad replikacją i patogenezą wirusów. Technika ta stanowi również cenną platformę umożliwiającą opracowanie genetycznie zdefiniowanych wektorów wirusowych vaccinia do dostarczania obcych genów.Metody te mają zastosowanie do klonowania pełnej długości cDNA dla szczepów negatywnych lub pozytywnych, wirusów RNA, w szczególności tych o genomach większych niż 10 kb. Procedurę zaprezentują członkowie mojego laboratorium: asystent badawczy Sang-Im Yun, stażyści podoktorscy Byung-Hak Song i Jin-Kyoung Kim oraz student studiów licencjackich Jordan Frank.Część wideo niniejszej publikacji obejmuje przygotowanie bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego sekwencje docelowe, syntezę RNA transkrybowanego z plazmidu typu „back plasmid” oraz sposób pomiaru zakaźności RNA i wydajności wirusa. Wszystkie procedury zastosowane przed wygenerowaniem plazmidu BAC zostały szczegółowo opisane w protokole tekstowym. W tej procedurze należy najpierw wyhodować pojedynczą kolonię E. coli DH10B zawierającą plazmid BAC w trzech mililitrach bulionu 2X YT z chloramfenikolem. Hodowlę inkubuje się przez 10 godzin w temperaturze 35°C przy wytrząsaniu z prędkością od 225 do 250 RPM.Po 10 godzinach zwiększ objętość hodowli. Następnie zaszczep 500 µL kultury w 500 ml medium i inkubuj szczepionkę przez sześć godzin przy intensywnym wytrząsaniu. Po sześciu godzinach odwiruj kulturę bakteryjną w dwóch butelkach o pojemności 250 ml przy 3 100 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie resuspenduj każdy osad w 30 ml roztworu GTE.Dodaj 500 µL lizozymu i inkubuj zawiesiny na lodzie przez 10 minut. W międzyczasie przygotuj świeży roztwór lizujący do następnego kroku. Po 10 minutach dodaj 60 mL roztworu lizującego i mieszaj poprzez wirowanie naczynia, aż roztwór stanie się klarowny.Pozostaw reakcje w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie dodaj 45 mililitrów roztworu neutralizującego do każdej butelki i odwracaj je do góry dnem do czasu dokładnego wymieszania. Następnie umieść je w lodzie na 10 minut.Zneutralizowane lizaty należy zebrać poprzez wirowanie w chłodzonym wirówce przy wysokiej sile g. Następnie nadsączniki przelać do dwóch nowych butelek o pojemności 250 ml. Do każdej z nich dodać 0,6 objętości 100% izopropanolu i pozostawić na lodzie przez 20 minut.Następnie odwiruj osady, odlej nadsączki i rozpuść pellety w pięciu mililitrach buforu TE. Połącz obie objętości w jednej probówce o pojemności 50 mililitrów i wytrąć RNA, dodając równą objętość pięciomolarnego chlorku litu, a następnie inkubując mieszaninę na lodzie przez 10 minut. W celu zebrania osadu RNA przeprowadź 20-minutowe wirowanie w niskiej temperaturze.Następnie przenieś nadsącz do nowej probówki o pojemności 250 ml, dodaj dwie objętości 100% izopropanolu i umieść probówkę w lodzie, aby utworzył się osad DNA. Po 20 minutach odwirowuj osad, odessać nadsącz, zawiesić pellet DNA w 9,5 ml buforu TE i przenieść roztwór DNA do probówki o pojemności 50 ml.Kontynuuj przygotowanie, tworząc gradient chlorku cezu z bromkiem etydyny. Przenieś mieszaninę do szczelnej probówki polipropylenowej za pomocą strzykawki z igłą 18G, a następnie zamknij probówkę. Wirować zamkniętą probówkę przez noc w ultrawirówce w celu utworzenia gradientu chlorku cezu.Następnego dnia należy pobrać prążek DNA z plazmidu BAC z gradientu chlorku cezu. Używając igły o rozmiarze 18 G, należy wykonać otwór odpowietrzający na górze gradientu, a następnie za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 20 G pobrać DNA BAC z boku gradientu i przenieść pobrany materiał do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml. Należy przeprowadzić przemywanie, dodając 2,5 objętości butanolu nasyconego wodą, a następnie wymieszać całość za pomocą standardowego wstrząsania w vortexie.Następnie odwiruj mieszaninę w temperaturze pokojowej i przenieś dolną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. Powtórz to przemywanie łącznie sześć razy, aby usunąć cały bromek etydyny. Teraz przeprowadź precypitację DNA z BAC. Do probówki dodaj objętość 1/10 3 M octanu sodu oraz 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubuj mieszaninę na lodzie przez 10 minut. Następnie odwiruj osad w temperaturze pokojowej i przemyj pellet DNA 1 ml 70% etanolu. Powtórz wirowanie i ponownie zbierz pellet. Na koniec wysusz osad DNA na powietrzu przez 10 minut i eluuj go w 200 µL buforu TE.Rozpocznij od wielkoskalowego trawienia enzymem restrykcyjnym plazmidu BAC za pomocą Xba-one w całkowitej objętości 100 µL. Trawienie prowadź w temperaturze 37 °C przez 12 do 15 godzin. Następnie inkubuj mieszaninę z dodatkowymi 25 jednostkami nukleazy z fasoli mung w temperaturze 30 °C przez dwie godziny.Po inkubacji uzupełnić objętość do 300 µL wodą destylowaną. Następnie przeprowadzić ekstrakcję fenolową poprzez dodanie do rozcieńczonej próbki takiej samej objętości mieszaniny fenol-chloroform i alkoholu izoamylkowego, intensywne wymieszanie na wortexie przez minutę, odwirowanie próbki i przeniesienie górnej fazy wodnej do nowej probówki.Następnie powtórz ekstrakcję chloroformem. W kolejnym kroku odzyskaj zlinearyzowane DNA BAC poprzez precypitację etanolem. Zbierz osad DNA za pomocą wirowania, odlej nadsącz i przemyj osad jednym mililitrem 70% etanolu. Powtórz etap wirowania i wysusz osad na powietrzu. Po 10 minutach suszenia rozpuść osad DNA w 30 mikrolitrach wody destylowanej. Następnie poddaj analizie jeden mikrolitr odzyskanego BAC na 0,8% żelu agarozowym.Następnie należy przeprowadzić 25 µL reakcji transkrypcji typu runoff z linearyzowanego DNA BAC, z dodatkiem znakowanego trytem UTP w celu ilościowego oznaczenia RNA. Reakcję należy prowadzić w temperaturze 37 °C przez godzinę. Następnie należy poddać analizie jeden lub dwa µL produktu reakcji transkrypcji typu runoff na żelu agarozowym o stężeniu 0,6%.Zacznij od komórek BHK-21 hodowanych przez 24 godziny w szalkach o średnicy 150 mm, wysianych w zagęszczeniu 3 milionów komórek na szalkę. Przepłucz monowarstwę komórek zimnym roztworem A, a następnie odseparuj je poprzez trypsynizację. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 270 g przez dwie minuty.Następnie komórki resuspendować w 50 ml zimnego roztworu A i ponownie odwirować. Płukanie powtórzyć trzykrotnie. Po ostatnim płukaniu komórki resuspendować w roztworze A do stężenia 20 milionów na ml. Następnie 400 µl aliquotę zawiesiny komórkowej zmieszać z 2 µg syntetycznego RNA w kuwecie o szerokości 2 mm.Niezwłocznie przeprowadź elektroporację mieszaniny w optymalnych warunkach i pozostaw komórki na 10 minut. Następnie przenieś komórki do probówki do mikrowirówki zawierającej 600 µL pełnej pożywki hodowlanej. Przygotuj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne elektroporowanych komórek w objętościach 1 mL. Naniesienie 100 µL aliquotów każdego rozcieńczenia na monowarstwy prawidłowych komórek BHK21. Po czterech do sześciu godzinach inkubacji przykryj komórki 0,5% agarozą w MEM z dodatkiem FBS i hoduj je przez kolejne cztery dni.Komórki BHK21 poddano pozornej elektroporacji lub elektroporacji transkryptami RNA pochodzącymi z dwóch niezależnych klonów pełnowymiarowego JEV-BAC. Po czterech dniach komórki zabarwiono fioletem krystalicznym w celu uwidocznienia zakaźnego RNA w komórkach. Na podstawie tego zabarwienia określono liczbę ognisk zakaźnych. Następnie, 20 godzin po transfekcji, zbadano ekspresję białek wirusowych w komórkach poddanych elektroporacji RNA, wykorzystując królicze antyserum przeciwko NS-one oraz sprzężone z Cy3 przeciwciało wtórne, widoczne w kolorze czerwonym. Jądra komórkowe zabarwiono kontrastowo DAPI, widocznym w kolorze niebieskim. Później, po 22 i 40 godzinach od transfekcji, za pomocą testów plackowych zbadano akumulację zakaźnych wirionów w nadsączach hodowlanych komórek poddanych elektroporacji RNA.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak w pełni odtworzyć zakaźnego wirusa z klonowanego cDNA szczepu pozytywnego, RNA, takiego jak wirus zapalenia mózgu japońskiego. Należy pamiętać, że praca z wirusem zapalenia mózgu japońskiego oraz innymi patogenami ludzkimi może być niezwykle niebezpieczna. Przed przeprowadzeniem tej procedury niezbędne jest odpowiednie przeszkolenie w zakresie bezpieczeństwa biologicznego.

bacterial-artificial-chromosomes-functional-genomics-tool-for-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Bakteryjne sztuczne chromosomy: Narzędzie do genomiki funkcjonalnej w badaniach nad wirusami RNA z łańcuchem dodatnim

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się...

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Źródło: Yun, S. et al. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (2015)Niniejszy film przedstawia odzyskiwanie zakaźnego wirusa zapalenia mózgu japońskiego z syntetycznego RNA przetranskrybowanego z klonu bakteryjnego chromosomu sztucznego. Pokazuje on proces elektroporacji komórek syntetycznym RNA, co pozwala genomowi wirusa na kierowanie produkcją nowych wirionów. Powstałe w wyniku tego plaki w zakażonych...

Odzyskiwanie zakaźnych wirionów z komórek transfekowanych syntetycznym RNA pochodzącym z bakteryjnego sztucznego chromosomu

Tutaj prezentujemy nowe podejście do identyfikacji wirusów roślinnych za pomocą dwuniciowych genomów DNA. Stosujemy standardowe metody ekstrakcji DNA i RNA z zakażonych liści oraz przeprowadzamy sekwencjonowanie nowej generacji. Narzędzia bioinformatyczne łączą sekwencje w kontigi, identyfikują kontigi reprezentujące genomy wirusów i przypisują genomy do grup taksonomicznych.

Połączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionu z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

Dwuniciowe RNA wytwarzane podczas replikacji wirusa RNA mogą być rozpoznawane przez receptory rozpoznające wzorce, aby wywołać wrodzoną odpowiedź immunologiczną. W przypadku wirusów RNA o ujemnym znaczeniu interakcja między niskim poziomem dsRNA a PRR pozostaje niejasna. Opracowaliśmy metodę mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dsRNA i PRR arenawirusa w poszczególnych komórkach.

Obrazowanie konfokalne dwuniciowego RNA i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniu wirusem RNA o ujemnym znaczeniu

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Niedawna epidemia wirusa Zika podkreśla znaczenie ustanowienia odwrotnego podejścia genetycznego do opracowania szczepionek i/lub strategii terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół ratowania zakaźnego rekombinowanego wirusa Zika z pełnowymiarowego klonu cDNA złożonego w bakteryjnym sztucznym chromosomie pod kontrolą ludzkiego wirusa cytomegalii o natychmiastowym wczesnym promotorze.

Uratowanie rekombinowanego wirusa Zika z bakteryjnego klonu cDNA ze sztucznego chromosomu

Dla dogłębnej analizy mechanistycznej syntezy RNA syncytialnego wirusa oddechowego (RSV), przedstawiamy protokół wykorzystania fosfoproteiny opiekuńczej (P) do koekspresji nukleoproteiny wolnej od RNA (N0) do późniejszego składania in vitro specyficznych dla wirusa nukleokapsydów (NC).

Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

Protokół opisuje metodę wprowadzania kontrolowanej różnorodności genetycznej w genomie wirusa zapalenia wątroby typu C poprzez połączenie pełnej długości syntezy zmutowanego RNA za pomocą podatnego na błędy PCR i genetyki odwrotnej. Metoda ta stanowi model selekcji fenotypu i może być stosowana do 10 kb długich genomów wirusa RNA o dodatnim sensie.

Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskania wektora wyrażenia pVAX1-PRRSV poprzez wprowadzenie odpowiednich miejsc restrykcyjnych na końcu 3' wstawek. Możemy linearyzować wektor i łączyć fragmenty DNA z wektorem jeden po drugim za pomocą technologii rekombinacji homologicznej.

Bezproblemowe podejście do klonowania konstrukcji wektora ekspresji wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń

Opisujemy wydajną metodę oddzielania jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz cząsteczek RNA z wirusowych społeczności środowiskowych. Kwasy nukleinowe są frakcjonowane przy użyciu chromatografii na hydroksyapatycie z zastosowaniem rosnących stężeń buforów zawierających fosforany. Metoda ta umożliwia izolację wszystkich typów wirusowych kwasów nukleinowych z próbek środowiskowych.

Wyodrębnianie jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz RNA z środowiskowej populacji wirusów z wykorzystaniem chromatografii na hydroksyapatycie

Poznaj metodę tworzenia zakaźnych cząstek wirusa z klonowanego cDNA wirusa JEV przy użyciu sztucznych chromosomów bakteryjnych. Ta technika umożliwia badanie biologii wirusów RNA i rozwój szczepionek.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Przeglądaj więcej filmów