Szybka hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych na mózgu szczurów z zespołem serotoninowym z przedrostkiem paraformaldehydu
23 września 2015
Ten protokół opisuje szybką i uproszczoną metodę hybrydyzacji in situ, idealną dla mózgu z prefiksem paraformaldehydu, zmniejszając w ten sposób potrzebę długotrwałych skomplikowanych etapów podczas korzystania ze świeżo zamrożonych tkanek. Metodę zwalidowano na podstawie identyfikacji genu receptora serotoniny5-HT 2A htr2a u szczurów.
Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie szybkiej hybrydyzacji w C dwóch na tkance mózgowej z przedrostkiem aldehydu paraformowego. Osiąga się to poprzez pierwsze odwodnienie skrawków tkanki mózgowej i potraktowanie ich jednym, dwoma i trzema odczynnikami do obróbki wstępnej. Drugim krokiem jest hybrydyzacja skrawków z pierwotnymi sondami oligonukleotydowymi, a następnie drugą, trzecią i czwartą sondą.
Następnie dodaj szybki czerwony substrat, aby wykryć docelowe RNA. Ostatnim krokiem jest ilościowe określenie poziomu sygnałów mRNA za pomocą oprogramowania Image J. Ostatecznie zmiany w ekspresji genów RNA można uzyskać, porównując grupę eksperymentalną i kontrolną.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że jest stosunkowo prosta, niedroga, powtarzalna i zajmuje mniej niż dwa dni. Ta praca została opracowana przeze mnie i Johna Jaya Lenana z Ross University School of Veterinary Medicine oraz Jean Soza i RU Tao z College of Medicine, Florida Atlantic University. W tej procedurze jej odwodnienia pobiera się cztery preparaty z pudełek na szkiełka mikroskopowe przechowywane w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza.
Przypisz sekcje do testów P-P-I-B-D-A-P-B i HT, zaznacz dwa geny A i oznacz je długopisem. Następnie zanurz szkiełka w 100% alkoholu w temperaturze pokojowej na pięć minut. Następnie suszyć szkiełka przez pięć minut w dygestorii do obróbki wstępnej, odpipetować 20 mikrolitrów odczynnika do obróbki wstępnej do każdej sekcji, umieścić szkiełka na szynie stojaka w tacy na wilgoć.
Delikatnie potrząsaj tacką na wilgoć na poziomej wytrząsarce na niskich obrotach przez 10 minut. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną przez dwie minuty. Zanurz szkiełka w zlewce o pojemności 1000 mililitrów zawierającej 450 mililitrów dwóch odczynników do obróbki wstępnej.
Następnie gotuj szkiełka w sumie przez pięć minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza, aby przywrócić strukturę RNA. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną przez dwie minuty za każdym razem. Umieść szkiełka w 100% alkoholu na pięć minut.
Następnie suszyć szkiełka przez pięć minut. W dygestorium użyj pisaka hydrofobowego, aby narysować okrąg wokół wybranego obszaru w sekcji tkanki. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów odczynnika do obróbki wstępnej do każdego wybranego obszaru, aby zwiększyć penetrację sondy i przykryć tackę na wilgoć pokrywką.
Następnie umieść blachę w piekarniku hybrydyzacyjnym wyposażonym w wytrząsarkę poziomą. Ustaw temperaturę piekarnika na 40 stopni Celsjusza i delikatnie potrząsaj blachą przez 30 minut, a następnie umyj szkiełka dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną przez dwie minuty za każdym razem. Na tym etapie należy odpipetować 10 mikrolitrów sondy P-P-I-B-D-A-P-B lub HTR dwie A na wybrane obszary.
Następnie przykryj tackę na wilgoć pokrywką, aby zapobiec parowaniu odczynnika. Delikatnie potrząśnij szkiełkami na wytrząsarce poziomej z małą prędkością, inkubując je w temperaturze 40 stopni Celsjusza w piekarniku przez dwie godziny. Następnie przemyć szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez dwie minuty za każdym razem, odpipetować 10 mikrolitrów amplifikacji jeden odczynnik na każdy wybrany obszar.
Wstrząśnij i inkubuj szkiełka w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przemyć szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez dwie minuty za każdym razem, odpipetować 10 mikrolitrów amplifikacji dwa odczynniki na każdy wybrany obszar. Wstrząśnij i inkubuj szkiełka w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Następnie umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez dwie minuty. Za każdym razem należy odpipetować 10 mikrolitrów amplifikacji, trzy odczynniki na każdym wybranym obszarze. Wstrząśnij i inkubuj szkiełka w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Następnie umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez dwie minuty. Odpipetować 10 mikrolitrów amplifikacji, cztery odczynniki na każdy wybrany obszar. Wstrząśnij i inkubuj szkiełka w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Następnie umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez dwie minuty. Odpipetować 10 mikrolitrów amplifikacji pięciu odczynników na każdy wybrany obszar. Wstrząśnij i inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
Następnie umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym przez dwie minuty. Odpipetować 10 mikrolitrów sześciu odczynników do amplifikacji na każdy wybrany obszar. Wstrząśnij i inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
Następnie ponownie umyj szkiełka dwa razy buforem myjącym przez dwie minuty za każdym razem. Teraz odpipetuj 10 mikrolitrów czerwonego odczynnika do każdego wybranego obszaru, umieść szkiełka w tacce na wilgoć na poziomym wytrząsarce w temperaturze pokojowej i delikatnie potrząsaj z niską prędkością przez 10 minut. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną przez 10 minut.
Za każdym razem szkiełka suszymy w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie umieść szkiełka w ksylenie w dygestoriach na pięć minut. Następnie odpipetuj 20 mikrolitrów pożywki montażowej na bazie ksylenu na każdy wybrany obszar i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.
W tym kroku przeciągnij i upuść plik obrazu do głównego okna obrazu J. Przejdź do paska menu i wybierz obraz. Następnie wybierz typ z menu rozwijanego i wybierz osiem bitów.
Następnie wybierz dostosuj, a następnie wybierz próg, aby otworzyć okno dialogowe. Dostosuj dolną wartość paska w oknie dialogowym, aby usunąć niechciane tło. Przejdź do paska menu i wybierz Analizuj, a następnie wybierz Analizuj cząstki, aby otworzyć drugie okno dialogowe.
Ustaw wielkość cząstek na 10. Następnie wybierz pozycję pokaż konspekty, a następnie wybierz pola wyświetlania wyników i podsumowania. Na koniec kliknij OK, aby wyświetlić dane cząstek w oknach dialogowych.
Aby obliczyć arkusz kalkulacyjny, wprowadź dane do arkusza Excela i uśrednij liczbę cząstek w grupie soli fizjologicznej jako linię bazową. Następnie oblicz poziom procentowy każdej sekcji i odpowiednio wykonaj wykres. Oto mikroskopijne widoki świetlne sygnałów hybrydyzacji oznaczonych czerwonymi kropkami.
Tkanki poprzedzono aldehydem paraform u głęboko znieczulonych szczurów, wcześniej leczonych solą fizjologiczną i MDMA. Zastosowane sondy oligonukleotydowe to D-A-P-B-P-P-I-B i HT dwa A. Ten rysunek pokazuje wpływ na ekspresję genu HT dwa A w podwzgórzu u szczurów wcześniej leczonych MDMA i 20% zmniejszenie HT dwa, zaobserwowano ekspresję. Technika ta ułatwia naukowcom zajmującym się neurobiologią pomiar ekspresji genu posłańca Ra za pomocą in situ na paraformie, tkance mózgowej z przedrostkiem wysokości.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje szybką i uproszczoną metodę hybrydyzacji in situ, idealną dla tkanki mózgowej utrwalonej w paraformaldehydzie. Metoda ta ogranicza konieczność przeprowadzania długotrwałych, złożonych etapów przy użyciu świeżo zamrożonych tkanek i została zwalidowana poprzez identyfikację genu receptora serotoninowego 5-HT 2A htr2a u szczurów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Ekspresja genów
- Hybrydyzacja in situ
Wstęp
- Hybrydyzacja in situ jest techniką stosowaną do wykrywania specyficznych sekwencji RNA w skrawkach tkanek.
- Tradycyjne metody mogą być czasochłonne i złożone, wymagając rozbudowanej obróbki próbek.
- Celem niniejszego badania jest usprawnienie tego procesu w celu zwiększenia jego efektywności.
- Receptor serotoninowy 5-HT 2A jest istotny dla zrozumienia różnych funkcji neurologicznych.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego protokołu hybrydyzacji in situ dla tkanki mózgowej.
- Uproszczenie procedury przy jednoczesnym zachowaniu dokładności w wykrywaniu ekspresji genów.
- Walidacja metody z wykorzystaniem genu htr2a jako celu.
Zastosowane metody
- Odwadnianie przekrojów tkanki mózgowej.
- Opracowanie odczynnikami do wstępnej obróbki.
- Hybrydyzacja z pierwotnymi i wtórnymi sondami oligonukleotydowymi.
- Detekcja docelowego RNA z użyciem substratu fast red oraz kwantyfikacja przy użyciu oprogramowania Image J.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na skuteczną identyfikację genu htr2a w tkance mózgowej szczura.
- Wykazuje on znaczące skrócenie czasu przetwarzania w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Analiza ilościowa wskazuje na wiarygodne poziomy sygnału mRNA.
- Porównania między grupą eksperymentalną a kontrolną ujawniają zmiany w ekspresji genu RNA.
Wnioski
- Metoda szybkiej hybrydyzacji in situ jest skuteczna w przypadku tkanki mózgowej utrwalonej w paraformaldehydzie.
- Podejście to może ułatwić dalsze badania nad ekspresją genów w neuronauce.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować szersze badania nad różnymi schorzeniami neurologicznymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka hybrydyzacja in situ z użyciem sond oligonukleotydowych na tkance mózgowej utrwalonej paraformaldehydem umożliwia efektywną, ilościową ocenę zmian w ekspresji genów w modelach istotnych dla przebiegu chorób. Ten uproszczony protokół zmniejsza złożoność procesu i skraca czas oczekiwania na wyniki, wspierając wysoką pewność walidacji celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach rozwoju leków neurofarmakologicznych. Podejście to usprawnia podejmowanie decyzji dotyczących portfolio badań dzięki umożliwieniu odtwarzalnej i skalowalnej kwantyfikacji mRNA w badaniach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę zmian w ekspresji genów w odpowiedzi na interwencje farmakologiczne.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów, takich jak receptory 5-HT2A, w obszarach mózgu istotnych dla danej choroby.
- Ułatwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację modulacji mRNA po ekspozycji na związek.
- Zwiększa pewność prognostyczną w procesie rozwoju celów neuropsychiatrycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testu
- Zapewnia powtarzalny, ilościowy odczyt ekspresji mRNA w utrwalonych przekrojach tkanek.
- Skraca czas opracowywania testów poprzez wyeliminowanie konieczności stosowania świeżych zamrożonych próbek i sond radioaktywnych.
- Umożliwia standaryzację i skalowalność w badaniach przesiewowych wpływu związków na ekspresję genów.
- Wspiera wiarygodne porównanie grup eksperymentalnych i kontrolnych w celu walidacji testu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla choroby poprzez kwantyfikację ekspresji genu docelowego w tkance mózgowej po podaniu leku.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną dzięki wykorzystaniu powszechnie dostępnych próbek prefiksowych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu skorygowane o ryzyko, w oparciu o ilościowe punkty końcowe na poziomie molekularnym.
- Dostarcza translacyjnych danych dotyczących biomarkerów dla modulacji szlaku serotonergicznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając szybką, ilościową analizę ekspresji genów w tkankach utrwalonych w paraformaldehydzie, co wspiera zarówno walidację celów terapeutycznych, jak i badania mechanistyczne.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez pomiar zmian mRNA po interwencji farmakologicznej.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, powtarzalnych wyników ilościowych odpowiednich do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia cyfrową kwantyfikację sygnałów mRNA przy użyciu programu Image J, co umożliwia rzetelne porównania statystyczne.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany molekularne z fenotypami istotnymi dla przebiegu choroby w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje szeroko stosowalny protokół analizy ekspresji genów dla programów B+R w dziedzinie neuronauki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Usprawnia przepływy pracy dzięki zastosowaniu sond nieradioaktywnych i kompatybilności z utrwalonymi tkankami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywne pod względem kapitałowym zarządzanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów z zakresu neurofarmakologii.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie przygotowania tkanek, projektowania sond oraz cyfrowej analizy obrazu.
- Wymaga dostępu do pieców do hybrydyzacji, systemów obrazowania oraz oprogramowania analitycznego, takiego jak Image J.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalnej kwantyfikacji i interpretacji danych.
- Metoda jest adaptowalna do różnych genów docelowych i obszarów mózgu przy użyciu zwalidowanych sond oligonukleotydowych.
- Metoda jest ograniczona do tkanek utrwalonych w paraformaldehydzie; nie nadaje się do wszystkich metod konserwacji tkanek.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Dehydration and Pretreatment
3:32
Hybridization and Amplification
5:35
Signal Detection
6:20
Image Particle Analysis
7:31
Results: A Light Microscopic View of Hybridization Signals and the Effect on Hypothalamic htr2a Expression in Rats Treated with MDMA
8:16
Conclusion
