Name: Szybka hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych na mózgu szczurów z zespołem serotoninowym z przedrostkiem paraformaldehydu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Naucz się szybkiej hybrydyzacji in situ z sondami oligonukleotydowymi na mózgu szczurów z przedrostkiem paraformaldehydu. Ta metoda upraszcza wykrywanie ekspresji genu htr2a w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant NIH (R15DA029863), grant na badania licencjackie Florida Atlantic University (M30014) oraz grant badawczy Ross University School of Veterinary Medicine. Chcielibyśmy podziękować Narodowemu Instytutowi ds. Nadużywania Narkotyków (Rockville, MD) za dostarczenie (±)3,4-metylenodioksymetamfetaminy (±MDMA) dla tej pracy.

Procedury wykorzystania zwierząt opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Ross University School of Veterinary Medicine i Florida Atlantic University. Chociaż wymagane są sterylne techniki i rękawice, środowisko wolne od RNaz nie jest konieczne podczas korzystania z tego protokołu.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotowanie i cięcie tkanek
	<ol>
		<li>Szczury należy losowo podzielić na trzy grupy: świeże/sola fizjologiczna (SAL; 0,9% NaCl), z prefiksem/SAL i z prefiksem/3,4-metylenodioksymetamfetamina (MDMA; szczegóły w tabeli 1).</li>
		<li>Podawać trzy dawki 1 ml/kg SAL i 10 mg/kg MDMA odpowiednio dootrzewnowo grupom SAL i MDMA w odstępie 2 godzin. Pozwól zwierzętom przetrwać leczenie przez 6 dni.</li>
		<li>W dniu 7 należy podać szczurom 100 mg/kg ketaminy w połączeniu z 5 mg/kg ksylazyny dootrzewnowo w celu głębokiego znieczulenia (tj. utraty mrugania rogówką i odruchów szczypania ogona).</li>
		<li>W przypadku grupy świeżej/SAL należy szybko odciąć głowy szczurom i usunąć mózg w celu przeprowadzenia nowego testu mózgu (patrz szczegóły w odnośniku5).</li>
		<li>W przypadku grup z prefiksem/SAL i z prefiksem/MDMA wykonaj nacięcie wzdłuż mostka około 10 -12 cm, a następnie odsłoń koniec mostka.</li>
		<li>Przytrzymaj koniec mostka hemostatem i przetnij przeponę bocznie po obu stronach ostrymi nożyczkami, a następnie przetnij w górę przez żebra i równolegle do płuc.</li>
		<li>Jedną ręką przytrzymaj brzuszny koniec serca małymi kleszczami. Drugą ręką przekłuć lewą komorę igłą strzykawkową 18 G (należy zauważyć, że strona adaptera igły jest połączona silikonowym wężem w kształcie litery Y z lodowatymi pojemnikami SAL i paraformaldehydu oraz pompami perystaltycznymi; patrz odniesienie9).</li>
		<li>Włączyć pompę SAL na średnim poziomie natężenia przepływu (~5 ml/min) i przekłuć prawy przedsionek kleszkami, aby umożliwić ucieczkę z krążenia powrotnego. Utrzymuj perfuzję SAL przez 30 minut.</li>
		<li>Włącz pompę paraformaldehydu na średnim poziomie i pozwól, aby lodowaty 4% paraformaldehyd przenikał zwierzę przez 30 minut.</li>
		<li>Wyjmij narzędzie do perfuzji i odetnij głowę zwierzęciu. Wykonaj tylne przednie przecięcie przez linię środkową czaszki, a następnie klapnij czaszką, aby odsłonić jamę czaszki 10.</li>
		<li>Wyjąć mózg szpatułką z jamy czaszki i umieścić mózg w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml 4% paraformaldehydu. Przechowywać mózg w probówce zawierającej paraformaldehyd w temperaturze 4 ºC w lodówce przez 24 godziny.</li>
		<li>Przenieść mózg do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml 30% roztworu sacharozy w temperaturze 4 °C przez 3 dni. Na koniec przechowuj mózg w plastikowych torebkach w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
		<li>Zamontuj mózg na uchwycie z pożywką do zatapiania i zamroź pożywkę zawierającą mózg w kriostacie w temperaturze -26 ºC. Pokrój świeżo zamrożony mózg na sekcje 20 μm, a mózg z prefiksem paraformaldehydu na sekcje 10 μm. Przenieś przekrój na szkiełko mikroskopu RT, dotykając szkiełka do sekcji.</li>
		<li>Suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Przechowywać szkiełka sekcyjne w szczelnie zamkniętej torbie w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>odwodnienie
	<ol>
		<li>Pobrać szkiełka podstawowe z zamrażarki w temperaturze -80 °C i przypisać sekcje do jednego z trzech testów: ht2a, ppiB (kontrola dodatnia) lub dapB (kontrola ujemna); oznaczyć i oznaczyć sekcje długopisem (nie używać ołówka). Zanurz szkiełka w 100% alkoholu o temperaturze pokojowej na 5 minut. Suszyć szkiełka przez 5 minut w dygestorium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępnej obróbki
	<ol>
		<li>Odpipetować 20 μl odczynnika Pretreat-1 (inaktywacja fosfatazy alkalicznej) do skrawków na szkiełkach. Umieść szkiełka na szynie stojaka w tacce na wilgoć (należy pamiętać, że taca jest przykryta pokrywką, aby utrzymać wysoką wilgotność, aby zapobiec parowaniu z roztworu reakcyjnego).</li>
		<li>Delikatnie potrząsać tacką na wilgoć na wytrząsarce poziomej z małą prędkością przez 10 minut. Umyć szkiełka dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) przez 2 minuty. Zanurzyć szkiełko w zlewce o pojemności 200 ml zawierającej 150 ml odczynnika Pretreat-2 (zerwanie wiązań krzyżowych wywołane wiązaniem paraformaldehydu). Gotować szkiełka w sumie przez 5 minut w temperaturze 100 ºC (odbudowa struktury RNA wywołana ciepłem11).</li>
		<li>Umyć szkiełka dwukrotnie za pomocą ddH2O przez 2 min. Umieścić szkiełka w 100% alkoholu na 5 min. Suszyć szkiełka przez 5 min w dygestorium. Użyj pisaka hydrofobowego, aby narysować okrąg wokół wybranego obszaru w sekcji tkanki (np. struktury niekorowe, w tym wzgórze i podwzgórze, jak pokazano na rysunku 2).</li>
		<li>Odpipetować 10 μl odczynnika Pretreatment-3 (zwiększa penetrację sondy) do każdego wybranego obszaru i przykryć tackę na wilgoć pokrywką. Umieścić blachę w piecu do hybrydyzacji wyposażonym w wytrząsarkę poziomą i ustawić temperaturę piekarnika na 40 °C; Delikatnie potrząsaj tacką przez 30 minut. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą ddH2O przez 2 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hybrydyzacja i amplifikacja
<ol>
	<li>Odpipetować 10 μl odpowiednio odczynników do sondy htr2a, ppiB i dapB na wybrane obszary. Przykryj tackę na wilgoć pokrywką, aby zapobiec parowaniu odczynnika. Delikatnie potrząśnij wytrząsarką poziomą ustawioną na niską prędkość. Inkubować szkiełka w temperaturze 40 °C w piekarniku przez 2 godziny.</li>
	<li>Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem płuczącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-1 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze 40 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-2 na każdym wybranym obszarze, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze 40 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem płuczącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-3 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze 40 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem płuczącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-4 na każdym wybranym obszarze, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze 40 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem płuczącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-5 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez 2 minuty. Odpipetować 10 μl odczynnika Amplification-6 na każdy wybrany obszar, wstrząsnąć i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 15 min. Przemyć szkiełka dwukrotnie buforem do przemywania przez 2 min.</li>
</ol>
3. Wykrywanie sygnału
<ol>
	<li>Odpipetować 10 μl odczynnika Red do każdego wybranego obszaru (Należy pamiętać, że odczynnik jest mieszaniną Red-B i Red-A w stosunku 1:60 i należy go natychmiast zużyć). Umieść szkiełko w tacce na wilgoć na wytrząsarce poziomej w pozycji RT i delikatnie potrząsaj niską prędkością przez 10 minut.</li>
	<li>Umyć szkiełka dwukrotnie (ddH2O) przez 10 min. Suszyć szkiełka w temperaturze 60 ºC w piekarniku przez 15 min. Umieścić szkiełka w ksylenie pod wyciągiem na 5 minut. Odpipetować 20 μl materiału montażowego na bazie ksylenu na każdy wybrany obszar i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.</li>
</ol>
4. Przechwytywanie obrazu
<ol>
	<li>Wykonaj cyfrowe mikrofotografie wybranych obszarów (np. podwzgórze, rysunki 1 i 3) w powiększeniu 4× i 20× soczewek obiektywowych. Zapisz plik obrazu.</li>
</ol>
5. Analiza cząstek obrazu
<ol>
	<li>Przeciągnij i upuść plik obrazu do głównego okna ImageJ. Przejdź do paska menu i wybierz "Obraz", następnie wybierz "Typ" z menu rozwijanego i wybierz "8-bitowy".</li>
	<li>Wybierz "Dostosuj", a następnie wybierz "Próg", aby otworzyć okno dialogowe. Dostosuj dolną wartość paska w oknie dialogowym, aby usunąć niechciane tło. Przejdź do paska menu i wybierz "Analizuj", a następnie wybierz "Analizuj cząstki", aby otworzyć drugie okno dialogowe.</li>
	<li>Ustaw wielkość cząstek na 10, następnie wybierz "Pokaż kontury" i wybierz pola "Wyświetl wyniki" i "Podsumuj". Na koniec kliknij "OK", aby wyświetlić dane cząstek w oknach dialogowych.</li>
</ol>
6. Obliczanie w arkuszu kalkulacyjnym
<ol>
	<li>Wprowadź dane do arkusza Excela i uśrednij liczbę cząstek w grupie SAL jako linię bazową. Oblicz poziom procentowy każdej sekcji i wykonaj odpowiedni wykres (Rysunek 4).</li>
</ol>

<ol><li>Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+syndrome+after+a+massive+overdose+of+controlled-release+paroxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychosomatics%22%5BJournal%5D)">Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine.</a> Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).</li>
<li>Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+recovery+after+severe+serotonin+syndrome%2C+severe+rhabdomyolysis%2C+multi-organ+failure+and+disseminated+intravascular+coagulopathy+from+MDMA%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung%22%5BJournal%5D)">Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA.</a> Heart Lung. 43, 117-119 (2014).</li>
<li>Bosch, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verbal+memory+deficits+are+correlated+with+prefrontal+hypometabolism+in+18FDG+PET+of+recreational+MDMA+users%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+On%22%5BJournal%5D)">Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users.</a> PLoS On. 8, e61234(2013).</li>
<li>Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+overnight+memory+consolidation+in+ecstasy+users%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychopharmaco%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users.</a> J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).</li>
<li>Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+radioactive+in+situ+hybridization+using+full+length+hydrolyzed+riboprobes+to+detect+%CE%B12+adrenoceptor+subtype+mRNAs+in+adult+and+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Proto%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain.</a> Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).</li>
<li>Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-ethylmaleimide+%28NEM%29+can+significantly+improve+in+situ+hybridization+results+using+35S-labeled+oligodeoxynucleotide+or+complementary+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytoche%22%5BJournal%5D)">N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes.</a> J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diag%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+E%22%5BJournal%5D)">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> J Vis E. , (2014).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+E%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis E. , (2012).</li>
<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pericytes+and+capillary+diameter+in+brain+slices+and+isolated+retinae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proto%22%5BJournal%5D)">Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae.</a> Nat Proto. 9, 323-336 (2014).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+techniques%3A+current+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytoche%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).</li>
<li>Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+in+rat+dentate+granule+cells%3A+comparison+between+fresh+and+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Method%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue.</a> J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).</li>
<li>Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+messenger+RNA+expression+by+in+situ+hybridization+using+RNA+probes+synthesized+via+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription.</a> Method. 52, 322-331 (2010).</li>
<li>Mijnster, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+and+cellular+distribution+of+serotonin+5-hydroxytryptamine2a+receptor+mRNA+in+the+nucleus+accumbens%2C+olfactory+tubercle%2C+and+caudate+putamen+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neuro%22%5BJournal%5D)">Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat.</a> J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+region-specific+alterations+of+5-HT2A+and+5-HT2C+receptors+in+serotonin+transporter+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroche%22%5BJournal%5D)">Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice.</a> J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).</li>
<li>Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+5-HT2A+receptor+mRNA+expression+following+withdrawal+from+a+chronic+escalating+dose+regimen+of+D-amphetamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Re%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine.</a> Brain Re. 1390, 10-20 (2011).</li>
<li>Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+5-HT2A+receptors+in+prefrontal+cortex+pyramidal+neurons+projecting+to+nucleus+accumbens.+Potential+relevance+for+atypical+antipsychotic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacolog%22%5BJournal%5D)">Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action.</a> Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).</li>
<li>Reneman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+and+chronic+effects+of+MDMA+%28%27Ecstasy%27%29+on+cortical+5-HT2A+receptors+in+rat+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human.</a> 26, 387-396 (2002).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Jednym z głównych problemów związanych z testem hybrydyzacji in situ jest wybór odpowiednich technik stosowanych do zachowania RNA ze względu na enzymy RNazy. Powszechnie wiadomo, że enzymy te są powszechnie obecne w komórkach i środowisku, co może wpływać na wyniki. Jednak aktywność enzymu można szybko rozróżnić, umieszczając tkankę w roztworze suchego lodu/alkoholu5,12. Chociaż szybkie zachowanie ma kluczowe znaczenie dla hybrydyzacji przy użyciu sondy rybonukleotydowej13, niewiele wiadom...

Zespół serotoninowy (5-hydroksytryptamina; 5-HT) jest ostrym zaburzeniem neurologicznym spowodowanym przez leki promujące 5-HT, takie jak leki przeciwdepresyjne1, a także występuje w sytuacjach używania MDMA w celach rekreacyjnych2. Mechanizmy molekularne odpowiedzialne za wahania nastroju, deficyty w uczeniu się i pamięci, które występują w związku z ostrym zespołem, nie są dobrze poznane3,4. Hybrydyzacja in situ jest potężnym narzędziem badawczym pozwalającym na wykrywanie i kwantyfikację określonych mRNA wyrażanych potencjalnie na poziomie pojedynczej komórki. Konwencjonalnym sposobem przeprowadzenia hybrydyzacji in situ jest wykorzystanie znakowanej radioaktywnie rybosondy, która specyficznie hybrydyzuje gen będący przedmiotem zainteresowania. Jednak główną wadą jest to, że metoda wymaga skomplikowanych i czasochłonnych etapów przygotowania sondy i hybrydyzacji, a także dostępu do świeżo zamrożonych tkanek utrzymywanych w środowisku wolnym od RNaz5,6. 
Sondy oligonukleotydowe zostały ostatnio opracowane do hybrydyzacji krótszych fragmentów RNA niż te wymagane dla rybosond7. Co więcej, sondy wytwarzają sygnał o niskim poziomie tła bez poświęcania specyficzności8. Ta nowo opracowana technologia sondy może być stosowana do hybrydyzacji in situ na tkankach mózgowych z prefiksami paraformaldehydowymi, powszechnie dostępnych w laboratoriach immunocytochemicznych.
Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ za pomocą sond oligonukleotydowych na mózgu szczura z prefiksem paraformaldehydu i porównujemy wyniki z tymi odnotowanymi w świeżo zamrożonym mózgu5,6. Protokół ten służy do testowania hipotezy, że nadużywanie substancji MDMA powoduje zmiany w geniereceptora 5-HT 2A mRNA htr2a w mózgu. Procedurę rozpoczęliśmy od leczenia MDMA, a następnie perfuzji tkanek paraformaldehydowych zwierzęcia, hybrydyzacji in situ sondy thr2a i analizy danych. Należy zauważyć, że dapB (bakteryjny gen kodujący reduktazę dihydrodipifolinianu) jest stosowany jako kontrola negatywna, a ppiB (gen porządkowy kodujący izomerazę peptydyloprolilu B) jako kontrola pozytywna.

<table><tbody><tr><td>Sonda kontroli negatywnej RNAscope-DapB</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek, INC</td><td>310098</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Pretreat 4</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek, INC</td><td>320046</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników RNAscope 2.0 HD - czerwony</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek, INC</td><td>310036</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAscope - Rn-Ppib</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek, INC</td><td>313921</td><td></td></tr><tr><td>Rat Htr2a</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek, INC</td><td>300031</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka pozioma</td><td>VWR</td><td>88032-088</td><td></td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Provis AX70</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych na mózgu szczurów z zespołem serotoninowym z przedrostkiem paraformaldehydu

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-metylenodioksymetamfetamina (MDMA; ecstasy) toksyczność może powodować specyficzne dla regionu zmiany w ekspresji serotoninergicznego mRNA z powodu ostrego zespołu serotoniny (5-hydroksytryptaminy; 5-HT). Hipotezę tę można przetestować za pomocą hybrydyzacji in situ w celu wykrycia genu receptora serotoniny5-HT 2A htr2a. W przeszłości takie procedury, wykorzystujące radioaktywną rybosondę, były trudne ze względu na skomplikowany przebieg pracy, który wymagał kilku dni na wykonanie, a dodatkową trudność polegała na tym, że technika wymagała użycia świeżo zamrożonych tkanek utrzymywanych w środowisku wolnym od RNaz. Ostatnio opracowanie krótkich sond oligonukleotydowych uprościło procedury hybrydyzacji in situ i umożliwiło stosowanie sekcji mózgu z prefiksami paraformaldehydowymi, które są szerzej dostępne w laboratoriach. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół z użyciem nieradioaktywnych sond oligonukleotydowych na tkankach mózgowych z prefiksem. Sondy hybrydyzacyjne użyte w tym badaniu obejmują dapB (bakteryjny gen kodujący reduktazę dihydrodipikolinianu), ppiB (gen porządkujący kodujący izomerazę peptydyloprolilu B) i htr2a (gen serotoniny kodujący receptory 5-HT2A). Ta metoda jest stosunkowo prosta, tania, powtarzalna i zajmuje mniej niż dwa dni.

Wykorzystując oligonukleotydowe sondy RNA (&lt;25 nt), hybrydyzację można wykryć jako czerwone kropki w komórkach podwzgórza przygotowanych z mózgów utrwalonych w paraformaldehydzie oraz świeżo zamrożonych. Cząsteczki mRNA htr2a występują w niektórych komórkach (wskazane strzałkami wypełnionymi), ale nie w innych (strzałki puste). Zaobserwowaliśmy, że nie ma różnicy między tkankami utrwalonymi w paraformaldehydzie a tkankami świeżo zamrożonymi (Rycina 1). Prawidłową hybrydyzację można najpierw o...

Ten protokół opisuje szybką i uproszczoną metodę hybrydyzacji in situ, idealną dla mózgu z prefiksem paraformaldehydu, zmniejszając w ten sposób potrzebę długotrwałych skomplikowanych etapów podczas korzystania ze świeżo zamrożonych tkanek. Metodę zwalidowano na podstawie identyfikacji genu receptora serotoniny5-HT 2A htr2a u szczurów.

Szybka hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych na mózgu szczurów z zespołem serotoninowym z przedrostkiem paraformaldehydu

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie szybkiej hybrydyzacji in situ na tkance mózgowej utrwalonej w paraformaldehydzie. Osiąga się to poprzez wstępne odwodnienie skrawków tkanki mózgowej i poddanie ich działaniu odczynników do wstępnej obróbki jeden, dwa i trzy. Drugim krokiem jest hybrydyzacja skrawków z pierwotnymi sondami oligonukleotydowymi, a następnie z drugą, trzecią i czwartą sondą.Następnie dodaje się substrat fast red w celu wykrycia docelowego RNA. Ostatnim krokiem jest ilościowe oznaczenie poziomu sygnałów mRNA przy użyciu oprogramowania Image J. W rezultacie zmiany w ekspresji genów RNA można uzyskać poprzez porównanie grup eksperymentalnej i kontrolnej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że jest ona stosunkowo prosta, niedroga, powtarzalna i jej wykonanie zajmuje mniej niż dwa dni. Praca ta została opracowana przeze mnie oraz przez Johna Jaya Lenana z Ross University School of Veterinary Medicine oraz Jean Sozę i RU Tao z College of Medicine, Florida Atlantic University. W tej procedurze, przed dehydratacją, należy wyjąć cztery preparaty z pudełek na szkiełka mikroskopowe przechowywanych w zamrażarce w temperaturze -80 °C.Przypisz sekcje do testów P-P-I-B-D-A-P-B oraz HT dwóch genów markera A i oznacz je długopisem. Następnie zanurz preparaty w 100% alkoholu w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Potem susz preparaty przez pięć minut w dygestorium. Do wstępnej obróbki pipetuj 20 µL odczynnika do wstępnej obróbki na każdą sekcję, a następnie umieść preparaty na szynie stelaża w kuwecie nawilżeniowej.Delikatnie wstrząśnij tacką z wilgotnymi preparatami na wstrząsarze poziomym przy niskiej prędkości przez 10 minut. Następnie przemyj szkiełka dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną przez dwie minuty. Zanurz szkiełka w zlewce o pojemności 1000 mililitrów zawierającej 450 mililitrów odczynnika do wstępnego przygotowania dwa.Następnie gotuj preparaty na szkiełkach przez łącznie pięć minut w temperaturze 100 °C, aby przywrócić strukturę RNA. Po tym czasie przemyj szkiełka dwukrotnie dwukrotnie destylowaną wodą, po dwie minuty każdego razu. Umieść szkiełka w 100% alkoholu na pięć minut.Następnie suszyć preparaty przez pięć minut. W dygestorium za pomocą pisaka hydrofobowego narysować okrąg wokół wybranego obszaru w przekroju tkanki. Następnie nanieść pipetą 10 µL odczynnika do wstępnego przygotowania nr 3 na każdy wybrany obszar, aby zwiększyć penetrację sond, i przykryć tackę nawilżającą pokrywką.Następnie umieść taczkę w piecu do hybrydyzacji wyposażonym w wstrząsarkę poziomą. Ustaw temperaturę pieca na 40 °C i delikatnie wstrząsaj taczką przez 30 minut. Po tym czasie przemyj preparaty dwukrotnie wodą dwukrotnie destylowaną, po dwie minuty każdego razu. Na tym etapie nanieś pipetą 10 µL sondy P-P-I-B-D-A-P-B lub HTR two A na wybrane obszary.Następnie przykryć tackę nawilżającą pokrywką, aby zapobiec odparowaniu odczynnika. Delikatnie wstrząsać slajdami na wytrząsaczu poziomym przy niskiej prędkości podczas inkubacji w temperaturze 40 °C w inkubatorze przez dwie godziny. Następnie przemyć slajdy dwukrotnie buforem do mycia przez dwie minuty za każdym razem, a następnie nanieść pipetą 10 µL odczynnika do amplifikacji 1 na każdy wybrany obszar.Wstrząsać i inkubować preparaty w temperaturze 40 °C przez 30 minut. Następnie przemyć preparaty dwukrotnie buforem myjącym po dwie minuty każdego razu, a następnie nanieść pipetą 10 µL odczynnika do amplifikacji 2 na każdy wybrany obszar. Wstrząsać i inkubować preparaty w temperaturze 40 °C przez 15 minut.Następnie przemyć preparaty dwukrotnie buforem do mycia przez dwie minuty. Każdorazowo nanieś pipetą 10 µL odczynnika do amplifikacji trzy na każdy wybrany obszar. Wstrząśnij i inkubuj preparaty w temperaturze 40 °C przez 30 minut.Następnie przemyć preparaty dwukrotnie buforem do płukania przez dwie minuty. Nanieść pipetą 10 µL odczynnika do amplifikacji nr 4 na każdy wybrany obszar. Wstrząsnąć i inkubować preparaty w temperaturze 40 °C przez 15 minut.Następnie przemyj preparaty dwa razy buforem do płukania przez dwie minuty. Nanieś pipetą 10 µL odczynnika do amplifikacji pięć na każdy wybrany obszar. Wstrząśnij i inkubuj preparaty w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie przemyj preparaty dwukrotnie buforem do płukania przez dwie minuty. Naniesie pipetą 10 µL odczynnika do amplifikacji sześć na każdy wybrany obszar. Wstrząśnij i inkubuj preparaty w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Następnie ponownie przemyj preparaty dwukrotnie buforem piorącym przez dwie minuty każdego razu. Teraz nanieś pipetą 10 µL czerwonego odczynnika na każdy wybrany obszar, umieść preparaty w tacy wilgotnościowej na wytrząsarce poziomej w temperaturze pokojowej i delikatnie wytrząsaj przy niskiej prędkości przez 10 minut. Następnie przemyj preparaty dwukrotnie wodą dwukrotnie destylowaną przez 10 minut.Za każdym razem suszyć preparaty w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 15 minut. Następnie umieścić preparaty w ksylenie w dygestorium na pięć minut. Kolejno, nanieść pipetą 20 µL medium montującego na bazie ksylenu na każdy wybrany obszar i przykryć szkiełkiem cover slip.W tym kroku przeciągnij i upuść plik obrazu do głównego okna obrazu J. Przejdź do paska menu i wybierz obraz. Następnie wybierz typ z menu rozwijanego i zaznacz ośmiobitowy.Następnie wybierz opcję adjust, a następnie threshold, aby otworzyć okno dialogowe. Dostosuj wartość dolnego suwaka w oknie dialogowym tak, aby usunąć niepożądane tło. Przejdź do paska menu, wybierz Analyze, a następnie analyze particles, aby otworzyć drugie okno dialogowe.Ustaw rozmiar cząstki na 10. Następnie zaznacz opcję pokaż kontury oraz wybierz wyświetl wyniki i podsumuj ramki. Na koniec kliknij OK, aby wyświetlić dane o cząstkach w oknach dialogowych.W celu wykonania obliczeń w arkuszu kalkulacyjnym wprowadź dane do arkusza Excel i oblicz średnią liczbę cząsteczek w grupie solnej jako wartość bazową. Następnie oblicz poziom procentowy dla każdego przekroju i przygotuj odpowiedni wykres. Poniżej przedstawiono widoki w mikroskopie świetlnym sygnałów hybrydyzacyjnych zaznaczonych czerwonymi kropkami.Tkanki zostały utrwalone paraformaldehydem u głęboko zanurkowanych w narkozie szczurów, którym uprzednio podano sól fizjologiczną oraz MDMA. Wykorzystane sondy oligonukleotydowe to D-A-P-B-P-P-I-B oraz HT two A. Rysunek ten przedstawia wpływ na ekspresję genu HT two A w podwzgórzu szczurów uprzednio traktowanych MDMA, gdzie zaobserwowano 20% redukcję ekspresji HT two, a. Technika ta ułatwia badaczom w dziedzinie neuronauki pomiar ekspresji genu mRNA przy użyciu hybrydyzacji in situ na utrwalonej paraformaldehydem tkance mózgowej.

rapid-situ-hybridization-using-oligonucleotide-probes-on

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje niepromienną procedurę hybrydyzacji in-situ, która umożliwia jednoczesną identyfikację dwóch gatunków transkryptów z rozdzielczością pojedynczych komórek w cienkich przekrojach mózgu kręgowców.

Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

Ten film demonstruje wykrywanie syntezy RNA receptora serotoninowego za pomocą sond oligonukleotydowych w tkance mózgowej szczura dotkniętej zespołem serotoninowym. Protokół obejmuje wstępną obróbkę tkanek, hybrydyzację sondy i detekcję enzymatyczną w celu wizualizacji i ilościowego określenia ekspresji RNA receptora serotoninowego pod mikroskopem.

Hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych do badania ekspresji RNA w skrawkach mózgu szczura

Źródło: Jolly, S., et.al. Połączenie podwójnej fluorescencji  hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w sekcjach mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2016). Ten film demonstruje zastosowanie hybrydyzacji in situ z podwójną fluorescencją do wizualizacji ekspresji dwóch celów RNA w sekcjach mózgu myszy. Protokół obejmuje sekwencyjne wykrywanie RNA za pomocą sond znakowanych izotiocyjanianem fluoresceiny i digoksygeniną, a następnie enzymatyczne wzmacnianie sygnału w...

 Wykonywanie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ w celu wykrycia ekspresji genów w skrawkach mózgu myszy

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Zastosowaliśmy powtarzalną przezczaszkową stymulację magnetyczną (rTMS) do jednostronnej półkuli mózgu szczura, umieszczając 25-milimetrową cewkę cyfry 8 1 cm bocznie do wierzchołka na linii dwuusznej i kątując cewkę o 45°. Własny system chłodzenia wodą był używany w rTMS przez ponad 20 minut.

Powtarzająca się przezczaszkowa stymulacja magnetyczna jednostronnej półkuli mózgu szczura

Identyfikacja receptora D1-alfa dopaminy w jądrze półleżącym jest kluczowa dla wyjaśnienia dysfunkcji receptora D1 podczas choroby ośrodkowego układu nerwowego. Przeprowadziliśmy nowatorski test hybrydyzacji RNA in situ, aby uwidocznić pojedyncze cząsteczki RNA w określonym obszarze mózgu.

Identyfikacja receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania RNA in situ

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.

DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

Opracowaliśmy test hybrydyzacji Duplex in situ do mapowania izoform receptora insuliny IR-A i IR-B w mysim splocie naczyniówkowym, pokonując ograniczenia tradycyjnych metod. To podejście o wysokiej rozdzielczości ujawnia ekspresję specyficzną dla izoformy, oferując nowe informacje na temat sygnalizacji insuliny w mózgu i potencjalnych terapii ukierunkowanych na izoformy w zaburzeniach neurologicznych.

Precyzyjna wizualizacja receptorów insuliny A i B w mózgu myszy za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Naucz się szybkiej hybrydyzacji in situ z sondami oligonukleotydowymi na mózgu szczurów z przedrostkiem paraformaldehydu. Ta metoda upraszcza wykrywanie ekspresji genu htr2a w badaniach neurobiologicznych.

Szybka hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych na mózgu szczurów z zespołem serotoninowym z przedrostkiem paraformaldehydu (Wideo) | JoVE Journal

Szybka hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych na mózgu szczurów z zespołem serotoninowym z przedrostkiem paraformaldehydu

Przeglądaj więcej filmów