Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Ogólnym celem tej procedury jest uratowanie zakaźnych cząstek wirusa wykonanych w całości ze sklonowanego CDNA o dodatniej nici RNA, wirusów RNA, których genomy są w tej samej polaryzacji co Mr.NA komórkowe, takich jak wirus japońskiego zapalenia mózgu. Ta genetyka regenowa oparta na CNA jest metodą semialną, która umożliwia bezpośrednią manipulację genomowym RNA wirusa, generując w ten sposób rekombinowane wirusy do badań molekularnych i genetycznych w replikacji i patogenezie wirusa. Technika ta stanowi również cenną platformę, która umożliwia opracowanie genetycznie zdefiniowanych szczepionek i wektorów wirusowych do dostarczania obcych genów.

Naczynia te mają zastosowanie do klonowania pełnej długości CDNA dla długości lub dodatniego szczepu wirusów RNA, szczególnie tych o genomach większych niż 10 kb. Procedurę zademonstruje kilku członków mojego asystenta laboratoryjnego, profesora San Nun, doktora habilitowanego UNG i Xing y Kim oraz studentów studiów licencjackich, Jordana Franka. Część wideo tej publikacji obejmuje przygotowanie sztucznego chromosomu bakteryjnego zawierającego interesujące sekwencje, syntezę RNA, transkrybowanego z tylnego plazmidu, oraz sposób pomiaru zakaźności RNA i wydajności wirusa.

Wszystkie procedury stosowane przed wygenerowaniem plazmidu wstecznego są bardzo szczegółowo opisane w protokole tekstowym. W tej procedurze najpierw wyhoduj pojedynczą kolonię E coli DH 10 B, przenosząc tylny plazmid w trzech mililitrach dwóch bulionów XYT z chloramfenikolem. Inkubować kulturę przez 10 godzin w temperaturze 35 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 225 do 250 obr./min.

Po 10 godzinach zwiększ skalę hodowli, a następnie zaszczep 500 mikrolitrów wzrostu w 500 mililitrach pożywki i hoduj inokulum przez sześć godzin, energicznie potrząsając po sześciu godzinach. Odwirować kulturę bakteryjną w 2 250 mililitrowych butelkach o sile 3,100 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś każdą granulkę w 30 mililitrach roztworu GTE.

Dodać 500 mikrolitrów lizozymu i inkubować zawiesiny na lodzie przez 10 minut. W międzyczasie przygotuj świeży roztwór do lizy do następnego kroku. Po 10 minutach dodaj 60 mililitrów roztworu do lizy i mieszaj, mieszając, aż roztwór stanie się klarowny.

Pozwól reakcjom zachodzić w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie dodaj 45 mililitrów roztworu neutralizującego do każdej butelki i odwróć butelki, aż dokładnie się wymieszają. Następnie połóż je na lodzie na 10 minut.

Zebrać zneutralizowane lizaty za pomocą wirówki z chłodzeniem o wysokim współczynniku G. Następnie zbierz supernatanty do dwóch nowych butelek o pojemności 250 mililitrów. Dodaj 0,6 objętości 100% izopropanolu do każdego i umieść je na lodzie na 20 minut.

Następnie odwiruj osady, a następnie odrzuć supernatanty i rozpuść granulki w pięciu mililitrach buforu TE. Połącz dwie objętości w jednej 50-mililitrowej probówce i wytrącić RNA, dodając równą objętość pięciu molowych chlorków litu i inkubując mieszaninę na lodzie przez 10 minut. Użyj 20-minutowego zimnego wirowania, aby zebrać osad RNA.

Następnie przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 250 mililitrów. Dodaj dwie objętości 100% izopropanolu i umieść probówkę na lodzie, aby wytrącił się osad DNA. Po 20 minutach odwirować osad, odessać supernatant, ponownie zawiesić osad DNA w 9,5 mililitra buforu TE i przenieść roztwór DNA do probówki o pojemności 50 mililitrów.

Kontynuować przygotowanie, ustawiając gradient chlorku cezu za pomocą bromku tego dium. Załaduj mieszaninę do zamykanej rurki polipropylenowej za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 18 i uszczelnij probówkę. Zakręć zamkniętą probówkę przez noc w ultrawirówce, aby utworzyć gradient chlorku cezu.

Następnego dnia zbierz pasmo DNA tylnego plazmidu z gradientu chlorku cezu. Użyj igły o rozmiarze 18, aby utworzyć otwór wentylacyjny w górnej części gradientu i igły o rozmiarze 20 ze strzykawką, aby zebrać tylne DNA z boku gradientu, a następnie przenieś kolekcję do 1,7 mililitrowej rurki mikro fuge. Wykonaj pranie, dodaj 2,5 objętości butanolu nasyconego wodą i wymieszaj z normalnym wirowaniem.

Następnie odwiruj mieszaninę w temperaturze pokojowej i przenieś dolną fazę wodną do nowej 1,7 mililitrowej probówki do mikrofuge. Powtórz to pranie w sumie sześć razy, aby usunąć cały bromek etydyny. Teraz wytrącić wsteczne DNA.

Dodać jedną dziesiątą objętości trzech molowych octanu sodu i 2,5 objętości 100% etanolu do probówki. Inkubuj mieszaninę na lodzie przez 10 minut. Następnie odwirować osad w temperaturze pokojowej i przemyć osad DNA jednym mililitrem 70% etanolu.

Powtórz wirowanie i ponownie zbierz pellet. Na koniec wysusz granulowane DNA na powietrzu przez 10 minut i umieść je w 200 mikrolitrach buforu TE. Rozpocznij od trawienia enzymu restrykcyjnego na dużą skalę tylnego plazmidu za pomocą xbo.

Jeden na łączną objętość 100 mikrolitrów. Wykonuj to trawienie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 15 godzin. Następnie kontynuuj wytrawianie z dodatkowymi 25 jednostkami nukleazy fasoli mung w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Po inkubacji doprowadzić objętość do 300 mikrolitrów wodą destylowaną. Teraz wykonaj ekstrakcję fenolową, dodając równą objętość chloroformu fenolowego, alkoholu izoamylowego do rozcieńczonej próbki. Wirowanie energicznie przez minutę, wirowanie w dół probówki i przenoszenie górnej fazy wodnej do nowej probówki.

Następnie powtórzyć ekstrakcję chloroformem. Następnie odzyskaj zlinearyzowane DNA przez wytrącanie etanolu. Zebrać osad DNA za pomocą wirowania, wyrzucić supernatant i umyć osad jednym mililitrem 70% etanolu.

Powtórz etap wirowania i wysusz granulki na powietrzu. Po 10 minutach suszenia rozpuść osad DNA w 30 mikrolitrach wody destylowanej. Następnie zbadaj jeden mikrolitr odzyskanego z powrotem na żelu 0,8% AROS.

Następnie ustaw 25-mikrolitrową transkrypcję odpływową zlinearyzowanego wstecznego DNA, w tym tritiated UTP do kwantyfikacji RNA. Przeprowadzaj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie zbadaj jeden lub dwa mikrolitry spływającej reakcji transkrypcji na 0,6% żelu AROS.

Zacznij od komórek BHK 21 hodowanych przez 24 godziny w 150-milimetrowych szalkach podanych po 3 miliony komórek na szalkę. Przepłucz monowarstwę komórek zimnym roztworem A, a następnie odłącz je trypsyną. Z drugiej strony. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 270 GS przez dwie minuty.

Następnie ponownie zawieś komórki w 50 mililitrach zimnego roztworu A i ponownie je odwiruj. Powtórz to pranie trzy razy po ostatnim praniu. Ponownie zawiesić komórki w ilości 20 milionów na mililitr w roztworze A. Następnie wymieszać 400 mikrolitrów podwielokrotności zawiesiny komórkowej z dwoma mikrogramami syntetycznego RNA w dwumilimetrowym roztworze.

Natychmiast oczyść mieszaninę elektrolitycznie w optymalnych warunkach i pozwól ogniwom odpocząć przez 10 minut. Następnie przenieś komórki do mikroprobówki fuge zawierającej 600 mikrolitrów kompletnej pożywki hodowlanej. Teraz przygotuj dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie elektroporowanych komórek w objętościach jednego mililitra, podaj 100 mikrolitrów porcji każdego rozcieńczenia na monowarstwach normalnych komórek bhk 21 po czterech do sześciu godzinach inkubacji, nałóż na komórki 0,5% aros w MEM plus FBS i hoduj je przez kolejne cztery dni.

Komórki Bhk 21 zostały pozorowane elektroporowane lub elektroporowane transkryptami RNA pochodzącymi z dwóch niezależnych klonów pełnej długości JEV Cztery dni później komórki zabarwiono fioletem krystalicznym, aby zobaczyć zakaźny RNA w komórkach. Za pomocą tego barwnika oznaczono ilościowo ośrodki zakaźne. Następnie ekspresję białka wirusa zbadano w komórkach poddanych elektroporacji RNA 20 godzin po transfekcji przy użyciu anty NS, jednej surowicy anty królika i trój-sprzężonego przeciwciała drugorzędowego SI widocznego na czerwono.

Jądra były przebarwieniami z DAPI widocznymi na niebiesko. Później, po 22 i 40 godzinach od transfekcji, produkcja zakaźnych varianów nagromadziła się w kulturze. Supernatanty komórek wyładowanych elektroporacją RNA badano za pomocą testów płytki nazębnej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak całkowicie uratować zakaźnego wirusa ze sklonowanego CNA pozytywnego szczepu RNA, takiego jak wirus japońskiego zapalenia mózgu. Nie zapominaj więc, że praca z wirusem japońskiego zapalenia mózgu i innymi ludzkimi patogenami może być niezwykle niebezpieczna. Przed wykonaniem tej procedury konieczne jest odpowiednie przeszkolenie w zakresie bezpieczeństwa biologicznego.