Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Ogólnym celem tej procedury jest odzyskanie zakaźnych cząsteczek wirusa wytworzonych w całości z klonowanego cDNA wirusów RNA o nici dodatniej, których genomy mają tę samą polarność co komórkowe mRNA, takich jak wirus zapalenia mózgu japońskiego. Ta oparta na cDNA genetyka odwrotna jest przełomową metodą umożliwiającą bezpośrednią manipulację wirusowym RNA genomicznym, co pozwala na generowanie wirusów rekombinowanych do badań molekularnych i genetycznych nad replikacją i patogenezą wirusów. Technika ta stanowi również cenną platformę umożliwiającą opracowanie genetycznie zdefiniowanych wektorów wirusowych vaccinia do dostarczania obcych genów.

Metody te mają zastosowanie do klonowania pełnej długości cDNA dla szczepów negatywnych lub pozytywnych, wirusów RNA, w szczególności tych o genomach większych niż 10 kb. Procedurę zaprezentują członkowie mojego laboratorium: asystent badawczy Sang-Im Yun, stażyści podoktorscy Byung-Hak Song i Jin-Kyoung Kim oraz student studiów licencjackich Jordan Frank.

Część wideo niniejszej publikacji obejmuje przygotowanie bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego sekwencje docelowe, syntezę RNA transkrybowanego z plazmidu typu „back plasmid” oraz sposób pomiaru zakaźności RNA i wydajności wirusa. Wszystkie procedury zastosowane przed wygenerowaniem plazmidu BAC zostały szczegółowo opisane w protokole tekstowym. W tej procedurze należy najpierw wyhodować pojedynczą kolonię E. coli DH10B zawierającą plazmid BAC w trzech mililitrach bulionu 2X YT z chloramfenikolem. Hodowlę inkubuje się przez 10 godzin w temperaturze 35°C przy wytrząsaniu z prędkością od 225 do 250 RPM.

Po 10 godzinach zwiększ objętość hodowli. Następnie zaszczep 500 µL kultury w 500 ml medium i inkubuj szczepionkę przez sześć godzin przy intensywnym wytrząsaniu. Po sześciu godzinach odwiruj kulturę bakteryjną w dwóch butelkach o pojemności 250 ml przy 3 100 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie resuspenduj każdy osad w 30 ml roztworu GTE.

Dodaj 500 µL lizozymu i inkubuj zawiesiny na lodzie przez 10 minut. W międzyczasie przygotuj świeży roztwór lizujący do następnego kroku. Po 10 minutach dodaj 60 mL roztworu lizującego i mieszaj poprzez wirowanie naczynia, aż roztwór stanie się klarowny.

Pozostaw reakcje w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie dodaj 45 mililitrów roztworu neutralizującego do każdej butelki i odwracaj je do góry dnem do czasu dokładnego wymieszania. Następnie umieść je w lodzie na 10 minut.

Zneutralizowane lizaty należy zebrać poprzez wirowanie w chłodzonym wirówce przy wysokiej sile g. Następnie nadsączniki przelać do dwóch nowych butelek o pojemności 250 ml. Do każdej z nich dodać 0,6 objętości 100% izopropanolu i pozostawić na lodzie przez 20 minut.

Następnie odwiruj osady, odlej nadsączki i rozpuść pellety w pięciu mililitrach buforu TE. Połącz obie objętości w jednej probówce o pojemności 50 mililitrów i wytrąć RNA, dodając równą objętość pięciomolarnego chlorku litu, a następnie inkubując mieszaninę na lodzie przez 10 minut. W celu zebrania osadu RNA przeprowadź 20-minutowe wirowanie w niskiej temperaturze.

Następnie przenieś nadsącz do nowej probówki o pojemności 250 ml, dodaj dwie objętości 100% izopropanolu i umieść probówkę w lodzie, aby utworzył się osad DNA. Po 20 minutach odwirowuj osad, odessać nadsącz, zawiesić pellet DNA w 9,5 ml buforu TE i przenieść roztwór DNA do probówki o pojemności 50 ml.

Kontynuuj przygotowanie, tworząc gradient chlorku cezu z bromkiem etydyny. Przenieś mieszaninę do szczelnej probówki polipropylenowej za pomocą strzykawki z igłą 18G, a następnie zamknij probówkę. Wirować zamkniętą probówkę przez noc w ultrawirówce w celu utworzenia gradientu chlorku cezu.

Następnego dnia należy pobrać prążek DNA z plazmidu BAC z gradientu chlorku cezu. Używając igły o rozmiarze 18 G, należy wykonać otwór odpowietrzający na górze gradientu, a następnie za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 20 G pobrać DNA BAC z boku gradientu i przenieść pobrany materiał do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml. Należy przeprowadzić przemywanie, dodając 2,5 objętości butanolu nasyconego wodą, a następnie wymieszać całość za pomocą standardowego wstrząsania w vortexie.

Następnie odwiruj mieszaninę w temperaturze pokojowej i przenieś dolną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. Powtórz to przemywanie łącznie sześć razy, aby usunąć cały bromek etydyny. Teraz przeprowadź precypitację DNA z BAC. Do probówki dodaj objętość 1/10 3 M octanu sodu oraz 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubuj mieszaninę na lodzie przez 10 minut. Następnie odwiruj osad w temperaturze pokojowej i przemyj pellet DNA 1 ml 70% etanolu. Powtórz wirowanie i ponownie zbierz pellet. Na koniec wysusz osad DNA na powietrzu przez 10 minut i eluuj go w 200 µL buforu TE.

Rozpocznij od wielkoskalowego trawienia enzymem restrykcyjnym plazmidu BAC za pomocą Xba-one w całkowitej objętości 100 µL. Trawienie prowadź w temperaturze 37 °C przez 12 do 15 godzin. Następnie inkubuj mieszaninę z dodatkowymi 25 jednostkami nukleazy z fasoli mung w temperaturze 30 °C przez dwie godziny.

Po inkubacji uzupełnić objętość do 300 µL wodą destylowaną. Następnie przeprowadzić ekstrakcję fenolową poprzez dodanie do rozcieńczonej próbki takiej samej objętości mieszaniny fenol-chloroform i alkoholu izoamylkowego, intensywne wymieszanie na wortexie przez minutę, odwirowanie próbki i przeniesienie górnej fazy wodnej do nowej probówki.

Następnie powtórz ekstrakcję chloroformem. W kolejnym kroku odzyskaj zlinearyzowane DNA BAC poprzez precypitację etanolem. Zbierz osad DNA za pomocą wirowania, odlej nadsącz i przemyj osad jednym mililitrem 70% etanolu. Powtórz etap wirowania i wysusz osad na powietrzu. Po 10 minutach suszenia rozpuść osad DNA w 30 mikrolitrach wody destylowanej. Następnie poddaj analizie jeden mikrolitr odzyskanego BAC na 0,8% żelu agarozowym.

Następnie należy przeprowadzić 25 µL reakcji transkrypcji typu runoff z linearyzowanego DNA BAC, z dodatkiem znakowanego trytem UTP w celu ilościowego oznaczenia RNA. Reakcję należy prowadzić w temperaturze 37 °C przez godzinę. Następnie należy poddać analizie jeden lub dwa µL produktu reakcji transkrypcji typu runoff na żelu agarozowym o stężeniu 0,6%.

Zacznij od komórek BHK-21 hodowanych przez 24 godziny w szalkach o średnicy 150 mm, wysianych w zagęszczeniu 3 milionów komórek na szalkę. Przepłucz monowarstwę komórek zimnym roztworem A, a następnie odseparuj je poprzez trypsynizację. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 270 g przez dwie minuty.

Następnie komórki resuspendować w 50 ml zimnego roztworu A i ponownie odwirować. Płukanie powtórzyć trzykrotnie. Po ostatnim płukaniu komórki resuspendować w roztworze A do stężenia 20 milionów na ml. Następnie 400 µl aliquotę zawiesiny komórkowej zmieszać z 2 µg syntetycznego RNA w kuwecie o szerokości 2 mm.

Niezwłocznie przeprowadź elektroporację mieszaniny w optymalnych warunkach i pozostaw komórki na 10 minut. Następnie przenieś komórki do probówki do mikrowirówki zawierającej 600 µL pełnej pożywki hodowlanej. Przygotuj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne elektroporowanych komórek w objętościach 1 mL. Naniesienie 100 µL aliquotów każdego rozcieńczenia na monowarstwy prawidłowych komórek BHK21. Po czterech do sześciu godzinach inkubacji przykryj komórki 0,5% agarozą w MEM z dodatkiem FBS i hoduj je przez kolejne cztery dni.

Komórki BHK21 poddano pozornej elektroporacji lub elektroporacji transkryptami RNA pochodzącymi z dwóch niezależnych klonów pełnowymiarowego JEV-BAC. Po czterech dniach komórki zabarwiono fioletem krystalicznym w celu uwidocznienia zakaźnego RNA w komórkach. Na podstawie tego zabarwienia określono liczbę ognisk zakaźnych. Następnie, 20 godzin po transfekcji, zbadano ekspresję białek wirusowych w komórkach poddanych elektroporacji RNA, wykorzystując królicze antyserum przeciwko NS-one oraz sprzężone z Cy3 przeciwciało wtórne, widoczne w kolorze czerwonym. Jądra komórkowe zabarwiono kontrastowo DAPI, widocznym w kolorze niebieskim. Później, po 22 i 40 godzinach od transfekcji, za pomocą testów plackowych zbadano akumulację zakaźnych wirionów w nadsączach hodowlanych komórek poddanych elektroporacji RNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak w pełni odtworzyć zakaźnego wirusa z klonowanego cDNA szczepu pozytywnego, RNA, takiego jak wirus zapalenia mózgu japońskiego. Należy pamiętać, że praca z wirusem zapalenia mózgu japońskiego oraz innymi patogenami ludzkimi może być niezwykle niebezpieczna. Przed przeprowadzeniem tej procedury niezbędne jest odpowiednie przeszkolenie w zakresie bezpieczeństwa biologicznego.